ES2147550T5

ES2147550T5 - Amplificacion selectiva de fragmentos de restriccion: procedimiento general para la identificacion de adn.

Info

Publication number: ES2147550T5
Application number: ES92402629T
Authority: ES
Inventors: Marc Zabeau; Pieter Vos
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 1991-09-24
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2012-09-24
Also published as: EP0969102A3; WO1993006239A1; ATE191510T1; NO941064L; CZ298187B6; DE69230873T3; JP2008131947A; AU672760B2; HU223760B1; DK0534858T4; RU2182176C2; IL103267A; CA2119557A1; CZ66994A3; JP2001061486A; ES2299229T3; ES2147550T3; GR3033895T3; PT969102E; AU2662992A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO PARA LA AMPLIFICACION CONTROLADA DE AL MENOS UNA PARTE DE UN ADN DE ARRANQUE QUE CONTIENE UNA PLURALIDAD DE LUGARES DE RESTRICCION PARA UNA ENDONUCLEASA DE RESTRICCION ESPECIFICA DETERMINADA Y DE LOS CUALES AL MENOS UNA PARTE ES UN ACIDO NUCLEICO CONOCIDO. LA APLICACION DE ESTE PROCESO PARA IMPRIMIR CON LOS DEDOS EL ADN DE SERES HUMANOS, ANIMALES O PLANTES, PARA LA IDENTIFICACION DE POLIMORFISMOS LARGOS DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION. KIT PARA LA APLICACION DEL PROCESO.

Description

Amplificación selectiva de fragmentos de restricción: procedimiento general para la identificación de ADN.

1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a aplicaciones de identificación del ADN y al uso de marcadores de ADN en varios campos diferentes que incluyen, pero sin limitación, la reproducción de plantas y animales, la identificación de variedades o de variedades de cultivo, la medicina de diagnóstico, la diagnosis de enfermedades en animales y plantas, la identificación de enfermedades heredadas genéticamente en los seres humanos, el análisis de relaciones familiares, el análisis forense y la tipificación microbiana.

Más específicamente, esta invención se refiere a procedimientos para la identificación del ADN y para detectar marcadores de ADN específicos en genomas de organismos que varían desde los microorganismos hasta las plantas superiores, los animales y los seres humanos. La invención también se refiere a moléculas de ADN sintéticas y a productos basados en las mismas que se usan en los procedimientos de la invención en los diferentes campos de aplicación.

2. Antecedentes de la invención 2.1. Identificación del ADN

La identificación del ADN o la tipificación del ADN, así como otros procedimientos de determinación del genotipo, el perfilado y el análisis de identificación del ADN, se refieren a la caracterización de las analogías o de una o más características distintivas en el componente genético o genoma de un individuo, de una variedad o raza o de una especie. La regla general es que cuanta más relación genética hay, mayor es la identidad o más apropiada es la semejanza de los genomas y, por consiguiente, más raras serán las características distintivas en el genoma. Estas características similares o distintivas pueden revelarse analizando el ADN de un organismo después de fragmentar el ADN con una endonucleasa de restricción. Las endonucleasas de restricción son enzimas que reconocen secuencias cortas de nucleótidos, normalmente con una longitud de 4 a 8 bases, y escinden las dos cadenas de ADN produciendo de esta forma fragmentos de ADN de longitud discreta. A causa de su alto grado de especificidad de secuencia, las endonucleasas de restricción escindirán las moléculas de ADN de una forma más específica. El resultado es que se produce una serie de reproducible de fragmentos de ADN. Los fragmentos de ADN pueden fraccionarse según su longitud sobre matrices porosas, o geles, produciendo modelos típicos de bandeo que constituyen una huella de identidad del ADN del componente genético del organismo.

2.2. Polimorfismos del ADN

Cuando se comparan las identidades genéticas de especies, variedades o razas muy relacionadas, las huellas de identificación del ADN pueden ser idénticas o muy similares. Cuando se observan diferencias dentro de huellas de identidad del ADN por lo demás idénticas, tales diferencias se denominan polimorfismos de ADN: éstos son nuevos fragmentos de ADN que aparecen en una huella de identidad. Se dice que el ADN es polimórfico en esta posición y el nuevo fragmento de ADN puede usarse como un marcador de ADN. Pueden producirse polimorfismos de ADN detectados en huellas de identidad de ADN obtenidas por escisión con enzimas de restricción, por cualquiera de las siguientes alteraciones en la secuencia de ADN: mutaciones que eliminan el sitio diana de endonucleasas de restricción, mutaciones que crean nuevos sitios diana, inserciones, deleciones o inversiones entre los dos sitios de restricción.

Tales polimorfismos de ADN generalmente se denominan RFLP, Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción. Tales cambios mutacionales se comportarán como marcadores genéticos fiables cuando se hereden de una forma mendeliana. Por consiguiente, los polimorfismos de ADN pueden usarse como marcadores genéticos de la misma forma que otros marcadores genéticos: en análisis de parentesco, en estudios genéticos sobre en la herencia de rasgos o en la identificación de individuos.

2.3. Técnicas de identificación del ADN

Para casi todos los organismos vivos, excepto los virus, la digestión de restricción del ADN genómico total de los organismos produce tantas bandas que no es posible marcar bandas individuales. Por lo tanto, todos los procedimientos para la identificación del ADN se basan en el principio de que sólo se visualiza una pequeña fracción de los fragmentos de ADN para producir un modelo de bandeo sencillo que constituye la huella de identificación del ADN.

El procedimiento utilizado más ampliamente implica la digestión del ADN del organismo con endonucleasas de restricción, la fraccionación de los fragmentos de restricción por electroforesis en gel, la transferencia y unión de los fragmentos de ADN fraccionados sobre membranas y la hibridación de la membrana con un fragmento de ADN específico ("sonda"). El fragmento de ADN formará moléculas de ADN de doble cadena con el fragmento (o fragmentos) de ADN situados sobre la membrana con secuencias de nucleótidos complementarias. Cuando la sonda se marca un marcador visualizable, el fragmento de ADN al que se une la sonda puede visualizarse. Este procedimiento generalmente recibe el nombre de "hibridación de Southern". Cuando se observan diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción correspondientes a los que se une la sonda en moléculas de ADN genómico muy relacionadas, estas diferencias se denominan polimorfismos de ADN, más específicamente polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción. Las diferencias de longitud de los fragmentos de restricción corresponden a las formas alélicas diferentes del locus genético reconocido por la sonda de ADN. Aunque el procedimiento de hibridación de Southern para la identificación del ADN se ha usado ampliamente, el procedimiento es laborioso y requiere mucho tiempo.

Además, el procedimiento tiene baja resolución y, por lo tanto, sólo puede usarse para evaluar loci individuales o en unos pocos loci como máximo en una sola reacción.

2.4. Reacción en cadena de la polimerasa

La técnica de Reacción en Cadena de la Plimerasa (PCR) es un procedimiento utilizado para sintetizar fragmentos específicos de ADN in vitro. El procedimiento se basa en el uso de oligonucleótidos específicos que se unirán a secuencias únicas presentes en una molécula de ADN y de una ADN polimerasa termoestable. Los oligonucleótidos están diseñados de tal forma que puedan recombinarse con las cadenas opuestas del ADN y servir como cebadores en una reacción de síntesis de ADN de manera que cada uno dirija la síntesis de nuevas cadenas de ADN. Por lo tanto, en una vuelta de síntesis se obtendrá una copia completa de la molécula de ADN entre los cebadores, de forma que el ADN entre los cebadores se duplica. Cada vuelta de síntesis de ADN produce el doble de la cantidad de ADN, obteniéndose por lo tanto la amplificación del ADN comprendido entre los dos cebadores. Por consiguiente, la técnica de PCR permite sintetizar un segmento preciso de ADN usando una pequeña cantidad de "ADN substrato". El documento WO 90/11372 describe la detección de un "nucleótico de ensayo" en una secuencia de ADN conocida. La detección implica el uso de cebadores definidos a partir de la secuencia de ADN adyacente al "nucleótido de ensayo".

El documento WO 90/08821 se refiere a la microdisección de AND cromosómico y a la digestión adicional del ADN obtenido. Los productos de digestión después se unen por ambos extremos a dúplex de oligonucleótidos que se usan para anclar cebadores correspondientes a una de sus cadenas.

3. Resumen de la invención

En la presente invención se ha ideado un nuevo procedimiento para amplificar, con el procedimiento de PCR, fragmentos de restricción obtenidos después de la escisión del ADN de un organismo con al menos una enzima de restricción. En esta nueva aplicación del procedimiento de PCR, los oligonucleótidos usados no están dirigidos contra una secuencia de ADN conocida, sino que están diseñados de tal forma que reconozca los extremos de los fragmentos de restricción. Para este fin es necesario modificar los extremos de los fragmentos de restricción añadiendo engarces de oligonucleótidos (o adaptadores) a tales extremos. La razón de esto es que, normalmente, los extremos de las enzimas de restricción sólo tienen pocos oligonucleótidos en común, es decir, de 2 a 8 nucleótidos, siendo esta longitud demasiado corta para usarse en el diseño de cebadores para la amplificación por PCR.

La invención se basa en el uso de una nueva aplicación de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar uno o más fragmentos de restricción a partir de mezclas complejas de fragmentos de ADN obtenidos mediante la digestión de moléculas de ADN genómico con endonucleasas de restricción. Una ventaja particular de la invención es permitir la amplificación de fragmentos de restricción de ADN en situaciones en las que no se determina la secuencia de nucleótidos de los extremos 5' y 3' de los fragmentos de restricción. En tales casos no pueden definirse los cebadores específicos de secuencia habituales que hibridan con cada cadena de un fragmento de restricción a amplificar y, por lo tanto, no se pueden usar los procedimientos conocidos en la técnica para realizar la amplificación.

El procedimiento de la invención puede usarse, por ejemplo, de dos formas diferentes, conduciendo a dos tipos diferentes de aplicaciones:

(1): Procedimientos para la identificación del ADN de genomas mediante la selección aleatoria de subseries de uno o más fragmentos de restricción o amplificar por la técnica de PCR. La invención también incluye oligonucléotidos sintéticos para uso en dichos procedimientos, y algunas aplicaciones de dichos procedimientos puede ser la tipificación forense, la identificación microbiana, la identificación de variedades, el análisis genealógico y la selección de marcadores de ADN asociados con rasgos genéticos;

(2): Procedimientos para identificar uno o más fragmentos de ADN preseleccionados que pueden ser polimórficos, mediante amplificación por PCR. La invención también incluye oligonucleótidos sintéticos específicos para uso en dichos procedimientos y algunas aplicaciones de dichos procedimientos pueden ser la selección de enfermedades heredadas genéticamente en los seres humanos, el control de la herencia de rasgos agrícolas en la reproducción de plantas y animales y la detección de agentes infecciosos en enfermedades.

4. Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona un esquema gráfico del procedimiento general de la amplificación por PCR de fragmentos de restricción señalizados obtenidos por digestión de moléculas de ADN genómico con una enzima de restricción.

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La Figura 2 representa la unión de adaptadores a diferentes extremos de fragmentos de restricción: extremos nivelados y extremos escalonados.

La Figura 3 representa la amplificación por PCD de fragmentos de restricción señalizados. Las áreas incluidas en recuadros representan los adaptadores que se unen al fragmento de restricción, y los cebadores que se usan en la amplificación por PCR. Las flechas indican la dirección de la síntesis del ADN.

La Figura 4 proporciona un esquema gráfico de la amplificación por PCR de fragmentos de restricción señalizados.

La Figura 5 muestra el diseño general de los cebadores selectivos usados en la amplificación por PCR de fragmentos de restricción señalizados. Los recuadros indican las secuencias repetidas invertidas presente en los extremos de los fragmentos de restricción. La selectividad de los cebadores se ilustra en dos ejemplos en los que hay respectivamente un acoplamiento perfecto y un desacoplamiento total entre la secuencia de bases selectivas y la de ADN molde de fragmento de restricción.

La Figura 6 muestra el principio de amplificación selectiva por PCR usando un cebador de PCR que selecciona moléculas de ADN molde que tienen una secuencia trinucleotídica adyacente a la secuencia del adaptador.

La Figura 7 representa la amplificación selectiva por PCR de fragmentos de restricción señalizados.

La Figura 8 muestra el principio de amplificación específica de fragmentos usando una combinación de dos cebadores de PCR que constan, cada uno, de 6 bases selectivas. Cada cebador forma una estructura de doble cadena en la cadena diferente del fragmento de restricción, por lo tanto, forma un complejo de cebador / molde a partir del cual puede iniciarse la síntesis de ADN (representada por las fechas).

La Figura 9 representa los elementos de secuencia generales que se reconocen con el procedimiento de amplificación con fragmentos de restricción selectivos, incluyendo las dos secuencias de nucleótidos que se reconocen y la distancia que separa las dos secuencias.

La Figura 10 representa los tipos de variaciones de las secuencias de nucleótidos que se detectan en el procedimiento de identificación de polimorfismos con la longitud de fragmentos amplificada.

La Figura 11 muestra un gel de azarosa al 1,0% con el análisis de los resultados de la amplificación de ADN de Tomate sometido a restricción con PstI, usando cebadores cada vez con mayor selectividad.

La Figura 12 muestra un gel de agarosa al 1,0% con el análisis de los resultados de la amplificación específica de 3 fragmentos PstI diferentes de ADN de Tomate, usando cebadores específicos de fragmentos.

La Figura 13 muestra un gel de 2,5% de poliacrilamida/1% de agarosa con huellas de identificación de ADN, obtenidas por amplificación con Fragmentos de Restricción Selectivos de dos líneas de Tomate.

La Figura 14 muestra parte de un gel de poliacrilamida de 4,5%, desnaturalizante, con huellas de identificación de ADN de 4 líneas de Tomate, obtenidas SRFA con la combinación de enzimas PstI/MseI.

La Figura 15 muestra parte del gel de poliacrilamida al 4,5%, desnaturalizante, con huellas de identificación de ADN de 10 líneas de Lactuca, obtenidas usando SRFA con la combinación de enzimas PstI/MseI.

La Figura 16 muestra parte de un gel de poliacrilamida al 4,5%, desnaturalizante, con huellas de ADN de líneas de Maíz, obtenidas usando SRFA con las combinaciones de enzimas PstI/TagI y EcoRI/TagI.

La Figura 17 muestra parte de un gel de poliacrilamida al 4,5%, desnaturalizante, con huellas de identificación de ADN de 26 cepas de Xanthomonas campestres, obtenidas usando SRFA con la combinación de enzimas ApaI/TagI.

La Figura 18 muestra parte de un gel de poliacrilamida al 4,5%, desnaturalizante, con huellas de identificación de ADN de diferentes individuos de 4 animales domésticos: pollo, cerdo, vaca y caballo, obtenidas usando SRFA con la combinación de enzimas SseI/MseI.

5. Descripción detallada de la invención 5.1. Definiciones

En la descripción y en los ejemplos que se presenta a continuación se usan varios términos. Para proporcionar una comprensión clara y consecuente de la especificación y las reivindicaciones, incluyendo el alcance del que dispondrán tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

-: Endonucleasa de Restricción: una endonucleasa de restricción o enzima de restricción es una enzima que reconoce una secuencia de bases específica (sitio diana) en una molécula de ADN de doble cadena, y escindirá las dos cadenas de la molécula de ADN en todos los sitios diana.

-: Fragmentos de Restricción: las moléculas de ADN producidas por digestión con una endonucleasa de restricción se denominan fragmentos de restricción. Cualquier genoma dado se digerirá por una endonucleasa de restricción particular produciendo una serie discreta de fragmentos de restricción. Los fragmentos de ADN que resultan de la escisión con endonucleasas de restricción se separan y detectan por electroforesis en gel.

-: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP): el SFN genómico de dos organismos muy relacionado, por ejemplo, presentará diferencias en su composición de secuencia de nucleótidos en muchos sitios. Cuando estas diferencias existen en el sitio diana para una endonucleasa de restricción, el sitio diana modificado no se escindirá en ese punto. Análogamente, una variación de la secuencia de nucleótidos puede introducir un nuevo sitio diana en un punto en el que no existe tal sitio en el otro organismo, haciendo que el ADN se corte por la enzima de restricción en este punto. Como alternativa, las inserciones o deleciones de nucleótidos que se producen en un organismo entre dos sitios diana para una endonucleasa de restricción, modificarán la distancia entre esos sitios diana. A causa de esto, la digestión de los ADN de los dos organismos producirá fragmentos de restricción con diferentes longitudes. Se obtendrá un polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción producido por la digestión del ADN de los dos organismos.

-: Electroforesis en Gel: para detectar los fragmentos de restricción, se requiere un procedimiento analítico que fracciona las moléculas de ADN de doble cadena basado en el tamaño. La técnica usada con más frecuencia para conseguir tal fraccionación es la electroforesis en gel. La velocidad a la que los fragmentos de ADN se mueven en tales geles depende de su tamaño; así, pues, las distancias recorridas disminuyen según aumentan las longitudes de los fragmentos. Los fragmentos de ADN fraccionados por electroforesis en gel pueden visualizarse directamente por un procedimiento de tinción si el número de fragmentos incluidos en el modelo es pequeño.

-: Oligonucleótidos sintéticos: las moléculas de ADN de una sola cadena que tienen preferiblemente de caso 10 a casi 50 bases, que pueden obtenerse por síntesis químicas, se denominan oligonucleótidos sintéticos. En general, estas moléculas de ADN sintéticas están diseñadas de forma que tienen una sola secuencia de nucleótidos, aunque es posible sintetizar familias de moléculas con secuencias relacionadas y que tienen diferentes composiciones de nucleótidos en posiciones específicas dentro de la secuencia de nucleótidos. El término oligonucleótido sintético se usará para hacer referencia a las moléculas de ADN que tienen una sola secuencia de nucleótidos. El término oligonucleótidos sintéticos mixtos se usará para hacer referencia a familias de oligonucleótidos sintéticos relacionadas.

-: Unión: La reacción enzimática catalizada por la enzima ligasa en la que dos moléculas de ADN de doble cadena se unen covalentemente entre sí se denomina unión. En general, las dos cadenas de ADN se unen covalentemente entre sí, pero también es posible impedir la unión de una de las dos cadenas mediante la modificación química o enzimática de uno de los extremos. En tal caso, sólo se producirá la unión covalente en una de las dos cadenas de ADN.

-: Adaptadores: moléculas de ADN cortas, de doble cadena, con un número limitado de pares de bases, por ejemplo, con una longitud de 10 a 30 pares de bases, que están diseñadas de tal forma que puedan unirse a los extremos de los fragmentos de restricción. Los adaptadores se componen de dos oligonucleótidos sintéticos que tienen secuencias de nuecleótidos que son complementarias en parte entre sí. Cuando se mezclan los dos oligonucleótidos sintéticos, forman una estructura de doble cadena en solución en las condiciones apropiadas. Uno de los extremos de la molécula de adaptador está diseñado de tal forma que pueda unirse al extremo de un fragmento de restricción, y el otro extremo está diseñado de forma que no pueda unirse.

-: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): la reacción enzimática en la que se sintetizan fragmentos de ADN a partir de un ADN sustrato in vitro se denomina PCR. La reacción implica el uso de dos oligonucleótidos sintéticos, que son complementarios a secuencias de nucleótidos presentes en las moléculas de ADN que estás separadas por una corta distancia de algunos cientos a algunos miles de pares de bases, y el uso de una ADN polimerasa termoestable. La reacción en cadena consta, por ejemplo, de una serie de 10 a 30 ciclos. En cada ciclo, el ADN sustrato primero se desnaturaliza a alta temperatura. Después de enfriar los oligonucleótidos sintéticos, los cuales están presentes en un amplio exceso, se formarán estructuras de doble cadena con las moléculas de ADN sustrato en solución en sitios específicos de la molécula de ADN sustrato que tienen secuencias de nucleótidos complementarias. Los complejos de oligonucleótido-ADN sustrato después servirán como sitios de iniciación para la reacción de síntesis de ADN catalizada por la ADN polimerasa, consiguiéndose de esta forma la síntesis de una cadena de ADN complementaria la cadena de ADN sustrato.

-: Amplificación de ADN: el término amplificación de ADN se usará para hacer referencia a la síntesis de moléculas de ADN de doble cadena in vitro usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Los productos de la reacción PCR se denominarán fragmentos de ADN amplificados.

-: Cebadores: en general, el término cebador se refiere a una cadena de ADN que puede cebar la síntesis de ADN. La ADN polimerasa no puede sintetizar ADN de novo sin cebadores; sólo puede prolongar una cadena de ADN existente en una reacción en la que se usa la cadena complementaria como molde para dirigir el orden de los nucleótidos a ensamblar. En el presente documento, las moléculas de oligonucleótidos sintéticos que se usan en la reacción de PCR recibirán el nombre de cebadores.

-: Procedimiento de Hibridación de Southern: el objetivo del procedimiento de hibridación de Southern, también denominado transferencia de Southern, es transferir físicamente ADN fraccionado por electroforesis en gel de agarosa sobre un soporte, tal como una membrana de nailon o papel de filtro de nitrocelulosa, manteniendo al mismo tiempo las posiciones relativas de los fragmentos de ADN que resultan del procedimiento de fraccionación. La metodología usada para realizar la transferencia desde el gel de agarosa al soporte es la extracción del ADN de gel y la introducción en el soporte por acción capilar.

-: Hibridación de ácidos nucleicos: la hibridación de ácidos nucleicos se usa para detectar secuencias de ADN relacionadas por hibridación de ADN de una sola cadena sobre soportes, tales como membranas de nailon o papeles de filtro de nitrocelulosa. Las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de bases complementarias reformarán la estructura de doble cadena cuando se mezclen en solución en las condiciones apropiadas. La estructura de doble cadena se formará entre dos ácidos nucleicos complementarios de una sola cadena si se inmoviliza una sobre un soporte. En el procedimiento de hibridación de Southern, se produce esta última situación.

-: Sonda de Hibridación: para detectar una secuencia de ADN particular en el procedimiento de hibridación de Southern, una molécula de ADN marcada o sonda de hibridación se hace reaccionar con el ADN fraccionado unido a un soporte, tal como una membrana de nailon o un papel de filtro de nitrocelulosa. Las áreas del filtro que llevan secuencias de ADN complementarias a la sonda de ADN marcada quedarán marcadas como secuencia de la segunda reacción de templado Después pueden detectarse las áreas del filtro que presentan tal marcaje según el tipo de marcador usado. La sonda de hibridación generalmente se produce por clonación molecular de una secuencia de ADN específica procedente del genoma de maíz.

Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento para la amplificación por Reacción en Cadena con Polimerasa de al menos un fragmento de restricción obtenido a partir de un ADN de partida que contiene una pluralidad de sitios de restricción para al menos una endonucleasa de restricción determinada específica, procedimiento que comprende:

(a): digerir dicho ADN de partida con al menos una endonucleasa de restricción, para fragmentarlo en fragmentos de restricción;

(b): unir los fragmentos de restricción obtenidos con al menos un adaptador oligonucleotídico sintético de doble cadena que tiene un extremo que es compatible para la unión con uno o los dos extremos de los fragmentos de restricción, obteniéndose de esta forma fragmentos de restricción señalizados;

(c): poner en contacto dichos fragmentos de restricción señalizados, en condiciones de hibridación, con al menos un cebador oligonucleotídico; donde dicho cebador o cebadores incluyen una secuencia de nucleótidos que tiene la misma secuencia de nucleótidos que las partes terminales de las cadenas en los extremos de dichos fragmentos de restricción señalizados, incluyendo los nucleótidos implicados en la formación de la secuencia diana para dicha endonucleasa de restricción y que incluye al menos parte de los nucleótidos presentes en los adaptadores unidos, y donde al menos uno de dichos cebadores incluye en su extremo 3' una secuencia seleccionada que comprende al menos un nucleótido localizado inmediatamente adyacente a los nuecleótidos implicados en la formación de dicha secuencia diana para dicha endonucleasa de restricción,

(d): amplificar dichos fragmentos de restricción señalizados hibridados con dicho cebador o cebadores en presencia de los nucleótidos necesarios y la ADN polimerasa o alargar los cebadores hibridados junto con los fragmentos de restricción señalizados, y

(e): identificar o recuperar los fragmentos de ADN amplificados o alargados producidos en la etapa (d).

5.2. Descripción de las realizaciones preferidas

Más particularmente, esta invención se refiere a un procedimiento y a medios que permiten aplicar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a la detección de polimorfismos de fragmentos de restricción (RFP), incluyendo polimorfismos de longitud. Esta invención comprende procedimientos para detectar RFP, oligonucleótidos sintéticos para uso en los procedimientos de la invención, equipos que comprenden medios para detectar RFP y aplicaciones de los métodos y procedimientos de la invención para la reproducción de plantas y animales, para el diagnóstico de enfermedades heredadas genéticamente, para la identificación de organismos y para la tipificación forense, etc.

Específicamente, esta invención proporciona medios para la identificación de fragmentos de restricción genómicos individuales o de series de fragmentos de restricción genómicos procedentes de cualquier organismo, microorganismo, planta, animal o ser humano, que estén asociados genéticamente de forma individual a uno o más rasgos particulares o que proporcionen colectivamente una huella de identificación del genoma que puede usarse para identificar un organismo, una variedad o un individuo.

El procedimiento general de la invención para la producción e identificación de los fragmentos de restricción implica el uso de endonucleasas de restricción, la unión de oligonucleótidos sintéticos a los fragmentos de restricción y la amplificación por PCR de los fragmentos de restricción (figura 14). Las endonucleasas de restricción escinden las moléculas de ADN genómico en sitios específicos, sitios diana, generando de esta forma fragmentos de restricción.

De acuerdo con la invención, puede conseguir la amplificación por PCR de los fragmentos de restricción, independientemente de si se conoce o no la secuencia nucleótidos de los extremos de los fragmentos de restricción, uniendo primero oligonucleótidos sintéticos (adaptadores) a los extremos de los fragmentos de restricción, proporcionando de esta manera a cada fragmento de restricción dos señales comunes que servirán como base de anclaje para los cebadores usados en la amplificación por PCR.

Típicamente, las enzimas de restricción producen extremos nivelados, en los que los nucleótidos terminales de las dos cadenas forman pares de bases, o extremos escalonados, en los que una de las dos cadenas sobresale proporcionando una corta extensión de una sola cadena (fig. 2). En el caso de los fragmentos de restricción con extremos nivelados, se usan adaptadores con un extremo nivelado. En el caso de fragmentos de restricción con extremos escalonados, se usan adaptadores que tienen una extensión de una sola cadena que es complementaria a la extensión de una sola cadena del fragmento de restricción. Por consiguiente, para cada tipo de fragmento de restricción se usan adaptadores específicos que difieren sólo en uno de los extremos, de forma que se permita la unión del adaptador al fragmento de restricción. Típicamente, los adaptadores usados se componen de dos oligonucleótidos sintéticos que son complementarios en parte entre sí y que normalmente tienen una longitud de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos, preferiblemente de 12 a 22 nucleótidos y que forman estructuras de doble cadena cuando se mezclan en solución. Usando la enzima ligasa, los adaptadores se unen a la mezcla de fragmentos de restricción. Cuando se usa un gran exceso molar de adaptadores con respecto a los fragmentos de restricción, se asegura que todos los fragmentos de restricción terminen llevando adaptadores en los dos extremos. Los fragmentos de restricción preparados con este procedimiento recibirán el nombre de fragmentos de restricción señalizados y el procedimiento se denominará adicionalmente de fragmentos de restricción.

Los adaptadores ahora pueden servir como moldes para los cebadores que tienen las características definidas anteriormente, y usarse en la siguiente reacción de amplificación por PCR. En una realización preferida de la invención, el fragmento de restricción lleva el mismo adaptador en sus dos extremos y, como se ilustra en la fig. 3, sólo puede usarse un cebador de PCR individual para amplificar el fragmento de restricción. Como en tal caso todo los fragmentos de restricción están señalizados de la misma forma, es evidente que la amplificación por PCR de una mezcla de fragmentos de restricción señalizados amplificará todos los fragmentos de restricción de una forma sincrónica. En otra realización que usa dos enzimas de restricción diferentes para escindir el ADN, se unen dos adaptadores diferentes a los extremos de los fragmentos de restricción. En este caso, pueden usarse dos cebadores de PCR diferentes para amplificar tales fragmentos de restricción. En otra realización preferida que usa dos enzimas de restricción, el adaptador para uno de los extremos de las enzimas se somete a biotinilación. Esto permite seleccionar entre la mezcla compleja de fragmentos de restricción los fragmentos de restricción que llevan al menos un extremo para esta enzima de restricción, usando los procedimientos habituales para aislar moléculas biotiniladas. Esta etapa reduce la complejidad de la mezcla de partida de los fragmentos de restricción y constituye una etapa de enriquecimiento previa a la amplificación por PCR, reduciendo con ello en ciertos casos las interferencias. La amplificación simultánea de varios fragmentos diferentes a menudo se denomina PCR múltiplex. En principio de la amplificación de fragmentos de restricción múltiplex se ilustra en la figura 4.

La presente invención se basa además en la definición de cebadores diseñados específicamente y en procedimientos específicos para dirigir la reacción de amplificación de PCR de tal forma que sea posible una amplificación controlada y, en una realización particular de la invención, de tal forma que sólo se amplifique una pequeña subserie de fragmentos de restricción señalizados.

En general, los productos de digestión por la acción de una endonucleasa de restricción de un ADN genómico y, en particular, del ADN genómico de un animal, una planta o un ser humano, produce grandes números de fragmentos de restricción. El número de fragmentos de restricción depende del tamaño del genoma y de la frecuencia de existencia del sitio diana de la endonucleasa de restricción en el genoma, lo cual a su vez se determina principalmente por el número de nucleótidos presentes en el sitio diana. El número de nucleótidos presentes en los sitos diana de las endonucleasas de restricción usadas comúnmente varía entre 4 y 8. Los tamaños del genoma de los organismos varían ampliamente de algunos millones de pares de bases, en el caso de microorganismos, a varios billones de pares de bases, para los animales y las plantas. Por lo tanto, el número de fragmentos de restricción obtenidos después de la escisión de las moléculas de ADN genómico con una enzima de restricción es tan grande que no es posible identificar fragmentos de restricción individuales en los productos de digestión de un ADN genómico fraccionado por electroforesis en gel. Tales productos de digestión normalmente producen una mezcla de bandas.

Así pues, la amplificación por PCR de fragmentos de restricción señalizados también produciría una mezcla de bandas, ya que todos los fragmentos se coamplifican sincrónicamente en la reacción de PCR. En una realización preferida de la invención aplicable a ADN genómicos de grandes tamaños, se ha usado un principio general para limitar el número de fragmentos de restricción que se van a amplificar. Esto se consigue preseleccionando una subserie de fragmentos de restricción señalizados de forma que sólo se amplifique un número relativamente pequeño de fragmentos de restricción señalizados durante la reacción de amplificación por PCR.

El principio selectivo definido en esta realización de la invención reside en el diseño de los oligonucleótidos que se usan como cebadores para la amplificación por PCR, como se ilustra en la figura 5.

Los fragmentos de restricción señalizados tiene l a siguiente estructura general: una secuencia de ADN variable (correspondiente al fragmento de restricción antes de la señalización), flanqueada por los dos lados por una secuencia de ADN invertida (secuencia constante). La secuencia de ADN invertida (secuencia de ADN constante) se compone de parte de la secuencia diana de la endonucleasa de restricción y de la secuencia del adaptador unido a los extremos del fragmentos de restricción. Las secuencias variables de los fragmentos de restricción comprendidas entre las secuencias de ADN constantes normalmente se desconocen y, por lo tanto, tendrán una composición de secuencia aleatoria. Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos que flanquean la secuencia de ADN constante serán totalmente aleatoria en una gran mezcla de fragmentos de restricción.

Por lo tanto, la presente invención proporciona cebadores específicos de PCR que comprenden una parte de la secuencia de nucleótidos constante y, en la realización que se basa en la amplificación de una subserie restringida de los fragmentos de restricción obtenidos, una parte de la secuencia variable. En la parte de la secuencia constante, la secuencia de nucleótidos está diseñada de forma que el cebador forme pares de bases perfectamente con la secuencia de ADN constante de una de las cadenas de ADN en el extremo del fragmento de restricción. La parte de la secuencia variable comprende una secuencia de nuecleótidos elegida aleatoriamente con una longitud que varía de 1 a 10 bases elegidas.

La expresión "secuencia variable" se refiere más exactamente a una secuencia que consta de nucleótidos seleccionados que forman una secuencia que después permanecerá constante para amplificación de una subserie de fragmentos de restricción. En una realización particular de la invención, pueden usarse varias secuencias de bases seleccionada para definir varios cebadores distintos. En tal caso, los cebadores pueden tener la misma secuencia constante y secuencias variables obtenidas a partir de bases seleccionadas que son diferentes entre los cebadores así formados.

Es la adición de estas secuencias variables (seleccionadas) al extremo 3' de los cebadores lo que dirigirá la preselección de los fragmentos de restricción señalizados que se amplificarán en la etapa de PCR: cuando la reacción PCR se realiza en condiciones apropiadas, los cebadores sólo iniciarán la síntesis de ADN en los fragmentos de restricción señalizados en los que la secuencia de ADN variable pueda formar pares de bases perfectamente con la cadena molde del fragmento de restricción señalizado, como se ilustra en la figura 5.

La selección se determina por el número de nucleótidos que residen en la parte de la secuencia variable del cebador: la selectividad de los cebadores aumenta con el número de nucleótidos en la parte de la secuencia variable (seleccionada). También se usará el término bases selectivas para hacer referencia a los nucleótidos de la parte de la secuencia variable, demostrándose de esta forma que la selección de estas bases es lo que hace selectivo al cebador. Tiene que comprenderse que un fragmento de restricción señalizado sólo se amplificará cuando las bases selectivas de los cebadores usados reconozcan secuencias complementarias en los dos extremos del fragmento. Cuando el cebador sólo se empareja con un extremo, la amplificación será lineal en lugar de exponencial, y el producto seguirá sin detectarse.

Es posible estimar de antemano el grado de selectividad obtenido con secuencias variables con diferentes números de bases selectivas usando la fórmula general 4^{2n}, en la que n es igual al número de bases selectivas: usando 1 base selectiva, se amplificará 1 de 16 fragmentos señalizados, usando 2 bases selectivas, 1 de 256, usando 3 bases selectivas, 1 de 4.096, usando 4 bases selectivas, 1 de 65.536, y así sucesivamente. Por lo tanto, una realización preferida de la presente invención permite la amplificación selectiva de una subserie aleatoria de fragmentos de restricción señalizados a partir de cualquier conjunto de productos de digestión de ADN genómico independientemente del número de fragmentos producidos por la enzima de restricción usada.

En una realización preferida, el número de nucleótidos selectivos se elige de horma que el número de fragmentos de restricción a amplificar se limite a 5-200. Aunque este número puede calcularse dividiendo el número de fragmentos por 4^{2n}, no es posible una predicción precisa, porque no todos los fragmentos de restricción pueden amplificarse con igual eficacia. Por lo tanto, en la práctica, se encuentran menos fragmentos de la amplificación de lo que se esperaba teóricamente. También debe indicarse que pueden usarse mezclas de dos (o más) cebadores. Esto permitirá la amplificación de los fragmentos reconocidos por cada cebador y, además, de los fragmentos reconocidos por los dos cebadores. Finalmente, debe indicarse que la selección basada en la formación de pares de bases ente los nucleótidos selectivos del cebador y el molde complementario se ve muy influenciada por la temperatura elegida para la etapa templado en la reacción de PCE; cuando esta temperatura está por debajo o demasiado cerca de la temperatura de fusión del complejo de cebador/molde, los cebadores se recombinarán con secuencias de molde que se han acoplado imperfectamente, permitiendo que se produzca un desacoplamiento en el complejo. Esto debe evitarse, ya que conducirá a la amplificación de muchos fragmentos más de los previstos, produciendo resultados más variables.

Los productos de PCR obtenidos de acuerdo con la invención pueden identificarse usando procedimientos de fraccionación convencionales para separar las moléculas de ADN de acuerdo con el tamaño, seguidos por tinción de las moléculas de ADN con los agentes apropiados. Como alternativa, los cebadores usados para la amplificación por PCR pueden señalizarse con un marcador radiactivo adecuado o con un cromóforo fluorescente, permitiendo así la identificación de los productos de reacción después de la fraccionación por tamaños. En una realización preferida de la invención, los productos de PCR se fraccionan por electroforesis en gel usando matrices de gel convencionales tales como, pero sin limitación, agarosa, poliacrilamida o mezclas de agarosa/poliacrilamida. Los productos de PCR obtenidos de acuerdo con la invención recibirán adicionalmente el término Fragmentos de Restricción Amplificador (ARF).

Los medios y el procedimiento de la presente invención pueden usarse para generar series de ARG a partir de productos de digestión de endonucleasas de restricción de cualquier genoma complejo. La invención permite ajustar el número de fragmentos de restricción obtenidos de acuerdo con la resolución del sistema de gel de fraccionación usado para separar los ARF. En una realización particular, los cebadores selectivos están diseñados para producir de 5 a 10 ARF. En una realización particular, los cebadores selectivos están diseñados para producir de 5 a 10 ARF que después se separan por electroforesis en gel de agarosa. Otra realización particular implica el uso de cebadores selectivos que están diseñados para producir de 20 a 50 ARF que después se separan en un sistema de electroforesis en gel de alta resolución tal como, pero sin limitación, geles de poliacrilamida o geles mixtos de poliacrilamida-agarosa.

En una realización preferida, la enzima o enzimas de restricción se eligen para producir fragmentos de restricción con un intervalo de tamaños de 20 a 1000 pares de bases, porque como es conocido generalmente la amplificación por PCR, este intervalo de tamaños de fragmentos se amplifica con más eficacia. Aunque en diversas matrices de gel convencionales pueden fraccionarse muchos fragmentos, se obtienen los mejores resultados mediante fraccionación en sistemas de gel de poliacrilamida desnaturalizantes como los usados actualmente para la secuenciación del
ADN.

De acuerdo con la invención, en la reacción de amplificación por PCR, se obtienen diferentes series de ARF con cada cebador selectivo diferente. Los modelos de ARF identificados de después de la separación constituyen huellas de identificación únicas y perfectamente reproducibles del ADN genómico. Tales huellas de identificación pueden tener varias aplicaciones tales como, pero sin limitación, la tipificación forense, la identificación de diagnóstico de organismos y la identificación de especies, razas o variables de individuos. El nivel de identificación se determinará por el grado de analogía (el grado de variabilidad) presentado por diferentes miembros de un grupo específico. La variabilidad o analogía se determina por el grado de variación en la composición de nucleótidos de los genomas relacionados. El principio fundamental de la invención es que en cada Fragmento de Restricción Amplificado se detectan dos secuencias de nucleótidos que están separadas entre sí por una distancia dada, como se ilustra en la figura 9. Cada una de las dos secuencias de nucleótidos se compone de dos partes: (a) el sitio diana para la endonucleasa de restricción y (b) la secuencia de nucleótidos adyacente al sitio diana, que está incluida en el cebador selectivo. En organismos, especies, variedades, razas o individuos relacionados, estos elementos de secuencia y sus distancias relativas se conservarán en un mayor o menor grado. Por lo tanto, las huellas de identificación constituyen una base para determinar el grado de relaciones de secuencia entre los genomas. Por otra parte, las diferencias en los modelos de ARF pueden usarse para distinguir genoma entre sí. Las ventajas particulares de la presente invención con respecto a otros procedimientos para la caracterización de genomas es la alta resolución que puede obtenerse con el procedimiento: pueden compararse simultáneamente varias decenas o incluso cientos de ARF.

Otra amplificación particular de la presente invención implica la selección e identificación de polimorfismos de fragmentos de restricción (RFP). Los cambios en la composición de nucleótidos del ADN genómico a menudo producen polimorfismos de fragmentos de restricción: las inserciones o deleciones afectan al tamaño de los fragmentos de restricción que los contienen (figura 10), y los cambios de nucleótidos pueden ocasionar la eliminación de sitios diana de endonucleasas de restricción o la creación de nuevos sitios diana de endonucleasas de restricción. Las técnicas usadas más comúnmente para identificar tales cambios son experimentados de transferencias de Southern que usan sondas de ADN clonadas, una técnica denominada normalmente detección de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Está técnica implica la selección extensiva de fragmentos de ADN clonados aleatoriamente en experimentos de transferencia de Southern para los FFLP asociados entre diferentes genomas. De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, los RFP pueden identificarse directamente comparando los ARF obtenidos a partir de diferentes genomas. En principio, el procedimiento de la presente invención es más sensible para detectar RFP porque no sólo se detectan diferencias en los sitios diana de la endonucleasa de restricción, sino también las diferencias en las secuencias de nucleótidos adyacente comprendidas en los cebadores de PCR selectivos. Por consiguiente, el procedimiento de la presente invención constituye un procedimiento bastante superior para la detección de RFLP.

Los RFLP actualmente se usan para varias aplicaciones que incluyen la tipificación forense, el control de enfermedades hereditarias en los seres humanos y el control de la herencia de rasgos agrícolas en la reproducción de plantas y animales. El principio fundamental es que pueden usarse ciertos polimorfismos de ADN que están muy asociados con rasgos genéticos específicos para controlar la presencia o ausencia de rasgos genéticos específicos.

De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, el análisis de los modelos de ARF puede usarse para definir la asociación genética de ARF polimórficos con rasgos genéticos específicos. Tales ARG polimórficos se denominarán adicionalmente Polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLP®), para distinguirlos de los polimorfismos de ADN de tipo RFLP detectados en experimentos de transferencia de Southern usando sondas de ADN clonadas.

Una aplicación particular de la presente invención implica la detección de AFLP asociados con rasgos genéticos específicos. La aplicación implica el análisis de modelos de ARF obtenidos con diferentes cebadores selectivos en productos de digestión de endonucleasas de restr4icción de ADN genómico de individuos muy relacionados que presentan diferencias en los rasgos genéticos específicos y el uso de técnicas de análisis que pueden encontrar correlaciones entre la herencia de uno o más AFLP® y el fenotipo presentado por los rasgos genéticos específicos.

Una segunda realización preferida de la presente invención implica el uso del procedimiento de la invención para identificar uno o más fragmentos de restricción específicos. Un fragmento de restricción específico puede amplificarse a partir de una mezcla compleja de fragmentos de restricción señalizados determinando primero la secuencia de nucleótidos de las primeras 8-12 bases de cada extremo del fragmento de restricción. Basándose en estas secuencias, se pueden diseñar dos cebadores, cada uno con 5 a 10 nucleótidos selectivos, que presente complementariedad de secuencia con la secuencia que flanquea el sitio de restricción de la cadena complementaria del fragmento de restricción. Usando tales series de cebadores, se puede obtener, después de la amplificación por PCT, un solo fragmento amplificado. El fragmento de restricción usado en este procedimiento puede ser un fragmento de restricción clonado o un fragmento de restricción amplificado. Como no pueden amplificarse de forma muy eficaz muchos fragmentos de restricción, el procedimiento preferido de la invención para identificar marcadores de ADN polimórficos implica primero amplificar una serie elegida aleatoriamente de fragmentos e identificar los AFLP que producen bandas fuertes después de la amplificación por PCR. Estos AFLP® pueden caracterizarse mediante secuenciación para crear cebadores específicos de fragmentos de restricción. Típicamente, el AFLP® se aislará cortando la banda de ADN correspondiente del gel y determinando las secuencias de nucleótidos en los dos extremos para establecer la secuencia de los primeros 5 a 10 nucleótidos adyacentes a los sitios diana de la endonucleasa de restricción. Una vez conocidas estas secuencias de nucleótidos, pueden diseñarse cebadores específicos de fragmentos de restricción que sólo amplificarán un fragmento de restricción procedente de un producto de digestión de ADN genómico. En esta realización particular de la invención, puede usarse una serie de dos cebadores selectivos diferentes para detectar un fragmento de restricción específico. En cada uno de los dos cebadores selectivos de una serie, se eligen las bases selectivas de forma que sean complementarias a la secuencia de nucleótidos adyacente al sitio diana de endonucleasas de restricción, como se ilustra en la figura 8. El número de bases selectivas a incluir en cada cebador depende de la complejidad de la mezcla de fragmentos de endonucleasas de restricción.

La técnica de PCR se ha desarrollado tremendamente durante los últimos años y se está convirtiendo rápidamente en uno de los métodos de diagnostico usados más ampliamente en la sanidad humana. Su aplicación incluye, entre otras cosas, la detección de enfermedades infecciosas y la detección de enfermedades hereditarias. Cada ensayo de diagnóstico se basa en el uso de dos oligonucleótidos sintéticos específicos que se usan como cebadores en la reacción de PCR para obtener uno o más fragmentos de ADN de longitude4s específicas. En la detección de la enfermedad, el ensayo detectará la presencia de una cantidad tan pequeña como una molécula de ADN por muestra, proporcionando el fragmento de ADN característico. En el caso de enfermedades hereditarias, los cebadores se diseñan de tal forma que sus productos puedan distinguir entre alelos normales y enfermos. La distinción se basa en las diferencias de secuencia en el segmento de ADN del genoma que es complementario al cebador o en las diferencias de distancia entre los dos cebadores.

Como los cebadores presentan un grado extremadamente alto de especificidad, el posible controlar diferentes enfermedades simultáneamente, un procedimiento conocido a menudo como PCR múltiplex. Sin embargo, el procedimiento de PCR múltiplex sufre la limitación de que generalmente sólo pueden controlarse de forma simultánea pocos rasgos diferentes, de 5 a 8. La base científica de esta limitación es que las condiciones óptimas para la amplificación por PCR (temperatura de templado, Mg+, concentración de cebadores) varía considerablemente dependiendo de lapo de cebadores usado. En la PCR múltiplex tienen que establecerse las condiciones de compromiso bajo las cuales todos los pares de cebadores produzcan productos detectables. Además, superpuesto a este fenómeno se encuentra el fenómeno de las fuertes diferencias en la eficacia de amplificación de fragmentos diferentes. Por consiguiente, a menudo ha surgido el problema de que no son detectables los productos de ciertos pares de cebadores en reacciones de PCR múltiplex.

Los procedimientos de la presente invención solucionan fundamentalmente estas limitaciones de la PCR múltiplex porque todos los cebadores usados en la presente invención tienen un parte sustancial de su secuencia de nucleótidos en común. Además, mediante la selección de AFLP®, se seleccionan marcadores de ADN que se amplifican con igual eficacia. Por lo tanto, el óptimo de las condiciones de amplificación de PCR para los diferentes cebadores selectivos presenta una variación mucho menor que la que se observa con los cebadores específicos de secuencia usados comúnmente. Fundamentalmente, existe un compromiso ideal entre el número de bases del oligonucleótido sintético que son necesarias para obtener la especificidad requerida de detección de un solo fragmento de ADN de un tamaño dado en un genoma complejo, que se calcula como se ha indicado anteriormente, y la longitud y composición del oligonucleótido que es óptima para la amplificación por PCR eficaz. Así pues, el procedimiento de la invención proporciona un procedimiento bastante superior para las PCR múltiplex.

La presente invención proporciona un procedimiento general para aislar marcadores de ADN a partir de cualquier genoma y para usar tales marcadores de ADN en todas las aplicaciones posibles de identificación del ADN.

Los siguientes ejemplos y figuras proporcionan una ilustración de la invención que, sin embargo, no se limita a estos ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Amplificación selectiva de fragmentos de restricción de ADN de tomate usando PSTI (A) Aislamiento y modificación del ADN

Se aisló ADN total de Tomate (Lycopersicon esculentum c.v. Moneymaker) a partir de hojas jóvenes como se describe por Bernatzski y Tanksley (Theor. Appl. Genet. 72, 314-321). El rendimiento típico fue de 50 a 100 \mug de ADN por gramo de material de hoja fresco. El ADN se dirigió con PstI (Pharmacia) y a los fragmentos de restricción se unieron adaptadores PstI de doble cadena (dc) siguiendo el procedimiento descrito más adelante. Estos adaptadores tenían la siguiente estructura:

5-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3

\hskip4,9cm

3-

\hskip0,4cm

CATCTGACGCATGT

\hskip0,6cm

-5

El saliente 3'TGCA de estos adaptadores se empareja por templado con los extremos escalonados creados por PstI. Tras la unión de esta adaptador no se restaura la secuencia de reconocimiento de PstI CTGCAG, porque el resto C 5' se reemplaza por A. La reacción de unión se diseñó de tal forma que los resultados finales fueran casi exclusivamente moléculas de fragmentos de ADN-adaptador. Esto se consiguió: 1. usando adaptadores no fosforilados, que excluyen la unión de adaptador-adaptador, y 2. realizando la unión y la reacción de restricción al mismo tiempo. El último procedimiento produce la restricción de cualquier producto de unión de fragmento-fragmento, eliminando de esta forma estos productos casi completamente. Los productos de unión de adaptador-fragmento no pueden diferirse por las enzimas de restricción, porque en estos productos no se restaura la secuencia de reconocimiento de PstI. Las condiciones de reacción usadas para la unión del adaptador fueron:

2 mg de ADN de Tomate

0,2 mg de adaptadores

20 unidades de PstI

1 unidad de ADN ligasa de T4

Tris, HAc pH 7,5 10 mM, mga. 10 mM, KAc 50 mM,

Ditiotreitol 2 mM, ATP 0,5 mM

La reacción de unión se realizó en un volumen de reacción de 20 \mul, durante 3 horas a 37ºC. Después de la unión del adaptador, los adaptadores no unidos se retiraron por precipitación selectiva. Para este fin, la mezcla de reacción se aumentó a 100 \mul y se añadió NH4Ac a una concentración final de 2,5 M. Se añadieron 100 \mul de etanol de -20ºC y la mezcla se incubó durante i minutos a temperatura ambiente. El ADN se recogió por centrifugación durante 10 minutos a 14000 rpm en una centrífuga Eppendorf enfriada a 4ºC. El sedimento de ADN se lavó una vez con 0,5 ml de etanol al 70% a temperatura ambiente y se disolvió en 40 \mul de T0,1E (Tris CHl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1mM). El ADN se almacenó a -20ºC. El procedimiento de precipitación selectivo descrito aquí retira los adaptadores no unidos de forma eficaz de la mezcla de reacción, pero también se pierden los fragmentos de ADN pequeños (\leq 200 pb).

B) La reacción de amplificación

El ADN preparado anteriormente se usó como molde para la amplificación de los fragmentos PstI. La mezcla de reacción para la PCR contenía:

1 ng de ADN molde,

150 ng de cebador,

1 unidad de ADN polimerasa de TAq (Perkin Elmer),

los 4 dNTP a una concentración de 200 \muM,

Tris. HCl pH 8,5 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, y

H_{2}O hasta un volumen total de 50 \mul

La mezcla de reacción se cubrió con 20 \mul de aceite mineral ligero para prevenir la evaporación durante la reacción de amplificación. La PCR se realizó en un Aparato de Ciclos Térmicos de ADN de Perkiin Elmer usando el siguiente perfil de ciclos: 1 minuto a 60ºC, un aumento de la temperatura de 60ºC a 72ºC a una velocidad de 1ºC/5 segundos, y 2,5 minutos a 72ºC. Se realizó un total de 33 ciclos. Después de la reacción se añadieron 20 \mul de cloroformo y 10 \mul de colorante de carga, en este caso sacarosa al 50% con un 0,1% p/v del colorante Orange G (Merck). Esto después se mezcló bien con la mezcla de reacción y se centrifugó brevemente para separar la fase orgánica (aceite mineral y cloroformo) de la mezcla de reacción suplementada con el colorante de carga. En un gel de agarosa al 1,0% se analizaron 20 \mul de esta mezcla de reacción.

C) Amplificación de ADN de Tomate con cebadores de selectividad creciente

Se amplificó ADN de Tomate digerido con PstI y señalizado con el adaptador PstI usando las condiciones especificadas anteriormente. Se seleccionaron cuatro cebadores diferentes con las secuencias:

1. 5-CTCGTAGACTGCGTACA-3

\hskip5,2cm

2.

\hskip0,6cm

5-GACTGCGTACAtgcagA-3

\hskip5,2cm

3.

\hskip0,6cm

5-GACTGCGTACAtgcagAC-3

\hskip5,2cm

4.

\hskip0,6cm

5-GACTGCGTACAtgcagACC-3

El cebador 1 es parte de la cadena superior de adaptador usado para modificar el ADN y, por lo tanto, debe amplificar todos los fragmentos PstI. El cebador 2 contiene parte de la secuencia del adaptador, la secuencia de reconocimiento de PstI (letras minúsculas) y un nucleótido selectivo (negritas), y teóricamente debe amplificar aproximadamente 1/16 de todos los fragmentos PstI. Los cebadores 3 y 4 son similares al cebador 2, pero contienen 2 y 3 nucleótidos selectivos respectivamente y, por lo tanto, es de esperar que amplifiquen aproximadamente 1/256 y 1/4096 de los fragmentos PstI. Parte de las mezclas de reacción se analizaron en un gel de agarosa al 1,0%, el cual se muestra en la Figura 11. Las franjas 1 y 6 de esta figura contienen marcadores de ADN, cuyos tamaños se indican a la izquierda. Las franjas 2, 3, 4 y 5 contienen las PCR obtenidas con los cebadores 1, 2, 3 y 4 respectivamente. Los resultados indican que sólo en el caso del cebador con 3 nucleótidos selectivos, al número de fragmentos amplificados fue tal que se obtuvo un modelo de bandas claras. Los otros 3 cebadores proporcionaron modelos de bandas que no pudieron resolverse en geles de agarosa porque se generaron muchos productos de PCR. Dentro de esta gran cantidad de productos de PCR siempre predominan algunos fragmentos, que se ven como bandas sobre una mancha de fondo de los otros productos de PCR. Probablemente, estos productos más fuertes están presentes en mayores números de copias en el genoma del Tomate o se amplifican de forma más eficaz que los otros productos. Se consideró que a causa del número total de fragmentos PstI de ADN genómico de Tomate (de 20.000 a 100.000), tenían que usarse cebadores con 3 nucleótidos selectivos para generar un modelo de bandas claras en geles de agarosa.

D) Análisis de fragmentos amplificados en transferencias de Southern

Los fragmentos amplificados se ensayaron en transferencias de Southern para certificar que estos fragmentos correspondían a fragmentos de restricción auténticos del mismo tamaño. Para este fin, se cortaron del gel de agarosa cuatro fragmentos individuales obtenidos con el cebador 4. El ADN se purificó a partir de estos cortes de gel por medio de absorción en perlas de vidrio (Gene Clean, fabricante Bio 101), y parte del ADN purificado se reamplificó para obtener aproximadamente 1 \mug de cada uno de los cuatro fragmentos de ADN. Las reacciones de reamplificación posteriormente se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa preparativo al 1,0% y se purificaron los fragmentos de ADN deseados. Se marcaron 200 ng de cada fragmento con (\alpha-32P)dATP usando un equipo de marcaje de hexámeros aleatorio de acuerdo con posprocedimientos recomendados por el fabricante (Boehringer Mannheim). El ADN total de Tomate se dirigió con PstI y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0%. Se usaron cuatro franjas separadas claramente que contenían, cada una, aproximadamente 3 \mug de ADN digerido. Después, el gel de agarosa se transfirió a una membrana de hibridación Genescreen+ como se indica por el fabricante (New England Nuclear). Después de la transferencia, el gel se cortó en cuatro cortes, conteniendo cada uno una franja del ADN de Tomate digerida con PstI. Cada uno de estos cuatro cortes se hidridó con una de cuatro sondas de ADN surgiendo el procedimiento descrito por Kein-Lankhorst y cl. (Theor. Apll. Genet. 81, 661-667). Las manchas de transferencia hibridazas se autorradiografiaron guante 40 horas usado películas Kodak XAR5. Los resultados obtenidos demostraron que todos los fragmentos de ADN genómico reconocidos por las cuatro sondas de ADN tenían las misma longitud que estas sondas. Esto demostró que los fragmentos amplificados usados como sondas procedían de los fragmentos detectados en las transferencias.

E) Amplificación selectiva de un solo fragmento de restricción

Se diseñaron tres series de cebadores para 3 fragmentos PstI aleatorios correspondientes procedentes de ADN genómico de tomate, cuya secuencia próxima a la secuencia de reconocimiento PstI se conocía. Se fabricaron series de cebadores con 5 nucleótidos selectivos como se indica a continuación:

\newpage

Serie de cebadores 1:

100

Serie de cebadores 2:

101

Serie de cebadores 3:

102

El ADN de Tomate se digirió con PstI y los adaptadores se unieron a los extremos de los fragmentos de restricción como se ha descrito anteriormente. Este ADN se usó como molde en reacciones PCR con las series de Cebadores 1, 2 ó 3, usando las condiciones descritas en una de las secciones previas. Los productos de reacción para cada PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1,0%. Este gel se muestra en la Figura 12. La Figura 12 muestra 13 franjas de las que las franajas 1, 2, 12 y 13 con marcadores de ADN. A ambos lados del gel se indican los tamaños en kilobases de estos marcadores. Las franjas 3, 6 y 9 muestran ADN plasmídico con cada uno de los tres fragmentos PstI digeridos con PstI, que produce el fragmento vector pUC18 (Yanisch.Perron y sol., Gene 33, 103-119) y el fragmento PstI insertado. Las franjas 4 y 5 muestran las amplificación con la serie de cebadores 1 de 5 fg del correspondiente ADN plasmídico y 1 ng del ADN genómico total respectivamente. Las franjas 7 y 8 muestran la amplificación con la serie de cebadores 2 del ADN plasmídico y el ADN genómico total y las franjas 10 y 11 muestran la amplificación con la serie de cebadores 3. Estos resultados demuestran que es posible amplificar un solo fragmento PstI de una mezcla de al menos 20.000 fragmentos, usando la técnica de amplificación de fragmentos de restricción selectivos con cebadores que tienen 5 nucleótidos selectivos.

F) Identificación de polimorfismos de ADN usando SRFA

En las secciones previas se demostró claramente que con la técnica de amplificación de fragmentos de restricción selectivos es posible amplificar fragmentos de restricción, ya sean fragmentos aleatorios o específicos, cuando se dispone de la información de la secuencia. Por lo tanto, sería posible buscar polimorfismos de sitios de restricción entre dos individuos de la misma especie. Esto se describe a continuación para dos líneas de Tomate que están muy relacionadas pero difieren en la presencia del gen de resistencia a nematodos de nudos de la raíz, Mi, en una de las líneas. Este gen Mi procede de Lycopersicon peruvianum, una especie relacionada distantemente con el Tomate comestible L. esculentum. Se ha introducido en la línea de L. esculentum por cruce entre las dos especies y posteriormente por cruces repetidos 12 veces con la generación parental de L. sculentum, seleccionando la descendencia con respecto a la presencia del gen Mi. Por lo tanto, las dos líneas de Tomate sólo difieren en un pequeña porción de su material genético, es decir, el gen Mi y la región circundante. Usando procedimientos genéticos clásicos se calculó que la región Mi constituía > 1% del genoma de esta línea.

Se aisló ADN a partir de las dos líneas de tomate (línea 83M-71392, sensible a Mi, y línea 83M-71398, resistente a Mi, obtenidas de De Ruiter Seeds, Bleiswijk, Países Bajos) y posteriormente se sometieron a digestión con PstI y se proporcionaron las adaptaciones como se ha descrito anteriormente. Usando cebadores se realizó un gran número de reacciones de amplificación que diferían en su extensión de nucleótidos selectivos. Se usaron tres nucleótidos selectivos y, aparte de los cebadores individuales, también se usaron combinaciones de dos cebadores diferentes. Las reacciones se analizaron en geles mixtos de Poliacrilamida/azarosa: se usaron un 2,5% de poliacrilamida y un 1,0% de azarosa, con una relación entre archilamida y bisacrilamida de 20:1. Los geles se procesaron en una unidad de gel Protean II (Biorad), usando espaciadores de 1,5 mm. Se usó un total de 16 cebadores diferentes proporcionando 16 reacciones con un solo cebador y 120 reacciones con todas las combinaciones posibles de dos cebadores. En la Figura 13 se muestra un ejemplo típico de un gel con seis de estas combinaciones. Las franjas 1 y 14 de este gel contienen marcadores de ADN, cuyos tamaños en kilobases se indican en el lado derecho del gel. Las franjas 2 y 3, 4 y 5, 6 y 7 contienen amplificaciones con un cebador específico o un par de cebadores de las dos líneas de Tomate. La selección de polimorfismos de restricción produjo un número de fragmentos de los que tres fueron muy prominentes y que se representan en las franjas 9, 11 y 12 de la figura 13 (indicadas por un pequeño círculo). Se esperaba que las bandas polimórficas de las franjas 9 y 12 fueran iguales, ya que en las dos reacciones estaba presente el mismo cebador (la diferencia es la presencia de un segundo cebador en la franja 11). Los dos fragmentos polimórficos de las franjas 11 y 12 se cortaron del gel, los cortes de gel se estrujaron haciéndolos pasar a través de una aguja de calibre 18 y el ADN se eluyó de los cortes de gel mediante elusión a través de una difusión en 200 \mul de Tris.HCl pH 8,0 100 m M y EDTA 10 mM. Se usaron 2 \muara la reamplificación de estos fragmentos cono se ha descrito anteriormente, 200 ng de cada fragmento se transformaron en fragmentos con extremos romos usando la ADN polimerasa de T4 y posteriormente se unieron a 100 ng del vector plasmídico pUC18 (Yanisch-Perron y col., Gene 33, 103-119) digerido con SmaI. La mezcla de unión se utililzó para transformar E. coli y, para cada fragmento, se seleccionó un clon de E. coli recombinante para el análisis de la secuencia. Todas estas manipulaciones se realizaron usando procedimientos convencionales descritos por Sambrook, Fritsch y Maniatis en: Moliculara Cloning, A. Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva Cork).

Se sintetizaron dos series de cebadores con 6 nucleótidos selectivos basándose en las secuencias de los dos fragmentos como se ha descrito anteriormente. Se pudo amplificar cada fragmento específicamente usando estas series de cebadores. Los fragmentos sólo se amplificaron a partir de la línea de Tomate, de la que procedían. Por lo tanto, estas series de cebadores presentaban el mismo polimorfismo encontrado inicialmente con los cebadores con 3 nucleótidos selectivos usados para encontrar este polimorfismo.

Ejemplo 2 Amplificación de fragmentos de restricción selectivos de ADN de tomate con dos enzimas de restricción

En el ejemplo 1 se ilustra el principio de amplificación de fragmentos de restricción selectivos (SRDA) usando ADN de Tomate y la enzima de restricción PstI. En este ejemplo se ilustrará SRFA usando dos enzimas de restricción diferentes, PstI y MseI.

Aislamiento y modificación del ADN

Se aisló ADN total de Tomate a partir de hojas jóvenes como se describe en el ejemplo 1. Como fuente del ADN se usaron dos pares de las denominadas líneas isogénicas, que reciben los nombres Gem^{R} y Gem^{S}, y GCR26 y GCR151, respectivamente (Estas líneas se describen las siguientes referencias: Denby y Williams, [1962], Can. J. Plant Sci. 42, 681-685, Smith y Ricie, [1983], Plant Mol. Boil. Rep. 1, 41-45). Los dos individuos de cada par de líneas isogénicas son muy similares desde el punto de vista genético, pero difieren en la presencia de un rasgo que confiere resistencia al patógeno fúngico Verticillium alboatratum.

La primera etapa de la modificación de los ADN comprendía la digestión de los ADN con las dos enzimas PstI y MseI. La digestión del ADN y la posterior unión de los adaptadores a los fragmentos de ADN se realizaron en el mismo tapón, que se denominó tampón RL (tampón de restricción-unión) y que contenían: Tris.HAc 10 mM/Mga. 10 mM/KAc 50 mM/DTT 5 mM, pH 7,5.

Restricción de los ADN con Pstl y Msel

2,5 \mu de ADN

12,5 unidades de PstI (Pharmacia, 10 unidades/\mul)

12,5 unidades de MseI (N.E: Biolabs, 4 unidades/\mul)

5 \mul 10 x tampón RL

H_{2}O hasta 50 \mul

La incubación de realizó a 37ºC durante 1 hora.

La siguiente etapa de la modificación de los ADN fue la unión de moléculas de adaptadores a los extremos de los fragmentos de ADN. Primero tuvieron que prepararse moléculas de adaptadores de doble cadena apropiadas.

Preparación de adaptadores

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103

\vskip1.000000\baselineskip

Para la preparación de una solución de 50 pmoles/\mul de este adaptador, se mezclaron 8 \mug (1430 pmoles) del 16-mero 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 con 7 \mug (1430 pmoles) del 14-mero 5-TACTCAGGACTCAT-3 en un volumen total de 28,6 \mul de H_{2}O.

104

Para la preparación de una solución de 5 pmoles/\mul de este adaptador, se mezclaron 5,25 \mug (715 pmles) del 21-mero biotinilado 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 con 3,5 \mug(715 pmoles) del 14-mero 5-TGTACGCAGTCTAC-3 en un volumen total de 143 \mul de H_{2}O.

Unión de las moléculas adaptadoras

Al ADN digerido se añadió una mezcla de 10 \mul que contenía:

1 \mul de bio-adaptador PstI (= 5 pmoles),

1 \mu de adaptador MseI (= 50 pmoles),

1,2 \mul de ATP 10 mM,

1 \mul de 10 x tampón RL,

1 unidad de ADN ligasa de T4 (Pharmacia, 5 unidades /\mul) y

H_{2}O hasta 10 \mul

La mezcla de reacción resultante de 60 \mul se incubó durante 3 horas a 37ºC.

Los adaptadores se diseñaron de tala forma que, después de la unión, no se restauraron sitios de restricción. De esta forma se impidió la unión de un fragmento a otro, ya que los concatémeros de los fragmentos estaban restringidos porque las enzimas de restricción todavía eran activas durante la reacción de unión. No fue posible la unión de adaptador-adaptador, porque los adaptadores no estaban fosforilados (véase también el ejemplo 1).

Selección de fragmentos de ADN biotinilado

La preparación de los ADN molde para SRFA usando dos enzimas de restricción generalmente incluía una etapa extra no usada cuando se usaba SRFA con una sola enzima. En esta etapa, los fragmentos de ADN a los que se unió un adaptador biotinilado se separaron de todos los demás fragmentos.

En esta etapa, los fragmentos biotinilados se separaron de los fragmentos no biotinilados (fragmentos MseI-MseI) mediante unión a perlas de estreptavidina paramagnéticas (Dynal), Se lavaron 10 \mul de perlas una vez en 100 \mul de Stex (NaCl 100 mM/Tris.HCl 10 mM/EDTA 1 MM/Tritón X-100 al 0,1% pH 8,0) y se suspendieron en 140 \mul de STEX. Posteriormente, las perlas se añadieron a la mezcla de unión proporcionando un volumen final de 200 \mul. Esto se incubó durante 30 minutos con agitación suave a temperatura ambiente para asegurar la unión apropiada de los fragmentos de ADN biotinilados a las perlas. Las perlas se recogieron manteniendo los tubos que contenían las perlas cerca de un imán.

De esta forma se impidió que las perlas se pipetearan cuando se transfirió el sobrenadante a otro tubo. Las perlas se lavaron una vez y posteriormente se transfirieron a un tubo limpio. Después, las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de STEX. Finalmente, las perlas se resuspendieron en 200 \mul de T01.E (Tris 10 mM/EDTA 0,1 mM, pH 8,0) se transfirieron a un tubo limpio. El ADN se mantuvo a 4ºC.

Los ADN digeridos con las enzimas de restricción, que disponían de los adaptadores, se unieron a las perlas de estreptavidina paramagnéticas, se purificaron a partir de los fragmentos MseI-MseI preparados como se ha descrito anteriormente y se denominaron ADN molde en las siguientes etapas.

Amplificación de fragmentos PstI-MseI

Los ADN molde preparados como se ha descrito anteriormente deben todos los fragmentos PstI-MseI de las líneas de Tomate mencionadas y, además, una pequeña cantidad de fragmentos PstI-PstI sin fragmentos MseI internos. En este experimento se visualizaron por amplificación carios de estos fragmentos PstI-MseI, esencialmente como se describe en el ejemplo 1. Los análisis en gel de los productos de amplificación se realizaron en geles de acrilamida desnaturalizantes (Maxam y Gilbert, Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560-564), porque las clases de fragmentos obtenidos por el procedimiento descrito en este ejemplo eran mucho menores que los descritos en el ejemplo 1. Además, estos tipos de geles permitieron la separación de hasta 100 bandas por franja, que suponía aproximadamente diez veces más que los geles de azarosa descritos en el ejemplo 1. Los fragmentos se visualizaron marcando uno de los cebadores de PCR en el extremo 5' con (\tau^{-32}P) ATP y plinucleótido quinasa.

Marcaje del cebador de PCR

El cebador seleccionado para el marcaje fue el 19-mero 5-GATGAGTCCTGAGTAAgaa-3, que se denominó cebador 1 MseI, y en el que los nucleótidos selectivos están indicados con letras minúsculas. El marcaje se realizó de la siguiente forma:

3,0 \mul de 18-mero (de la solución de 50 ng/\mul = 150 ng)

5,0 \mul (\tau^{-32}P)-ATP (de la solución de 10 \muCi/\mul = 50\muCi)

3,0 \mul de Tris.HCl 250 mM/MgC_{2} 100 mM/DTT 50 mM, pH 7,5

0,5 \mul de quinasa de T4 (Pharmacia, 10 unidades/\mul)

18,5 \mul de H_{2}O

Esto proporcionó un volumen total de 30 \mul, que se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Para cada PCR se añadió 1 \mul de este cebador marcado en posición 5'.

Se realizó un total de 28 PCR, en las que cada uno de los cuatro ADN molde se amplificó con 7 combinaciones de cebadores, Cada combinación de cebadores tenía el mismo cebador MseI (cebador 1 MseI, descrito anteriormente), pero variaba en la elección del cebador PstI. Se eligió un total de siete cebadores diferentes (como ocurre en el cebador MseI, los nucleótidos selectivos están indicados con letras minúsculas).

105

Todos los cebadores de PCR se disolvieron en H_{2}O a una concentración de 50 ng/\mul.

La reacción de amplificación

La mezcla de PCR constaba de:

2,0 \mul de ADN molde,

1,0 \mul de cebador MseI marcado en posición 5' (5ng),

0,5 \mul de cebador MseI no marcado (25 ng),

0,6 \mul de cebador PstI (30 ng),

2,0 \mul de Tris.HCl 100 mM/MgCl2 15 mM/KCl 500 mM, pH 8,5,

0,8 \mul de dNTP 5 mM,

0,1 \mul de polimerasa de Taq (Cetus Perkin Elmer; 5 unidades/\mul) y

13,0 \mul de H_{2}O

Todos los componentes de la reacción se añadieron y se mezclaron bien, y un componente esencial de la PCR, generalmente la enzima, se añadió en último lugar. Después, la reacción se inició tan pronto como fue posible.

Las amplificaciones se realizaron en un aparato de ciclos térmicos de Perkin Elmer 9600. El perfil de ciclos fue el siguiente:

1 ciclo:	desnaturalización:	30 seg. a 94ºC
	templado:	30 seg. a 65ºC
	extensión:	60 seg. a 72ºC
11 ciclos:	desnaturalización:	30 seg. a 94ºC

temperatura inferior de templado 0,7ºC cada ciclo, 64,3ºC, 63,6ºC, 62,9ºC, 62,2ºC, 61,5ºC.60,8ºC, 60,1ºC. 59,4ºC, 58,7ºC, 58,0ºC, 57,3ºC. Incubar durante 30 segundos a cada temperatura.

	extensión:	60 seg. a 72ºC
23 ciclos:	desnaturalización:	30 seg. a 94ºC
	templado:	30 seg. a 56ºC
	extensión:	60 seg. a 72ºC

Análisis en gel de los fragmentos amplificados

Los productos de reacción se analizaron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 4,5%. Se usaron geles de 50 x 38 cm, cuyos cassettes de geles para preparar estos geles se adquirieron de Biorad. Se usaron 100 ml de una solución de gel que contenía un 4,5% p/v de archilamida/0,225% p/v de visacrilamida/Urea 7,5 M/Tris 50 mM/ácido bórico 50 mM/EDTA 1 mM, pH 8,3. 100 ml de la solución de gel se mezclaron con 500 \mul de persulfato amónico al 10% y 100 \mul de TEMED inmediatamente antes de verter el gel. Como tampón de electroforesis se usó un tampón de TRis/ácido bórico/EDTA que contenía: Tris 100 mM/ácido bórico 100 mM/EDTA 10 mM/azul de bromoferol al 0,01% p/v/xileno cianol al 0,01% p/v. Las mezclas resultantes se calentaron durante 3 minutos a 95ºC y después se enfriaron rápidamente en hielo. En el gel se introdujeron 2 \mul de cada muestra. Los geles se procesaron a una potencia constante de 110 vatios, proporcionando una liberación constante de calor durante la electroforesis. En estas condiciones, la resistencia del campo de los geles correspondía a 40-50 voltios/cm.

En la Figura 14 se muestran los resultados de las reacciones de SRFA. Las franjas se numeran de 1 a 28 y contienen cada vez las cuatro líneas de Tomate con una de las siete combinaciones de cebadores.

El orden de las líneas de Tomate en los geles es: 1. GCR26, 2. GCR151, 3. Gem^{R} y 4. Gem^{S}. Las franjas 1 a 4 contienen estos ADN amplificados con el cebador 1 MseI y el cebador 1 PstI, las franjas 5 a 8 contienen estos ADN amplificados con el cebador 1 MseI y el cebador 2 PstI, las franjas 9 a 12 contienen estos ADN amplificados con el cebador 1 MseI y el cebador 3 PstI, las franjas 13 16 contienen estos ADN amplificados con el cebador 1 MseI y el cebador 4 PstI, las franjas 17 a 20 contienen estos ADN amplificados con el cebador 1 MseI y el cebador 5 PstI, y las franjas 21 a 24 contienen estos ADN amplificados con el cebador MseI y el ceador 6 PsrI, y las franjas 25 a 28 contienen estos ADN amplificados con el cebador 1 MseI y el cebador 7 PstI. El gel no contiene marcadores de tamaño, pero los fragmentos de ADN visualizados corresponden de \pm 200 nucleótidos en la parte inferior de la figura a \pm 500 nucleótidos en la parte superior:

Ejemplo 3 Amplificación de fragmentos de restricción selectivos de ADN de diferentes especies de lactuca con dos enzimas de restricción

En el ejemplo 2 se ejemplifica el principio de la amplificación de fragmentos de restricción selectivos (SRFA) usando dos enzimas de restricción para el ADN de Tomate. En este ejemplo se demostrará que se obtiene resultados similares usando ADN de diversas especies de Lactuca y usando las mismas dos enzimas de restricción PstI y MseI.

Aislamiento y modificación del ADN

Los ADN se aislaron como se describe en el ejemplo 1 usando material de hojas jóvenes de diversas especies de Lactuca. Como se indica más adelante, estas plantas incluyen la variedad de lechuga comercial (L. sativa) y varios indidviduos de dos especies de Lactuca silvestres, L. saligna y L. virosa. Las plantas recibieron arbitrariamente los siguientes nombres:

1. L. saligna, no. 21, planta 1.

2. L. saligna, no. 21, planta 2

3. L. saligna, no. 22, planta 1

4. L. saligna, no. 22, planta 2

5. L. virosa, no. 01, planta 1

6. L. virosa, no. 01, planta 1

7. L. virosa, no.2

8. L. virosa, no. 03, planta 1

9. L. virosa, no. 03, planta 1

10. L. sativa, una variedad terna comercial.

Así pues, el material genético analizado representada 6 tipos de plantas diferentes, incluyendo dos individuos diferentes de 4 de estas plantas.

La modificación de los ADN de Lactuca para generar los moldes para las SRFA se realizó de forma idéntica al procedimiento descrito en el ejemplo 2.

Amplificación de fragmentos PstI-MseI

Los ADN preparados como se ha descrito anteriormente se usaron como moldes para las reacciones de SRFA. SE usaron dos combinaciones de cebadores empleando un solo cebador MseI y dos cebadores PstI diferentes. Estos cebadores (nucleótidos selectivos representados en letras minúsculas) fueron:

Cebador MseI:	5-GATGAGTCCTGAGTAAaca-3
Cebador-1 PstI:	5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
Cebador-2 PstI:	5-GACTGCGTACATGCAGca-3

La amplificación de los fragmentos PstI-MseI usando los cebadores representados anteriormente se realizó exactamente como se describe en el ejemplo 2, y los fragmentos generados se visualizaron sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes como se describe en el ejemplo 2. En la Figura 15 se muestran los modelos de bandas obtenidos. Las franjas 1 a 10 muestran los ADN 1 a 10 amplificados con el cebador MseI en combinación con el cebador 1 PstI, las franjas 11 a 20 muestran los ADN 1 a 10 amplificados con el cebador MseI en combinación con el cebador 2 PstI. A la derecha del gel se indican los marcadores de tamaño (no visibles en esta Figura) en nucleótidos. Las diferencias de los modelos de bandas reflejan las diferencias de relación de las diversas plantas.

Ejemplo 4 Amplificación de fragmentos de restricción de líneas endogámicas de maíz con una diversidad de combinaciones de enzimas de restricción

En el ejemplo 2 y 3 se ejemplifica el principio de la ampliación de fragmentos de restricción selectivos (SRFA) usando dos enzimas de restricción y usando ADN de Tomate y ADN de Lechuga (especies de Lactuca) respectivamente. En este ejemplo se ilustrará que se obtienen resultados similares con líneas de Maíz (Zea mais). Además, se ilustrará que puede usarse una diversidad de combinaciones de enzimas de restricción para obtener huellas de identificación del ADN de, en este caso, líneas de Maíz.

Aislamiento y modificación del ADN

Se usaron dos líneas endogámicas de maíz, denominadas 1 y 2. el origen de estas líneas es irrelevante, porque según la experiencia de los presentes solicitantes cualquier línea seleccionada proporciona buenas huellas de identificación del ADN usando SRFA. El ADN de estas líneas se aisló a partir de material de hojas jóvenes como se describe por SAghai-Mahoof y col. (1984). POrc. Natl. Acd. Sci. U.S.A. 81, 8014-8018). Para obtener los ADN molde se usaron las siguientes combinaciones de enzimas de restricción (EK): PstI/TagI, EcoRI/TagI, AseI/TAgI, Sse8387-I/TagI. Todas las enzimas se adquirieron de Pharmacia, excepto ASeI que se adquirió de New England Biolabs y Sse8387-I que se adquirió de Amersham. Los ADN molde se prepararon esencialmente como se describe en los ejemplo 2 y 3, con las siguientes excepciones:

La restricción del ADN se realizó incubando primero con TagI a 65ºC durante una hora e incubando posteriormente con la segunda enzima, PstI, AseI, EcoRI o Sse8387-I, durante una hora más de 37ºC. La unión de los adaptadores se realizó como se describe en el ejemplo 2 usando los siguientes adaptadores:

106

Amplificación de fragmentos de restricción

La amplificación de los fragmentos de restricción se realizó como se describe en el ejemplo 2. Los cebadores seleccionados apara marcar los productos de amplificación fueron los siguientes cebadores TagI que tienen 3 nucleótidos selectivos (indicados por letras minúsculas):

110

Estos 4 cebadores se usaron para la detección de los productos de amplificación con todas las combinaciones de las cuatro enzimas. Con cada combinación de enzimas, se seleccionaron 4 cebadores para la otra enzima proporcionando un total de 16 combinaciones para cada enzima. Estos cebadores se indican a continuación (los nucleótidos selectivos se muestran en letras minúsculas). Para los cebadores EcoRI y AseI se seleccionaron 3 nucleótidos selectivos, para los cebadores PstI se seleccionaron 2 nucleótidos selectivos y para los cebadores SseI se seleccionó un solo nucleótido. Para las enzimas que cortan con menos frecuencia en el ADN genómico, de Maíz, se seleccionaron cebadores que contenían extensiones con menos nucleótidos selectivos.

111

112

113

114

Se realizó un total de 128 PCR (2ADN x 4 combinaciones de enzimas x 16 combinaciones de cebadores), siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 2. Los productos de reacción de estas PCR se analizaron en 3 geles (que contenían 48 franjas/gel) como se describe en el ejemplo 2. Todas las combinaciones de cebadores proporcionaron huellas de identificación del ADN de 50 a 100 bandas de franja, excepto la combinación SseI/TagI, que sólo proporcionó de 10 a 15 bandas por franjas. En la Figura 16 se muestra un ejemplo de uno de los geles. Esta Figura muestra parte del gel con el análisis de las huellas de identificación del ADN obtenidas con las combinaciones de enzimas PstI/TagI y EcoRI/TagI. Las franjas 1 a 8 muestran huellas de identificación del ADN de los dos ADN de Maíz obtenidos por SRFA con el cebador 3 TagI y los cebadores 1, 2, 3 y 4 PstI respectivamente, las franjas 9 a 16 muestran huellas de identificación del ADN de los dos ADN de Maíz obtenidos por SRFA con el cebador 4 TagI y los cebadores 1, 2, 3 y 4 PstI respectivamente, la franja 17 muestra el ADN lambda marcador del tamaño digerido con PstI, mostrándose los tamaños de algunos de los fragmentos en nucleótidos a la derecha, y las franjas 18 a 25 muestran huellas de identificación del ADN de los dos ADN de Maíz obtenidos por SRFA con el cebador 1 TagI y los cebadores 1, 2, 3 y 4 EcoRI respectivamente.

Ejemplo 5 Fragmentos de restricción selectivos de ADN bacteriano

En los ejemplos 2, 3 y 4 se ejemplifica el principio de la amplificación de fragmentos de restricción selectivos (SRFA) usando dos enzimas de restricción para ADN de Tomate, Lechuga (especies de Lactuca) y Maíz, respectivamente. En este ejemplo, se ilustrará que esta técnica también puede usarse para caracterizar ADN bacterianos. Se obtuvieron varias cepas de Xanthomonas campestres del Laboratorio de Microbiología en Gante, Bélgica, para ilustrar la utilidad de la técnica en bacterias.

Aislamiento y modificación del ADN

Todos los ADN se prepararon con cepas de Xanthomonas campestres aisladas a partir de una diversidad de orígenes, la mayor parte de las veces de plantas infectadas. Estas cepas, con los números 1 a 26 se presentan a continuación y pueden obtenerse del Laboratorio de Microbiología de Gante, Bélgica.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

El ADN de estas cepas bacterianas se aisló como se describe por Marmur (J. Mol. Biol. 3, 208-218). Los ADN se digirieron esencialmente como se describe en el ejemplo 4, con la excepción de que se eligieron TagI y ApaI como enzimas de restricción. La unión de los adaptadores se realizó como se describe en el ejemplo 4 usando los siguientes adaptadores:

115

Amplificación de fragmentos de restricción

La amplificación de los fragmentos de restricción se realizó como se describe en el ejemplo 2. Los cebadores seleccionados para la SRFA fueron el cebador TagI 5-CGFATGAGTCCTGACCGAg-3 (que tiene un nucleótido selectivo indicado en letras minúsculas) y el cebador ApaI 5-GACTGCGTACAGGCCCg-3 (que tiene un nucleótido selectivo indicado en letras minúsculas). El cebador ApaI se marcó en el extremo 5' para la detección de los fragmentos amplificados como se describe en el ejemplo 2.

Cada uno de los 26 ADN se amplificó usando la serie de cebadores descrita anteriormente. Las condiciones de amplificación fueron las descritas en el ejemplo 2, con la excepción de que se omitieron los últimos 9 ciclos de la PCR a causa de la menor complejidad de los ADN en comparación con el ADN vegetal de los ejemplos 2, 3 y 4.

Las huellas de caracterización del ADN obtenidas con los ADN bacterianos descritos en este ejemplo se muestran en la Figura. 17. Las franjas 1 a 26 representan los ADN bacterianos 1 a 26. A la derecha del gel se indican los tamaños de los ADN marcadores (no visibles en el gel) en nucleótidos. Estas cifras muestran claramente que la relación de las cepas bacterianas se refleja por la analogía de los modelos de bandas.

Ejemplo 6 Amplificaciones de fragmentos de restricción selectivos de ADN de diversos animales con dos enzimas de restricción

En los ejemplos previos se ejemplificó la amplificación de fragmentos de restricción selectivos (SRFA) para el ADN vegetal de diversas fuentes. En este ejemplo se ilustra la eficacia del procedimiento usando muestras aleatorias de ADN obtenido a partir de diferentes animales domésticos. Las especies animales ensayadas son: Gallus domesticus (pollo); Susscrofa domestica L. (cerdo), Bos taurus (vaca); y Equus caballus (caballo). Las enzimas de restricción usadas son Sse8387I y MseI.

Aislamiento y modificación del ADN

Los ADN se aislaron a partir de muestras de sangre siguiendo los procedimientos descritos por Maniatis y col., (1982). Las muestra de ADN 1 a 3 (pollo), 4 a 7 (cerdo), 8 a 11 (vaca) y 12 a 15 (caballo) se digirieron por las enzimas de restricción Sse8387I y MseI. Los fragmentos de ADN se unieron a adaptadores como se describe en el ejemplo 2. Como las enzimas de restricción Sse8387I y PstI generan salientes 3' compatibles, se podrían usar los adaptadores PstI y MseI descritos en el ejemplo 2.

Amplificación de fragmentos de restricción

Los ADN molde mencionados anteriormente y preparados como se describe en el ejemplo 2 sirvieron como moldes en las reacciones de SRFA. Las combinaciones de cebadores usadas constaban de un solo cebador MseI y diferentes cebadores SseI:

117

La amplificación de los fragmentos Sse8387I-MseI usando los pares de cebadores descritos anteriormente se realizó usando el protocolo descrito en el ejemplo 2. Los productos de reacción se procesaron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes como también se describen en el ejemplo 2. En la Figura 18 se muestra una autorradiografía que muestra las huellas de identificación de las muestras anteriores. Las franjas 1 a 15 muestran las huellas de identificación de los ADN 1 a 15 amplificados con el cebador MseI emparejado con el cebador 1 Sse8387I, las franjas 16 a 30 muestran modelos similares obtenidos con el cebador MseI combinado con el cebador 2 Sse8387I. Las diferencias en las huellas de identificación entre los animales de una especie refleja heterogeneidad en las poblaciones animales; los modelos generales son característicos para una especie específica.

La invención se refiere a un procedimiento para la amplificación por Reacción en Cadena con Polimerasa de al menos un fragmento de restricción obtenido a partir de un ADN de partida que contiene una pluralidad de sitios de restricción para al menos una endonucleasa de restricción determinada específica, procedimiento que comprende:

En una realización particular de este procedimiento, el nucleótido terminal de al menos uno de dichos cebadores en la dirección del alargamiento buscado corresponde al último de los nucleótidos implicados en el sitio de restricción para dicha endonucleasa específica, comprendiendo el procedimiento la identificación o recuperación de los fragmentos de restricción de dicho ADN de partida que se ha amplificado.

En otra realización particular de este procedimiento, al menos uno de dichos dejadores incluye una secuencia seleccionada que comprende un número determinado (uno o varios nucleótidos) que se extiende más allá del último de los nucleótidos implicados en el sitio de restricción para dicha endonucleasa específica en la dirección de su propio alargamiento dentro los fragmentos de restricción correspondientes durante la etapa de amplificación.

En un realización específica del procedimiento descrito anteriormente, el engarce de ADN de doble cadena contiene varios sitios para diferentes endonucleasas específicas que son distintas entre sí, comprendiendo el procedimiento la repetición, sobre un mismo ADN de partida, de las etapas del procedimiento definido anteriormente con una de estas endonucleasas de restricción y con otra de dichas endonucleasas específicas distintas, y usando cebadores cuyas secuencias de nucleótidos se seleccionan como se define en la descripción anterior, pero con respecto a dicha otra endonucleasa específica.

El procedimiento descrito anteriormente o el oligonucleótido de la invención es apropiado para la identificación de polimorfismos en determinados ADN procedentes de las mismas especies vivas, por ejemplo, ADN genómicos de un microbio, planta o animal, incluyendo los seres humanos, o fragmentos de los mismos, bien entre ellos mismos o con respecto a un patrón de ADN determinado correspondiente, comprendiendo el uso someter el ADN bajo estudio al procedimiento o al contacto del oligonucleótido en condiciones que permitan una reacción de amplificación o de elongación, comparar los modelos de restricción obtenidos a partir de cada uno de dichos ADN y, opcionalmente, de dicho ADN patrón y relacionar la existencia y, cuando sea apropiado, la localización de ese polimorfismo de ADN con las diferencias observadas entre los tamaños de los fragmentos de restricción de los diferentes ADN.

La invención también se refiere a un ADN fragmentado cuyos fragmentos diferentes tienen secuencias que corresponden a productos de digestión iniciales del ADN de partida no fragmentado a partir del cual se producen con una misma endonucleasa específica determinada, caracterizado porque todos dichos fragmentos se señalizaron en sus extremos 5' y 3' respectivamente por adaptadores 3' y 5' determinados correspondientes a la parte escindida de un mismo engarce de ADN de partida que inicialmente incluía un solo sitio de restricción para dicha endonucleasa específica, y opcionalmente prolongado con secuencias constantes determinadas. El ADN fragmentado puede estar en forma de un modelo de bandas de migración en un soporte adecuado, por ejemplo, un soporte de gel, en el que los fragmentos inicialmente se hicieron migrar bajo la influencia de un campo eléctrico.

El ADN fragmentado también puede comprender porciones terminales que incluyen oligonucleótidos, caracterizadas por la siguiente composición, partiendo del extremo 5':

(i.): una secuencia de nucleótidos (secuencia constante) de al menos 10 bases, pero no mayor de 30 bases, complementaria a una secuencia de ADN determinada usada como adaptador, seguida inmediatamente por:

(ii.): una secuencia de nucleótidos complementaria al sitio diana de una endonucleasa de restricción específica usada en la etapa (a), siempre que tal secuencia de nucleótidos o parte de ella es esté comprendida en (ii=), seguida inmediatamente por:

(iii.): una secuencia de nucleótido de al menos un nucleótido, pero más corta de 10 nucleótidos, seleccionada, por ejemplo, con una longitud de 1 a 5 nucleótidos.

La invención además se refiere a un equipo para la fragmentación de determinados ADN por al menos una endonucleasa de restricción específica en fragmentos, y el análisis de estos fragmentos, que comprende:

-: la endonucleasa de restricción específica;

-: un engarce oligonucleotídico de ADN de doble cadena que incluye un solo sitio dentro de su propia secuencia nucleotídica para dicha endonucleasa específica, con lo que ésta escinde dicho engarce en los adaptadores 5' y 3' correspondiente respectivamente, donde dicho engarce de ADN de doble cadena tiene un tamaño suficiente como para proporcionar partes 5' y 3' que posteriormente pueden proporcionar moldes para los cebadores de PCR de este equipo;

-: cebadores de PCR que comprende respectivamente, por un parte, las mismas secuencias que las cadenas de los adaptadores 5' y 3' complementarias a las cadenas que posteriormente actúan como moldes para dichos cebadores, donde dichos cebadores incluyen además los nucleótidos complementarios a los que están implicados en la formación del sitio para dicha endonucleasa de restricción específica determinada en las cadenas de molde;

-: si es apropiado, segmentos oligonucleotídicos de secuencias determinadas (constantes) para generar sitios de suficiente longitud para la hibridación con dichos cebadores, para el alargamiento de los extremos 5' de dichos adaptadores 5' o los extremos 3' de dichos adaptadores 3', o ambos, antes de la digestión de dicho engarce por dicha endonucleasa de restricción específica para producir dichos adaptadores 5' y 3' respectivamente o, como alternativa, para el alargamiento de los fragmentos señalizados obtenidos después de la unión de dichos adaptadores 5' y 3' a los extremos de los fragmentos del ADN de partida;

-: opcionalmente, un patrón de ADN fragmentado que corresponde al ADN determinado objeto del estudio de fragmentación, con lo que los fragmentos de dicho ADN convencional se obtienen por digestión con dicha endonucleasa específica.

Una realización particular de este equipo es tal que dichos segmentos oligonucleotídicos para el alargamiento de los adaptadores 5' y 3' o de los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ADN señalizados tienen secuencias de nucleótidos idénticas.

En otra realización, el engarce del equipo contiene varios sitios únicos respectivos para endonucleasas específicas diferentes entre sí, incluyendo dicho equipo además cebadores que corresponden a cada uno de los adaptadores 3' y 5' formados por la escisión de dicho engarce con dichas endonucleasas específicas diferentes respectivamente, donde dichos cebadores son respectivamente como se describen en la reivindicación 8, respecto a los adaptadores 3' y 5' que se producen en dicho engarce por su escisión con cada uno dichas endonucleasas específicas.

Además, en una realización particular, el equipo puede comprender patrones de ADN fragmentados, como se ha definido anteriormente con respecto a las endonucleasas de restricción específicas correspondientes, donde cada uno de dichos patrones de ADN fragmentados se relaciona con cada una de las enzimas de restricción específicas determinadas.

Claims

1. Procedimiento para la amplificación mediante Reacción en Cadena con Polimerasa de al menos un fragmento de restricción obtenido a partir de un ADN de partida que contiene una pluralidad de sitios de restricción para al menos una endonucleasa de restricción determinada específica, procedimiento que comprende:

(a.): digerir dicho ADN de partida con al menos una endonucleasa de restricción, para fragmentarlo en fragmentos de restricción:

(b.): unir los fragmentos de restricción obtenidos con al menos un adaptador oligonucleotídico sintético de doble cadena que tiene un extremo que es compatible para la unión con uno o los dos extremos de los fragmentos de restricción, obteniéndose de esta forma fragmentos de restricción señalizados;

(c.): poner en contacto dichos fragmentos de restricción señalizados, en condiciones de hibridación, con al menos un cebador oligonucleótidico; donde dicho cebador o cebadores incluyen una secuencia de nucleótidos que tiene la misma secuencia de nucleótidos que las partes terminales de las cadenas en los extremos de dichos fragmentos de restricción señalizados, incluyendo los nucleótidos implicados en la formación de la secuencia diana para dicha endonucleasa de restricción e incluyendo al menos parte de los nucleótidos presentes en los adaptadores unidos, donde al menos uno de dichos cebadores incluye en su extremo 3' una secuencia seleccionada que comprende al menos un nucleótido localizado inmediatamente adyacente a los nucleótidos implicados en la formación de la secuencia diana para dicha endonucleasa de restricción de dicha secuencia diana,

(d.): amplificar dichos fragmentos de restricción señalizados hidridados con dicho cebador o cebadores en presencia de los nucleótidos necesarios y la ADN polimerasa o alargar los cebadores hidridados junto con los fragmentos de restricción señalizados, y

(e.): identificar o recuperar los fragmentos de ADN amplificados o alargados producidos en la etapa (d).

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en la etapa (c), el cebador o cebadores forman pares de bases perfectamente con un secuencia de ADN constante compuesta de parte de la secuencia diana de la endonucleasa de restricción y de la secuencia del adaptador.

3. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos un cebador comprende una secuencia seleccionada de 1 a 10 nucleótidos.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicación 1 a 3, en el que los cebadores comprenden de 10 a 50 nucleótidos y en el que la secuencia diana de la endonucleasa de restricción comprende de 4 a 8 nucleótidos.

5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de nucleótidos de los cebadores que forma pares de bases con el adaptador comprende de 10 a 30 nucleótidos.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los adaptadores están diseñados de tal forma que la secuencia diana correspondiente de la endonucleasa no se restaure cuando el adaptador hibride con el fragmento o los fragmentos de restricción señalizados y, donde el cebador o cebadores son oligonucleótidos que comprenden una secuencia constante que forma partes de bases perfectamente con al menos un extremo de la secuencia de al menos un fragmento de restricción señalizado de una mezcla, secuencia constante que comprende nucleótidos que forman pares de bases con parte de la secuencia diana para dicha endonucleasa de restricción, incluyendo al menos uno de dichos cebadores, en la posición adyacente al extremo 3' de los endonucleótidos implicados en la formación de dicha secuencia diana, de 1 a 10 nucleótidos seleccionados adicionales.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la secuencia de ácido nucleico del ADN de partida se desconoce al menos en parte.

8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se usan dos endonucleasas de restricción diferentes.

9. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que todos los cebadores tienen la misma secuencia de nucleótidos constante.

10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se usa una mezcla de cebadores diferentes.

11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que al menos un cebador contiene 1, 2 ó 3 nucleótidos seleccionados en su extremo 3'.

12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que en la etapa (a) se usan dos endonucleasas de restricción diferentes y donde al menos un adaptador oligonucleotídico sintético de doble cadena para una de las endonucleasa está biotinilado.

13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que al menos un cebador está marcado.

14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el número de nucleótidos selectivos se elige de forma que el número de fragmentos de restricción a amplificar esté limitado a 5-200.

15. Un procedimiento para la preparación de una serie de fragmentos de restricción amplificados, que comprende:

(a): amplificar una subserie de fragmentos de restricción a partir de una mezcla de fragmentos de restricción generados obtenida a partir de un ADN de partida usando un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

(b): separar los fragmentos de restricción señalizados amplificados, y

(c): identificar los fragmentos de restricción amplificados.

16. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho ADN de partida a amplificar es ADN genómico procedente de una muestra biológica humana a animal, especialmente una muestra de tejido o de sangre.

17. Un procedimiento de acuerdo con un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho ADN de partida a amplificar es ADN genómico procedente de una planta o de un tejido vegetal.

18. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho ADN de partida a amplificar es ADN de un microorganismo.

19. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la identificación de polimorfismos entre diferentes ADN de partida procedentes de la misma especie viva, que comprende identificar las diferencias observadas entre los fragmentos de restricción amplificados de los diferentes ADN de partida.

20. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la identificación de polimorfismos en ADN genómicos de un microorganismo, planta o animal, incluyendo los seres humanos, o de fragmentos de los mismos, bien entre ellos o con respecto a un patrón de ADN determinado correspondiente.

21. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para identificar polimorfismos de ADN asociados con rasgos heredados genéticamente en los seres humanos, polimorfismos de ADN asociados con rasgos heredados genéticamente en animales o polimorfismos de ADN asociados con rasgos heredados genéticamente en plantas, y para identificar marcadores de ADN basándose en tales polimorfismos de ADN.

22. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además comparar dos o más fragmentos de ADN amplificados o alargados identificados o recuperados en la etapa (e) de dicho procedimiento, para detectar semejanzas entre variedades de plantas o animales, especies, variedades de cultivo o microorganismos, o para evaluar distancias genéticas o caracterizar tales variedades de plantas o animales, especies, variedades de cultivo o microorganismos.

23. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que los fragmentos de ADN amplificados o alargados producidos en la etapa (e) se identifican o recuperan como huellas de identificación del ADN.

24. Un procedimiento para la identificación de marcadores de ADN asociados a un rasgo genético, comprendiendo dicho procedimiento identificar polimorfismos de acuerdo con la reivindicación 22 entre moléculas de ADN de partida procedentes de las mismas especies vivas que presentan diferencias en dicho rasgo genético y correlacionar dichos polimorfismos con el fenotipo presentado por dicho rasgo genético.

25. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además las etapas de:

(f): aislar al menos un fragmento de ADN identificado o recuperado en la etapa (e);

(g): determinar la secuencia de nucleótidos de los primeros 8-10 restos de nucleótidos internamente adyacentes a la secuencia diana de la endonucleasa de restricción en los dos extremos de dichos fragmentos de ADN; y

(h): diseñar cebadores de oligonucleótidos que tengan una secuencia de nucleótidos de acuerdo con los cebadores de la etapa (c) de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos seleccionada comprende de 5 a 10 restos de nucleótidos que corresponden a los primeros 8-10 restos de nucleótidos internamente adyacentes a los sitios de restricción en los dos extremos de dicho fragmento de ADN.