NO318016B1

NO318016B1 - Fremgangsmate for amplifisering av minst ett restriksjonsfragment og oligonukleotidprimaere anvendelser, kit og sett av amplifiserte restriksjonsfragmenter derav.

Info

Publication number: NO318016B1
Application number: NO19941064A
Authority: NO
Inventors: Marc Zabeau; Pieter Vos
Original assignee: Keygene Nv
Priority date: 1991-09-24
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 2005-01-24
Also published as: CZ66994A3; DK0534858T4; EP0534858A1; DK0969102T3; HUT68504A; PT534858E; HU223760B1; JP2008131947A; EP0969102A3; ATE382094T1; ZA927323B; EP0534858B1; DE69230873T2; DE69233719T2; EP0969102B1; US6045994A; ES2147550T3; RU2182176C2; NO941064D0; JPH06510668A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelser av DNA fingerprinting og anvendelse av DNA markører innen et antall forskjellige områder som innbefatter, men er ikke begrenset til, plante og dyreavling, type eller dyrkiungsidentifikasjon, diagnostisk medisin, sykdomsdiagnostikk av dyr og planter, identifikasjon av genetisk arvede sykdommer hos mennesker, analyser av familieslektskap, juridiske analyser og mikrobiell typebestemmelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt fremgangsmåter for DNA fingerprinting og for detektering av spesifikke DNA markører i genomer varierende fra mikroorganismer til høyere planter, dyr og mennesker. Oppfinnelsen vedrører også syntetiske DNA molekyler og produkter basert derpå som blir anvendt i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen innenfor forskjellige anvendelsesområder.

DNA fingerprinting

DNA fingerprinting eller DNA typing, samt andre metoder for genotyping, profildan-nelse og DNA identifikasjonsanalyse, refererer til karakterisering av enten likheter eller en eller flere bestemte trekk i den genetiske oppstillingen eller genomet til et individ, en varietet eller rase, eller en art. Den generelle regelen er at desto nærmere det genetiske slektskapet er desto større er likheten eller mer hensiktsmessig er likheten til genomene og dermed vil bestemte trekk i genomet være mer skjeldent. Disse likhetene eller bestemte trekkene kan bli vist ved analysering av DNA til en organisme eller spalting av DNA med en restriksjonsendonuklease. Restriksjonsendonukleaser er enzymer som gjenkjenner korte nukleotidsekvenser, vanligvis 4 til 8 baser i lengde og spalter de to DNA trådene for derved å produsere fragmenter av DNA med bestemt lengde. På grunn av den store graden av sekvensspesifisitet vil restriksj onsendonukleasene spalte DNA molekylene på en meget spesifikk måte. Resultatet er at et reproduserbart sett av DNA fragmenter vil bli dannet. DNA fragmentene kan bli fraksjonert i forhold til deres lengde på porøse matriser, eller geler, som gir typiske båndmønstre som utgjør et DNA fingeravtrykk av organismens genetiske innhold.

DNA polymorfisme

Når fingerprintene av meget nært beslektede arter, varieteter eller raser blir sammenlignet kan DNA fingerprintene være identiske eller meget like. Når forskjeller blir observert i ellers identiske DNA fingerprints blir slike forskjeller referert til som DNA polymorfismer: disse er nye DNA fragmenter som fremkommer i et fingerprint. DNA sies å være polymorf ved denne posisjon og det nye DNA fragmentet kan bli anvendt som en DNA markør. DNA polymorfismer detektert i DNA fingerprint oppnådd ved restrik-sjonsenzymspaltning kan resultere ut fra hvilke som helst av de følgende endringene i DNA sekvensen: mutasjoner som ødelegger restriksjonsendonukleasemålsetet, mutasjoner som danner nye målseter, innskudd, delesjoner eller inversjoner mellom to restrikk-sjonsseter.

En slik DNA polymorfisme blir generelt referert til som RFLP, restriksjonsfragmentlengdepolymorfismer. Slike mutasjonsforandringer vil oppføre seg som bona fide genetiske markører når de arves ifølge Mendels lover. DNA polymorfismer kan dermed bli anvendt som genetiske markører på samme måte som andre genetiske markører: i analyser av foreldre, i genetiske studier på arveligheten av trekk og ved identifikasjon av individer.

Teknikker for DNA fingerprinting

Når det gjelder nesten alle levende organismer unntatt virus gir restriksjonsspaltningene av totalt genomisk DNA til organismene så mange bånd at det ikke er mulig å registrere individuelle bånd. Derfor er alle metodene for DNA fingerprinting basert på prinsippet om at bare en liten fraksjon av DNA fragmentene blir visualisert for å tilveiebringe et enkelt båndmønster som utgjør DNA fingerprintet.

Den mest anvendte metoden innbefatter spalting av DNA til organismen med restriksjonsendonukleaser, fraksjonering av restriksjonsfragmentene ved gelelektroforese, overføring og binding av fraksjonerte DNA fragmenter på membraner og hybridisering av membranen med et spesifikt DNA fragment ("probe"). DNA fragmentet vil danne dobbelttrådete DNA molekyler med DNA fragmentet (eller fragmentene) på membranen som har komplementære nukleotidsekvenser. Når proben er merket med en visuali-serbar markør kan DNA fragmentet som proben er koblet til bli visualisert. Denne prosedyren blir generelt referert til som "Southern hybridisering". Når forskjeller blir observert i størrelsene på de tilsvarende restriksjonsfragmentene som probene kobles til i nært beslektede genomiske DNA molekyler blir disse forskjellene referert til som DNA polymorfismer, mer spesifikt restriksjonsfragmentlengdepolymorfismer. Restriksjonsfrag-mentlengdeforskjellene tilsvarer forskjellige alleliske former av det genetiske lokuset gjenkjent av DNA proben. Til tross for at hybridiseringsmetoden for DNA fingerprinting har vært meget anvendt er fremgangsmåten arbeidskrevende og tidskrevende. Fremgangsmåten har en lav oppløsning og kan dermed bare bli anvendt for å registrere enkeltloki eller bare noen få loki i en enkelt reaksjon.

Polymerasekjedereaksjon

Polymerasekjedereaksjon (PCR) teknikken er en fremgangsmåte for syntetisering av spesifikke DNA fragmenter in vitro. Fremgangsmåten er basert på anvendelsen av spesifikke oligonukleotider som vil bli koblet til unike sekvenser på et DNA molekyl og en termostabil DNA polymerase. Oligonukleotidene er konstruert på en slik måte at de kan bli smeltet sammen med de motsatte trådene til DNA og virke som primere i en DNA syntesereaksjon på en slik måte at hver vil lede syntesen av nye DNA tråder. I en synte-serunde vil en fullstendig kopi av DNA molekylet mellom primerne bli dannet slik at DNA mellom primerne blir duplikert. Hver runde av DNA syntesen resulterer i dobling av DNA og fører derfor til amplifikasjon av DNA innbefattet mellom de to primerne. PCR teknikken muliggjør dermed for syntetisering av et nøyaktig DNA fragment ved anvendelse av en liten mengde "substrat DNA".

KJENTE TEKNIKK

WO 90/08821 rapporterer amplifikasjon av hvert fragment i en valgt region til et kro-mosom for å berike DNAet i nevnte region.

Rosenthal et al, Nucleic Acids Research vol. 18, nr. 10, 1990, 3095 - 3096, rapporterer en fremgangsmåte for amplifikasjon og sekvensering av et DNA med start fra en kjent sekvens i nevnte DNA for å hybridisere primere.

WO 90/11372 er relatert til en DNA-diagnostisk test og spesielt til deteksjon av et spesifikt testnukleotid i en kjent sekvens.

WO 91/05861 er relatert til en fremgangsmåte for amplifikasjon av DNA-fragmenter ved hjelp av primersekvenser homologe til sekvensen til linkene lagt til endene til DNA-fragmentene.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en ny fremgangsmåte for å amplifisere, med PCR metoden, restriksjonsfragmenter oppnådd etter spaltning av DNA til en organisme med minst et restriksj onsenzym. I denne nye anvendelsen av PCR metoden er oligonukleotidene som blir anvendt ikke rettet mot en kjent DNA sekvens, men er konstruert slik at de gjenkjenner endene av restriksjonsfragmentene. Til nå har det vært nød-vendig å modifisere endene av restriksjonsfragmentene ved tilsetning av oligonukleo-tidlinkere (eller adaptere) til endene. Grunnen for dette er at endene til restrikksjons-enzymene har bare vanlige få nukleotider som er felles. Dvs. 2 til 8 nukleotider, som er for kort til å bli anvendt for å konstruere primere for PCR amplifikasjon.

Oppfinnelsen er basert på anvendelsen av en ny anvendelse av polymerasekjedereak-sjonsteknikken (PCR) for amplifisering av en eller flere restriksjonsfragmenter fra komplekse blandinger av DNA fragmenter oppnådd ved spaltning av genomiske DNA molekyler med restriksjonsendonukleaser. En spesiell fordel ifølge oppfinnelsen er å mulig-gjøre amplifikasjon av DNA restriksjonsfragmentene i situasjoner hvor nukleotidsekvensen til 5' og 3' endene av restriksjonfragmentene ikke er bestemt. I slike tilfeller kan de vanlige sekvensspesifikke primerne hybridisere til hver tråd av et restriksj onsfragment som skal bli amplifisert ikke bli definert og derfor er det ikke mulig å anvende fremgangsmåtene kjent innenfor fagområdet for amplifikasjon.

Fremgangsmåten ifølge oppfmnelsen kan bl.a. bli anvendt på to forskjellige måter som fører til to forskjellige typer av anvendelser: (1) Metoder for DNA fingerprinting av genomer ved tilfeldig selektering av undergrupper av en eller flere restriksjonsfragmenter som skal bli amplifisert ifølge PCR teknikken. Oppfinnelsen omfatter også syntetiske oligonukleotider for anvendelse i nevnte metoder og noen anvendelser av nevnte metoder kan være rettslige bestemmelser, mikrobielle identifikasjon, varietet-identifikasjon, avstamningsbestemmelsesanalyse og screening av DNA markører koblet til genetiske trekk; (2) Metoder for identifisering av en eller flere på forhånd valgte DNA fragmenter som kan være polymorfe, ved PCR amplifikasjon. Oppfinnelsen omfatter også spesifikke syntetiske oligonukleotider for anvendelse i nevnte metoder og noen anvendelser av nevnte metoder kan være screening av genetiske arvede sykdommer hos mennesker, registrering av arv av agronomiske trekk innen plante og dyreavling og deteksjon av infeksjonsmidler i sykdommer.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 angir en grafisk oppstilling av den generelle metoden for PCR amplifikasjon med merkede restriksjonsfragmenter oppnådd ved spaltning av genomiske DNA molekyler med et restriksjonsenzym. Figur 2 angir ligering av adaptorene til forskjellige ender av restriksjonsfragmentene: butte ender og overhengende ender. Figur 3 angir PCR amplifikasjon av tagged restriksjonsfragmenter. De skraverte områdene angir adaptorene som er ligert til restriksjonsfragmentet og primerne som blir anvendt i PCR amplifikasjonen. Pilene angir retningen til DNA syntesen. Figur 4 angir en grafisk oppstilling for PCR amplifikasjon av tagged restriksjonsfragmenter. Figur 5 angir den generelle konstruksjonen av selektive primere som blir anvendt i PCR amplifikasjonen av tagged restriksjonfragmenter. Pilene angir inverterte gjentatte sekvenser ved endene til restriksjonsfragmentene. Selektiviteten til primerne er illustrert i to eksempler hvor det er henholdvis en perfekt paring og en total feilparing mellom den selektive basesekvensen og restriksjonsfragmenttemplat DNA. Figur 6 viser prinsippet for selektiv PCR amplifikasjon ved anvendelse av en PCR primer som selekterer templat DNA molekylet som har en trinukleotidsekvens ved siden av adaptorsekvensen.

Figur 7 angir selektiv PCR amplifikasjon av tagged restriksjonsfragmenter.

Figur 8 viser prinsippet for fragmentspesifikk amplifikasjon ved anvendelse av en kombinasjon av to PCR primere som hver omfatter 6 selektive baser. Hver primer danner en dobbelttrådet struktur i den andre tråden av restriksjonsfragmentet og danner derved et primer/templatkompleks hvorifra DNA syntesen kan bli initiert (representert ved pilene).

Fi gur 9 angir de generelle sekvenselementene som blir gjenkjent med metoden for selektiv restriksjonsfragmentamplifikasjon, inkludert de to nukleotidsekvensene som blir gjenkjent og avstanden som separerer de to sekvensene.

Figur 10 angir typer av nukleotidsekvensvariasjoner som blir detektert i metoden for identifisering av amplifiserte fragmentlengdepolymorfismer. Figur 11 viser en 1,0 % agarosegel med analyser av resultatene av amplifikasjon av tomat DNA spaltet med Pstl ved anvendelse av primere med økende selektivitet. Figur 12 viser en 1,0 % agarosegel med analyser av resultatene av spesifikk amplifikasjon av tre forskjellige Pstl fragmenter av tomat DNA ved anvendelse av fragmentspesifikke primere. Figur 13 viser en 2,5 % polyakrylamidVl % agarosegel med DNA fingerprinter oppnådd ved selektiv restriksjonsfragmentamplifikasjon av de to tomatlinjene. Figur 14 viser en del av en 4,5 % denaturerende polyakrylamidgel med DNA fingerprinter av 4 tomatlinjer ved anvendelse av SRFA med enzymkombinasjon PstlAMsel. Figur 15 viser en del av en 4,5 % denaturerende polykarylamidgel med DNA fingerprinter av 10 Lactuca linjer ved anvendelse av SRFA med enzymkombinasjonen Pstl/Msel. Figur 16 viser en del av 4,5 % denaturerende polyakrylamidgel med DNA fingerprinter av 2 maislinjer ved anvendelse av SRFA med enzymkombinasjonene Pstl/Tagl og EcoRLTagl. Figur 17 viser en del av en 4,5 % denaturerende polyakrylamidgel med DNA fingerprinter av av 26 Xantomonas campestris stammer ved anvendelse av SRFA med enzymkombinasjon Apal/Tagl. Figur 18 viser en del av en 4,5 % denaturerende polyakrylamidgel med DNA fingerprinter av forskjellige individer av 4 husdyr kylling, gris, ku og hest ved anvendelse av SRFA med enzymkombinasjon Ssel/Msel.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Definisjoner

I beskrivelsen og eksemplene nedenfor blir et antall betegnelser anvendt. For å angi en klar og bestemt forståelse av beskrivelsen og kravene, inkludert rammen som blir gitt for slike angivelser er følgende definisjoner gitt.

Restriksjonsendonuklease: et restriksjonsendonuklease eller restriksjonsenzym er et i enzym som gjenkjenner en spesifikk basesekvens (målsete) i et dobbelttrådet DNA

molekyl og vil spalte begge trådene av DNA molekylet ved hvert målsete.

Restriksjonsfragmenter: DNA molekylene produsert ved spaltning ved en restriksjonsendonuklease blir referert til som restriksjonsfragmenter. Et hvilket som helst gitt genom vil bli spaltet med en bestemt restriksjonsendonuklease til et adskilt sett av restriksjonsfragmenter. DNA fragmentene som er et resultat fra restriksjonsendonukleasespaltningen blir separert og detektert ved gelelektroforese.

Restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP): genomisk DNA til de to nært beslektede organismene vil f.eks utvise forskjeller i deres

nukleotidsekvenssammensetning ved mange seter. Når disse forskjellene oppstår i

i målsetet for en restriksjonsendonuklease vil det modifiserte målsetet ikke bli spaltet ved punktet. Likeledes kan en nukleotidsekvensvariasjon innføre et nytt målsete som ikke eksisterer i den andre organismen som forårsaker at DNA blir spaltet av restriksjonsenzymet ved det punktet. Alternativt vil innskudd eller delesjoner av nukleotider som oppstår i en organisme mellom to målseter for en restriksjonsendonuklease modifisere avstanden mellom målsetene. På grunn av dette vil spaltning av de to organismenes DNA produsere restriksjonsfragmenter med forskjellige lengder. En polymorfisme i lengden av restriksjonsfragmentene produsert ved spaltning av DNA til de to organismene vil resultere.

Gelelektroforese: for å detektere restriksjonsfragmenter er analytiske metoder for

i separering av dobbelttrådete DNA molekyler på grunnlag av størrelse nødvendig.

Den mest vanlige anvendte teknikken for oppnåelse av slik fraksjonering er gelelektroforese. Raten hvorved DNA fragmenter beveger seg i slike geler avhenger av deres størrelse og dermed til avstanden som blir gått reduseres når fragmentlengdene øker. DNA fragmentene fraksjonert ved gelelektroforese kan bli visualisert direkte ved en fargeprosedyre dersom antall fragmenter innbefattet i mønsteret er lite.

Syntetiske oligonukleotider: enkelttrådet DNA molekyler med fortrinnsvis fra omtrent 10 til omtrent SO baser som kan bli syntetisert kjemisk eller referert til som syntetiske oligonukleotider. Generelt blir disse syntetiske DNA molekylene konstruert å ha en unik nukleotidsekvens til tross for at det er mulig å syntetisere familier av molekyler med beslektede sekvenser og som har forskjellige nukleotidsammensetninger ved spesifikke posisjoner innenfor nukleotidsekvensen. Betegnelsen syntetisk oligonukleotid vil bli anvendt for å referere til DNA molekyler som har en unik nukleotidsekvens. Betegnelsen blandede syntetiske oligonukleotider vil bli anvendt for å referere til familier av beslektede syntetiske

oligonukleotider.

Ligering: den enzymatiske reaksjonen katalysert av enzymligase hvor dobbelttrådete DNA molekyler er kovalentlig koblet sammen blir referert til som ligering. Begge DNA trådene blir koblet kovalent sammen, men det er også mulig å forhindre ligeringen av en av de to trådene gjennom kjemisk eller enzymatisk modifikasjon av en av endene. I dette tilfellet vil den kovalente koblingen bare

oppstå i en av de to trådene.

Adapterer: korte dobbelttrådete DNA molekyler med et begrenset antall basepar,

f.eks 10 til 30 basepar i lengde som er konstruert på en slik måte at de kan bli ligert til endene av restriksjonsfragmentene. Adapterer består av to syntetiske oligonukleotider med nukleotidsekvenser som delvis er komplementære i forhold til hverandre. Ved blanding av de to syntetiske oligonukleotidene vil de danne en dobbelttrådet struktur i oppløsningen under hensiktsmessige betingelser. En av endene til adaptormolekylet er konstruert slik at det kan bli ligert til enden av et restriksj onsfragment og den andre enden blir konstruert slik at den ikke kan bli

ligert.

Polymerasekjedereaksjon (PCR): den enzymatiske reaksjonen hvor DNA

fragmentene blir syntetisert fra et substrat DNA in vitro blir referert til som PCR. Reaksjonen innbefatter anvendelse av to syntetiske oligonukleotider som er komplementære med nukleotidsekvensene i DNA molekylene som er separert av en kort avstand med noen få hundre til noen få tusen basepar og anvendelse av en termostabil DNA polymerase. Kjedereaksjonen består f.eks av en serie på 10 til 30 sykluser. I hver syklus blir substrat DNA først denaturert ved høy temperatur. Etter nedkjøling av de syntetiske oligonukleotidene som er tilstede i et stort overskudd vil det bli dannet dobbelttrådete strukturer med substrat DNA molekylene i

oppløsning ved spesifikke seter på substrat DNA molekylet som har komplementære nukleotidsekvenser. Oligonukleotid-substrat DNA kompleksene vil deretter virke som initieringsseter for DNA syntesereaksjonen katalysert av DNA polymerase som resulterer i syntese av en ny DNA tråd som er

komplementær med substrat DNA tråden. - DNA amplifikasjon: betegnelsen DNA amplifikasjon vil bli anvendt for å angi syntese av dobbelttrådete DNA molekyler in vitro ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon (PCR). Produktene

av PCR reaksjonen vil bli referert til som amplifiserte DNA fragmenter.

Primere: generelt refererer betegnelsen primer til en DNA tråd som kan prime syntesen av DNA. DNA polymerase kan ikke syntetisere DNA de novo uten primere: det er bare mulig å utvide en eksisterende DNA tråd i en reaksjon hvor den komplementære tråden blir anvendt som et templat for å lede rekkefølgen av nukleotider som skal bli sammenstilt. De syntetiske oligonukleotidmolekylene som

blir anvendt i PCR reaksjonen vil bli referert til som primere.

Southern hybridiseringsprosedyre: hensikten med Southern hybridiseringsprosedyre, også referert til som Southern blotting, er å overføre fysisk DNA fraksjoner ved agarosegelelektroforese på en bærer så som nylonmembran eller et nitrocellulosefilterpapir, mens de relative posisjonene til DNA fragmentene som er et resultat fra fraksjoneringsprosedyren beholdes. Metodologien som blir anvendt for å oppnå overføringen fra agarosegelen til

bæreren er å trekke DNA fra gelen inn i bæreren med kappilær virkning. Nuklemsyrehybridisering: nukleinsyrehybridisering blir anvendt for å detektere relaterte DNA sekvenser ved hybridisering av enkelttrådet DNA på bærere så som nylonmembran eller nitrocellulosefilterpapirer. Nukleinsyremolekylene som har komplementære basesekvenser vil omdanne den dobbelttrådete strukturen dersom den blir blandet i oppløsning under riktige betingelser. Dobbelttrådet struktur vil bli dannet mellom to komplementære enkelttrådete nukleinsyrer selv om en er immo-bilisert på en bærer. I Southern hybridiseringsprosedyren oppstår den sistnevnte

situasjonen.

Hybridiseirngsprobe: for å detektere en bestemt DNA sekvens i Southern hybridiseringsprosedyren blir et merket DNA molekyl eller en hybridiseringsprobe reagert til fraksjonert DNA bundet til en bærer så som nylonmembran eller nitrocellulosefilterpapir. Områdene på filteret som inneholder DNA sekvenser komplementære med den merkede DNA proben blir selv merket som en konsekvens av den nye sammensmeltningsreaksjonen. Områdene av filteret som har slik merking kan deretter bli detektert ifølge typen av markør som blir anvendt. Hybridiserings-proben blir generelt dannet ved molekylær kloning av en spesifikk DNA sekvens fra maisgenomet.

Beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt en fremgangsmåte og metoder som muliggjør at polymerasekjedereaksjonen (PCR) kan anvendes for deteksjon av restriksjonsfragmentpolymorfismer (RFP) inkludert lengdepolymorfismer. Foreliggende oppfinnelse omfatter metoder for detektering av RFP, syntetiske oligonukleotider for anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kit omfattende metoder for detektering av RFP og anvendelse av metoder og prosedyrer ifølge oppfinnelsen for avling av planter og dyr, diagnostikk av genetisk arvede sykdommer, identifikasjon av organismer og juridiske vurdering osv.

Foreliggende oppfinnelse angir spesielt metoder for identifikasjon av enten individuelle genomiske restriksjonsfragmenter eller av sett av genomiske restriksjonsfragmenter fra en hvilken som helst organisme, mikroorganisme, plante, dyr eller menneske, som enten er individuelt genetisk koblet til en eller flere bestemte trekk eller som samlet angir et fingerprint av genomet som kan bli anvendt for å identifisere en organisme, en varietet eller et individ.

Den generelle fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling og for identifikasjon av restriksjonsfragmenter innbefatter anvendelse av restriksjonsendonukleaser, ligering av syntetiske oligonukleotider til restriksjonsfragmentene og PCR amplifikasjon av restriksjonsfragmentene (figur 1). Restriksjonsendonukleaser spalter genomiske DNA molekyler ved spesifikke seter, målseter og danner derved restriksjonsfragmenter.

PCR amplifikasjon av restriksjonsfragmenter kan enten man kjenner nukleotidsekvensen til endene av restriksjonsfragmentene eller ikke bli oppnådd ifølge oppfinnelsen ved først å ligere de syntetiske oligonukleotidene (adaptorene) til endene av restriksjonsfragmentene for derved å utstyre hvert restriksjonsfragment med to feller tagger som vil virke som en forankringsbase for primerne anvendt i PCR amplifikasjonen.

Vanligvis produserer restriksjonsenzymene enten butte ender, hvor de terminale nukleotidene til begge trådene er baseparede, eller overhengende ender hvor en av de to trådene rager utover for å tilveiebringe en kort enkelttrådet forlegning (figur 2). Når det gjelder restriksjonsfragmenter med butte ender blir adaptorer anvendt med en butt ende. Når det gjelder restriksjonsfragmenter med overhengende ender blir adaptorer anvendt som har en enkelttrådet forlengelse som er komplementær med den enkelttrådete for-lengelsen av restriksjonsfragmentet. For hver type av restriksjonsfragment blir spesifikke adaptorer anvendt og disse er bare forskjellige i en av endene for å muliggjøre at adaptoren blir ligert til restriksjonsfragmentet. Adaptorene som blir anvendt består av to syntetiske oligonukleotider som delvis er komplementære med hverandre og som har en lengde på omtrent 10 til 30 nukleotider, fortrinnsvis 12 til 22 nukleotider og som danner dobbelttrådete strukturer når blandet sammen i oppløsning. Ved anvendelse av enzymligase blir adaptorene ligert til blandingen av restriksjonsfragmentene. Ved anvendelse av et stort molart overskudd av adaptorer i forhold til restriksjonsfragmenter er man sikker på at alle restriksjonsfragmentene vil bære adaptorer i begge ender. Restriksjonsfragmenter dannet ved hjelp av denne metoden vil bli referert til som taggede restriksjonsfragmenter og metoden vil bli ytterligere referert til som restriksj onsfragmenttagging.

Adaptorene kan nå virke som templater for primerne med karaktertrekkene som definert ovenfor, anvendt i den påfølgende PCR amplifikasjonsreaksjon. I en foretrukket utførel-sesform ifølge oppfinnelsen inneholder restriksjonsfragmentet den samme adaptoren ved begge endene og en enkelt PCR primer kan bli anvendt for å amplifisere restriksjonsfragmentet som illustrert i figur 3. På grunn av at alle restriksjonsfragmentene er tagged på samme måte i et slikt tilfelle er det innlysende at PCR amplifikasjon av en blanding av taggede restriksjonsfragmenter vil amplifisere alle restriksjonsfragmentene på en synkron måte. I en annen utførelsesform ved anvendelse av to forskjellige restriksjonsenzymer for å spalte DNA blir to forskjellige adaptorer ligert til endene av restriksjonsfragmentene. I dette tilfellet kan to forskjellige PCR primere bli anvendt for å amplifisere slike restriksjonsfragmenter. I en annen foretrukket utførelsesform ved anvendelse av to restriksjonsenzymer er adaptoren for én av enzymendene biotinylert. Dette muliggjør at man kan selektere ut av den komplekse blandingen av restriksjonsfragmentene de restriksjonsfragmentene som i det minste bærer en ende for dette restriksjonsenzymet, ved anvendelse av vanlige metoder for isolering av biotinylerte molekyler. Dette trinnet reduserer kompleksiteten til utgangsblandingen av restriksjonsfragmentene og utgjør et anrikningstrinn før PCR amplifikasjonen som derved reduserer i visse tilfeller bakgrunnen. Samtidig amplifikasjon av flere forskjellige fragmenter blir ofte referert til som multipleks PCR. Prinsipp for multipleksrestriksjonsfragmentamplifikasjon er illustrert i figur 4.

Foreliggende oppfinnelse er videre basert på defmisjonen av spesifikt konstruerte primere og spesifikke metoder for å rette PCR amplifikasjonsreaksjonen på en slik måte at en kontrollert amplifikasjon er mulig og i en spesiell utførelsesform ifølge oppfinnelsen på en slik måte at bare en liten undergruppe av taggede restriksjonsfragmenter blir amplifisert.

Generelt tilveiebringer restriksjonsendonukleasespaltninger av genomisk DNA, og spesielt dyr, plante eller human genomisk DNA, meget stort antall av restriksjonsfragmenter. Antall restriksjonsfragmenter avhenger av størrelsen på genomet og av frekvensen på forekomsten av målsetet til restriksj onsendonukleasen i genomet som igjen hovedsa-kelig blir bestemt av antallet nukleotider i målsetet. Antall nukleotider i målsetene til vanlig anvendte restriksjonsendonukleaser varierer fra 4 til 8. Genomstørrelsene til organismene varierer meget fra noen få millioner basepar når det gjelder mikroorganismer til flere billioner basepar for dyr og planter. Antall restriksjonsfragmenter oppnådd etter spaltning av genomiske DNA molekyler med et restriksjonsenzym kan derfor vari-ere fra noen få hundre til flere millioner. Generelt er antall restriksjonsfragmenter så stort at det ikke er mulig å identifisere individuelle restriksjonsfragmenter i genomiske DNA spaltninger fraksjonert ved gelelektroforese. Slike spaltninger danner vanligvis utflytende bånd.

PCR amplifikasjon av taggede restriksjonsfragmenter produserer derfor også utflytende bånd på grunn av at alle fragmentene skal koamplifiseres synkront i PCR reaksjonen. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen som er anvendbar på genomisk DNA med større størrelser er anvendt et generelt prinsipp for å begrense antallet restriksjonsfragmenter som skal bli amplifisert. Dette blir utført ved preselektering av en undergruppe av taggede restriksjonsfragmenter slik at bare et relativt lite antall taggede restriksjonsfragmenter vil bli amplifisert i løpet av PCR amplifikasjonsreaksjonen.

Det selektive prinsippet definert i denne utførelsesformen ifølge oppfinnelsen ligger i konstruksjon av oligonukleotider som blir anvendt som primere for PCR amplifikasjon som illustrert i figur 5.

Taggede restriksjonsfragmenter har følgende generelle struktur: en variabel DNA-sekvens (som tilsvarer restriksjonsfragmentet før tagging), flankert på begge sidene av en

invertert DNA sekvens (konstant sekvens). Den inverte DNA sekvensen (konstant DNA sekvens) består av en del av målsekvensen til restriksjonsendonukleasen og av sekvensen til adaptoren koblet til begge sidene av restriksjonsfragmentet. De variable sekvensene til restriksjonsfragmentene innbefattet mellom de konstante DNA sekvensene er

vanligvis ukjente og har dermed en tilfeldig sekvenssammensetning. Nukleotidsekvensene som flankerer den konstante DNA sekvensen vil dermed være totalt forskjellig i en stor blanding av restriksjonsfragmenter.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor spesifikke PCR primere som omfatter en konstant nukleotidsekvensdel og i utførelsesformen ifølge oppfinnelsen basert på amplifikasjon av en spaltet undergruppe av restriksjonsfragmentene oppnådd, en variabel sek-vensdel. I den konstante sekvensdelen er nukleotidsekvensen konstruert slik at primeren vil fortrinnsvis basepare med den konstante DNA sekvensen til en av DNA trådene ved enden av restriksjonsfragmentet. Den variable sekvensdelen omfatter en tilfeldig valgt nukleotidsekvens varierende fra 1 til 10 valgte baser.

Ekspresjons "varibel sekvens" angir en sekvens bestående av selekterte nukleotider som danner en sekvens som deretter vil forbli konstant for amplifisering av en undergruppe av restriksjonsfragmenter. En bestemt utførelsesform ifølge oppfinnelsen kan flere sekvenser av selekterte baser bli anvendt for å definere flere forskjellige primere. I et slikt tilfelle kan primerne ha samme konstante sekvens og variable sekvenser kan bli dannet av selekterte baser som er forskjellige fra primerne som dermed blir dannet.

Det er tilsetning av disse variable (selekterte) sekvensene til '3 enden av primerne som vil lede preseleksjonen av taggede restriksjonsfragmenter som vil bli amplifisert i PCR trinnet: når PCR reaksjonen blir utført under hensiktsmessige betingelser vil primerne bare initiere DNA syntesen på de taggede restriksjonsfragmentene hvor den variable DNA sekvensen kan basepare nøyaktig med templattråden til det taggede restriksjonsfragmentet, som illustrert i figur 5.

Seleksjonen blir bestemt av antall nukleotider tilstede i den variable sekvensdelen av primeren: selektiviteten til primerne øker med antall nukleotider i den variable (selekterte) sekvensdelen. Det vil også bli anvendt betegnelsen selektive baser for å angi nukleotider i den variable sekvensdelen som dermed viser at seleksjon av disse basene gjør primeren selektiv. Det er å bemerke at et tagged restriksjosfragment bare vil bli amplifisert når de selektive basene av primerne anvendt for å gjenkjenne begge komplementære sekvenser ved enden av fragmentet. Når primeren bare matcher en ende vil amplifikasjonen være lineær istedenfor eksponentiell og produktet vil forbli udetektert.

Det er mulig å på forhånd vurdere grad av selektivitet oppnådd med variable sekvenser med forskjellige antall av selektive baser ved anvendelse av den generelle formelen 4^n, hvor n er lik antall selektive baser: ved anvendelse av en selektiv base en av 16 taggede fragmenter vil bli amplifisert, ved anvendelse av to selektive baser, en av 256, ved anvendelse av tre selektive baser, en av 4.096, ved anvendelse av fire selektive baser, en av 65.536 og osv., vil bli amplifisert. En foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør derfor selektiv amplifisering av en tilfeldig undergruppe av tagged restriksjonsfragmenter fra en hvilken som helst genomisk DNA spaltning uansett antall fragmenter produsert av de anvendte restriksj onsenzymene.

I en foretrukket utførelsesform blir antall selektive nukleotider valgt slik at antallet restriksjonfragmenter som vil bli amplifisiert er begrenset til 5 til 200. Til tross for at dette antallet kan bli beregnet ved å dele antall fragmenter med 4^n er det ikke mulig å utføre en nøyaktig antagelse på grunn av at ikke alle restriksjonsfragmentene kan bli amplifisert med lik effektivitet. I praksis finner man derfor et mindre antall fragmenter av amplifikasjonen enn det som teoretisk er ventet. Det er også bemerke at blandinger av to (eller flere) primere kan bli anvendt. Dette vil muliggjøre amplifikasjon av fragmentene gjenkjent av hver primer og i tillegg, fragmenter som blir gjenkjent av de to primerne. Det er videre å bemerke at seleksjon basert på baseparing mellom de selektive nukleotidene til primeren og det komplementære templatet er under sterk innvirkning av temperaturen valgt for sammensmeltningstrinnet i PCR reaksjonen når denne temperaturen er under eller for nær opp til srneltetemperaturen til primer/templat-komplekset og primerne vil sammensmelte uriktig matchende templatsekvenser som muliggjør at en feil matching oppstår i komplekset. Dette bør unngås på grunn av at det vil føre til amplifikasjon av mange flere fragmenter enn forutsatt og danner mer variable resultater.

PCR produktene oppnådd i henhold til oppfinnelsen kan bli identifisert ved anvendelse av standard fraksjoneirngsmetoder for separering av DNA molekylene i henhold til størrelse, etterfulgt av farging av DNA molekylene med hensiktsmessige midler. Alternativt kan primerne anvendt for PCR amplifikasjonen bli merket med en radioaktiv markør eller fluorescenskromofor som muliggjør identifikasjon av reaksjonsproduktene etter størrelsesfraksjoneringen. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir PCR produktene fraksjonert ved gelelektroforese ved anvendelse av standard gelmatriser så som, men ikke begrenset til, agarose, polyakrylamid eller blandet agarose/polyakrylamid. PCR produktene oppnådd ifølge oppfinnelsen vil videre bli angitt med betegnelsen amplifiserte restriksjonsfragmenter (ARF).

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt for å danne sett av ARF fra restriksjonsspaltninger av et hvilket som helst omfattende genom. Oppfinnelsen muliggjør at antall restriksjonsfragmenter som blir oppnådd blir innstilt i henhold til resolusjonen av gelfraksjoneirngssystemet anvendt for å separere ARF. I en bestemt utførelsesform blir de selektive primerne konstruert for å danne 5 til 10 ARF som deretter blir separert ved agarosegelelektroforese. En annen spesiell utførelsesform innbefatter anvendelse av selektive primere som er konstruert for å produsere 20 til 50 ARF som deretter blir separert på et gelelektroforesesystem med høy oppløsning så som, men ikke begrenset til, polyakrylamidgeler eller blandede polyakrylamid-agarosegeler.

I en foretrukket utførelsesform blir restriksjonsenzymet eller enzymene valgt for å tilveiebringe restriksjonsfragmenter i størrelsesområdet på 20 til 1000 basepar, på grunn av som generelt kjent for PCR amplifikasjon, blir dette fragmentstørrelsesområdet amplifisert mest effektivt. Til tross for at mange fragmenter kan bli fraksjonert på forskjellige standard gelmatriser blir de beste resultatene oppnådd ved fraksjonering på denaturerende polyakrylamidgelsystemer som vanligvis blir anvendt for DNA sekven-siering.

I henhold til oppfinnelsen er forskjellige sett av ARF oppnådd med hver forskjellige selektive primer i PCR amplifikasjonsreaksjonen. Mønstrene for ARF identifisert etter separasjon utgjør unike og fullstendig reproduserbare fingerprint av genomisk DNA: Slike fingerprint kan ha flere anvendelser så som, men ikke begrenset til, juridiske type-bestemmelser, diagnostisk identifikasjon av organismer, identifikasjon av arter, raser, varieteter eller individer. Identifikasjonsnivået vil bli bestemt av graden av likhet (grad av variabilitet) utvist for forskjellige medlemmer av en spesifikk gruppe. Variabiliteten eller likheten blir bestemt utifrå variasjonsgraden i nukleotidsammensetningen til relaterte genomer. Det underliggende prinsippet ifølge oppfinnelsen er at i hvert amplifiserte restriksjonsfragment er to nukleotidsekvenser detekert og blir separert fra hverandre med en gitt avstand, som illustrert i figur 9. Hver av de to nukleotidsekvensene består av to deler: (a) målsetet for restriksjonsendonukleasen og (b) nukleotidsekvensen ved siden av målsetet som er innbefattet i den selektive primeren. I beslektede organismer, arter, varieteter, raser eller individer vil disse sekvenselementene og deres relative avstander bli konservert i større eller mindre grad. Fingerprint utgjør derfor et grunnlag for å bestemme grad av sekvensslektskap mellom genomer. Forskjeller i ARF møns-trene kan derimot bli anvendt for å skjelne genomer fra hverandre. De spesielle for-delene ifølge foreliggende oppfinnelse i forhold til andre metoder for fingerprinting av genomer er den høye resolusjonen som kan bli oppnådd med metoden: flere titalls eller til og med hundrevis ARF kan bli sammenlignet samtidig.

En annen spesiell anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter screening og identifikasjon av restriksjonsfragmentpolymorfismer (RFP). Forandringer i nukleotidsammensetningen til genomisk DNA resulterer ofte i polymorfismer til restriksj onsfrag-menter: innskudd eller delesjoner påvirker størrelsen til restriksjonsfragmentene som inneholder disse (figur 10), nukleotidforandringer kan resultere i eliminering av restriksjonsendonukleasemålsetene eller dannelsen av nye restriksjonsendonuklasemålseter (figur 11). Den mest anvendte teknikken for identifisering av slike forandringer er Southern blot eksperimenter ved anvendelse av klonede DNA prober, en teknikk som vanligvis blir referert til som restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP) deteksjon. Denne teknikken innbefatter omfattende screening av tilfeldig klonede DNA fragmenter i Southern blot eksperimenter for assosierte RFLP blant forskjellige genomer. I henhold til fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse kan RFP bli identifisert direkte ved sammenligning av ARF oppnådd fra forskjellige genomer. I prinsippet er fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelsen mer sensitiv for detektering av RFP på grunn av ikke bare forskjellene i målsetene til restriksjonsendonukleasen blir detektert, men også forskjeller i ved siden av liggende nukleotidsekvenser innbefattet i de selektive PCR primerne. Foreliggende fremgangsmåte utgjør derfor en mye bedre metode for detektering av RFLP.

RFLP blir for tiden anvendt for flere anvendelser inkludert juridiske bestemmelser, registrering av genetiske arvelige sykdommer hos mennesker og registrering av arveligheten til agronomiske trekk innen plante og dyreavling. Det underliggende prinsippet er at hvis visse DNA polymorfismer som er nært koblet med spesifikke genetiske trekk kan bli anvendt for å registrere tilstedeværelsen eller fraværet av spesifikke genetiske trekk.

Ifølge fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelsen kan analyser av ARF mønsteret bli anvendt for å definere genetisk kobling av polymorfe ARF med spesifikke genetiske trekk. Slike polymorfe ARF vil bli ytterligere referert til som amplifiserte fragmentlengdepolymorfismer (AFLP) for å skjelne dem fra RFLP type DNA polymorfismer detektert i Southern blot eksperimenter ved anvendelse av klonede DNA prober.

En bestemt anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter deteksjon av AFLP koblet til spesifikke genetiske trekk. Oppfinnelsen innbefatter analyse av ARF mønstre oppnådd med forskjellige selektive primere i restriksjonsspaltninger av genomisk DNA til nært beslektede individer som utviser forskjeller i spesifikke genetiske trekk og anvendelse av analyseteknikker som kan finne korrelasjoner mellom arving av en eller flere AFLP og fenotypen som vises ved spesifikke genetiske trekk.

En annen foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter anven-deise av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til å identifisere en eller flere spesifikke restriksjonsfragmenter. Et spesifikt restriksjonsfragment kan bli amplifisert fra en kompleks blanding av taggede restriksjonsfragmenter ved først å bestemme nukleotidsekvensen til de første 8-12 basene ved hver ende av restriksjonsfragmentet. Basert på disse sekvensene kan man konstruere to primere med hver 5 til 10 selektive nukleotider som utviser en sekvens som er komplementær til sekvensen som flankerer restriksjonssetet til den komplementære tråden av restriksjonsfragmentet. Ved anvendelse av slike sett av primere kan man etter PCR amplifikasjon oppnå et enkelt amplifisert fragment. Restriksjonsfragmentet anvendt i denne metoden kan være enten et klonet restriksjonsfragment eller et amplifisert restriksjonsfragment. På grunn av at det ikke er mange restriksjonsfragmenter som kan bli meget effektivt amplifisert involverer den foretrukne fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for identifisering av polymorfe DNA markører en første amplifisering av tilfeldig valgte sett av fragmenter og identifisering av AFLP som gir sterke bånd etter PCR amplifikasjon. Disse AFLP kan bli karakterisert ved sekvensering for å danne restriksjonsfragmentspesifikke primere. AFLP vil vanligvis bli isolert ved utspaltning av tilsvarende DNA bånd fra gelen og bestemme nukleotidsekvensene ved begge endene for å etablere sekvensen til de første 5 til 10 nukleotidene ved siden av restriksjonsendonukleasemålsetene. Når disse nukleotidsekvensene er kjent kan restriksjonsfragmentspesifikke primere bli konstruert som bare vil amplifisere et enkelt restriksjonsfragment fra en genomisk DNA spaltning. I denne spesielle utførelsesformen ifølge oppfinnelsen kan et sett av to forskjellige selektive primere bli anvendt for detektering av et spesifikt restriksjonsfragment. I hver av de to selektive primerne til et sett blir de selektive basene valgt slik at de er komplementære til nukleotidsekvensen ved siden av restriksjonsendonueklasemålsetet som illustrert i figur 8. Antall selektive baser som skal bli innbefattet i hver primer avhenger av kompleksiteten til restriksj onsendo-nukleasefragmentblandingen.

PCR teknikken er blitt meget utviklet i de senere årene og er blitt en av de mest anvendte diagnostiske metodene innen helsevesenet. Anvendelsen derav innbefatter blant annet deteksjon av infeksiøse sykdommer og deteksjon av genetisk arvede sykdommer. Hver diagnostisk test er basert på anvendelsen av to spesifikke syntetiske oligonukleotider som blir anvendt som primere i PCR reaksjonen for å oppnå en eller flere DNA fragmenter med spesifikke lengder. Ved sykdomsdeteksjon vil testen detektere tilstedeværelse av så lite som et DNA molekyl pr prøve som angir det karakteristiske DNA fragmentet. I tilfellet av genetisk arvelige sykdommer er primerne konstruert slik at deres produkter kan diskriminere mellom normale alleler og sykdomsalleler. Forskjellen ligger enten på sekvensforskjeller i DNA segmentet i genomet som er komplementært

med primeren eller på avstandsforskjeller mellom de to primerne.

På grunn av at primerne utviser en ekstremt høy grad av spesifisitet er det mulig å registrere forskjellige sykdommer samtidig og er en metode som ofte blir referert til som multipleks PCR. Multipleks PCR metoden lider derimot av begrensninger som omfatter at generelt bare få, 5 til 8, forskjellige trekk kan bli registrert samtidig. Det vitenskape-lige grunnlaget for denne begrensningen er at de optimale betingelsene for PCR amplifikasjon (sammensmeltningstemperatur, Mg+ konsentrasjon, primerkonsentrasjon) varierer betraktelig avhengig av primerparene som blir anvendt. I multipleks PCR må kompromissbetingelser bli etablert slik at alle primerparene gir detekterbare produkter. Sammen med dette fenomenet er det i tillegg fenomenet omfattende sterke forskjeller i amplifikasjonseffektivitet til forskjellige fragmenter. Man har derfor ofte støtt på pro-blemet som innbefatter at produktet av visse primerpar ikke er detekterbare i multipleks PCR reaksjoner.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse unngår stort sett disse begrensnin-gene med multipleks PCR på grunn av at alle primerne anvendt i foreliggende oppfinnelse har en vesentlig del av deres nukleotidsekvens felles. Ved selektering av AFLP er det blitt selektert DNA markører som blir amplifisert med lik effektivitet. Det optimale ved PCR amplifikasjonsbetingelsene for forskjellige selektive primere utviser mye mindre variasjon enn det som observeres med vanlige anvendte sekvensspesifikke primere. Dette betyr et ideelt kompromiss mellom antallet baser i det syntetiske oligonukleotidet som er nødvendig for å oppnå den nødvendige spesifisiteten ved deteksjo-nen av et enkelt DNA fragment med gitt størrelse i et omfattende genom, som er beregnet ovenfor, og lengden og sammensetningen av oligonukleotidet som er optimalt for effektiv PCR amplifikasjon. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer derfor en mye bedre metode for multipleks PCR.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en generell metode for isolering av DNA mar-kører fra et hvilket som helst genom og for anvendelse av slike DNA markører i alle mulige anvendelser ved DNA fingerprinting.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for amplifisering av minst ett restriksjonsfragment ervervet fra et utgangs-DNA, kjennetegnet ved at den omfatter følgende prosess: kutting av nevnte utgangs-DNA med minst én restriksjonendonuklease, for å fragmentere det til restriksjonsfragmenter; (a) ligere restriksjonsfragmentene ervervet ved minst én dobbeltrådet syntetisk oligonukleotid-adaptor som har én ende som er kompatibel og som skal ligeres til én eller begge av endene til restriksjonsfragmentene for derved å produsere "tagged" restriksjonsfragmenter; (b) bringe i kontakt nevnte "tagged" restriksjonsfragmenter under hybridise-ringsbetingelser med minst én oligonukleotidprimer; hvor nevnte primer eller primere inkluderer en nukleotidsekvens-baseparing til en del av målsekvensen til restriksjonsendonukleasen som er tilstede i de "tagged" restriksjonsfragmentene og baseparing til en del av adaptorsekvensen og hvor minst én av nevnte primere inkluderer i dets 3' ende, en selektert sekvens som omfatter minst én nukleotid lokalisert umiddelbart nær nukleotidene som er involvert i dannelsen av nevnte målsekvens, (c) amplifisering av nevnte "tagged" restriksjonsfragmenter hybridisert med nevnte primere eller primere ved tilstedeværelse av de påkrevde nukleotider og DNA-polymerase eller elongering av de hybridiserte primerne sammen med de "taggede" restriksjonsfragmenten, og (d) identifisering eller gjenvinning av amplifiserte eller elongerte DNA-fragmenter som ble produsert i trinn (d).

Oppfinnelsen vedrører videre en oligonukleotidprimer til anvendelse i fremgangsmåten nevnt ovenfor, kjennetegnet ved at den er i stand til å basepare til en nukleotidsekvens som omfatter en adaptorsekvens og del av målsekvensen til en restriksjonsendonuklease, og som umiddelbart i nærheten av den 3' enden av målsekvensen har 1 til 10 selekterte nukleotid(er).

Oppfinnelsen vedrører videre en anvendelse av en dobbeltrådet, syntetisk oligonukleotid ifølge krav 27 eller 28 som kalles "adaptor" for ligering til restriksjonsfragmenter for derved å generere "tagged restriksjonsfragmenter" for etterfølgende amplifisering av en delmengde av de ervervede "tagged" restriksjonsfragmenter, hvor adaptoren har nukleotidsekvenser som delvis er komplementære til hverandre, hvor én av endene til adaptoren er designet slik at den kan ligeres til én eller begge ender av restriksjonsfragmentet.

Oppfinnelsen vedrører videre et kit for amplifisering av minst ett restriksjonsfragment fra utgangs-DNA etter kutting med ett eller flere spesifikke restriksjonsendonukleaser som omfatter:

spesifikk restriksjonsendonuklease eller -endonukleaser,

minst én dobbeltrådet, syntetisk oligonukleotid (adaptor) som har én ende som er kompatibel til å ligeres til én eller begge endene til restriksjonsfragmentene for derved å produsere "tagged" restriksjonsfragmenter fra utgangs-DNA;

en oligonukleotidprimer ifølge det ovenstående.

Oppfinnelsen vedrører også et sett av amplifiserte restriksjonsfragmenter til anvendelse i ovennevnte fremgangsmåte, kjennetegnet ved at de kan erverves ved en prosess som omfatter følgende: kutting av et utgangs-DNA med minst én restriksjonsendonuklease for å fragmentere det til restriksjonsfragmenter; (a) ligere restriksjonsfragmentene ervervet ved minst én dobbeltrådet, syntetisk oligonukleotid-adaptor som har én ende som er kompatibel slik at den kan ligeres til én eller begge av endene til restriksjonsfragmentene for derved å produsere "tagged" restriksjonsfragmenter; (b) bringe i kontakt nevnte "tagged" restriksjonsfragmenter under hybridise-ringsbetingelser med minst én oligonukleotidprimer; hvor nevnte primer eller primere inkluderer en nukleotidsekvens-baseparing til en del av målsekvensen til restriksjonsendonukleasen tilstede i den "tagged" restriksjonsfragmenter og baseparing til en del av adaptorsekvensen og hvor minst én av nevnte primere inkluderer i dets 3' ende en selektert sekvens som omfatter minst én nukleotid lokalisert umiddelbart nært nukleotidene involvert i dannelsen av nevnte målsekvens, (c) amplifisering av nevnte "tagged" restriksjonsfragmenter hybridisert med nevnte primer eller primere ved tilstedeværelse av de påkrevde nukleotider og DNA-polymerase eller elongering av de hybridiserte primerne sammen med de "tagged" restriksjonsfragmentene, og (d) identifisere eller gjenvinne amplifiserte eller elongerte DNA-fragmenter som produsert i trinn (d).

Følgende eksempler og figurer illustrerer oppfinnelsen.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1; SELEKTIVE

RESTRIKSJONSFRAGMENT AMPLIFIKASJON AV TOMAT DNA VED ANVENDELSE AV Pstl

A) Isolering og modifikasjon av DNA

Totalt tomat DNA (Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker) ble isolert fra unge blader som beskrevet av Bernatzski og Tnaksley (Theor. Appl. Genet. 72, 314-321). Vanlig utbytte var 50-100 ug DNA pr gram frisk bladmateriale. DNA ble spaltet med Pstl (Pharmacia) og dobbelttrådet (ds) Pstl-adaptere ble ligert til restriksjonfragmentene ifølge prosedyren beskrevet nedenfor. Disse adaptere hadde følgende struktur:

3TGCA-overhenget i disse adapterene sammensmelter til de utragende endene dannet Pstl. Pstl gjenkjenningssekvensen CTGCAG blir ikke bevart ved ligering av denne adapteren på grunn av at 5'C-residiet er erstattet med A. Ligeringsreaksjonen ble konstruert på en slik måte at sluttresultatet omtrent utelukkende er DNA fragment-til-adapter molekyler. Dette ble oppnådd ved: 1. anvendelse av ikke-fosforylerte adaptere som utelukker adapter-til-adapter ligering, 2. utførelse av ligerings- og restriksjonsreaksjonen på samme tid. Sistnevnte prosedyre resulterer i restriksjon av et hvilket som helst fragment-til-fragmentligeringsprodukt som derved eliminerer disse produktene nesten fullstendig. Adapter-til-fragmentligeringsproduktene kan ikke bli spaltet av restriksjonsenzymet på grunn av at Pstl gjenkjenningssekvensen ikke blir bevart i disse produktene. Reaksjonsbetingelsene som blir anvendt for adapterligering var:

2 ug tomat DNA

0,2 [ig adaptere

20 enheter Pstl

1 enhet T4 DNA-ligase,

10 mM Tris.HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 2 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP

Ligeringsreaksjonen ble utført i et reaksjons volum på 20 ul i 3 timer ved 37°C. Etter adapterligeringen ble ikke-ligerte adaptere fjernet ved selektiv presipitering. For dette ble reaksjonsblandingen øket til 100 [il og NH4AC ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 2,5 M. 100 ul etanol ved -20°C ble tilsatt og blandingen ble inkubert i 5 min ved romtemperatur. DNA ble samlet ved sentrifugering i 10 min ved 14.000 rpm i et avkjølt eppendorf sentrifugerør ved 4°C. DNA pelleten ble vasket en gang med 0,5 ml 70 % etanol ved romtemperatur og oppløst i 40 ul T0.1E (10 mM Tris.HCl pH 8,0,0,1 mM EDTA). DNA ble lagret ved -20°C. Den selektive presipitasjonsprosedyren beskrevet heri fjerner de ikke-ligerte adapterene effektivt fra reaksjonsblandingen, men små DNA fragmenter (_ 200 bp) går også tapt.

B) Amplifikasionsreaksion

DNA preparert ovenfor ble anvendt som templat for amplifikasjon av Pstl-fragmentene. Reaksjonsblandingen for PCR inneholdt:

1 ng templat DNA

150 ng primer

1 enhet Taq DNA polymerase (Perkin Eimer)

200 uM av alle 4 dNTP

10 mM Tris.HCl pH 8,5,1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1H20 til et totalvolum på 50|il.

Reaksjonsblandingen ble belagt med 20 ul lett mineralolje for å forhindre avdampning iløpet av amplifikasjonsreaksjonen. PCR ble utført på en Perkin Eimer DNA Thermal Cycler ved anvendelse av følgende syklusprofil: 1 min ved 94°C, 1 min ved 60°C, en temperaturøkning fra 60<C>C til 72°C med en rate på l°C/5 sek. og 2V% ved 72°C. Totalt 33 sykluser ble utført. Etter reaksjonen ble 20 ul kloroform tilsatt og 10 pil appliserings-farge, i dette tilfellet 50 % sukrose med 0,1 % vekt/vol av fargestoffet Orange G (Merck). Dette ble deretter blandet omhyggelig med reaksjonsblandingen og kort sentri-fugert for å separere den organiske fasen (mineralolje og kloroform) fra reaksjonsblandingen supplementet! med appliseringsfargen. 20 ul av denne reaksjonsblandingen ble analysert på en 1,0 % agarosegel. C) Amplifikasjon av tomat DNA med primere med økende selektivitet

Tomat DNA spaltet med Pstl og tagged med Pstl-adapter ble amplifisert ved anvendelse av betingelsene beskrevet ovenfor. Fire forskjellige primere ble selektert med sekvenser:

Primer 1 er del av topptråden til adapteren anvendt for å modifisere DNA og derfor bør amplifisere alle Pstl-fragmentene. Primer 2 inneholder en del av adaptersekvensen, Pstl-gjenkjenningssekvensen (små bokstaver) og et selektivt nukleotid (uthevet) og skal teoretisk amplifisere omtrent 1/16 del av alle Pstl-fragmentene. Primerne 3 og 4 er lik primer 2, men inneholder 2 og 3 selektive nukleotider og er derfor ventet å amplifisere omtrent 1/256 og 1/4096 av Pstl-fragmentene. En del av reaksjonsblandingene ble analysert på en 1,0 % agarosegel som er vist i figur 11. Kolonnene 1 og 6 ifølge denne figuren inneholder DNA markører og størrelsene er angitt til venstre. Kolonnene 2,3,4 og 5 inneholder PCR oppnådd med primerne 1,2,3 og 4. Resultatene indikerer at bare tilfell-ler med primer med tre selektive nukleotider var antallet amplifiserte fragmenter slik at et klart båndmønster ble oppnådd. De andre tre primerne ga båndmønstre som ikke kunne bli oppløst på agarosegeler på grunn av at for mange PCR produkter ble dannet. Innenfor disse mange PCR produktene er det alltid noen fragmenter som dominerer og sees som bånd på en bakgrunn av utflytende bånd fra andre PCR produkter. Disse ster-kere produktene er sannsynligvis tilstede i høyere kopiantall på tomatgenomet, eller blir amplifisert mer effektivt enn de andre produktene. Det ble antatt at primerne med tre selektive nukleotider måtte bli dannet for å danne et klart båndmønster på agarosegeler på grunn av at det totale antallet av Pstl-fragmentene av tomatgenomisk DNA (20.000 til 100.000).

D) Analyse av amplifiserte fra<g>menter på Southern blot

Amplifiserte fragmenter ble testet på Southern blot for å verifisere at disse fragmentene tilsvarer bona fide restriksjonsfragmenter med samme størrelse. For denne hensikten ble fire individuelle fragmenter oppnådd med primer 4 og kuttet ut av agarosegelen. DNA ble renset for disse gelbitene ved hjelp av absorbsjon på glasskuler (Gene Clean, manufacturer Bio 101), og en del av renset DNA ble reamplifisert for å oppnå omtrent 1 u.g av hver av de fire DNA fragmentene. Reamplifikasjonsreaksj onene ble deretter elektroforert på en 1,0 % preparativ agarosegel og de ønskede fragmentene ble renset. 200 ng av hvert fragment ble merket med (_-32P)dTAP ved anvendelse av et tilfeldig heksa-mer merkingskit ifølge fremgangsmåtene angitt av forhandleren (Boehringer Mannheim). Total tomat DNA ble spaltet med Pstl og elektroforert på en 1,0 % agarosegel. Fire klart separerte kolonner hver inneholdene omtrent 3 (xg spaltet DNA ble anvendt. Deretter ble agarosegelen blottet på en Genescreen+ hybridiserings-membran som angitt av forhandleren (New England Nuclear). Etter blotting ble gelen spaltet i fire biter som hver inneholdt en kolonne av tomat DNA spaltet med Pstl Disse fire bitene ble hver hybridisert til en av de fire DNA probene ifølge prosedyren beskrevet av Klein-Lankhorst et al (Theor. Apll. Genet. 81,661-667). De hybridiserte blottene ble autoradiografert i 40 timer ved anvendelse av Kodak XARS filmer. De oppnådd resultatene viste at alle genomiske DNA fragmentene gjenkjent av de fire DNA probene hadde samme lengde som disse probene. Dette demonstrerte at de amplifiserte fragmentene, anvendt som prober, kom fra fragmentene detektert på blottene.

E) Selektiv amplifikasjon av et enkelt restriksjonsfragment

Tre sett av primere ble konstruert for tre tilsvarende tilfeldige Pstl-fragmenter fra tomatgenomisk DNA hvor sekvensen ved siden av Pstl-gjenkjenningssekvensen var kjent. Sett av primere med fem selektive nukleotider ble dannet som vist nedenfor.

Primersett 1:

Sekvens 1:

Primersett 2:

Sekvens 2:

Primersett 3:

Sekvens 3:

Tomat DNA ble spaltet med Pstl og adaptere ble ligert til endene av restriksj onsfrag-mentene som beskrevet ovenfor. Dette DNA ble anvendt som templat i PCR med primersettene 1 eller 2 eller 3 ved anvendelse av betingelsene som beskrevet i en av de

tidligere seksjonene. Reaksjonsproduktene tii hver PCR ble analysert på en 1,0 % agarosegel. Denne gelen er vist i figur 12. Figur 12 viser 13 kolonner hvor kolonnene 1,2,12 og 13 er DNA markører. Størrelsene i kilobaser til disse markørene er indikert på begge sider av gelen. Kolonnene 3,6 og 9 viser plasmid DNA med hver av de tre Pstl-fragmentene spaltet med Pstl og angir vektorfragmentet, pUC18 (Yanisch-Perron et al, Gene 33, 103-119) og det innskutte Pstl-fragmentet. Kolonnene 4 og 5 viser amplifikasjon med primersett 1 av 5 fg av tilsvarende plasmid DNA og 1 ng av totalt genomisk DNA. Kolonnene 7 og 8 viser amplifikasjon med primersett 2 til plasmid DNA og totalt genomisk DNA og kolonne 10 og 11 viser amplifikasjon med primersett 3. Disse resultatene demonstrerer at det er mulig å amplifisere et enkelt Pstl-fragment ut av en blanding av minst 20.000 fragmenter ved anvendelse av den selektive restriksjonsfragment-amplifikasjonsteknikken med primere som har fem selektive nukleotider.

F) Identifikasjon av DNA polvmorfisme ved anvendelse av SRFA

Ovenfor var det klart demonstrert at med den selektive restriksjonsfragmentamplifika-sjonsteknikken er det mulig å amplifisere restriksjonsfragmenter, enten tilfeldig, eller spesifikke fragmenter når sekvensinformasjonen er tilgjengelig. Det er derfor mulig å lete etter restriksjonssetepolymorfismer mellom to individer av samme art. Dette er beskrevet nedenfor for to tomatlinjer som er meget beslektet, men er forskjellige når det gjelder tilstedeværelse av oppsvulming av planterøtter nematoderesistensgenet, Mi, i en av linjene. Dette Mi-genet kommer fra Lycopersicon peruvianum, en art fjernt beslektet med den spiselige tomaten L.esculentum. Det er blitt innført i L.esculentum-linjen ved kryssing og påfølgende tilbakekryssing 12 ganger til L.esculentum-foreldren og valg av avkom for tilstedeværelse av Mi-genet. De to tomatlinjene er derfor bare forskjellige i en liten del av deres genomiske materiale, dvs. Mi-genet og omgivende region. Mi-regionen ble beregnet å utgjøre mindre enn 1 % av genomet til denne linjen ved anvendelse av klassiske genetiske metoder.

DNA ble isolert fra to tomatlinjer (linje 83M-71392, Mi-sensitive og linje 83M-71398, Mi-resistente, oppnådd fra De Ruiter Seeds, Beliswijk, Nederland) og deretter spaltet med Pstl og utstyrt med adaptere som beskrevet ovnenfor. Et stort antall amplifikasjons-reaksjoner ble utført ved anvendelse av primere som var forskjellige når det gjelder ek-stensjon av selektive nukleotider. Tre selektive nukleotider ble anvendt og bortsett fra enkeltprimere ble også kombinasjoner av to forskjellige primere anvendt. Reaksjonene ble analysert på blandete polyakrylamid/agarosegeler: 2,5 % polyakrylamid og 1,0 % agarosegel ble anvendt, med et forhold mellom akrylamid og bisakrylamid på 20:1. Gelene ble kjørt på en Protean U gelenhet (Biorad) ved anvendelse av spacere på 1,5 mm. Totalt 16 forskjellige primere ble anvendt og ga 16 reaksjoner med en enkeltprimer og 120 reaksjoner med alle mulige kombinasjoner av to primere. Et typisk eksempel på en gel med seks av disse kombiansjonene er vist i figur 13. Kolonnene 1 og 14 fra denne gelen inneholder DNA markører og størrelsene i kilobaser er angitt på den høyre siden av gelen. Kolonnene 2 og 3,4 og 5, 6 og 7 osv. inneholder amplifikasjoner med med en spesifikk primer eller primerpar og to tomatlinjer. Screening for restriksjonssetepolymorfismer ga et antall fragmenter og tre av disse var betydelige og er angitt i kolonnene 9,11 og 12 i figur 13 (indikert med en liten sirkel). Polymorfe bånd i kolonnene 9 og 11 var ventet å være like på grunn av at den samme primeren var tilstede i begge reaksjonene (forskjellen er tilstedeværelse av en andre primer i kolonne 11). To polymorfe fragmenter ifølge kolonnene 11 og 2 ble spaltet ut av gelen og gelbitene ble knust ved å tvinge disse gjennom en 18 gauge nål og DNA ble eluert fra gelbitene ved eluering gjennom diffusjon i 200 ul 100 mM Tris.HCl pH 8,0,10 mM EDTA. 2 ul ble anvendt for reamplifikasjon av disse fragmentene som beskrevet ovenfor. 200 ng av hvert fragment ble gjort buttendet ved anvendelse av T4 DNA polymerase og deretter ligert til 100 ng plasmidvektor pUC18 (Yanisch-Perron et al, Gene 33,103-119) spaltet med Smal. Ligeringsblandingen ble transformert til E.coli og for hvert fragment ble en rekombinant E.coli klon selektert for sekvensanalyse. Alle disse manipulasjonene ble utført ved anvendelse av standard prosedyrer som beskrevet av Sambrook, Fritsch og Maiatis i Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboartory Press, New York).

To tester av primere med 6 selektive nukleotider ble syntetisert basert på sekvensene til disse to fragmentene som beskrevet ovenfor. Hvert fragment var mulig å amplifisere spesifikt ved anvendelse av disse primersettene. Fragmentene ble bare amplifisert fra tomatlinjen som de kom i fra. Disse primersettene utviser samme polymorfisme som opprinnelig er tilstede i primerne med 3 selektive nukleotider anvendt for å finne denne polymorfismen.

EKSEMPEL 2: SELEKTIV RESTRIKSJONSFRAGMENT AMPLIFIKASJON AV TOMAT DNA MED TO RESTRIKSJONSENZYMER

I eksempel 1 er prinsippet med selektiv restriksjonsfragmentamplifikasjon (SRDA) eksemplifisert ved anvendelse av tomat DNA og restriksjonsenzymet Pstl. I dette eksemplet vil SRFA ved anvendelse av to forskjellige restriksjonsenzymer, Pstl og Msel bli illustrert.

Isolering og modifikasjon av DNA

Total tomat DNA ble isolert fra unge blader som beskrevet i eksempel 1. To par av såkalte isogene linjer ble anvendt som DNA kilder, betegnet Gem^ og Gem^, og henholdsvis GCR26 og GCR151. (Disse linjene er beskrevet i følgende referanser: Denby og Williams, [1962], Can. J. Plant Sei. 42,681-685, Smith og Ritchie, [1983], Plant Mol. Biol. Rep. 1,41-45). De to individuelle formene til hvert par av isogene linjer er genetisk meget like, men forskjellige når det gjelder tilstedeværelse av et trekk som gir resistens mot sopp patogenet Verticillium albo-atraum.

Det første trinnet ved modifikasjonen av DNA omfatter restriksjon av DNA med to enzymer Pstl og Msel. Spaltning av DNA og også påfølgende ligering av adapterene til DNA-fragmentene ble utført i samme buffer som var betegnet RL-buffer (restriksjons-ligeringsbuffer) og som inneholdt: 10 mM Tris.HAc/10 mM MgAc/50 mM KAc/t mM DDT, pH 7,5.

Restriksjon av DNA med Pstl og Msel

2,5 ug DFNA

12,5 enheter Pstl (Pharmacia, 10 enheter/ul)

12,5 enheter Msel (N.E. Biolabs, 4 enheter/ul)

5 ul 10 x RL-buffer

H2Otil 50 uJ

Inkubasjon ble utført ved 37°C i 1 time.

Det neste trinnet i modifikasjon av DNA var ligering av adaptermolekylene til endene av DNA fragmentene. Først var det nødvendig å danne hensiktsmessige dobbelttrådete adaptermolekyler.

Preparering av adaptere

For preparering av en oppløsning av 50 pmol/ul av denne adapteren ble 8 ug (1430 pmol) av 16-mer 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 blandet med 7 ug (1430 pmol) 14-mer 5-TACTCAGGACTCAT-3 i et totalvolum på 28,6 ul H2O.

For preparering av en oppløsning av 5 pmol/ul av denne adapteren ble 5,25 [tg (715 pmol) av biotinylert 21-mer 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 blandet med 3,5 [xg (715 pmol) av 14-mer 5-TGTACGCAGTCTAC-3 i et totalvolum på 143 [il H20.

Ligering av adaptermolekvlene

Til spalte DNA ble en blanding av 10 ul tilsatt inneholdene:

1 [il Pstl bio-adapter (= 5 pmol)

1 [il Msel adapter (= 50 pmol)

1,2 [il 10 mM ATP

1 [il 10 x RL-buffer

1 enhet T4 DNA ligase (Pharmacia, 5 enheter/ul)

H20 til 10 ml

Den resulterende reaksjonsblandingen på 60 [il ble inkubert i 3 timer ved 37°C.

Adapterene ble konstruert på en slik måte at restriksj onssetene ikke ble gjenopprettet etter ligeringen. På denne måten ble fragment-til-fragmentligering forhindret på grunn av at fragmentkokatamerer er spaltet, fordi restriksj onsenzymene fortsatt var aktive i løpet av ligeringsreaksjonen. Adapter-til-adapterligeringen var ikke mulig på grunn av at adapterene ikke var fosforylerte (se eksempel 1).

Seleksjon av biotinylerte DNA-fragmenter

Preparering av templat-DNA for SRFA ved anvendelse av to restriksjonsenzymer invol-verte generelt et ekstra trinn som ikke ble anvendt ved anvendelse av SRFA med et enkelt enzym. I dette trinnet ble DNA fragmentene hvortil en biotinylert adapter var ligert ble separert fra alle andre fragmentene. Biotinylerte fragmenter ble separert fra ikke-biotinylerte fragmenter (Msel-Msel-fragmenter) i dette trinnet ved binding til paramagnetiske streptavidinkuler (Dynal). 10 (il kuler ble vasket en gang i 100 ul STEX (100 mM NaCl/10 mM Tris.HCl/1 mM EDT A/0,1 % Triton X-100 pH 8,0) og resuspendert i 140 (il STEX. Kulene ble deretter tilsatt til ligeringsblandingen, til et sluttvolum på 200 [il. Dette ble inkubert i 30 min med forsiktig agitering ved romtemperatur for å forsikre riktig binding av de biotinylerte DNA-fragmentene til kulene. Kulene ble samlet ved å holde rørene inneholdende kulene nære en magnet. Dette forhindret kulene fra å bli pipettert når supernatanten ble overført til et annet rør. Kulene ble vasket en gang og deretter overført til et friskt rør. Deretter ble kulene vasket tre ganger med 200 [il STEX. Til slutt ble kulene resuspendert i 200 ul T01.E (10 mM Tris/0,1 mM EDT A, pH 8,0) og overført til et nytt rør. DNA ble oppbevart ved 4°C.

DNA spaltet med restriksjonsenzymene, utstyrt med adaptere, koblet til paramagnetiske streptavidinkuler og renset fra Msel-Msel-fragmentene dannet som beskrevet ovenfor vil bli referert til som templat-DNA i følgende trinn.

Amplifikasjon av Pstl-Msel-fragmentene

Templat-DNA dannet som beskrevet ovenfor bør inneholde alle Pstl-Msel-fragmenter fra ovennevnte tomatlinjer, og i tillegg en liten mengde av Psel-Psel-fragmenter uten indre Msel-fragmenter. I dette eksperimentet ble et antall av disse Psel-Msel-fragmentene visualisert ved amplifikasjon vesentlig som beskrevet i eksempel 1. Gelanalyser av amplifikasjonsproduktene ble utført på denaturerende akrylamidgeler (Maxam og Gilbert, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74,560-564), på grunn av at typen av fragmenter oppnådd i prosedyren beskrevet i dette eksemplet var mye mindre enn de som er beskrevet i eksempel 1.1 tillegg muliggjorde disse geltypene separasjon på opptil 100 bånd pr kolonne som var omtrent 10 ganger mer enn agarosegelene beskrevet i eksempel 1. Fragmentene ble visualisert ved merking av en av PCR-primerne ved 5'-enden med (_-3<2p>)ATP og polynukleotidkinase.

Merking av PCR <p>rimere

Primeren valgt for merking var 19-mer 5-GATGAGTCCTGAGTAAgaa-3 som ble betegnet Msel-primer-l, og hvor de selektive nukleotideneer vist med små bokstaver. Merkingen ble utført på følgende måte:

3,0 [il 18-mer (fra oppløsningen av 50 ng/ul =150 ng)

5,0 ul (T -<32>P)-ATP (fra oppløsningen av 10 uCi/ul = 50 uCi)

3,0 [il 250 mM Tris.HCl/100 mM MgCl2/50 mM DTT, pH 7,5

0,5 ul T4-kinase (Pharmacia 10 enheter/ul)

18,5 (il H20

Dette ga et totalvolum på 30 [il som ble inkubert ved 37°C i 30 min. For hver PCR ble 1 [il av denne 5' merkede primeren tilsatt.

Totalt 28 PCR ble utført og hver av de 4 templat-DNA ble amplifisert med 7 primerkombinasjoner. Hver primerkombinasjon hadde samme Msel-primer (Msel-primer-l, beskrevet ovenfor), men varierte i valg av Pstl-primer. Totalt 7 forskjellige primere ble valgt (som med Msel-primeren er de selektive nukleotidene indikert med små bokstaver):

Alle PCR-primerene ble løst opp i H20 ved en konsentrasjon på 50 ng/ul.

Amplifikasionsreaksion

PCR-blandingen besto av:

2,0 ul templat-DNA

1,0 (il 5'-merket Msel-primer (5 ng)

0,5 ul umerket Msel-primer (25 ng)

0,6 ul Pstl-primer (30 ng)

2,0 ul 100 mM Tris.HCl/15 mM MgCl2/500 mM KC1, pH 8,5

0,8 ul 5 mM dNTP

0,1 ul Taq polymerase (Cetus Perkin Eimer, 5 enheter/ul)

13,0 ul H20

Alle komponentene av reaksjonen ble tilsatt og grundig blandet og en vesentlig kompo-nent av PCR, generelt enzymet, ble tilsatt til slutt. Deretter ble reaksjonen påbegynt så fort som mulig.

Amplifikasjonene ble utført på en Perkin Eimer 9600 termisk syklering. Sykleringspro-filen var som følger:

Gelanalyse av amplifiserte fragmenter

Reaksjonsproduktene ble sammensmeltet på 4,5 % denaturerende polyakrylamidgeler.

50 x 38 cm geler ble anvendt og gelkassettene for å danne disse gelene ble oppnådd fra Biorad. 100 ml geloppløsning ble anvendt inneholdene 4,5 % vekt/vol akrylamid/0,225 % vekt/vol bisakrylamid(7,5 M urea/50 mM Tris/tO mM borsyre/l mM EDT A, pH 8,3. 100 ml geloppløsning ble blandet med 500 ul 10 % ammoniumpersulfat og 100 ul

TEMED øyeblikkelig før støping av gelen. En Tris/borsyre/EDTA-buffer ble anvendt som elektroforesebuffer og inneholdt: 100 mM Tris/100 mM borsyre/2 mM EDTA, pH 8,3. Reaksjonsblandingene ble blandet med et likt volum (20 fil) 98 % formamid/10 mM EDT A/0,01 % vekt/vol bromfenol blå/0,01 % vekt/vol xylencyanol. De resulterende blandingene ble oppvarmet i 3 min. ved 95°C og deretter hurtig avkjølt på is. 2 ul av hver prøve ble applisert på gelen. Gelene ble kjørt ved konstant kraft på 110 watt for å oppnå en konstant varmeutvikling i løpet av elektroforesen. Under disse betingelsene tilsvarte feltstyrken til gelene 40 til 50 volt/cm.

Resultatene av SRFA reaksjonene er vist i figur 14. Kolonnene er nummerert fra 1 til 28 og inneholder hver gang fire tomatlinjer med en av de 7 primerkombinasjonene. Rekke-følgen til tomatlinjene på gelen er: 1. GCR16, 2. GCR151, 3. Gem<R>, 4. Gems.

Kolonnene 1 til 4 inneholder disse DNA amplifisert med Msel-primer-1 og Pstl-primer-1, kolonnene 5 til 8 inneholder disse DNA amplifisert med Msel-primer-1 og Pstl-primer-2, kolonnene 9 til 12 inneholder disse DNA amplifisert med Msel-primer-1 og PstI-primer-3, kolonnene 13 til 16 inneholder disse DNA amplifisert med Msel-primer 1 og PstI-primer-4, kolonnene 17 til 20 inneholder disse DMA amplifiserte med Msel-primer-1 og PstI-primer-5, kolonnene 21 til 24 inneholder disse DNA amplifisert med Msel-primer-1 og PstI-primer-6, og kolonnene 25 til 28 inneholder disse DNA amplifisert med Msel-primer-1 og PstI-primer-7. Gelen inneholder ingen størrelsesmarkører, men DNA fragmentene som er visualisert tilsvarer ± 200 nukleotider nederst i figuren til ± 500 nukleotider øverst.

EKSEMPEL 3: SELEKTIV RESTRIKSJONSFRAGMENTAMPLIFI RA-SJON AV DNA FRA FORSKJELLIGE LACTUCA ARTER MED TO RESTRIKSJONSENZYMER

I eksempel 2 er prinsippet for selektiv restriksjonsfragment (SRFA) amplifikasjon ved anvendelse av to restriksjonsenzymer eksemplifisert for tomat DNA. I dette eksemplet er det illustrert at lignende resultater blir oppnådd ved anvendelse av DNA fra forskjellige lactuca arter ved anvendelse av de samme to restriksjonsenzymene Pstl og Msel.

Isolering og modifikasjon av DNA

DNA ble isolert som beskrevet i eksempel 1 ved anvendelse av ungt bladmateriale fra forskjellige Lactuca arter. Som angitt nedenfor innbefatter disse plantene en kommersiell salat (L.sativa) art og flere arter av to ville Lactuca arter, L.saligna og L.virosa. Plantene ble vilkårlig tildelt følgende navn:

1. L. saligna, nr 21, plante 1

2. L. saligna, nr 21, plante 2

3. L.saligna, nr 22, plante 1

4. L.saligna, nr 22, plante 2

5. L.virosa, nr 01, plante 1

6. L. virosa, nr 01, plante 2

7. L. virosa, nr 02,

8. L. virosa, nr 03, plante 1

9. L. virosa, nr 03, plante 2

10. L.sativa, en kommersiell hodesalatart

Det genetiske materialet som ble analysert representerte 6 forskjellige plantetyper som inkluderer to forskjellige individer av 4 av disse plantene. Modifikasjon av Lactuca DNA for å danne templater for SFRA ble utført identisk med prosedyren beskrevet i eksempel 2.

Amplifikasjon av Pstl-Msel fragmenter

DNA preparert som beskrevet ovenfor ble anvendt som templater for SRFA reaksjoner. To primerkombinasjoner ble anvendt ved anvendelse av en enkelt Msel-primer og to forskjellige Pstl-primere. Disse primerne (selektive nukleotider angitt med små bokstaver) var:

Amplifikasjon av Pstl-Msel fragmenter ved anvendelse av primeren angitt ovenfor ble utført nøyaktig som beskrevet i eksempel 2 og de dannede fragmentene ble visualisert på denaturerende polyakrylamidgeler som beskrevet i eksempel 2. De oppnådde bånd-mønstrene er vist i figur 15. Kolonnene 1 til 10 viser DNA 1 til 10 amplifisert med Msel-primer i kombinasjon med Pstl-primer-1, kolonnene 11 til 20 viser DNA 1 til 10 amplifisert med Msel-primer i kombinasjon med PstI-primer-2. Størrelsesmarkørene (ikke synlige i denne figuren) i nukleotidene er angitt til høyre for gelen. Forskjellene i båndmønstrene reflekterer forskjellene i slektskapet til de forskjellige plantene.

EKSEMPEL 4: SELEKTIV RESTRIKSJONSFRAGMENT AMPLIFIKASJON AV INNAVLEDE MAISLINJER MED FORSKJELLIGE RESTRIKSJONSENZYMKOMBINASJONER

I eksempel 2 og 3 er prinsippet for selektiv restriksjonsfragment (SRFA) amplifikasjon ved anvendelse av to restriksjonsenzymer eksemplifisert ved anvendelse av tomat DNA og salat (Lactuca arter) DNA. I dette eksemplet vil det bli illustrert at lignende resultater blir oppnådd med mais (Zea mais) linjene. Det vil i tillegg bli illustrert at forskjellige restriksjonsenzymkombinasjoner kan bli anvendt for å oppnå DNA fingerprint fra i dette tilfellet maislinjer.

Isolering og modifikasjon av DNA

To innavlede maislinjer ble anvendt og betegnet 1 og 2. Kilden til disse linjene er irrelevant på grunn av at en hvilken som helst valgt linje ga gode DNA fingerprint ved anvendelse av SRFA. DNA fra disse linjene ble isolert fra ungt bladmateriale som beskrevet av Saghai-Mahoof et al (1984), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81, 8014-8018). Følgende restriksjonsenzymkombinasjoner (EK) ble anvendt for å dannet templat-DNA: PstJ/TaqL EcoRI/Taql, Asel/Taql, Sse8387-I/Taql. Alle enzymene ble oppnådd fra Pharmacia med unntakelse av Asel som ble oppnådd fra New England Biolabs og Sse8387-I som ble oppnådd fra Amersham. Templat-DNA ble dannet vesentlig som beskrevet i eksemplene 2 og 3 med følgende unntakelser:

Spaltning av DNA ble utført ved først å inkubere med Taql ved 65°C i 1 time og deretter inkubere med det andre enzymet, PstL Asel, EcoRI eller Sse8387-I i ytterligere 1 time ved 37°C. Ligering av adapterene var som beskrevet i eksempel 2 ved anvendelse av følgende adaptere:

Amplifikasjon av restriksjonsfragmenter

Amplifikasjon av restriksjonsfragmentene ble utført som beskrevet i eksempel 2. Primerne selektert for merking av amplifikasjonsproduktene var følgende Taql-primere med 3 selektive nukleotider (indikert med små bokstaver):

Disse 4 primerne ble anvendt for deteksjon av amplifikasjonsproduktene med alle fire enzymkombinasjonene. For hver enzymkombinasjon ble 4 primere for det andre enzymet valgt for å tilveiebringe totalt 16 kombinasjoner for hvert enzym. Disse primerne er angitt nedenfor (selektive nukleotider er vist med små bokstaver). For EcoRI og Asel ble primere med 3 selektive nukleotider valgt, for Pstl-primere ble 2 selektive nukleotider valgt og for Ssel-primere ble et enkelt selektert nukleotid valgt. For enzymer spaltet mindre frekvent i genomisk mais DNA ble primere selektert inneholdende ekstensjoner med færre selektive nukleotider.

Totalt 128 PCR ble utført (2 DNA x 4 enzymkombinasjoner x 16 primerkombinasjoner) ifølge protokollen beskrevet i eksempel 2. Reaksjonsproduktene til disse PCR ble analysert på tre geler (inneholdene 48 kolonner/gel) som beskrevet i eksempel 2. Alle primerkombinasjonene ga DNA fingerprint på 50 til 100 bånd pr kolonne, med unntakelse for kombinasjon SseLTaql som bare ga 10 til 15 bånd pr kolonne. Et eksempel på et av gelene er vist i figur 16. Denne figuren viser en del av gelen med analyse av DNA fingeravtrykk oppnådd med enzymkombinasjonene Pstl/Taql og EcoRI/Taql. Kolonnene 1 til 8 viser DNA-fingerprint av to mais DNA oppnådd ved SRFA med TaqI-primer-3 og Pstl-primer-1, -2, -3 og -4, kolonnene 9 til 16 viser DNA fingeravtrykk av to mais DNA oppnådd ved SRFA med TaqI-primer-4 og Pstl-primerene-l, -2, -3 og -4, kolonne 17 viser størrelsesmarkør lambda-DNA spaltet med Pstl, idet størrelsene til noen av fragmentene i nukleotidene er angitt til høyre og kolonnene 18 til 25 viser DNA fingeravtrykk av to mais DNA oppnådd ved SRFA med Taql-primer-l og EcoRI-primerene-1, - 2, -3 og -4.

EKSEMPEL 5: SELEKTIVT RESTRIKSJONSFRAGMENT AV BAKTERIELL DNA

I eksempel 2, 3 og 4 er prinsippet for selektiv restriksjonsfragment (SRFA) amplifikasjon ved anvendelse av to restriksjonsenzymer eksemplifisert for tomat, salat (Lactuca arter) og mais DNA. I dette eksemplet vil det bli vist at denne teknikken kan også bli anvendt for å karakterisere bakteriell DNA. Et antall Xanthomonas campestris arter ble oppnådd fra Laboratory of Micorbiology i Gent, Belgia, for å illustrere anvendbarheten av teknikken i bakterier.

Isolering og modifikasjon av DNA

Alle DNA ble dannet fra Xanthomonas campestris stammer isolert fra forskjellige opp-hav og for det meste fra infiserte planter. Disse stammene som er nummerert 1 til 26 er angitt nedenfor og kan bli oppnådd fra Laboratory of Microbiology i Gent, Belgia. DNA fra disse bakterielle stammene ble isolert som beskrevet av Marmur (J. Mol. Biol. 3, 208-218). DNA ble spaltet vesentlig som beskrevet i eksempel 4 med unntakelse av at Taql og Apal ble valgt som restriksjonsenzymer. Ligering av adapterene var som beskrevet i eksempel 4 ved anvendelse av følgende adaptere:

Amplifikasjon av restriksjonsfragmentene

Amplifikasjon av restriksjonsfragmentene ble utført som beskrevet i eksempel 2.

primerne selektert for SRFA var Taql-primeren t-CGATGAGTCCTGACCGAg-3 (som har et selektivt nukleotid indikert med små bokstaver) og Apal-primeren 5-GACTGCGTACAGGCCCg-3 (med et selektivt nukleotid indikert med liten bokstav). Apal-primeren ble merket i 5' enden for deteksjon av amplifiserte fragmenter som beskrevet i eksempel 2.

Hvert av 26 DNA ble amplifisert ved anvendelse av primersettet beskrevet ovenfor.

Amplifikasjonsbetingelsene var som beskrevet i eksempel 2 med unntakelse av at de siste 9 syklusene av PCR ble utelatt på grunn av den lavere kompleksiteten til DNA sammenlignet med plante DNA i eksemplene 2,3 og 4.

DNA fingeravtrykkene oppnådd med bakterielle DNA som beskrevet i dette eksemplet er vist i figur 17. Kolonnene 1 til 26 representerer bakterielle DNA 1 til 26. Størrelsene på markør DNA (ikke synlige på gelen) i nukleotidene er vist til høyre for gelen. Denne figuren viser klart at slektskapet til de bakterielle stammene er reflektert ved likheten i båndmønstrene.

EKSEMPEL 6: SELEKTIVE RESTRIKSJONSFRAGMENTAMPLOTKASJO-NER AV DNA FRA FORSKJELLIGE DYR MED TO RESTRIKSJONSENZYMER

I de tidligere eksemplene ble selektiv restriksjonsfragmentamplifikasjon (SRFA) eksemplifisert for plante DNA fra forskjellige kilder. Her illustreres effektiviteten til prosedyren ved anvendelse av tilfeldige DNA prøver oppnådd fra forskjellige husdyr. De testede dyreartene er: Gallus domesticus (kylling), Susscrofa domestica L. (gris), Bos taurus (ku), Equus caballus (hest). Restriksjonsenzymene som ble anvedt er Sse8387Iog Msel.

Isolering og modifikasjon av DNA

DNA ble isolert fra blodprøver ifølge prosedyrene beskrevet av Maniatis et al (1982). DNA prøvene 1 til 3 (kylling), 4 til 7 (gris), 8 til 11 (ku) og 12 til 15 (hest) ble spaltet med restriksjonsenzymene Sse8387I og Msel. DNA fragmentene ble ligert til adaptere som beskrevet i eksempel 2. På grunn av at restriksjonsenzymene Sse8387I og Pstl danner kompatible 3' overheng kan det anvendes Pstl- og Msel-adapter som beskrevet i eksempel 2.

Amplifikasjon av restriksjonsfragmentene

Templat DNA angitt ovenfor og dannet som beskrevet i eksempel 2 virker som templater i SRFA reaksjonene. Primerkombinasjonene anvendt besto av en enkelt Msel-primer og forskjellige Ssel-primere:

Amplifikasjon av Sse8387I-MseI fragmentene ved anvendelse av primerparene beskrevet ovenfor ble utført ved anvendelse av protokollen beskrevet i eksempel 2. Reaksjonsproduktene ble kjørt på denaturerende polyakrylamidgeler også beskrevet i eksempel 2. En autoradiograf som viser fingerprint av ovennevnte prøver er vist i figur 18. Kolonnene 1 til og med 15 viser fingerprint av DNA 1 til 15 amplifisert med Msel-primer paret med Sse8387I-primer-l, kolonne 16 til og med 30 viser lignende mønstre oppnådd med Msel-primeren kombinert med Sse8387I-primer-2. Forskjeller i fingerprint mellom dyrene til en art reflekterer heterogenisiteten i dyrepopulasjonene og de totale mønstrene er karakteristisk for en spesiell art.

I en spesiell utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse beskrives en fremgangsmåte for kontrollert amplifikasjon av minst en del av et utgangs DNA som inneholder en mengde restriksjonsseter for en bestemt spesifikk restriksjonsendonuklease og hvor minst en del av nukleinsyresekvensen er ukjent, idet fremgangsmåten omfatter: (a) spaltning av nevnte utgangs DNA med nevnte spesifikke restriksjonsendonuklease for å fragmentere det til de tilsvarende seriene av restriksjonsfragmenter

som henholdsvis omfatter 5' endene og 3' endene,

(b) hvis ikke 5' og 3' adapterene definert heretter allerede er i separerte former, også

spaltning med nevnte spesifikke endonuklease, en bestemt dobbelttrådet oligo-nukleotidlinker inkludert et enkeltsete innenfor dets egen nukleotidsekvens for nevnte spesifikke endonuklease for derved å spalte nevnte linker i slike 5' og 3' adaptere, (c) ligering av restriksjonsfragmentene oppnådd fra utgangs DNA ved deres 5' og 3' ender med nevnte 3' og 5' adaptere for derved å produsere tagged restriksjonsfragmenter av utgangs DNA, idet fragmentene deretter omfatter de respektive 5' og 3' ender tagger hvor nukleotidsekvensene omfatter de til

3' og 5' adaptorene inkludert nukleotidene involvert i det spesifikke restriksjonssetet, (d) hvis ikke, hvor hensiktsmessig for å tilveiebringe egnede templater for primere,

nevnte nevnte 5' og 3' adaptere ble før den foregående ligeringen forlenget ved tilsetting dertil oligonukleotidsegmenter av bestemte og konstante sekvenser ved deres respektive 5' og 3' ender, forlenging, hvor hensiktsmessig for samme hen-sikt, de tilsvarende endene til nevnte tagged restriksjonsfragmenter med nevnte oligonukleotidsegmenter, hvorved tagged restriksjonsfragmenter elongert i

begge ender med nevnte konstante sekvenser blir oppnådd,

(e) kontakting av nevnte tagged, eller, hvor hensiktsmessig, elongerte restriksjonsfragmenter under hybridiserende betingelser med to oligonukleotidprimere, (f) hvori nevnte primere innbefatter sekvenser med samme nukleotidsekvens som de terminale delene av trådene til 5' og 3' endene og nevnte tagged eller, når hensiktsmessig, elongerte restriksjonsfragmenter, som i seg selv er komplementære med trådene som virker som templater for nevnte primere, idet nevnte primere henholdsvis innbefatter nukleotider komplementære med de som er involvert i dannelsen av setet for nevnte bestemte spesifikke restriksjonsendonuklease

i templattråden,

(g) amplifisering av nevnte elongerte restriksjonsfragmenter hybridisert med nevnte primere ved PCR eller lignende teknikker i nærvær av de nødvendige nukleotidene og polymerasen for å forårsake ytterligere elongering av de hybridiserte primerne langs restriksjonsfragmentene til utgangs DNA hvortil nevnte primere opprinnelig hybridiserte i hele deres lengde, og (h) identifisering eller isolering av nevnte sistnevnte fragmenter.

I en spesiell utførelsesform ifølge denne prosessen tilsvarer de terminale nukleotider til minst en av nevnte primere i retningen av elongeringen til det siste av nukleotidene involvert i restriksj onssetet for nevnte spesifikke endonuklease og fremgangsmåten omfatter identifisering eller isolering av restriksjonsfragmentene til nevnte utgangs DNA som er blitt amplifisert.

I en annen bestemt utførelsesform ifølge denne prosessen innbefatter minst av nevnte primere en valgt sekvens omfattende et bestemt antall (en eller flere nukleotider) som utgår utover de siste nukleotidene involvert i restriksjonssetet for nevnte spesifikke endonuklease i retningen til egen elongering innenfor de tilsvarende restriksjonsfragmentene i løpet av amplifikasjonstrinnet.

I en spesifikk utførelsesform av ovennevnte fremgangsmåte inneholder dobbelttrådet DNA linker flere seter for forskjellige spesifikke endonukleaser som alle er forskjellige fra hverandre, idet fremgangsmåten omfatter gjentakelse, på samme utgangs DNA trinnene i fremgangsmåten definert ovenfor med en av disse restriksjonsendonukleasene om enn med en annen av nevnte bestemte spesifikke endonukleaser og ved anvendelse av primere hvor nukleotidsekvensene blir valgt som definert i ovennevnte beskrivelse, men med hensyn til nevnte andre spesifikke endonuklease.

Fremgangsmåten beskrevet ovenfor eller av oligonukleotidet ifølge oppfinnelsen, er hensiktsmessig for identifikasjon av polymorfismer for bestemmelse av DNA med opp-hav fra samme levende arter, f.eks genomisk DNA som er mikrobielt, fra planter eller dyr, inkludert mennesker, eller fragmentene derav, enten alene eller relativt til en tilsvarende bestemt DNA standard, idet anvendelsen omfatter å utsette DNA som studeres for fremgangsmåten eller kontakt av oligonukleotidet ved betingelser som muliggjør amplifikasjon eller elongeringsreaksjon, sammenligning av restriksjonsmønstrene som blir oppnådd begynnende fra hver av nevnte DNA og, eventuelt, av nevnte standard DNA og relatere eksistensen, og, hvor hensiktsmessig, lokaliseringen av DNA polymorfismen til forskjeller observert mellom størrelsene på restriksjonsfragmentene til forskjellige

DNA.

Oppfinnelsen vedrører også et fragmentert DNA hvor de forskjellige fragmentene har sekvenser som alle tilsvarer opprinnelige spaltninger av det ufragmenterte utgangs DNA som de er dannet fra med en lik bestemt spesifikk endonuklease, kjennetegnet ved at alle nevnte fragmenter ble tagged ved deres 5' og 3' ender ved bestemte 3' og 5' adaptorer tilsvarende den spaltede delen av en tilsvarende utgangs DNA linker som opprinnelig innbefattet et enkelt restriksj onssete for nevnte spesifikke endonuklease og eventuelt forlenget med bestemte konstante sekvenser. Det fragmenterte DNA kan være i form av et mønster av migreringsbånd på en egnet bærer, f.eks gelbærer, hvor fragmentene derav innledningsvis er blitt migrert under innvirkning på et elektrisk felt. Det fragmenterte DNA kan også omfatte endedeler innbefattende oligonukleotid kjennetegnet ved følgende sammensetning, begynnende fra 5' enden: (i) en nukleotidsekvens (konstant sekvens) på minst 10 baser, men ikke lenger enn 30 baser, komplementær med en bestemt DNA sekvens anvendt som adaptor,

øyeblikkelig etterfulgt av:

(ii) en nukleotidsekvens komplementær med målsetet til en spesifikk restriksjonsendonuklease anvendt i trinn (a) forutsatt at nukleotidsekvensen eller

deler av denne ikke er innbefattet i (ii), øyeblikkelig etterfulgt av:

(iii) en nukleotidsekvens på minst ett nukleotid, men kortere enn 10 nukleotider, valgt, f.eks med lengde på 1 til 5 nukleotider.

Oppfinnelsen innbefatter videre et kit for fragmentering av bestemt DNA med minst en spesifikk restriksjonsendonuklease i fragmenter og analyser av disse fragmentene omfattende: spesifikk restriksjonsendonuklease;

en dobbelttrådet DNA oligonukleotid linker sammen med et enkeltsete innenfor egen nukleotidsekvens for nevnte spesifikke endonuklease for derved å spalte nevnte linker i henholdsvis tilsvarende 5' og 3' adaptorer, hvori nevnte dobbelttrådete DNA linker har tilstrekkelig størrelse for å tilveiebringe 5' og 3'

deler som deretter kan tilveiebringe templater for PCR primere fra dette kittet; PCR primere som henholdsvis omfatter på den ene siden de samme sekvensene som trådene til 5' og 3' adaptorene komplementære med trådene som virker som templater for nevnte primere hvori nevnte primere videre innbefatter nukleotidene komplementære med de som er involvert i dannelsen av setet for nevnte bestemte

spesifikke restriksjonsendonuklease i templat trådene,

om hensiktsmessig, oligonukleotidsegmenter ved bestemte (konstante) sekvenser for dannelsen av seter med tilstrekkelig lengde for hybridisering med den nevnte primer, for elongering av 5' endene til nevnte 5' adaptorer eller 3' endene av nevnte 3' adaptorer eller begge, før spaltning av nevnte linker av nevnte spesifikke restriksjonsendonuklease for å produsere nevnte 5' og 3' adaptorer, eller alternativt for elongering av taggede fragmenter oppnådd etter ligering av nevnte 5' og 3'

adaptorer til ekstrimetene til nevnte fragmenter av utgangs DNA;

eventuelt en fragmentert DNA standard tilsvarende det bestemte DNA utsatt for en fragmenteirngsstudie, hvorved fragmentene av nevnte standard DNA ble oppnådd ved spaltning av dette med nevnte spesifikke endonuklease.

En spesiell utførelsesform ifølge dette kittet er slik at nevnte oligonukleotidsegementer for elongering av begge nevnte 5' og 3' adaptorer eller 5' og 3<1> ender av tagged DNA fragmenter har identiske nukleotidsekvenser.

Linkeren i kittet inneholder i en annen utførelsesform flere respektive unike seter for spesifikke endonukleaser som alle er forskjellige fra hverandre, idet nevnte kit ytterligere innbefatter primere som tilsvarer hver av 3' og 5' adaptorer dannet ved spaltning av nevnte linker med nevnte forskjellige spesifikke endonukleaser, hvori nevnte primere er som definert i krav 8, med hensyn på 3' og 5' adaptorene som blir produsert i nevnte linker ved spaltning derav ved hver av nevnte spesifikke endonukleaser.

I en bestemt utførelsesform kan kittet omfatte fragmenterte DNA standarder som definert ovenfor med hensyn på tilsvarende spesifikke restriksjonsendonukleaser, hvori hver av nevnte fragmenterte DNA standarder er med hensyn på hver av de bestemte spesifikke restriksjonsenzymene.

Claims

1. Fremgangsmåte for amplifisering av minst ett restriksjonsfragment ervervet fra et utgangs-DNA, karakterisert ved at den omfatter følgende prosess: kutting av nevnte utgangs-DNA med minst én restriksj onendonuklease, for å fragmentere det til restriksjonsfragmenter; (e) ligere restriksjonsfragmentene ervervet ved minst én dobbeltrådet syntetisk oligonukleotid-adaptor som har én ende som er kompatibel og som skal ligeres til én eller begge av endene til restriksjonsfragmentene for derved å produsere "tagged" restriksjonsfragmenter; (f) bringe i kontakt nevnte "tagged" restriksjonsfragmenter under hybridise-ringsbetingelser med minst én oligonukleotidprimer; hvor nevnte primer eller primere inkluderer en nukleotidsekvens-baseparing til en del av målsekvensen til restriksj onsendonukleasen som er tilstede i de "tagged" restriksjonsfragmentene og baseparing til en del av adaptorsekvensen og hvor minst én av nevnte primere inkluderer i dets 3' ende, en selektert sekvens som omfatter minst én nukleotid lokalisert umiddelbart nær nukleotidene som er involvert i dannelsen av nevnte målsekvens, (g) amplifisering av nevnte "tagged" restriksjonsfragmenter hybridisert med nevnte primere eller primere ved tilstedeværelse av de påkrevde nukleotider og DNA-polymerase eller elongering av de hybridiserte primerne sammen med de "taggede" restriksj onsfragmenten, og (h) identifisering eller gjenvinning av amplifiserte eller elongerte DNA-fragmenter som ble produsert i trinn (d).

2. Fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at det i trinn (c) inkluderer primeren eller primerne sekvenser som har samme nukleotidsekvens som de terminale delene av trådene i endene av nevnte "tagged" restriksjonsfragmenter, som inkluderer nukleotidene involvert i dannelsen av målsekvensen for nevnte restriksjonsendonuklease og som inkluderer minst en del av nukleotidene tilstede i de ligerte adaptorene, hvor minst én av nevnte primere inkluderer dets 3' ende en selektert sekvens som omfatter minst én nukleotid lokalisert umiddelbart nært til nukleotidene involvert i dannelsen av målsekvensen for nevnte restriksjonsendonuklease.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det i trinn (c) primer eller primerne perfekt baseparer med en konstant DNA-sekvens sammensatt av en del av målsekvensen til restriksjonsendonukleasen og til sekvensen til adaptoren.

4. Fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 2, karakterisert v e d at minst én primer omfatter en selektert sekvens av 1 til 10 nukleotid(er).

5. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at primerne omfatter 10 til 50 nukleotider, og hvor målsekvensen til restriksjonsendonukleasen omfatter 4 til 8 nukleotider.

6. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 5, karakterisert ved at nukleotidsekvensen til primerne baseparer med adaptorer som omfatter fra 10 til 30 nukleotider.

7. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 6, karakterisert ved at adaptorene er designet på en slik måte at den korresponderende målsekvensen til endonukleasen ikke er gjenopprettet når adaptoren hybridiserer med det "tagged" restriksjonsfragmenter) og hvor primer eller primerne er oligonukleotider som omfatter en konstant sekvens som baseparer perfekt til minst én ende av sekvensen til minst ett "tagget" restriksjonsfragment fra en blanding, hvis konstante sekvens omfatter nukleotider baseparet til en del av målsekvensen for nevnte restriksjonsendonuklease, og minst én av nevnte primere inkluderer ved siden av 3'ende av nukleotidene involvert i dannelsen av nevnte målsekvens, 1 til 10 ytterligere selekterte nukleotider.

8. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 7, karakterisert ved at nukleinsyresekvensen til utgangs-DNA er delvis ukjent.

9. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 8, karakterisert ved at to forskjellige restriksjonsendonukleaser anvendes.

10. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 9. karakterisert ved at alle primerne har samme konstante nukleotidsekvens.

11. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 9, karakterisert ved at en blanding av forskjellige primere anvendes.

12. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 9, karakterisert ved at minsten primer inneholder 1, 2 eller 3 selekterte nukleotider i deres 3' ender.

13. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 11, karakterisert ved at to forskjellige restriksjonsendonukleaser blir brukt i trinn (a) og hvor minst én dobbeltrådet syntetisk oligonukleotidadaptor for én av endonukleasene er biotinylert.

14. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 13, karakterisert ved at minst én primer er merket.

15. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 14, karakterisert ved at antallet av selektive nukleotider er valgt slik at antallet av restriksjonsfragmenter som amplifiseres er begrenset til 5 til 200.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: amplifisering av en delmengde (subset) av restriksjonsfragmenter fra en blanding av genererte restriksjonsfragmenter ervervet fra et utgangs-DNA ved å bruke en fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 15, a) separering av de amplifiserte "tagged" restriksjonsfragmentene, b) identifisering av de amplifiserte restriksjonsfragmentene.

17. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved at nevnte utgangs-DNA som amplifiseres er genomisk DNA fra en biologisk prøve som stammer fra et menneske eller dyr, spesielt et vev eller en blod-prøve.

18. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved at nevnte utgangs-DNA som amplifiseres er genomisk DNA fra en plante, eller plantevev.

19. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved at nevnte utgangs-DNA som amplifiseres er DNA fra en mikroorganisme.

20. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 16, karakterisert ved at identifiseringen av polymorfiet mellom forskjellige utgangs-DNA stammer fra de samme levende artene, som omfatter å identifisere forskjeller som er observert mellom de amplifiserte restriksjonsfragmentene av de forskjellige utgangs-DNA.

21. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved identifisering av polymorfier i genomisk DNA til en mikroorganisme, plante eller dyr, som inkluderer mennesker eller et fragment derav, enten blant dem selv eller relativ til en korresponderende bestemt DNA-standard.

22. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved at den identifiserer DNA-polymorfier assosiert med genetisk nedarvede trekk hos mennesker, DNA-polymorfier assosiert med genetisk nedarvede trekk i dyr, eller for å identifisere DNA-polymorfier assosiert med genetisk nedarvede trekk i planter og for å identifisere DNA-markører basert på slike DNA-polymorfier.

23. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved at den ytterligere omfatter å sammenligne to eller flere amplifiserte eller elongerte DNA-fragmenter identifisert eller gjenvunnet i trinn (e) av nevnte fremgangsmåte for å detektere likheter mellom plante- eller dyrevarieteter, arter, kultivarer, mikroorganismer eller for å evaluere genetiske avstander og karakterisere slike plante- eller dyrevarieteter, arter, kultivarer, mikroorganismer.

24. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved at de amplifiserte eller elongerte DNA-fragmentene som produ-seres i trinn (e) identifiseres eller gjenvinnes som DNA-fingerprinter.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte prosess omfatter å identifisere polymorfier i henhold til krav 23, mellom utgangs-DNA som stammer fra samme levende arter som utviser forskjeller i nevnte genetiske trekk og korrelerer med nevnte polymorfier med fenotype som utvises ved nevnte genetiske trekk.

26. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved at den ytterligere omfatter følgende trinn: (i) isolering av minst ett DNA-fragment identifisert eller gjenvunnet i trinn (e); (j) bestemmelse av nukleotidsekvensen til de første 8-10 nukleotidresidiene som internt er ved siden av målsekvensen til restriksjonsendonukleasen i begge endene til nevnte DNA-fragmenter; (k) designe oligonukleotidprimerne som har en nukleotidsekvens ifølge primerne i trinn (c) ifølge krav 1, hvor den selekterte nukleotidsekvensen omfatter 5 til 10 nukleotidresidier som korresponderer til de første 8-12 nukleotidresidiene internt ved siden av restriksjonssetene i begge ender av nevnte DNA-fragment.

27. Oligonukleotidprimer til anvendelse i fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at den er i stand til å basepare til en nukleotidsekvens som omfatter en adaptorsekvens og del av målsekvensen til en restriksjonsendonuklease, og som umiddelbart i nærheten av den 3' enden av målsekvensen har 1 til 10 selekterte nukleotid(er).

28. Oligonukleotid til anvendelse i fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter nukleotider involvert i dannelsen av en adaptorsekvens og en del av en målsekvens til en restriksjonsendonuklease og umiddelbart i nærheten til 3' ende av målsekvensen, har en 1 til 10 selekterte nukleotid(er).

29. Oligonukleotid ifølge krav 27 eller 28, karakterisert ved at den omfatter 10 til 50 nukleotider, hvor målsekvensen til restriksjonsendonukleasen omfatter 4 til 8 nukleotider.

30. Oligonukleotidet ifølge ethvert av kravene 27 til 29, karakterisert ved at den konstante sekvensen omfatter fra 10 til 30 nukleotider.

31. Oligonukleotidet ifølge ethvert av kravene 27 til 30, karakterisert ved at den omfatter 1, 2 eller 3 selekterte nukleotid(er).

32. Oligonukleotidet ifølge ethvert av kravene 27 til 31, karakterisert ved at det er merket.

33. Anvendelse av en dobbeltrådet, syntetisk oligonukleotid ifølge krav 27 eller 28 som . kalles "adaptor" for ligering til restriksjonsfragmenter for derved å generere "tagged restriksjonsfragmenter" for etterfølgende amplifisering av en delmengde av de ervervede "tagged" restriksjonsfragmenter, hvor adaptoren har nukleotidsekvenser som delvis er komplementære til hverandre, hvor én av endene til adaptoren er designet slik at den kan ligeres til én eller begge ender av restriksjonsfragmentet.

34. Anvendelse av en dobbeltrådet, syntetisk oligonukleotid-adaptor ifølge krav 33, hvor adaptoren er designet på en slik måte at restriksjonssetet til restriksjonsfragmentet ikke gjenvinnes etter ligering.

35. Kit for amplifisering av minst ett restriksjonsfragment fra utgangs-DNA etter kutting med ett eller flere spesifikke restriksjonsendonukleaser som omfatter: spesifikk restriksjonsendonuklease eller -endonukleaser, minst én dobbeltrådet, syntetisk oligonukleotid (adaptor) som har én ende som er kompatibel til å ligeres til én eller begge endene til restriksjonsfragmentene for derved å produsere "tagged" restriksjonsfragmenter fra utgangs-DNA; en oligonukleotidprimer ifølge ethvert av kravene 27 til 32.

36. Kit ifølge krav 35, karakterisert ved at det inneholder DNA-polymerase, spesielt Taq-polymerase og/eller dNTP og/eller bufferløsninger.

37. Diagnostisk kit ifølge kravene 35 eller 36 for genetisk analyse, for eksempel for rettsmedisinstyping av mennesker.

38. Kit ifølge kravene 35 eller 36 for gentisk analyse, karakterisert vedå detektere arv av bestemte trekk hos dyr eller trekk hos planter.

39. Et sett av amplifiserte restriksjonsfragmenter til anvendelse i fremgangsmåten ifølge kravl, karakterisert ved at de kan erverves ved en prosess som omfatter følgende: kutting av et utgangs-DNA med minst én restriksjonsendonuklease for å fragmentere det til restriksjonsfragmenter; (e) ligere restriksjonsfragmentene ervervet ved minst én dobbeltrådet, syntetisk oligonukleotid-adaptor som har én ende som er kompatibel slik at den kan ligeres til én eller begge av endene til restriksjonsfragmentene for derved å produsere "tagged" restriksjonsfragmenter; (f) bringe i kontakt nevnte "tagged" restriksjonsfragmenter under hybridise-ringsbetingelser med minst én oligonukleotidprimer; hvor nevnte primer eller primere inkluderer en nukleotidsekvens-baseparing til en del av målsekvensen til restriksjonsendonukleasen tilstede i den "tagged" restriksjonsfragmenter og baseparing til en del av adaptorsekvensen og hvor minst én av nevnte primere inkluderer i dets 3' ende en selektert sekvens som omfatter minst én nukleotid lokalisert umiddelbart nært nukleotidene involvert i dannelsen av nevnte målsekvens, (g) amplifisering av nevnte "tagged" restriksjonsfragmenter hybridisert med nevnte primer eller primere ved tilstedeværelse av de påkrevde nukleotider og DNA-polymerase eller elongering av de hybridiserte primerne sammen med de "tagged" restriksjonsfragmentene, og (h) identifisere eller gjenvinne amplifiserte eller elongerte DNA-fragmenter som produsert i trinn (d).

40. Et sett av amplifiserte restriksjonsfragmenter ifølge krav 39, karakterisert ved at de er tilstede på en gel, en membran eller en film.