DE69813203T2 - Verbesserte Primer zur AFLP Amplifizierung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen in der DNA-Amplifikationstechnologie, insbesondere der AFLP-Technologie. Genauer betrifft die Erfindung die Verwendung von verbesserten Primern (Starternukleinsäuremolekülen) in der AFLP, die das Auftreten einer so genannten „Fehlpaarungsinitialreaktion" („missmatch priming") reduzieren. Dies erhöht die Klarheit und Zuverlässigkeit des erzeugten Fingerabdrucks („fingerprint").
  • Die selektive Restriktionsfragmentamplifikation oder AFLP ist bekannt, zum Beispiel aus der Europäischen Patentanmeldung 0 534 858 durch den Anmelder. Im Allgemeinen umfasst AFLP die Schritte:
    • (a) Verdauen einer Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, mit einer oder mehreren spezifischen Restriktionsendonukleasen, um die DNA in eine entsprechende Folge von Restriktionsfragmenten zu fragmentieren;
    • (b) Ligieren der Restriktionsfagmente, solchermaßen erhalten mit mindestens einem doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotidadapter, von dem ein Ende kompatibel mit einem oder beiden Enden der Restriktionsfragmente ist, um hierdurch markierte Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA herzustellen;
    • (c) Kontaktieren des markierten Restriktionsfragments unter hybridisierenden Bedingungen mit mindestens einem Oligonukleotidprimer;
    • (d) Amplifizieren des markierten Restriktionsfragments, das mit den Primern durch PCR oder eine ähnliche Technik hybridisiert wird, um so eine weitere Verlängerung (Elongation) der hybridisierten Primer entlang der Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA zu bewirken, mit welcher die Primer hybridisiert haben; und
    • (e) Identifizieren oder Entdecken des so erhaltenen amplifizierten oder verlängerten DNA-Fragments.
  • Die so erhaltenen amplifizierten DNA-Fragmente können dann analysiert und/oder visualisiert werden, zum Beispiel durch Mittel einer Gelelektrophorese. Dies stellt einen genetischen Fingerabdruck bereit, der spezifische Banden entsprechend zu den Restriktionsfragmenten zeigt, die mit dem Adapter verknüpft worden sind, durch den Primer erkannt worden sind und so während des Amplifikationsschrittes verlängert worden sind. Der so erhaltene Fingerabdruck stellt Informationen über das spezifische Restriktionsstellenmuster der Ausgangs-DANN, und folglich von dem genetischen Aufbau des Organismus, von dem die DNA stammt, bereit.
  • AFLP kann dadurch verwendet werden, um die DNA zu identifizieren, sie auf die Gegenwart von spezifischen Restriktionsstellenmustern oder Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP), die der Gegenwart von verschiedenen Genen oder genetischen Eigenschaften entsprechen, zu analysieren oder für ähnliche Zwecke, zum Beispiel durch ein Vergleichen dieser mit DNA-Proben von bekannter Herkunft oder Restriktionsmustern oder Daten davon.
  • So wie AFLP eine Amplifikation von beiden Strängen einer doppelsträngingen Ausgangs-DNA bereit stellt, erlaubt AFLP vorteilhafterweise die exponentielle Amplifikation des Fragments, d.h. gemäß den Folgen 2, 4, 8, 16 etc.. Ebenso erfordert AFLP weder ein vorheriges Wissen über die zu analysierende DNA-Sequenz noch eine vorherige Identifizierung von geeigneten Proben und/oder die Konstruktion einer Genbibliothek von der Ausgangs-DNA.
  • Der in AFLP verwendete Primer sollte derart sein, dass er den Adapter erkennt und an ihn bindet, um so als ein „Ausgangspunkt" für die Polymeraseausdehnung des Primers entlang des Templates zu dienen. Zu diesem Zweck besitzen die Primer gewöhnlich eine Nukleotidsequenz, die mit mindestens der Sequenz, die dem 3'-Ende des zu amplifizierenden Restriktionsfragments benachbart ist, hybridisieren kann (d.h. die Sequenz an dem 5'-Ende des verwendeten Adapters).
  • Neben dieser so genannten „konstanten Region" der Primersequenz können die in AFLP verwendeten Primer ebenso eine oder mehrere weitere Basen (so genannte „selektive Basen") an dem 3'-Ende ihrer Sequenz zur Hybridisierung mit einer beliebigen komplementären Base oder Basen an dem 3'-Ende des Adapter-ligierten Restriktionsfragments enthalten. Während des Amplifikationsschritts werden von allen Adapter-ligierten Restriktionsfragmenten, die in der Mischung anwesend sind, lediglich solche Fragmente, die Basen enthalten, die komplementär zu den selektiven Basen sind, die neben dem ligierten Adapter liegen (d.h. an den 3'-Enden von beiden Strängen des doppelsträngigen Fragments), exponentiell amplifiziert und stellen dadurch ein Band in dem endgültigen Fingerabdruck bereit.
  • Auf diese Weise reduziert die Verwendung dieser „selektiven" Primer die Gesamtmenge an Banden in dem endgültigen Fingerabdruck, und machen den Fingerabdruck auf diese Weise klarer und spezifischer. Ebenso wird die Verwendung von verschiedenen selektiven Primern im Allgemeinen sich unterscheidende Fingerabdrücke bereit stellen, welche ebenso als ein Werkzeug für die Zwecke der Identifizierung oder Analyse verwendet werden können.
  • Diese selektiven Basen, dich nicht abhängig von der Sequenz des verwendeten Adapters sind und die im Allgemeinen entweder zufällig oder durch Mittel des Ausprobieren („trial and error") gewählt werden können, um so den informativsten Fingerabdruck von der so genannten „variablen Region" des Primers bereit zu stellen. Die Anzahl der selektiven Basen wird herkömmlich durch ein Plus-Zeichen angezeigt, gefolgt von einer ganzen Zahl: ein „+n-Primer" zeigt einen Primer an, der n selektive Basen enthält.
  • In der Praxis werden AFLP-Amplifikationen mit Primern, die 3 oder mehr selektive Basen enthalten, oftmals als Mehrfach-Schritt-Vorgehensweisen ausgeführt, in denen der endgültigen Amplifikation mit dem/den Primer(n) mit der gewünschten Anzahl an selektiven Basen eine oder mehrere so genannte „Präamplifikationen" mit Primern vorangehen, die eine geringere („fewer") Anzahl von selektiven Basen enthalten. Zum Beispiel +3- oder +4-Amplifikationen werden häufig als eine Zwei-Schritt-Amplifikation ausgeführt, die eine +1- (oder manchmal eine +2-) Präamplifikation, gefolgt von einer +3- oder +4-Endamplifikation umfassen. Die endgültige Amplifikation wird dann mit der amplifizierten Mischung ausgeführt, die von der/den Präamplifikation(en) erhalten wurde(n). In solch einer Präamplifikation entsprechen die spezifischen selektiven Basen der Primer in der Regel den selektiven Basen, die in den entsprechenden Positionen des endgültigen +n-Primers vorhanden sind.
  • Im Allgemeinen wird die Verwendung einer Präamplifikation sowohl die relative als auch die absolute Menge geeigneter Ziel-Templates („target templates") beträchtlich erhöhen, verglichen mit der Gesamtanzahl der Adapter-ligierten Restriktionsfragmente, die in der ursprünglichen Ausgangsmischung vorhanden sind. Eine Präamplifikation stellt daher eine erhöhte Verfügbarkeit von geeigneten Ziel-Templates in der präamplifizierten Mischung (verglichen mit der ursprünglichen Ausgangsmischung) bereit, sodass während der endgültigen Amplifikation mehr Primer das korrekte Template finden können.
  • Für eine weitere Beschreibung von AFLP, seinen Vorteilen, seinen Ausführungsformen ebenso wie den Techniken, Enzymen, Adaptern, Primern und weiteren Verbindungen und Werkzeugen, die darin verwendet werden, erfolgt ein Hinweis auf EP-0 534 858. Ebenso werden in der hierin nachfolgenden Beschreibung die Definitionen, die in Absatz 5.1 der EP-0 534 858 gegeben sind, verwendet, soweit nichts anderes angezeigt ist.
  • Im Prinzip muss die Primersequenz vollständig komplementär zu der korrespondierenden Sequenz des Templates sein. Wenn dies nicht der Fall ist (d.h. wenn dort eine Sequenz „Fehlpaarung" zwischen dem Primer und dem Template vorliegt), sollte keine Ausdehnung des Primers entlang des Templates stattfinden (siehe 1). Ansonsten können andere als die gewünschten oder spezifisch angezeigten Fragmente (d.h. solche Banden, die das Vorhandensein oder die Abwesenheit der genetischen Eigenschaft, die von Interesse ist, anzeigen, zum Beispiel durch ein Vergleich mit einem vorherigen Fingerabdruck oder einer Datenbank) in einem größeren oder geringeren Ausmaß amplifiziert werden und zu kontaminierenden Banden (hierin bezeichnet als „Fehlpaarungsbanden" („mismatch bands")) in dem Fingerabdruck führen.
  • Diese so genannte „Fehlpaarungsinitialreaktion" („mismatch priming") kann daher die Klarheit und/oder Zuverlässigkeit des erhaltenen Fingerabdrucks reduzieren, insbesondere wenn solch eine Fehlpaarung an oder nahe dem kritischen 3'-Ende der Primersequenz statt findet, wo die Primerausdehnung initiiert wird. Dies kann die Selektivität des Primers reduzieren, da die Menge von Fragmenten, mit denen der Primer hybridisiert (und die hierdurch amplifiziert werden) durch diese ungewünschten Fragmenten erhöht wird. Dies kann sich insbesondere auf „analytische" AFLP-Techniken auswirken, in denen die (wiederholte) Wahl von spezifischen selektiven Basen häufig verwendet wird, um Fingerabdrücke bereit zu stellen, die direkt mit bekannten Fingerabdrücken oder Daten verglichen werden können (im Allgemeinen Fingerabdrücke oder Daten, die unter Verwenden des/der gleichen Protokolls, Restriktionsenzyme, Primer, Adapter, etc. erhalten wurden).
  • Im Allgemeinen ist das Auftreten einer Fehlpaarung in der konstanten Region der Primersequenz praktisch unmöglich, da die konstante Region des Primers so gewählt ist, dass sie exakt der (einmaligen und bekannten) Adaptersequenz entspricht.
  • In der Praxis wurde gefunden, dass, obwohl im Prinzip keine Beschränkung der Anzahl von selektiven Basen, die verwendet werden können, besteht, das Auftreten von Fehlpaarungsbanden erhöht sein kann, wenn Primer mit 4 oder mehr, und insbesondere 6 oder mehr selektiven Basen verwendet werden.
  • Allgemeiner wurde gefunden, dass, wenn Primer mit 4 oder mehr, und insbesondere mit 6 oder mehr selektiven Basen verwendet werden, nicht länger eine geeignete „Balance" zwischen der Gesamtanzahl der verwendeten Primer und der Gesamtanzahl des beabsichtigten Ziel-Templates, die amplifiziert/detektiert werden sollen, erhältlich ist. In einer repräsentativen Ausgangsmischung von Adapter-ligierten Restriktionsfragmenten können weniger als 10, oder manchmal sogar nur ein oder zwei der korrekten Templates (zwischen Tausenden von anderen Fragmenten) vorhanden sein. Dies kann nicht nur bedeuten, dass die Anzahl der vorhandenen Templates absolut betrachtet zu gering ist, sondern auch, dass die (überschüssigen) Primer Schwierigkeiten haben werden, ein korrektes Template zu finden, und an andere Adapter-ligierte Fragmente binden können, trotz einer Sequenzfehlpaarung. Sie können sogar verursachen, dass diese unerwünschten Fragmente amplifiziert werden, was zu weiteren Fehlpaarungsbanden führt. Es wurde ebenso gefunden, dass viel mehr Fehlinitialreaktion („mispriming") mit +4-Primern bei einer +1+1-Präamplifikation vorliegt, als bei einer 1+2+-Präamplifikation.
  • Im Prinzip kann das Auftreten solcher Fehlpaarungen reduziert oder sogar verhindert werden durch das Verwenden von Präamplifikationen, in denen – zum Beispiel – die Anzahl selektiver Nukleoside in jedem Primer schrittweise um eines für jede Präamplifikation erhöht wird. Jedoch ist die Durchführung von (einer) solchen seriellen oder schrittweisen Präamplifikation(en) sehr zeitaufwendig und höchst unpraktikabel, sodass die meisten Vorteile von AFLP, insbesondere die Rate und Menge, mit der wertvolle Ergebnisse erzeugt werden können, verloren gehen würden.
  • Die Verwendung von Präamplifikationen, in welchen die Anzahl der selektiven Basen schrittweise um 3 erhöht wird, würde jedoch erneut zu einer Erhöhung einer Fehlpaarungsinitialreaktion führen. Dies würde ebenso ein „Wandern" entlang eines Restriktionsfragmentes verhindern, d.h. serielle oder schrittweise Amplifikationen unter Verwenden von zum Beispiel +3-, +6-, +9- etc. Primern, welche einige wichtige praktische Anwendungen haben könnten.
  • Im Stand der Technik haben einige Publikationen die Verwendung von modifizierten oder alternativen Nukleosiden vorgeschlagen. Zum Beispiel beschreibt GB-A 2 295 228 die selektive Amplifikation einer Teilmenge von markierten Restriktionsfragmenten, wobei die Restriktionsstelle der Restriktionsendonuclease degeneriert ist (nicht identifizierte Basen enthält) und wobei entweder der Adapter oder der Primer selektive Nukleotide enthält, um den Grad der Fehlpaarungen zu reduzieren. Degenerierte Restriktionsstellen von Restriktionsendonucleasen sind Stellen, die eine Degenerierung innerhalb der Restriktionsstelle besitzen, wodurch eine Spaltung innerhalb oder außerhalb der Degenerierungsregion erfolgt, oder solche, wodurch die DNA an einer Position in einem spezifischen Abstand von einer spezifischen Erkennungssequenz gespalten wird. Um eine Fehlpaarungsinitialreaktion zu reduzieren, werden spezifische Adaptoren und/oder Primer verwendet, um die degenerierten Restriktionsstellen, die eine Fehlpaarungsinitialreaktion verursachen können, zu kompensieren.
  • Nichols et al., Nature, (1994), Bd. 369, Nr. 6480, S. 492–493 offenbart Primer, die alternative Nukleoside enthalten zur Verwendung in PCR-basierenden Verfahren. Der Artikel schlägt die Verwendung von alternativen Nukleosiden, insbesondere 3-Nitropyrrol-Analoge, vor, um Primergestaltungsprobleme zu lösen, die auf Grund der Degenerierung des genetischen Codes aufkommen. Die in dem Artikel offenbarten Primer berücksichtigen ein Fehlpaarungs-Basenpaaren und die Autoren lehren, dass der Einbau von alternativen Nukleosiden, wie 3-Nitropyrrol-Analalogen, in Primern für eine PCR, Fehlpaarungsinitialreaktionen erhöht.
  • Gegenstand der Erfindung ist es daher, AFLP zu verbessern, durch Reduzieren des Auftretens von Fehlpaarungsinitialreaktionen und/oder Reduzieren der Anzahl von Banden, welche als ein Ergebnis hiervon erhalten werden, insbesondere wenn Primer mit selektiven Basen, spezieller 2–10, insbesondere 4–8 selektiven Basen, verwendet werden.
  • Gemäß der Erfindung wurde nun gefunden, dass dies durch das Verwenden von AFLP-Primern erreicht werden, welche ein oder mehrere „alternative Nukleosid" oder „Nukleosidanaloge", wie weiterhin hierin nachfolgend beschrieben, enthalten. Im Allgemeinen sind diese alternativen Nukleoside Analoge von den bekannten natürlichen Nukleosiden, wie Adenin (A), Thymidin (T), Cytosin (C), Guanidin (G), Uracil (U), die entweder besser oder schlechter an die komplementäre Base des Templates binden und/oder weniger oder nicht selektiv an mehr als eine komplementäre Base in dem Template-Strang binden.
  • Überraschenderweise wurde gefunden, dass sogar die Verwendung von alternativen Nukleosiden, welche weniger stark an die komplementäre Base binden als die analogen Nukleoside, und dadurch das Primer/Template-Duplex destabilisieren, ebenso die Selektivität verbessern können, trotz der Tatsache, dass die Verwendung eines solchen weniger stark bindenden Nukleosids an sich zu einer (absichtlich induzierten) Fehlpaarung führen könnte, wenn dies an einer selektiven Base erfolgt. Ähnliche Erwägungen wurden für die Verwendung von nicht selektiven Nukleosiden angestellt, von denen ebenso erwartet werden würde, dass sie die Selektivität reduzieren.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher die Verwendung eines selektiven Primers, enthaltend 2–8 selektive Nukleotide an seinem 3'-Ende, wobei der Primer weiterhin ein oder mehrere alternative Nukleoside enthält, wobei es sich um ein Nukleosid handelt, das eine Veränderung in dem Basenkern, dem Zuckerrest, der Bindung zwischen dem Basenkern und dem Zuckerrest und/oder der Verknüpfung des Nukleosids mit anderen Nukleosiden in der Primersequenz oder einer beliebigen Kombination davon aufweist, verglichen mit den natürlich auftretenden Nukleosiden A, T, C und G und/oder U, wobei das alternative Nukleosid in einer Position 1–10 Basen vom 3'-Ende der Primersequenz lokalisiert ist, in selektiver Restriktionsfragmentamplifikation (AFLP). Genauer befinden sich das eine oder die mehreren alternative(n) Nukleoside) 2–8 Basen von dem 3'-Ende des Primers, bevorzugter 4–7 Basen von dem 3'-Ende des Primers.
  • Obwohl im Prinzip die meisten Fehlpaarungsbanden ein Ergebnis einer Fehlinitialreaktion an lediglich einer Position zu sein scheinen, können mehr als ein alternatives Nukleosid in einem Primer der Erfindung eingebaut werden. Der Primer wird jedoch bevorzugt weniger als drei, bevorzugter weniger als zwei, sogar noch bevorzugter nur ein alternatives Nukleosid enthalten. Falls zwei oder mehrere alternative Nukleoside vorhanden sind, können diese entweder einander benachbart in der Sequenz des Primers sein, oder durch ein oder mehrere herkömmliche Nukleotide/Nukleoside getrennt werden. In dieser Hinsicht sollte vermerkt werden, dass – in einer gegebenen Situation – dort kein enger Zusammenhang zwischen der Anzahl der Fehlpaarungen und der Anzahl der alternativen Nukleoside, die in den Primer gemäß der Erfindung eingebaut wurden, bestehen dürfte. Durch das Verwenden einer erhöhten Anzahl von alternativen Nukleosiden kann ihr Gesamteffekt erhöht sein und es kann sogar ein synergistischer Effekt erhalten werden.
  • Der Primer ist bevorzugt ein selektiver Primer, genauer ein selektiver Primer, enthaltend 2–10, bevorzugt 4–8 selektive Nukleotide. Das Nukleosidanalogon (welches im Allgemeinen in einer Position 1–10, bevorzugt 2–8, bevorzugter 4–7 Basen von dem 3'-Ende der Primersequenz sein kann), kann daher in der konstanten Region oder in der variablen Region der Primersequenz liegen (abhängig von der Anzahl der vorhanden selektiven Basen).
  • Daher hängt es im Allgemeinen von der Länge der variablen Region ab, ob die selektive Base in der variablen Region oder der selektiven Region liegt. Zum Beispiel kann die alternative Base in einem +1- bis +4-Primer in die konstante Region des Primers eingebaut werden, während sie in Primern mit 8 oder mehr selektiven Basen im Allgemeinen in der variablen Region liegen wird.
  • Es sollte jedoch vermerkt werden, dass gemäß der Erfindung das Vorhandensein eines alternativen Nukleosids in der konstanten Region ebenso die Selektivität verbessern kann, insbesondere wenn das Nukleosidanalogon/die Nukleosidanaloge vorhanden ist/sind in den ersten vier Basen benachbart zu, noch bestimmter in den zwei Basen benachbart zu der variablen Region (sofern dies im Hinblick auf sowohl die oben gegebenen möglichen Positionen für das Nukleosidanalogon als auch die Gesamtanzahl der in dem Primer vorhandenen selektiven Basen möglich ist).
  • Wenn ein so genanntes nicht selektives Nukleosid – wie weiterhin unten beschrieben – in dem variablen Teil des Primers verwendet wird, ist es am meisten bevorzugt in einer Position verwendet, die bereits durch Mittel einer Präamplifikation fixiert wurde.
  • Der Begriff Nukleosid wird hierin in seiner normalen Bedeutung des Standes der Technik verwendet, d.h. eine Purin- oder Pyrimidinbase oder ein Analogon hiervon, kovalent gebunden an einen Zuckerrest oder ein Analogon hiervon, welches ferner eine Phosphit- oder Phosphingruppe enthalten kann; und schließt Ribonukleoside, Desoxiribonukleoside (welche bevorzugt sind) und andere per se bekannte Nukleoside ein.
  • Der Begriff Nukleotid wird ebenso in seiner normalen Bedeutung verwendet, als ein Nukleosid, das eine Phosphatgruppe oder ein Analogon hiervon enthält. Wenn in dieser Offenbarung ein Nukleosid erwähnt wird, sollte verstanden werden, dass ebenso das entsprechende Nukleotid analog in einer per se bekannten Art verwendet werden kann.
  • Die hierin verwendeten alternativen Nukleoside sind Nukleoside, die eine Veränderung in dem Basenkern (d.h. dem Purin- oder Pyrimidinrest), dem Zuckerrest, der Bindung zwischen der Base und dem Zucker und/oder der Verknüpfung des Nukleosids mit anderen Nukleosiden in der Primersequenz oder einer beliebigen Kombination hiervon, verglichen mit der natürlich auftretenden Nukleosiden A, T, C, G und/oder U aufweisen können.
  • Diese Veränderung sollte zu einer veränderten Bindungsaffinität (d.h. stärker, schwächer und/oder weniger selektiv) des Primers oder eines Teils hiervon an die entsprechende Sequenz des Templates führen, verglichen mit dem entsprechenden natürlichen Primer.
  • Im Allgemeinen wird das alternative Nukleosid selbst, auf Grund seiner modifizierten Struktur, eine veränderte Bindungskapazität zu den Nukleosiden in der entsprechenden Position des Templates haben, was zu einer Veränderung in der Bindungsaffinität des Primers als Ganzes führt. Jedoch ist es ebenso möglich, dass das Vorhandensein eines alternativen Nukleosids in dem Primer (ebenso oder sogar vorherrschend) die Bindungskapazität eines beliebigen der anderen Nukleoside A, T, C und G in der Primersequenz verändert, insbesondere wenn diese Basen dicht bei dem alternativen Nukleosid in der Primersequenz liegen.
  • Weiterhin, obwohl das Nukleosidanalogon im Allgemeinen fähig ist, an die entsprechende Base in der Template-Sequenz zu binden, d.h. durch Wasserstoffbrückenbindung (zum Beispiel durch Watson-Crick-Basenpaarung oder ähnliche Interaktionen), ist dies nicht erforderlich. Zum Beispiel kann das Nukleosidanalogon ebensoein Spacermolekül (Zwischenraummolekül) oder eine ähnliche Struktur umfassen, die praktisch keine Bindungskapazität zu einem Nukleosid in dem Template besitzt.
  • Ebenso kann das alternative Nukleosid eine Veränderung in der Weise besitzen, dass es gekoppelt (d.h. gebunden) an die anderen Nukleoside in dem Primer ist, was als solches die Bindungskapazität des Zucker/Basenkerns des alternativen Nukleosids selbst nicht verändert, jedoch dennoch die Bindungskapazität des Primers als Ganzes beeinflussen kann. Solche Veränderungen in den Bindungen zwischen den Nukleosiden werden im Allgemeinen zu Veränderungen in dem Rückgrat des Primers und zu der Bildung von so genannten „Oligonukleotidanalogen" führen, wie weiter unten diskutiert.
  • Es sollte vermerkt werden, dass während der Amplifikation, der Primer – und dadurch die/das hierin enthaltene(n) alternative(n) Nukleoside) – in das Ausdehnungsprodukt eingebaut werden wird, das durch die Polymerasereaktion entlang des Templates hergestellt wird. Der dann erhaltene Strang sollte dann selbst fähig sein, als ein Template für einen weiteren Amplifikationszyklus zu dienen, um eine exponentielle Amplifikation der Originalstränge zu ermöglichen und die alternativen Nukleoside werden vorzugsweise so gewählt, dass sie dies ermöglichen, wie es dem Fachmann klar sein wird.
  • Es wird im Allgemeinen bevorzugt werden, dass das alternative Nukleosid eine vollständige Ausdehnung des Templates ermöglicht. Dies geschieht deshalb, weil - auch wenn AFLP nicht vorherrschend auf die Detektion von RFLP, jedoch vorherrschend auf die Detektion von Punktmutationen, entweder in der Restriktionsstelle oder in dem selektiven Nukleosid, gerichtet ist – jeder AFLP-Marker vorherrschend durch seine Länge identifiziert wird, sodass eine vollständige Ausdehnung wichtig ist. In so einem Fall werden die alternativen Nukleoside, die in dem Ausdehnungsprodukt vorhanden sind, gewöhnlich an oder nahe dem 5'-Ende des neuen Template-Stranges vorhanden sein (da der verwendete Primer das 5'-Ende des Ausdehnungsproduktes bildet).
  • Was im Allgemeinen beobachtet wird, wenn Nitropyrrol-basierende Primer verwendet werden, ist, dass eine lediglich teilweise Ausdehnung nicht erfolgte und ein neues Produkt von vorhersagbarer Länge erhalten wurde. Natürlich wurde dieses Produkt nicht beobachtet, wenn die Stränge, die den alternativen Primer beherbergen, visualisiert wurden. Daher beeinträchtigt dies die Verwendbarkeit von alternativen Primern, die auf dem Nitropyrrolkern basieren, nicht zu sehr.
  • Jedoch sollten beliebige alternative Nukleoside, welche möglicherweise die vollständige Ausdehnung des Primers behindern könnten, bevorzugt dennoch (mindestens bis zu einem gewissen Grad) eine exponentielle Amplifikation ermöglichen, d.h. die Stränge, die durch eine Primer-Ausdehnung gebildet werden, sollten dennoch fähig sein (mindestens in einem gewissen Ausmaß) als ein Template in einem nachfolgenden Amplifikationszyklus zu funktionieren.
  • Im Allgemeinen sind die Veränderungen, welche zu dem alternativen Nukleosid führen, generell das Ergebnis von Änderungen in der chemischen Struktur der Purin- oder Pyrimidinbase, des Zuckerrestes, der kovalenten Bindung zwischen der Base und dem Zucker und/oder der Verknüpfung des Nukleosids mit anderen Nukleosiden, verglichen mit den natürlich auftretenden Nukleosiden A, T, G, C und U.
  • Diese chemischen Veränderungen können das Hinzufügen eines oder mehrerer Atoms/Atome zu der Nukleosidstruktur, das Deletieren eines oder mehrerer Atoms/Atome aus der Nukleosidstruktur und/oder das Ersetzen eines oder mehrerer Atoms/Atome aus der Nukleosidstruktur durch eine oder mehrere verschiedenes/verschiedene Atome) oder Bindung(en), das Hinzufügen eines oder mehrerer Substituenten zu einem Nukleosid, das Ändern des Substitutionsmusters oder das Binden eines Nukleosids oder der strukturellen Einheiten hiervon (Base, Zucker, Verknüpfung) umfassen, genauso wie weitere bekannte Strategien zur Herstellung von Nukleosidanalogen, genauso wie eine beliebige Kombination hiervon. Insbesondere kann jede der strukturellen Einheiten des Nukleosids durch eine dazu analoge Gruppe ersetzt werden, so wie solche, die per se im Stand der Technik der Nukleotidchemie bekannt sind.
  • Zum Beispiel kann der Purin- oder Pyrimidinkern ersetzt sein durch die entsprechenden jeweils Aza- und Deazapurinreste oder Aza- und Deazapyrimidinreste; Xantin- und Hypoxantinkerne; Inosin- und Nebularinbasenkern; genauso wie andere substituierte oder unsubstituierte heterozyklische Basenanaloge, die per se bekannt sind, die zum Beispiel per se in WO 94/24114, Wo 96/11937, WO 96/14329 und US-A-5,645,985, genauso wie in den weiteren hierin erwähnten Referenzen diskutiert sind.
  • Ebenso können die Basenkerne durch eine beliebige Anzahl von Substituenten substituiert werden, die per se von substituierten Analogen von natürlich auftretenden Nukleosiden bekannt sind, einschließlich Substituenten wie C1-C10-Alkyl-, C1-C10-Alkenyl- und C1-C10-Alkynylgruppen, Halogenatomen, aromatischen und heteroaromatischen Gruppen, Nitrogruppen, Thiogruppen etc. Diese und andere geeignete Substituenten werden zum Beispiel per se diskutiert in WO 94/24114, WO 96/11937, WO 96/14329 und US-A-5,645,985, genauso wie in den weiteren hierin erwähnten Referenzen.
  • Zum Beispiel kann der Basenkern ersetzt werden durch eine Nitro-substituierte – insbesondere eine 3-Nitro-substituierte – Nitropyrrol-, Diazol- und Triazolgruppe oder eine andere geeignete Nitro-substituierte heterozyklische Gruppe, wie in WO 94/06810 und US-A-5,438,131 beschrieben. Von dieser Klasse von Verbindungen ist 3-Nitropyrrol insbesondere bevorzugt.
  • Nicht begrenzende Beispiele von geeigneten Basenkernen sind die 7-Deazapurinanaloge, z.B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin und 7-Deazahypoxanthin; die 9-Deazapurinanaloge, z.B. 9-Deazaadenin, 9-Deazaguanin und 9-Deazahypoxanthin; die 8-Azapurinanaloge, z.B. 8-Azaadenin, 8-Azaguanin und 8-Azahypoxanthin, die 5-Azapyrimidine (1,3,5-Triazine), z.B. 5-Azacytosin, 5- Azathymin und 5-Azauracil, die 6-Azapyrimidine (1,2,4-Triazine), z.B. 6-Azacytosin, 6-Azathymin und 6-Azauracil; die dideazaheterozyklischen Basenanaloge, z.B. 8-Aza-7-deazapurine (Pyrazolo-[3,4-d]pyrimidine), Aminoimidazolcarboxamid, passend abgeleitete 1,2,4-Triazole, Thiazole; die Selenazole; die methylierten Basenanaloge, z.B. 5-Methylcytosin, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Methylpseudouracil, N2,N2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 4-N-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Methyladenin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5'-Methoxycarbonylmethyluracil, Uracli-5-hydroessigsäure („uracil-5-oxyacetic acid") (v), Pseudouracil, 2-Thiocytosin, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil und 2,6-Diaminopurin, genauso wie 8-Oxo-N6-methyladenin und 7-Deazaxanthin. Diese und andere geeignete Basenanaloge werden zum Beispiel per se diskutiert in WO 94/24114, WO 96/14329, WO 96/11937 und US-A-5,645,985, genauso wie in den weiteren hierin erwähnten Referenzen.
  • Der Zuckerrest kann ein 2'-Desoxyriboseanteil oder ein beliebiges geeignetes Analogon hiervon sein, der/das per se aus der Nukleosidchemie bekannt ist. Solche Analoge schließen andere Pentose- oder Hexoseanteile ein, einschließlich D-Ribose-, 2'-O-Alkyl-, 2'-O-Alkyl-, 2'-Amino-, 2'-Halo-funktionalisierte Zuckerreste, genauso wie alternierende Strukturen wie ein Zyklopentanring, ein 6-gliedriger Morpholinoring und dergleichen. Zucker, die eine andere Stereochemie besitzen als die von D-Ribose, sind ebenso eingeschlossen.
  • Ebenso kann/können eine oder mehrere Hydroxylgruppe(n) in dem Zuckeranteil ersetzt werden durch – zum Beispiel – ein Halogen, ein Heteroatom, eine alphatische Gruppe, oder als Ether, Amine, Thiol und dergleichen funktionalisiert sein. Ebenso kann der Zucker Gruppen tragen, wie die oben für den Basenkern erwähnten Substituenten, genauso wie andere Substituenten für Zuckerreste, die per se aus der Nukleosidchemie bekannt sind.
  • Ebenso kann der Zuckeranteil eines Nukleosids durch eine geeignete carbozyklische Gruppe oder durch nicht zyklische Kohlenhydratgruppen ersetzt werden, die per se als Analoge von Zuckerresten in der Nukleosidchemie bekannt sind.
  • Die obigen und andere Modifikationen an dem Zuckerrest sind zum Beispiel per se diskutier in WO 94/24114, WO 96/14329, WO 96/11937 und US-A-5,645,985 ebenso wie in den weiteren hierin erwähnten Referenzen.
  • Insbesondere kann der Zuckeranteil durch einen entsprechenden Ring-geöffneten Zuckerrest, wie einer alkzyklischen Pentose (einschließlich einer alizyklischen Ribose) und Hexoseresten, ersetzt werden.
  • Die Bindungen zwischen den Nukleosiden in dem Primer können durch ein beliebiges Analogon der nativen Phosphodiestergruppe ersetzt werden, das benachbarte Nukleomonomere kovalent verkuppeln kann, einschließlich solcher „Substitutverknüpfungen" wie Phosphodiesteranaloge, z.B. Phorphorthioat-, Methylphosphonat- und Phosphoramidatverknüpfungen; genauso wie nicht Phosphor enthaltende Verknüpfungen, z.B. wie Acetale und Amide. Die Nukleoside können ebenso über eine 2'-5'-Verknüpfung anstelle der normalen 3'-5'-Verknüpfung gebunden sein. Diese und andere Veränderungen der Art, wie die Nukleotide in dem Primer miteinander verknüpft sind, was im Allgemeinen zu Veränderungen in dem Primerrückgrat führen wird, sind zum Beispiel per se diskutiert in WO 94/24114, WO 96/11937 , WO 96/14329 und US-A-5,645,985, ebenso wie in den weiteren hierin erwähnten Referenzen.
  • Die Bestandteile des „Rückgrats" des Primers können ebenso modifiziert oder sogar ersetzt werden durch eine/ein oder mehrere Aminosäure(n), Peptid(e) oder Peptidgruppe(n) und/oder Peptidbindung(en), um so genannte „Peptidnukleinsäuren" („peptide nucleic acids", PNA) bereitzustellen, wie zum Beispiel beschrieben von B. Hyrup und P.E. Nielsen (Bioorganic and Medicinal Chemistry (1996), Bd. 4, Nr. 1, S. 5–23) und von J.P. Finn et al. (Nucleic Acids Research, Bd. 24, Nr. 17, 3357–3363 (1996)). Diese PNA's können auf den nativen Nukleosiden C, G, T oder A basieren oder können ferner Analoge hiervon enthalten, wie die hierin offenbarten Kerne.
  • Die gemäß der Erfindung verwendeten alternativen Nukleoside können ebenso entfernbare Schutzgruppen enthalten, die per se für Nukleoside und Nukleosidanaloge bekannt sind, einschließlich der enzymatisch entfernbaren Gruppen aus EP-A-0 649 855.
  • Aus dem Obigen wird klar sein, dass die Erfindung nicht insbesondere auf das/die verwendete(n) alternative(n) Nukleoside) beschränkt ist: Im Prinzip können alle modifizierten Nukleoside, die geeigneterweise in einen Primer eingebaut werden können und die Bindungsaffinität des Primers an das Template verändern, verwendet werden, solange sie zu einer Reduzierung von Fehlpaarungsinitialreaktionen oder Fehlpaarungsbanden führen. Die Erfindung umfasst ebenso ein Verfahren und ein Assay zur Identifizierung von erfolgversprechenden Kandidaten durch ein Vergleichen der Fingerabdrücke, die durch +n und +(n + 1) Fingerabdrücke erzeugt wurden, wie weiterhin unten diskutiert wird.
  • Die gemäß der Erfindung verwendeten alternativen Nukleoside sind kommerziell erhältlich und/oder können in einer per se in der Nukleosidchemie bekannten Art oder mit analogen Verfahren zubereitet werden. Zum Beispiel können sie de novo aus geeigneten Ausgangsmaterialien zubereitet werden und/oder durch (weitere) Ableitung von den nativen Nukleosiden A, T, C, G, U oder bekannten synthetischen Nukleosiden. Eine Anzahl solcher Nukleosidanaloge sind im Stand der Technik zur Verwendung in PCR-Primern beschrieben worden. Gemäß der Erfindung werden sie nun verwendet, um eine Fehlpaarungsinitialreaktion in Amplifikationstechniken, insbesondere in AFLP, für welchen Zweck sie vormals nicht vorgeschlagen worden sind, zu reduzieren.
  • Beispiele von geeigneten alternativen Nukleosiden sind zum Beispiel gegeben in Wo 94/24114, WO 96/11937, WO 96114329 und US-A-5,645,985, genauso wie in den weiteren hierin erwähnten Referenzen.
  • Im Allgemeinen können die in der Erfindung verwendeten Nukleoside in selektive und nicht selektive Nukleoside unterschieden werden. Selektive Nukleotide sind Nukleotide, welche imstande sind, zu binden an, oder bevorzugt binden an, lediglich eine der Basen A, T, C, G, die in dem Template vorhanden sind. Nicht selektive Nukleotide sind imstande, mehr als eine oder sogar alle der Basen A, T, C, G in dem Template-Strang zu binden.
  • Typische Beispiele von selektiven Basen schließen die so genannten „universellen Nukleotide" ein, die im Stand der Technik bekannt sind, wie 1,2-Didesoxyribofuranose, 1,2-Didesoxy-1(C)-phenylribofuranose, die Desoxyribose von Benzimidazol, Hypoxanthin-, Xanthin-, Guanindesoxyribonukleoside, 5-Fluordesoxyuridin (paart lediglich mit A und G), (Desoxy)Inosin, etc. Andere geeignete universelle Nukleoside schließen die verschiedenen Nitropyrrol-, Nitrodiazol-, Nitrotriazol- und andere Nitro-substituierte heterozyklische Gruppen ein, die Nukleoside enthalten, beschrieben in WO 94/06810 und US-A-5,438,131.
  • Die in der Erfindung verwendeten alternativen Nukleoside können ferner als stabilisierende und destabilisierende Nukleoside klassifiziert werden. Stabilisierte Nukleoside werden in der Regel stärker an die komplementäre Base in dem Template binden als das native A, T, C oder G, und/oder durch ihr Vorhandensein das Template/Primer-Duplex stabilisieren. Destabilisierende Nukleoside werden weniger stark an die komplementäre Base binden und/oder im Allgemeinen eine Destabilisierung des Primer/Template-Hybrids bereitstellen.
  • Den Einfluss, den das Vorhandensein eines bestimmten alternativen Nukleosids in einem Primer auf die Bindungsstärke besitzt, kann in einer per se bekannten Art bestimmt werden. Zum Beispiel kann die Schmelztemperatur („melting temperature", Tm) eines Template/Primer-Duplex, in welchem der Primer das alternative Nukleosid enthält, mit dem Tm des Template/Primer-Duplex, in welchem der Primer die Nukleotide A, T, G oder C, die natürlich komplementär zu dem in dem Template vorhandenen Nukleotid sind, verglichen werden. Ein niedrigerer Tm für das Primeranalogon bedeutet eine reduzierte Bindungsstärke verglichen mit dem nativen Nukleosid, ein höherer Tm eine höhere Bindungsstärke.
  • Beispiele von in der Erfindung verwendbaren selektiven, stabilisierenden alternativen Nukleosiden sind: Nukleoside, die einen 2,6-Diaminopurinkern, wie 2,6-Diaminopurin, 5-Methyl-2'-desoxyCytidin und 5-Propynyl-2'-desoxyCytidin enthalten.
  • Beispiele von in der Erfindung verwendbaren selektiven, destabilisierenden alternativen Nukleosiden sind: N6-Methyl-2'-desoxyAdenosin, 7-Deaza-2'-desoxyAdenosin, 2-OMethyl-desoxyAdenosindA, 8-Brom-2'-desoxyAdenosin, 8-Brom-2'-desoxyGuanosin, 5-Brom-2'-desoxyCytidin, 5-Iod-2'-desoxyCytidin, 5-Brom-2'-desoxyUridin, 5-Iod-2'-desoxyUridin, 5-Fluor-2'-desoxyUridin, O6-Me-2'-desoxyGuanosin, O4-Me-Thymidin, 7-Deaza-2'-desoxyGuanosin, 3'-DesoxyAdenosin, 8-Oxo-2'-desoxyAdenosin, 7-Deaza-2'-desoxyGuanosin, 8-Oxo-2'-desoxyGuanosin, 2'-DesoxyUridin, 2-Amino-2'-desoxyAdenosin, 4-ThiodesoxyThymidin, 2-Thio-desoxyThymidin, genauso wie einen 2-Aminopurinkemrn enthaltende Nukleoside.
  • Beispiele von in der Erfindung verwendbaren nicht selektiven, destabilisierenden alternativen Nukleosiden sind: dSpacer („d-Abstandskalter"), 2'-DesoxyNebularin, 2'-DesoxyInosin, genauso wie die oben beschrieben universellen Nukleotide, einschließlich solcher mit 3-Nitropyrrol-, 4-Methylindol- oder 5-Nitroindolgruppen, die den Basenkern ersetzen.
  • Bevorzugte alternative Nukleoside sind 2,6-Diaminopurin, N6-Methyl-2'-desoxyAdenosin, 7-Deaza-2'-desoxyAdenosin, 2-OMethyl--2'-desoxyAdenosin, 8-Brom-desoxyAdenosin, Spacer-Gruppen und 5-Nitroindol enthaltende Nukleoside, genauso wie Nukleoside, die auf Inosin oder dem Inosinkern basieren.
  • Andere insbesondere bevorzugte Klassen sind solche, die 3-Nitropyrrol-, 3-Nitrodiazol-, 3-Nitrotriazol- und andere 3-Nitro-substituierte heterozyklische Gruppen als Basenkernanalogon enthalten; 3-Nitropyrrol ist besonders bevorzugt. Alternative Nukleoside, die auf dem Difluortoluenkern basieren, können ebenso von besonderem Wert sein.
  • Zur Zeit werden die besten Ergebnisse unter Verwendung von Inosin oder anderen alternativen Nukleosiden, die auf dem Inosinkern basieren, erhalten.
  • Eine weitere besonders bevorzugte Klasse von alternativen Nukleosiden sind solche, in denen der Zuckeranteil durch einen entsprechenden Ring-geöffneten Zuckerrest ersetzt wurde, wie ein alizyklischer Pentose- oder Hexoserest. Als Basenkern können diese alizyklischen Nukleoside entweder die nativen Basen A, T, G und C (welche bevorzugt sind) enthalten, genauso wie U und alle anderen oben beschriebenen analogen Basenkerne. Die Struktur und Synthese solcher alizyklischen Nukleoside ist beschrieben in Herdewijn et al., J. Med. Chem., 35, 1458 (1992) und Koster et al., Nucl. Acids Res. 12, 4539 (1984), und eine exemplarische Synthese ist in 2 gezeigt. Besonders bevorzugt sind solche alternativen Nukleoside, die eine alizyklische Ribose als den Zuckeranteil und A, T, C oder G als die Base enthalten.
  • Ein andere besonders bevorzugte Klasse von alternativen Nukleosiden können die Peptidnukleinsäuren, wie hierin oben beschrieben, sein.
  • Natürlich können einige der oben erwähnten Modifikationen oder Veränderungen der nativen Nukleosid/Nukleotidstruktur ebenso kombiniert werden, um weitere wertvolle alternative Nukleoside der Erfindung bereitzustellen. Zum Beispiel können die bevorzugten Basenkernanaloge, wie Kerne von dem Inosin- oder dem Nitropyrroltyp, mit Ring-geöffneten Zuckerresten, wie oben beschrieben, kombiniert werden.
  • In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung sind die alternativen Nukleoside dergestalt, dass sie ebenso als ein detektierbarer Marker für den Nukleinsäurestrang, in welchen sie eingebaut sind, dienen können, unter Verwenden einer beliebigen geeigneten physikalischen, chemischen oder biologischen Detektionstechnik, die per se bekannt ist.
  • Zum Beispiel können die alternativen Nukleoside ein oder mehrere radioaktives) Atome) enthalten, um so für eine Radiomarkierung bereitgestellt zu werden, wobei in diesem Fall die alternativen Nukleoside Analoge von bekannten Nukleosiden sein können, die leichter synthetisch mit einem eingebauten radioaktiven Atom in ihrer Struktur an der gewünschten Position bereitgestellt werden können, als das entsprechende native Nukleosid A, T, C oder G.
  • Die alternativen Nukleoside können ebenso derart sein, dass sie auf Grund ihrer physikalischen und/oder chemischen Struktur detektiert und/oder unterschieden werden können, zum Beispiel auf Grund ihrer chemischen Eigenschaften (d.h. Suszeptibilität für spezifische chemische Reaktionen oder Reagenzien oder spezifische Enzyme, die in der Detektion verwendet werden), ihrer physikalischen Eigenschaften (d.h. um – zum Beispiel – ein hochspezifisches Muster von kernmagnetischer Resonanz bereitzustellen) oder des Vorhandenseins von spezifisch detektierbaren Gruppen oder Strukturen, wie fluoreszierender oder phosphoreszierender Gruppen, oder Gruppen oder Strukturen, welche die Strahlung einer spezifischen Frequenz absorbieren können, um so eine spektroskopische Detektion zu ermöglichen. Ein anderer Weg, auf dem das alternative Nukleosid als ein detektierbarer Marker dienen kann, ist, dass es für eine unterscheidbare und/oder detektierbare Ausdehnung des Primers bereitgestellt wird, zum Beispiel durch das Wirken als ein Stop für die Polymerase, was in „verkürzten" Ausdehnungsprodukten resultiert.
  • Es wird klar sein, dass, wenn solch ein detektierbares alternatives Nukleosid verwendet wird, die Detektion des amplifizierten Fragments ebenso auf der Basis der spezifischen Eigenschaften des Markernukleosids, wie es in den amplifizierten Fragmenten eingebaut ist, erfolgen kann. Daher muss die Detektion der amplifizierten Fragmente gemäß dieser Ausführungsform nicht durch Gelelektrophorese oder ähnliche Techniken erfolgen. In diesem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren für die spezifische Amplifikation von PCR-Fragmenten, insbesondere AFLP-Fragmenten, durch Amplifikationsmittel, insbesondere AFLP, bei welchem ein Primer verwendet wird, der ein oder mehrere detektierbare(s) alternatives) Nukleosid(e), wie hierin offenbart, enthält und in welchem die Detektion und/oder Identifizierung der amplifizierten Fragmente auf der Basis der spezifischen Eigenschaften der detektierbaren alternativen Nukleoside erfolgt.
  • In dieser spezifischen Ausführungsform kann ein beliebiges alternatives Nukleosid, wie hierin offenbart, das es möglich macht, zwischen dem/n Nukleinsäurestrang/Nukleinsäuresträngen zu unterscheiden, in welchen/welche es eingebaut worden ist (d.h. während der Amplifikation) und einem Nukleinsäurestrang/Nukleinsäuresträngen, in welchem/welche es nicht vorhanden ist (d.h. den Fragmenten der Originalmischung) unter Verwenden einer geeigneten Detektionstechnik, als Marker verwendet werden.
  • Die Primer, die die alternativen Nukleoside enthalten, können in einer per se bekannten Art zubereitet werden, zum Beispiel durch Einbauen des alternativen Nukleosids in die Primersequenz während der Synthese hiervon. Herkömmliche Techniken zur Zubereitung von Oligonukleotiden können verwendet werden, einschließlich automatisierter chemischer Synthesen, basierend auf der Phosphamidit- oder Phosphotriesterchemie; Festphasenverfahren; genauso wie Techniken, wie eine Bruch-Translation, Zufallsinitialreaktion oder die Zubereitung von Oligonukleotiden über eine PCR. Diese und andere geeignete Techniken für die Synthese von Oligonukleotiden sind zum Beispiel per se diskutiert in WO 94/24114, WO 96/11937, WO 96/14329 und US-A-5,645,985, genauso wie in den weiteren hierin erwähnten Referenzen.
  • Es ist ebenso möglich, einen Standard-AFLP-Primer abzuleiten, um so ein oder mehrere der Nukleosid(e) A, T, G oder C, die hierin vorhanden sind, in ein alternatives Nukleosid gemäß der Erfindung umzuformen, zum Beispiel über basenspezifische oder stellenspezifische Ableitung, entweder chemisch oder enzymatisch. Zum Beispiel kann eine chemische oder enzymatische Methylierung verwendet werden.
  • Gewöhnlich wird das alternative Nukleosid verwendet, um in einer bekannten Primersequenz eines oder mehrere der Nukleotide A, T, C oder G zu ersetzen.
  • Bevorzugt wird das native Nukleotide A, T, G oder C entweder durch ein bekanntes selektives Analogon hiervon oder durch ein nicht selektives Nukleoside ersetzt. Zum Beispiel kann jedes von A, T, C oder G in einer bekannten Prmersequenz durch ein entsprechendes Aza- oder Deaza-Analogon, ein substituiertes Analogon oder eine alizyklische Ribose, die ein wie oben beschriebenes Analogon enthält, genauso wie durch ein nicht selektives 3-Nitropyrrol-enthaltendes Nukleosid ersetzt werden. Aus dem Obigen wird jedoch klar sein, dass dies nicht erforderlich ist, und dass nicht analoge und/oder destabilisierende Nukleoside genauso wie Spacermoleküle verwendet werden können, sowohl in der konstanten als auch in der variablen Region.
  • Im Allgemeinen wird die Selektivität eines Primers beibehalten oder sogar verbessert, wenn eine selektive Base in einem bekannten Primer durch ein bekanntes selektives Analogon von A, T, C oder G ersetzt wird. Trotzdem kann ebenso gemäß der Erfindung, sogar wenn eine selektive Base durch ein destabilisierendes Nukleosid oder ein nicht selektives Nukleosid ersetzt wird, eine Reduktion von einer Fehlpaarungsinitialreaktion und/oder von Fehlpaarungsbanden erreicht werden. Es kann jedoch ebenso eine feste Sequenz nach der AFLP-Präamplifikation vorhanden sein, die nicht selektive alternative Nukleoside in dem variablen Teil des Primers zulässt; andernfalls könnte eine ungewollte Amplifikation möglicherweise induziert werden.
  • In der Praxis wurde gefunden, dass das Verwenden von destabilisierenden alternativen Nukleosiden, wie Inosin-basierenden Nukleosiden, sogar Ergebnisse bereitstellen kann, die besser sind als die von stabilisierenden alternativen Nukleosiden.
  • Ebenso, wenn ein bekanntes AFLP-Protokoll durch ein Reduzieren des Auftretens oder der Intensität von Fehlpaarungsbanden zu verbessern ist, wird es im Allgemeinen bevorzugt werden, ein oder mehrere Nukleoside) in der bekannten Primersequenz durch ein bekanntes selektives Analogon hiervon zu ersetzen, um die Amplifikation der gleichen Fragmente, wie sie mit dem bekannten Protokoll amplifiziert werden, zu sichern.
  • Trotzdem sollte daran erinnert werden, dass im Allgemeinen selektive Basen in AFLP-Primern zufällig oder durch Mittel des Ausprobierens ausgewählt werden können, und dass das Gleiche für alternative Nukleoside, die in der variablen Region in den Primer der Erfindung verwendet werden, gilt („holds").
  • Im Allgemeinen können die ein alternatives Nukleosid enthaltenden Primer der Erfindung als „Olinukleotidanaloge" betrachtet werden, wie zum Beispiel in den internationalen Anmeldungen WO 94/22894 und WO 94/22883 definiert, d.h. als Verbindungen, die wie Oligonukleotide funktionieren, jedoch nicht natürlich auftretende Teile besitzen, d.h. veränderten Basenanteile, Zuckeranteile und/oder veränderte Zucker-Zwischenverknüpfungen.
  • Demgemäß können die Primer der Erfindung, welche Oligonukleotide sind, die unter diese allgemeine Definition fallen, als „Primeranaloge" betrachtet werden.
  • Diese analogen Primer können in AFLP in einer per se für AFLP-Primer bekannten Art verwendet werden. Insbesondere können sie in Verbindung mit den Adaptern verwendet werden, für die der entsprechende „native" Primer gewöhnlich verwendet wird, oder ansonsten, um den nativen Primer eines bekannten Protokolls zu ersetzen.
  • Die AFLP-Amplifikation selbst wird weiterhin in einer per se bekannten Art durchgeführt, zum Beispiel wie in EP-A-0 534 858 beschrieben, und die resultierenden amplifizierten Fragmente können visualisiert werden. Der resultierende Fingerabdruck sollte weniger Fehlpaarungsbanden und/oder eine Reduktion in der Intensität jedweder Fehlpaarungsbanden zeigen, verglichen mit Fingerabdrücken, die unter Verwenden des entsprechenden nativen Primers erhalten wurden.
  • Wie es per se in der AFLP-Technologie bekannt ist, stellt die Verwendung einiger Primer informativere Fingerabdrücke im Vergleich zu anderen bereit, abhängig von Faktoren, wie der verwendeten Ausgangs-DNA (z.B. ihrem Ursprung), des/der verwendeten Restriktionsenzyms/Restriktionsenzyme, den verwendeten Adaptern, den verwendeten Primern und insbesondere den verwendeten spezifischen selektiven Basen und der Anzahl hiervon. Ebenso kann das Auftreten von Fehlpaarungsinitialreaktionsereignissen unter Verwenden von „nativen" Primer variieren, wiederum abhängig von den obigen Faktoren, genauso wie weiteren per se bekannten Faktoren, die die Stabilität von Primer/Template-Duplexen beeinflussen können, wie die der relativen oder absoluten Anzahl von CG-Paarungen in dem Duplex, der verwendeten Hybridisierungsbedingungen, der Länge der Primer, der möglichen Bildung von Sekundärstrukturen in dem Template-Strang etc..
  • Ähnlicherweise ist es möglich, dass einige Primer der Erfindung, die alternative Nukleoside enthalten, zu besseren Ergebnisse ergeben als andere, d.h. dass sie zu informativeren Fingerabdrücken führen und/oder einen Ursprung für weniger Fehlpaarungsinitialreaktionsereignissen geben. Dies wird nicht lediglich von den oben erwähnten Faktoren abhängig sein, sondern insbesondere von dem verwendeten spezifischen analogen Primer, d.h. der Anzahl, Natur und Position der alternativen Nukleoside, die hierin vorhanden sind, möglicherweise in Verbindung mit den verwendeten Hybridisierungsbedingungen.
  • Es wird klar sein, dass es sogar möglich ist, dass einige analoge Primer der Erfindung in einer spezifischen Anwendung schlechtere Ergebnisse ergeben können als der entsprechende natürliche Primer. Ein Fachmann wird jedoch in der Lage sein – auf der Basis der hierin erfolgten Offenbarung -, analoge Primer der Erfindung auszuwählen, die am besten für jede spezifische Anwendung geeignet sind, ohne von dem Schutzbereich und dem allgemeinen erfinderischen Konzept der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
  • Im Allgemeinen können die spezifischen analogen Primer, die für eine beliebige gegebene Amplifikation zu verwenden sind, von dem Fachmann ausgewählt werden, zum Beispiel von den bekannten Primern und basierend auf allgemeinen Erfahrungen, den Eigenschaften der verwendeten analogen Nukleosiden, genauso wie von der hierin gemachten Offenbarung ausgehend. Die Auswahl der analogen Primer kann ebenso Routineexperimente oder sogar ein bestimmtes Maß des Ausprobierens einschließen, d.h. durch Wiederholen einer gegebenen AFLP- Reaktion mit einem oder mehreren anlogen Primer(n) der Erfindung, bis ein informativerer Fingerabdruck und/oder eine Reduktion von Fehlpaarungsbanden erreicht wird. Zum Beispiel können analoge Primer mit mehr (oder weniger) alternativen Nukleosiden, mit (einem) verschiedenen alternativen Nukleosid(en)2 mit dem/den alternativen Nukleosid(en) in verschiedenen Positionen in der Primersequenz und/oder mit anderen Veränderungen in der analogen Primersequenz (d.h. ihrer Geamtlänge, der Anzahl der verwendeten selektiven Basen und der verwendeten spezifischen selektiven Basen) ausprobiert werden.
  • Ebenso stellt die vorliegende Anmeldung sowohl spezifische Kriterien als auch ein spezifisches Assay zum Bestimmen und/oder zum Voraussagen des Einflusses bereit, den sowohl das Vorhandensein eines alternativen Nukleosids als auch seiner Position in der Primersequenz auf das Auftreten von Fehlpaarungsinitialreaktionen haben wird.
  • In diesem Assay wird die Anzahl von Fehlpaarungsereignissen (Banden), die mit einem Primeranalogon der Erfindung erhalten werden, mit der Anzahl von Fehlpaarungsereignissen (Banden), die mit dem entsprechenden nativen Primer erhalten werden, verglichen.
  • Durch diese Vorgehensweise kann das Auftreten von Fehlpaarungsereignissen (Banden) – separat für das Primeranalogon und den natürlichen Primer – bestimmt werden, durch das Durchführen einer Reihe von einer einzelnen +n- und vier +(n + 1)-Amplifikationen (zum Beispiel einer +3- und vier +4-Amplifikationen). In dieser Reihe von fünf Amplifikationen – welche bevorzugt parallel laufen -, werden vier +(n + 1)-Primer entsprechend zu dem +n-Primer verwendet, von denen jeder (im Wesentlichen) die gleiche Sequenz wie der +n-Primer hat, jedoch jeweils eines der nativen Nukleoside A, T, C oder G an seinem 3'-Ende als eine weitere selektive Base hat, d.h. +n-A, +n-T, +n-C und +n-G (zusammengenommen angezeigt als +n-N-Primer).
  • So werden fünf Fingerabdrücke erhalten (bevorzugt in parallelen Spuren desselben Gels), welche dann verglichen werden. Auf Grund des Vorhandenseins einer weiteren selektiven Base werden die vier +n-N-Primer weniger Banden bereitstellen als der +n-Primer; jedoch sollten die Fingerabdrücke, die mit jedem der vier +n-N-Primer erhalten werden, zusammengenommen exakt die gleichen (die gleiche Anzahl von) Banden ergeben wie der +n-Fingerabdruck. Irgendwelche weiteren Banden werden auf Fehlpaarungsereignisse zurückzurühren sein und daher eine quantitative Messung der Fehlpaarungsereignisse in der verwendeten AFLP-Reaktion bereitstellen.
  • In dem Assay der Erfindung laufen (mindestens) zwei solcher Reihen von fünf +n /+(n + 1)-Fingerabdrücken. In der ersten Fünferreihe wird ein Primeranalogon der Erfindung als +n-Primer, zusammen mit den vier entsprechenden +n-N-Analogprimern verwendet. In der zweiten Fünferreihe wird der/werden die äquivalente(n) native(n) +n- und vier +n-N-Primer verwendet. Die Anzahl der Fehlpaarungsbanden, die mit dem Primeranalogon erhalten werden, wird dann mit der Anzahl von Fehlpaarungsbanden, die mit dem nativen Primer unter den gleichen Umständen erhalten werden, verglichen. Auf diese Weise kann bestimmt werden, ob die Verwendung eines analogen Primers der Erfindung – d.h. das Vorhandensein eines oder mehrerer alternativen/alternativer Nukleosids/Nukleoside hierin und/oder die dessen/deren Position – die Anzahl von Fehlpaarungsereignissen reduziert.
  • Dieses Assay, welches weiterhin in dem experimentellen Teil beschrieben wird, kann verwendet werden, um allgemein erfolgversprechende Verbindungen zur Verwendung als alternative Nukleoside in AFLP-Primern zu identifizieren und/oder um allgemein Positionen in AFLP-Primern zu identifizieren, die für einen Ersatz durch ein alternatives Nukleosid oder durch das/die verwendete(n) spezifische(n) alternative(n) Nukleosid(en) zugänglich sind. Für solche allgemeinen Informationen können die Ergebnisse von mehreren Assays kombiniert werden.
  • In einem direkter anwendbaren Aspekt kann das Assay verwendet werden, um solche Informationen für einen spezifischen Primer, eine spezifische Anwendung und/oder eine spezifische AFLP-Reaktion zu erhalten. In jedem Fall wird das Assay der Erfindung Primeranaloge identifizieren, die eine Reduktion von Fehlpaarungsereignissen unter den Bedingungen des Assays bereitstellen (d.h. Ausgangs-DNA, Restriktionsfragmente, die hiervon erzeugt werden, verwendete Adapter etc.). Da diese Bedingungen gewöhnlich (so gewählt sind, dass sie) der beabsichtigten endgültigen AFLP-Reaktion entsprechen, können die analogen Primer, die auf diese Weise identifiziert werden, unmittelbar in diese endgültige Verwendung eingesetzt werden.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von AFLP, in welchem ein analoger Primer gemäß der Erfindung verwendet wird, um einen bekannten AFLP-Primer zu ersetzen. Bevorzugt werden der alternative Primer und der native Primer, außer dem Vorhandensein des einen oder der mehreren alternativen Nukleosids/Nukleoside, wie hierin oben definiert, identische Sequenzen besitzen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung liegt in dem Fingerabdruck, welcher durch das oben beschriebene Verfahren und/oder durch Verwenden der hierin beschriebenen analogen Primer erzeugt wurde, genauso wie in einem beliebigen Fotoausdruck oder einer anderen Repräsentation hiervon.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine spezifische Amplifikation von PCR-Fragmenten, insbesondere AFLP-Fragmenten, die nicht durch die Gelelektrophorese als ein Verfahren, um einen Fingerabdruck zu erzeugen, detektiert werden, sondern durch beliebige andere Mittel. Dieser Aspekt der Erfindung kann die Verwendung eines markierten oder auf eine andere Weise detektierbaren alternativen Nukleosids, wie hierin oben offenbart, umfassen.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Kits für AFLP, die mindestens einen analogen Primer, wie hierin oben beschrieben, in Kombination mit den Adaptern, mit denen beabsichtigt wird, die analogen Primer der Erfindung zu verwenden (d.h. mit denen die konstante Region des analogen Primers hybridisieren kann), umfasst. Die Kits können weiterhin alle bekannten Komponenten für AFLP-Kits enthalten, wie Restriktionsenzyme (in welchem Fall die Adapter bevorzugerweise geeignet sind, mit den Restriktionsstellen, die mit den Enzymen erzeugt werden, ligiert zu werden); eine Polymerase für die Amplifikation, wie die Taq-Polymerase; Nukleotide zur Verwendung in der Primerausdehnung; genauso wie Puffer und andere Lösungen und Reagenzien; etc.. Ein weiterer Verweis wird auf die Europäische Patentanmeldung 0 534 858 gemacht.
  • Die Erfindung wird nun mittels des experimentellen Teils und der hierin enthaltenen Beispiele, genauso wie der Figuren weiter illustriert, in denen:
  • 1 eine schematische Darstellung einer Template/Primer-Fehlpaarung und einer Fehlpaarungsinitialreaktion ist;
  • 2–5 DNA-Fingerabdrücke zeigen, die von AFLP-Reaktionen erhalten wurden;
  • 6 eine exemplarische Synthese der alizyklischen Nukleosidanaloge, die in der Erfindung verwendbar sind, zeigt;
  • 7 erneut einen DNA-Fingerabdruck zeigt, der von einer AFLP-Reaktion erhalten wurde.
  • Schließlich wird, obwohl die vorliegende Erfindung hierin nachfolgend unter Bezugnahme auf AFLP beschrieben wird, in Erwägung gezogen, dass die Lehre der Erfindung auf ein beliebiges Initialreaktionsereignis angewendet werden kann, in welchem das Auftreten von einer Fehlpaarungsinitialreaktion zu verhindern oder zu reduzieren ist. Die Erfindung kann daher in einer beliebigen Technik Anwendung finden, in welcher, der Bildung eines Template/Primer-Hybrids folgend, eine Ausdehnung des Primers entlang des Templates auszuführen ist, einschließlich allen per se bekannten Amplifikationstechniken.
  • Experimenteller Teil
  • A. Einleitung
  • Eine Fehlpaarung tritt selten in Standard-AFLP-Reaktionen auf, die darauf gerichtet sind, ungefähr 50–100 AFLP-Fragmente (Banden) in einem AFLP-Fingerabdruck, der einer Amplifikation folgt, zu erhalten. In den meisten AFLP-Reaktionen, insbesondere bei Pflanzen, wird dies realisiert, wenn AFLP-Primer mit einer Ausdehnung von 3 selektiven Nukleosiden (so genannten „+3-Primern") verwendet werden. Jedoch kann, wenn Primer mit mehr als drei selektiven Nukleosiden auf dem gleichen präamplifizierten Template verwendet werden, die Bildung von Fehlpaarungsbanden manchmal ein Problem werden, welches zu „kontaminierten" Fingerabdrücken und/oder einem Verlust in der Selektivität führen kann. Dies wird klar, wenn AFLP-Fingerabdrücke, die unter Verwenden von +3-Primern erhalten wurden, mit AFLP-Fingerabdrücken verglichen werden, die unter Verwenden von +4-Primern erhalten wurden, welche die gleichen drei selektiven Basen wie der +3-Primer und darüber hinaus jeweils A, C, G oder T als das vierte selektive Nukleosid enthalten. Wenn diese Fingerabdrücke der vier separaten AFLP-Amplifikationen, die diese vier +4-Primer verwenden, verglichen werden mit dem +3-Fingerabdruck, sollten lediglich Banden des ursprünglichen +3-Fingerabdrucks in dem +4-Fingerabdruck vorhanden sein. Mit anderen Worten, die vier +4-Fingerabdrücke zusammen sollten den ursprünglichen +3-Fingerabdruck ergeben. Durch eine AFLP-Fehlpaarung treten jedoch kontaminierende Banden in den Fingerabdrücken der +4-Primer auf, wie es in dem in 2 gezeigten Fingerabdruck gesehen werden kann.
  • Unerwarteterweise scheint dieses Problem erhöht zu sein, wenn die Anzahl von selektiven Basen in dem Primer erhöht ist. Wenn mehr als drei, insbesondere vier oder mehr selektive Nukleoside verwendet werden, kann die Erzeugung von Fehlpaarungsbanden die Zuverlässigkeit gefährden.
  • Im Prinzip scheinen die meisten Fehlpaarungsbanden ein Ergebnis einer Fehlinitialreaktion an lediglich einer Position zu sein (3, 4). Ebenso scheint es manchen Unterschied in der Frequenz der Fehlinitialreaktion bei identifizierten Template-Sequenzen zu geben: Dies könnte in Bezug zu der Struktur der Template-Sequenz, dem Sequenzüberschuss („sequence abundance") oder der Sequenzbevorzugung stehen.
  • Ebenso scheint es, dass eine Fehlinitialreaktion nicht abhängig ist von der Sequenz, die den selektiven Nukleosiden vorangeht. Dies wurde unter Verwenden von Templates gefunden, die mit anderen Restriktionsenzymen für eine Amplifikation zubereitet wurden, unter Verwenden von +4-Primern (5).
  • Geeignete Primer können mittels folgender Kriterien ausgewählt werden:
    • – Bei Verwenden von alternativen Primern sollte es möglich sein, Fingerabdrücke zu erhalten, d.h. das alternative Nukleosid sollte von der thermostabilen Polymerase, die in der PCR-Reaktion verwendet wird, als ein Nukleosid erkannt werden.
    • – Die Selektivität des Primers sollte verbessert werden: d.h. weniger Fehlpaarungsbanden sollten erhalten werden. Dies kann unter Verwenden des hierin beschriebenen Assays für +3- und +4-Primer analysiert werden, d.h. dass eine AFLP unter Verwenden alternativer +4-Primer weniger Fehlinitialreaktionsbanden erzeugt als die entsprechenden Standard-+4-Primer (7). Das gleiche trifft auf Primer mit mehr als 4 selektiven Nukleosiden zu: Durch ein Erhöhen der Anzahl der selektiven Nukleoside um eines jedes Mal müssen die Banden in dem Fingerabdruck eine Teilmenge von Banden in einem Fingerabdruck ohne diese erhöhte Anzahl selektiver Nukleoside sein, und Fingerabdrücke mit Primern, die mit einem von jeweils A, C, G oder T ausgedehnt werden, müssen zusammen lediglich die Banden aufweisen, die in dem Fingerabdruck ohne die erhöhte Anzahl von selektiven Nukleosiden vorhanden sind.
  • B. Grundprinzip hinter der Verwendung von ausgedehnten Primern.
  • Der Hintergrund hinter der Verwendung von ausgedehnten Primern liegt unter anderem in der Möglichkeit von Multiplexprimern: Häufig wird die maximale Auflösung in einem Polyacrylgel unter Verwenden von +3-AFLP-Primern erreicht. Wenn die Anzahl der Fragmente durch Verwenden von ausgedehnten Primern reduziert wird, könnten mehr als zwei Primern in einer Reaktion verwendet werden. Die Anzahl der in einer Reaktion verwendeten Primer könnte um 4n mit dem Erhöhen in der Anzahl der selektiven Nukleoside (n) erhöht werden. Die Erhöhung der Anzahl von informativen Fragmenten würde den Informationsgehalt eines Fingerabdrucks wesentlich verbessern. Das Grundprinzip hinter der Verwendung von ausgedehnten Primern liegt also in dem Erzielen einer Erhöhung der Konzentration bestimmter Fragmente, mit dem Ziel einer Erhöhung der Detektionsgrenze für diese Fragmente. Dies wird insbesondere dann relevant, wenn unterschiedliche Markierungen oder unterschiedliche Detektionssysteme zur Erzeugung eines Fingerabdrucks als hierin beschrieben verwendet werden, die weniger sensitiv sein mögen.
  • Für einige Genome können +3-Primer nicht verwendet werden, da sie zu viele Fragmente erzeugen, um in einem Polyacrylgel aufgegelöst zu werden (mehr als einhundert). Ein Erhöhen der Anzahl von selektiven Nukleosiden könnte dieses Problem lösen, wenn die Selektivität der Primer garantiert ist.
  • C. Detaillierte Erläuterung der Figuren.
  • 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Template/Primer-Paarung (oben) und eine Fehlpaarungsinitialreaktion an +1 (MM + 1)-, +2 (MM + 2)-, +3 (MM + 3)- und +4 (MM + 4)-Positionen in dem Primer.
  • 2 zeigt AFLP-Fingerabdrücke nach der Amplifikation mit dem radioaktiv markierten EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern 00CCT, +4totCCT, 01CCTA, 02CCTC, 03CCTG, 04CCTT, 00CGA, +4totCGA, 01CGAA, 02CGAC, 03CGAG, 04CGAT. Um die Fingerabdrücke in den Bahnen +4totCCT- und +4totCGA zu erzeugen, wurden jeweils die Primer 01CCTA, 02CCTC, 03CCTG, 04CCTT und 01CGAA, 02CGAC, 03CGAG und 04CGAT in äquimolaren Mengen zusammengefasst und die Gesamtkonzentration des MseI-Primers in solchen Reaktionen wurde genauso gehalten, als wenn lediglich ein MseI-Primer verwendet wurde. Den AFLP-Reaktionen gingen eine +1+1-Präamplifikation voraus. Dieses Bild illustriert, dass +4-Primer keine Teilmenge von Fragmenten erzeugen, die durch den entsprechenden +3-Primer erzeugt werden, dass jedoch viele kontaminierende Banden vorhanden sind. Daher erzeugen die vier +4-Primer mit A, C, T und G als das vierte selektive Nukleosid zusammen nicht den entsprechenden +3-Fingerabdruck, welches ebenso klar für die Fingerabdrücke ist, die nach einer Amplifikation mit +4totCCT und +4totCGA erzeugt werden. Für jede Bande in dem 00CGA-Fingerabdruck wird angezeigt, was das vierte selektive Nukleosid in einem MseI +4-Primer sein sollte, um diese spezifische Bande zu erzeugen: 1 zeigt ein A an (die Bande wird erzeugt mit dem Primer 01CGAA), 2 zeigt ein C an (die Bande wird erzeugt mit dem Primer 02CGAC), 3 zeigt ein G an (die Bande wird erzeugt mit dem Primer 03CGAG) und 4 zeigt ein T an (die Bande wird erzeugt mit dem Primer 04CGAT).
  • EcoRI-Primer 00AAC: 5'-GACTGCGTACCAATTC AAC-3'
    MseI-Primer 00CCT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCT-3'
    MseI-Primer 01CCTA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCTA-3'
    MseI-Primer 02CCTC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCTC-3'
    MseI-Primer 03CCTG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCTG-3'
    MseI-Primer 04CCTT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCTT-3'
    MseI-Primer 00CGA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGA-3'
    MseI-Primer 01CGAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAA-3'
    MseI-Primer 02CGAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAC-3'
    MseI-Primer 03CGAG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAG-3'
    MseI-Primer 04CGAT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAT-3'
  • 3 zeigt DNA-Fingerabdrücke, die mit dem radioaktiv markierten EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern CGA, +4tot, CGAA, CGCA, CGGA, CGTA, +4tot, CGAA, CAAA, CCAA, CTAA, CGA, +4tot, CGAC, CGCC, CGGC, CGTC, +4tot, CGAC, CAAC, CCAC, CTAC, die fähig sind, ähnliche Banden zu amplifizieren, wie angezeigt, erzeugt wurden. Fette Zeichen in der Primersequenz zeigen den Unterschied bezogen auf den CGAA- und den CGAC-Primer an. Um die Fingerabdrücke in den Bahnen +4tot zu erzeugen, wurden die Primer CGAA, CGAC, CGAG und CGAT in äquimolaren Mengen zusammengefasst und die Konzentration des MseI-Primers in solchen Reaktionen wurde genauso gehalten, als wenn lediglich ein MseI-Primer verwendet wurde. Den AFLP-Reaktionen ging eine +1+1-Präamplifikation voraus. Banden, die mit einem Sternchen angezeigt sind, sind Fehlpaarungsbanden in den +4tot-Fingerabdrücken: +4-Sequenzen auf der linken und der rechten Seite der Figur zeigen die +4-Ausdehnungen an, die Ausdehnungen für Paarungsprimer sein würden, um solche Fragmente zu erzeugen, wie von den Fingerabdrücken abgeleitet, die mit den Primern erzeugt wurden, die diese Ausdehnungen besitzen, wie oben in der Figur angezeigt.
  • Durch das Identifizieren der meisten der Fehlpaarungs-Templates, welche die Fehlpaarungsbanden in den mit +4tot, CGAA, CGAC, CGAG und CGAT erzeugten Fingerabdrücken erklären könnten, wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass eine Fehlpaarung meistens an einer Position in den Template-Molekülen auftritt.
  • EcoRI-Primer 00AAC: 5'-GACTGCGTACCAATTC AAC-3'
    MseI-Primer CGA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGA-3'
    MseI-Primer CGAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAA-3'
    MseI-Primer CGCA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGCA-3'
    MseI-Primer CGGA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGGA-3'
    MseI-Primer CGTA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGTA-3'
    MseI-Primer CAAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CAAA-3'
    MseI-Primer CCAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCAA-3'
    MseI-Primer CTAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CTAA-3'
    MseI-Primer CGAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAC-3'
    MseI-Primer CGCC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGCC-3'
    MseI-Primer CGGC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGGC-3'
    MseI-Primer CGTC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGTC-3'
    MseI-Primer CAAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CAAC-3'
    MseI-Primer CCAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCAC-3'
    MseI-Primer CTAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CTAC-3'
  • 4 zeigt DNA-Fingerabdrücke, die mit dem radioaktiv markierten EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern CGA, +4tot, CGAC, CAAC erzeugt wurden. Alle zwei Bahnen, die mit +4 beginnen, zeigen Fingerabdrücke, die mit dem gleichen MseI-Primer erzeugt wurden, jedoch wurde minus und plus ein PNA-Oligo hinzugefügt, das spezifisch das Template blockiert, das mit dem MseI-+4-Primer CAAC amplifiziert wird. Diese Figur zeigt, dass in der Tat ein Teil des Templates, das mit dem Primer CAAC amplifiziert wurde, ebenso mit dem Primer CGAC und den Primern +4tot amplifiziert wurde, da ähnliche Banden in allen Fingerabdrücken blockiert sind, wie mit Pfeilen angezeigt. In den Bahnen +4tot wurden die Primer CGAA, CGAC, CGAG und CGAT in äquimolaren Mengen zusammengefasst und die Gesamtkonzentration an MseI-Primer in diesen
  • Reaktionen wurde genauso gehalten, als wenn lediglich ein MseI-Primer verwendet wurde. Den AFLP-Reaktionen ging eine +1+1-Präamplifikation voraus.
  • EcoRI-Primer 00AAC: 5'-GACTGCGTACCAATTC AAC-3'
    MseI-Primer CGA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGA-3'
    MseI-Primer CGAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAA-3'
    MseI-Primer CGAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAC-3'
    MseI-Primer CGAG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAG-3'
    MseI-Primer CGAT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAT-3'
    MseI-Primer CAAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CAAC-3'
    PNA: 5'-CCT GAG TAA CAA C
  • 5A und 5B zeigen DNA-Fingerabdrücke, die mit dem radioaktiv markierten EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MspI-Primern 00AAC, +4totAAC, 01AACA, 02AACC, 03AACG, 04AACT, +4totCAC, 00CAC, 01CACA, 02CACC, 03CACG, 04CACT auf einem Template, welches mit EcoRI und MspI als Restriktionsenzyme hergestellt wurde, erzeugt wurden. In den Bahnen +4totAAC und +4totCAC wurden jeweils die Primer 01AACA, 02AACC, 03AACG und 04AACT und die Primer 01CAC, 02CACC, 03CACG und 04CACT in äquimolaren Mengen zusammengefasst und die Gesamtkonzentration des Msp-Primers in solchen Reaktionen wurde genauso gehalten, als wenn lediglich ein MspI-Primer verwendet wurde. Den AFLP-Reaktionen ging eine +1+1-Präamplifikation voraus.
  • Diese Figur illustriert, dass eine Fehlinitialreaktion unter Verwenden von +4-Primern nicht per se von der Enzymkombination abhängig ist.
  • MspI-Adapter 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3' 3'-TACTCAGGACTCGC-5'
  • Präamplifikationsprimer:
    EcoRI-Primer A GACTGCGTACCAATTC A
    MspI-Primer A GATGAGTCCTGAGCGG A
    MspI-Primer C GATGAGTCCTGAGCGG C
  • AFLP-Primer:
    EcoRI-Primer 00AAC GACTGCGTACCAATTC AAC
    MpeI-Primer 00AAC GATGAGTCCTGAGCGG AAC
    MpeI-Primer 01AACA GATGAGTCCTGAGCGG AACA
    MpeI-Primer 02AACC GATGAGTCCTGAGCGG AACC
    MpeI-Primer 03AACG GATGAGTCCTGAGCGG AACG
    MpeI-Primer 04AACT GATGAGTCCTGAGCGG AACT
    MpeI-Primer 00CAC GATGAGTCCTGAGCGG CAC
    MpeI-Primer 01CACA GATGAGTCCTGAGCGG CACA
    MpeI-Primer 02CACC GATGAGTCCTGAGCGG CACC
    MpeI-Primer 03CACG GATGAGTCCTGAGCGG CACG
    MpeI-Primer 04CACT GATGAGTCCTGAGCGG CACT
  • 6A zeigt eine exemplarische Synthese von den azyklischen Nukleosidanalogen, die in der Erfindung verwendbar sind. Reagenzien und Bedingungen: i, MeOH, AcCl; ii, DMF, NaH, BnBr; iiii aq. HOAc; dann NaBH4, EtOH; iv, TrCl, C5H5N; v, THF, Imidazol, NaH, CS2, Mel; vi, Bu3SnH, AIBN, Toluen; vii, p-TsOH, McOH, CH2Cl2; viii, MsCl, CH2Cl2, Et3N; ix, NaH, B; x, Cyclohexen, EtOH, Pd(OH)2; xi, DMTCl, C5H5N; xii, CIP (OCNE)N(i-Pr)2.
  • 6B zeigt ein natürliches Nukleosid (links) und ein azyklisches Nukleosid (rechts).
  • 7 zeigt DNA-Fingerabdrücke, in welchen alternative Nukleoside in den MseI-Primern verwendet wurden, um Fehlpaarungsamplifikationen abzuhelfen. Alle AFLP-Reaktionen wurden gemäß den Standardvorgehensweisen durchgeführt. Den AFLP-Reaktionen ging eine +1+1-Präamplifikation voraus. Der radioaktiv markierte EcoRI-Primer 00AAC wurde als der EcoRI-+3-Primer in allen AFLP-Reaktionen verwendet. Die Namen der Primer wurden in einer Art vergeben, dass sie die Unterschiede zwischen den Primern, die verwendet wurden, um die DNA-Fingerabdrücke zu erzeugen, illustrieren.
  • 7A: AFLP-Fingerabdrücke nach der Amplifikation mit dem EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern 00TAA, 01TAA, 02TAA, 03TAA, 04TAA, 01TA(P), 02TA(P), 03TA(P), 04TA(P), 01T(P)A, 02T(P)A, 03T(P)A, 04T(P)A. Die +3-Ausdehnung der MseI-Primer ist CAC. +4-Primer werden in Erwägung gezogen, um Fragmente zu erzeugen, die eine Teilmenge der Fragmente repräsentieren, die in den Fingerabdrücken, die mit dem +3-Primer (00TAA) erzeugt wurden, vorhanden sind. In der Sequenz der Primer, wie unten gezeigt, zeigt P die Position eines 3-Nitropyrrolrestes an.
  • EcoRI-Primer 00AAC: GACTGCGTACCAATTC AAC
    MseI-Primer 00TAA: GATGAGTCCTGAGTAACAC
    MseI-Primer 01TAA: GATGAGTCCTGAGTAACACA
    MseI-Primer 02TAA: GATGAGTCCTGAGTAACACC
    MseI-Primer 03TAA: GATGAGTCCTGAGTAACACG
    MseI-Primer 04TAA: GATGAGTCCTGAGTAACACT
    MseI-Primer 01TA(P): GATGAGTCCTGAGTA(P)CACA
    MseI-Primer 02TA(P): GATGAGTCCTGAGTA(P)CACC
    MseI-Primer 03TA(P): GATGAGTCCTGAGTA(P)CACG
    MseI-Primer 04TA(P): GATGAGTCCTGAGTA(P)CACT
    MseI-Primer 01T(P)A: GATGAGTCCTGAGT(P)ACACA
    MseI- Primer 02T(P)A: GATGAGTCCTGAGT(P)ACACC
    MseI-Primer 03T(P)A: GATGAGTCCTGAGT(P)ACACG
    MseI-Primer 04T(P)A: GATGAGTCCTGAGT(P)ACACT
  • 7B: AFLP-Fingerabdrücke nach der Amplifikation mit dem EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern TAA, TA(B), T(B)A, TA(PU) und T(PU)A. Die +3-Ausdehnung der MseI-Primer ist CAC. Lediglich die Banden, die mit einem Sternchen angezeigt sind, sind Nicht-Fehlpaarungsbanden. Die Primer TA(B) und T(B)A beinhalten einen 2-Desoxynebularinrest; die Primer TA(PU) und T(PU)A beinhalten einen 2-Aminopurinrest. In der Sequenz der Primer, wie unten gezeigt, zeigt B die Position des 2-Desoxynebularinrestes an; PU zeigt die Position des 2-Aminopurinrestes an.
  • EcoRI-Primer 00AAC: GACTGCGTACCAATTC AAC
    MseI-PrimerTAA: GATGAGTCCTGAGTAA CACA
    MseI-Primer TA(B): GATGAGTCCTGAGTA(B)CACA
    MseI-Primer T(B)A: GATGAGTCCTGAGT(B)ACACA
    MseI-Primer TA(PU): GATGAGTCCTGAGTA(PU)CACA
    MseI-Primer T(PU)A: GATGAGTCCTGAGT(PU)ACACA
  • 7C: AFLP-Fingerabdrücke nach der Amplifikation mit dem EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern 00TAA, 01TAA, 02TAA, 03TAA, 04TAA, 00(altT)AA, 01(altT)AA, 02(altT)AA, 03(altT)AA, 04(altT)AA. Die +3-Ausdehnung der MseI-Primer ist CAC. +4-Primer werden in Erwägung gezogen, um Fragmente zu erzeugen, die eine Teilmenge der Fragmente repräsentieren, die in den Fingerabdrücken, die mit dem +3-Primer (00TAA) erzeugt wurden, vorhanden sind. AltT-Primer beinhalten ein Nukleosid mit einer azyklischen Ribose, jedoch mit der Standardbase T. In der Sequenz der Primer, wie unten gezeigt, zeigt (altT) die Position des altT-Restes an.
  • EcoRI-Primer 00AAC: GACTGCGTACCAATTCAAC
    MseI-Primer 00TAA: GATGAGTCCTGAGTAACAC
    MseI-Primer 01TAA: GATGAGTCCTGAGTAACACA
    MseI-Primer 02TAA: GATGAGTCCTGAGTAACACC
    MseI-Primer 03TAA: GATGAGTCCTGAGTAACACC
    MseI-Primer 04TAA: GATGAGTCCTGAGTAACACT
    MseI-Primer 00(altT)AA: GATGAGTCCTGAG(altT)AA CAC
    MseI-Primer 01(altT)AA: GATGAGTCCTGAG(altT)AA CACA
    MseI-Primer 02(altT)AA: GATGAGTCCTGAG(altT)AA CACC
    MseI-Primer 03(altT)AA: GATGAGTCCTGAG(altT)AA CACG
    MseI-Primer 04(altT)AA: GATGAGTCCTGAG(altT)AA CACT
  • 7D: AFLP-Fingerabdrücke von zwölf Individuen einer Brassica F2-Population nach der Amplifikation mit dem EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern 02(altT)AA, 02TAA und 00TAA. Die +3-Ausdehnung der MseI-Primer ist CAC. Die +4-Primer werden in Erwägung gezogen, um Fragmente erzeugen, die eine Teilmenge der Fragmente repräsentieren, die in den Fingerabdrücken vorhanden sind, die mit dem +3-Primer (00TAA) erzeugt wurden. 02(altT)AA beinhaltet ein Nukleosid mit einer azyklischen Ribose, jedoch mit der Standardbase T. In der Sequenz der Primer, wie unten gezeigt, zeigt (altT) die Position des altT-Restes an.
  • EcoRI-Primer 00AAC: GACTGCGTACCAATTC AAC
    MseI-Primer 02(altT)AA: GATGAGTCCTGAG(altT)AA CACC
    MseI-Primer 02TAA: GATGAGTCCTGAGTAA CACC
    MseI-Primer 00TAA: GATGAGTCCTGAGTAA CAC
  • 7E: AFLP-Fingerabdrücke nach der Amplifikation mit dem EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern TAA, T(I)A, TA(I), T(altA)A. Die +4-Ausdehung der MseI-Primer ist AGCC. Lediglich die Banden, die durch ein Sternchen angezeigt sind, sind Nicht-Fehlpaarungsbanden. Die Primer T(I)A und TA(I) beinhalten einen Inosinrest; T(altA)A beinhaltet ein Nukleosid mit einer azyklischen Ribose, jedoch mit der Standardbase A. In der Sequenz der Primer, wie unten gezeigt, zeigt I die Position des Inosinrestes an; (altA) zeigt die Position des altA-Restes an.
  • EcoRI-Primer 00AAC: GACTGCGTACCAATTC AAC
    MseI-Primer TAA: GATGAGTCCTGAGTAA AGCC
    MseI-Primer T(I)A: GATGAGTCCTGAGT(I)A AGCC
    MseI-Primer TA(I): GATGAGTCCTGAGTA(I) AGCC
    MseI-Primer T(altA)A: GATGAGTCCTGAGT(altA)A AGCC
  • 7F: AFLP-Fingerabdrücke nach der Amplifikation mit dem EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern 00TAA, 00TA(I), 00T(I)A, 01TAA, 01TA(I), 01T(I)A, 02TAA, 02TA(I), 02T(I)A, 03TAA, 03TA(I), 03T(I)A, 04TAA, 04TA(I), 04T(I)A. Die +3-Ausdehnung der MseI-Primer ist CGA. Die +4-Primer werden in Erwägung gezogen, um Fragmente erzeugen, die eine Teilmenge der Fragmente repräsentieren, die in den Fingerabdrücken vorhanden sind, die mit dem +3-Primer (00TAA) erzeugt wurden. Alternative Primer beinhalten einen Inosinrest; in der Sequenz der Primer, wie unten gezeigt, zeigt I die Position des Inosinrestes an.
  • EcoRI-Primer 00AAC: GACTGCGTACCAATTC AAC
    MseI-Primer 00TAA: GATGAGTCCTGAGTAA CGA
    MseI-Primer 00TA(I): GATGAGTCCTGAGTA(I) CGA
    MseI-Primer 00T(I)A: GATGAGTCCTGAGT(I)A CGA
    MseI-Primer 01TAA: GATGAGTCCTGAGTAA CGAA
    MseI-Primer 01TA(I): GATGAGTCCTGAGTA(I) CGAA
    MseI-Primer 01T(I)A: GATGAGTCCTGAGT(I)A CGAA
    MseI-Primer 02TAA: GATGAGTCCTGAGTAA CGAC
    MseI-Primer 02TA(I): GATGAGTCCTGAGTA(I) CGAC
    MseI-Primer 02T(I)A: GATGAGTCCTGAGT(I)A CGAC
    MseI-Primer 03TAA: GATGAGTCCTGAGTAA CGAG
    MseI-Primer 03TA(I): GATGAGTCCTGAGTA(I) CGAG
    MseI-Primer 03T(I)A: GATGAGTCCTGAGT(I)A CGAG
    MseI-Primer 04TAA: GATGAGTCCTGAGTAA CGAT
    MseI-Primer 04TA(I): GATGAGTCCTGAGTA(I) CGAT
    MseI-Primer 04T(I)A: GATGAGTCCTGAGT(I)A CGAT
  • 7G: AFLP-Fingerabdrücke nach der Amplifikation mit dem EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern 01TAA, 01TA(P), 01(altT)AA, 01TA(altA), 01TA(I), 01T(I)A, 01(II)A, 01T(II) (7G.1), 04TAA, 04TA(P), 04T(P)A, 04(altT)AA, 04TA(altA), 04TA(I), 04T(I)A, 04(II)A, 04TG(II) ( 7G.2).
  • Die +3-Ausdehnung der MseI-Primer ist CAC. Lediglich die Banden, die mit einem Sternchen angezeigt sind, sind Nicht-Fehlpaarungsbanden. In der Sequenz der Primer, wie unten gezeigt, zeigt P die Position eines 3-Nitrapyrolrestes an. I zeigt die Position eines Inosinrestes an; II zeigt die Position von zwei Inosinresten an. (altA) zeigt die Position eines altA-Restes an, (altT) zeigt die Position eines altT-Restes an.
  • EcoRI-Primer 00AAC: GACTGCGTACCAATTC AAC
    MseI-Primer 01TAA: GATGAGTCCTGAGTAA CACA
    MseI-Primer 01TA(P): GATGAGTCCTGAGTA(P)CACA
    MseI-Primer 01(altT)AA: GATGAGTCCTGAG(altT)AA CACA
    MseI-Primer 01TA(altT): GATGAGTCCTGAGTA(altA) CACA
    MseI-Primer 01TA(I): GATGAGTCCTGAGTA(I) CACA
    MseI-Primer 01T(I)A: GATGAGTCCTGAGT(I)A CACA
    MseI-Primer 01(II)A: GATGAGTCCTGAG(II)A CACA
    MseI-Primer 01T(II): GATGAGTCCTGAGT(II) CACA
    MseI-Primer 04TAA: GATGAGTCCTGAGTAA CACT
    MseI-Primer 04TA(P): GATGAGTCCTGAGTA(P) CACT
    MseI-Primer 04T(P)A: GATGAGTCCTGAGT(P)A CACT
    MseI-Primer 04(altT)AA: GATGAGTCCTGAG(altT)AA CACT
    MseI-Primer 04TA(altA) GATGAGTCCTGAGTA(altA) CACT
    MseI-Primer 04TA(I): GATGAGTCCTGAGTA(I) CACT
    MseI-Primer 04T(I)A: GATGAGTCCTGAGT(I)A CAC
    MseI-Primer 04(II)A: GATGAGTCCTGAG(II)A CACT
    MseI-Primer 04T(II): GATGAGTCCTGAGT(II) CACT
  • BEISPIEL 1: AFLP-REAKTIONEN UNTER ANWENDEN VON STANDARDPRIMERN UND PRIMERN, DIE ALTERNATIVE NUKLEOSIDE BEINHALTEN AUF EINEM DNA-TEMPLATE VON BRASSICA, WELCHES UNTER VERWENDEN VON ZWEI RESTRIKTIONSENZYMEN ZUBEREITET WURDE
  • In diesern Beispiel wird eine AFLP unter Anwenden entweder von Standard-Primern oder von Primern, die alternative Nukleoside beherbergen, illustriert. Die AFLP wurde durchgeführt wie beschrieben (Zabeau und Vos, Europäische Patentanmeldung, EP 0534858 ; Vos et al. 1995 Nucl. Acids. Res. Bd. 23 Nr. 21 S. 4407–4414) und wird unten kurz beschrieben.
  • a. Isolierung und Modifizierung der DNA
  • Die gesamte Brassica (Rapsölsamen)-DNA wurde aus jungen Blättern isoliert unter Verwenden einer modifizierten CTAB-Vorgehensweise, wie beschrieben (Stewart C.J. jr. und Via L.E. 1993 BioTechniques 14, 748–750). In allen AFLP-Reaktionen wurden die Restriktionsenzyme EcoRI und MseI für die Templatezubereitung verwendet, sofern nichts anderes erwähnt ist. Genomische DNA (0,5 μg) wurde für 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten EcoRI und 5 Einheiten MseI in 40 μl 10 mM Tris.HAc pH 7,5, 10 mM mgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT, 50 ng/μl BSA inkubiert. Nachfolgend wurde 10 μl einer Lösung hinzugefügt, die 5 pMol EcoRI-Adapter, 50 pMol MseI-Adapter, 1 Einheit T4 DNA-Ligase, 1 mM ATP in 10 mM Tris.HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT, 50 ng/μl BSA enthielt, und die Inkubation wurde für 3 Stunden bei 37°C fortgesetzt.
  • Die Struktur des EcoRI-Adapter war:
    Figure 00450001
  • Die Struktur der MseI-Adapters war:
    Figure 00450002
  • Die Adapter wurden durch das Hinzufügen äquimolarer Mengen beider Stränge zubereitet; die Adapter wurden nicht phosphoryliert. Nach der Ligation wurde die Reaktionsmischung auf 500 μl verdünnt mit 10 mM Tris.HCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0 und bei –20°C gelagert. Auf die verdünnte Reaktionsmischung wird weiterhin als Template-DNA verwiesen.
  • Wenn andere Enzymkombinationen verwendet werden, werden verschiedene Adapter verwendet, die mit den kohäsiven Enden, die durch solche Enzyme erzeugt werden, kompatibel sind, die Kernsequenz der Adapter kann jedoch die gleiche bleiben wie in der verwendeten EcoRI/MseI-Enzymkombination. Es ist jedoch wichtig, dass, wenn 2 Enzyme verwendet werden, die zwei Kernsequenzen der Adaptoren, die auf die zwei klebrigen Enden passen („fit"), verschieden sind. Die Primer werden dementsprechend adaptiert.
  • b. AFLP-Präamplifikationsreaktionen
  • Die für die AFLP-Präamplifikationen (+1-Primer) verwendeten Primer werden unten beschrieben:
    EcoRI-Primer: 5'-GACTGCGTACCAATTCN-3'
    MseI-Primer: 5'-GATGAGTCCTGAGTAAN-3'
  • Die AFLP-Primer bestehen aus einem konstanten Teil und einem variablen Teil. Das N in den Primern zeigt an, dass dieser Teil des Primers variabel war. Es gibt 4 mögliche +1-Primer für jeden der EcoRI- und MseI-+1-Primer, mit den Ausdehnungen A, C, G oder T. Sie werden in der folgenden Weise angewendet: Wenn die AFLP-Reaktionsprimer (+3 oder +4) mit jeweils einem A, C, G oder T als das erste selektive Nukleosid beginnen, besitzen die Präamplifikationsprimer ebenso jeweils ein A, C, G oder G als das selektive Nukleosid.
  • In den AFLP-Präamplifikationsreaktionen wurden 20 μl Reaktionsmischungen zubereitet, die 30 ng sowohl von dem EcoRI als auch dem MseI Primer, 5 μl – Template-DNA, 0,4 Einheiten Taq-Polymerase, 10 mM Tris.HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,2 mM aller 4 dNTPs enthielten. Die Primer wurden nicht radioaktiv markiert. Die AFLP-Präamplifikationsreaktionen wurden für 20 Zyklen durchgeführt, unter Verwenden des folgenden Zyklusprofils: ein 30 Sekunden dauernder DNA-Denaturierungsschritt bei 94°C, ein 30 Sekunden dauernder Annealing-Schritt („Annäherungsschritt) bei 56°C und ein 1 Minute dauernder Ausdehnungsschritt bei 72°C. Alle Amplifikationsreaktionen wurden in einem PE-9600-Thermocycler (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT, USA) durchgeführt. Nach diesem Präamplifikationsschritt wurden die Reaktionsmischungen 20-fach mit 10 mM Tris.HCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0 verdünnt und es wird auf sie als präamplifiziertes Template für die zweite Amplfikationsreaktion (die AFLP-Reaktion) verwiesen.
  • c. AFLP-Reaktionen
  • Die für die AFLP-Amplifikationsreaktionen verwendeten Standardprimer sind wie unten dargestellt:
    EcoRI-Primer: 5'-GACTGCGTACCAATTCNNN-3'
    MseI-Primer: 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3' 5'-GTGAGTCCTGAGTAANNNN-3'
  • Die N's in den Primern zeigen an, dass dieser Teil des Primers variabel war: Es gibt im Prinzip 64 mögliche Primer mit drei selektiven Nukleosiden (NNN) und 256 mögliche Primer mit vier selektiven Nukleosiden (NNNN).
  • Die alternativen Primer besitzen grundlegend die gleiche Sequenz, jedoch kann können ein oder mehrere der Nukleosid/Nukleoside in einer beliebigen Position in dem Primer durch ein oder mehrere alternatives) Nrikleosid(e) ersetzt werden.
  • Die AFLP-Reaktionen wurden in der folgenden Weise durchgeführt: Für die AFLP-Reaktionen wurde entweder ein radioaktiv markierter EcoRI-Primer und ein nicht markierter MseI-Primer oder ein radioaktiv markierter MseI-Primer und ein nicht markierter EcoRI-Primer angewendet. Die Primer waren endmarkiert, unter Verwenden von (γ-33P)-ATP und T4-Polynukleotidkinase. Die Markierungsreaktionen wurden in 50 μl 25 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM Spermidin.3HCl durchgeführt unter Verwenden von 500 ng Oligonukleotid-Primer, 100 μCi (γ-33P)-ATP und 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase. Für die AFLP-Analyse wurden 20 μl der Reaktionsmischungen zubereitet, die 5 ng markierten Primer (0,5 μl von der Markierungsreaktionsmischung), 30 ng unmarkierter Primer, 5 μl präamplifizierte Template-DNA, 0,4 Einheiten Taq-Polymerase, 10 mM Tris.Hcl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,2 mM aller 4 dNTPs enthielten. Die AFLP-Reaktionen wurden unter Verwenden des folgenden Zyklusprofils durchgeführt: ein 30 Sekunden dauernder DNA-Denaturierungsschritt bei 94°C, ein 30 Sekunden dauernder Annealing-Schritt (siehe unten) und ein 1-minütiger Ausdehnungsschritt bei 72°C. Die Annealing-Temperatur in dem ersten Zyklus betrug 65°C, wurde nachfolgend in jedem Zyklus um 0,7°C für die nächsten 12 Zyklen reduziert und wurde bei 56°C für die verbleibenden 23 Zyklen fortgesetzt. Alle AFLP-Reaktionen wurden in einem PE-9600-Thermocycler (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT, USA) durchgeführt.
  • d. Gelanalyse der AFLP-Reaktionsprodukte
  • Nach der Amplifikation wurden die Reaktionsprodukte mit dem gleichen Volumen (20 μl) an Formamid-Farbstoff (98% Formamid, 10 mM EDTA pH 8,0 und Bromphenolblau und Xylenzyanol als Verfolgungsfarbstoffe („tracking dies")) gemischt. Die resultierenden Mischungen wurden für 3 Minuten bei 90°C erhitzt und dann schnell auf Eis abgekühlt. 2 μl jeder Probe wurde auf ein 5%-iges Denaturierungs-(Sequenzierungs-)Polyacrylamidgel (Maxam und Gilbert, 1980, Methods in Enzymology 65, 499–560) geladen. Die Gelmatrix wurde unter Verwenden von 5% Acrylamid, 0,25% Methylenbisacryl, 7,5 M Harnstoff in 50 mM Tris/50 mM Borsäure/1 mM EDTA zubereitet. Zu 100 ml der Gellösung wurden 500 μl 10%-iges APS und 100 μl TEMED hinzugefügt und die Gele wurden unter Verwenden einer SequiGen 38 × 50 cm Gelapparatur (Biorad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) gegossen. Es wurden Haifischzahnkämme („sharktooth combs") verwendet, um 97 Bahnen in den SequiGen-Geleinheiten zu ergeben. 100 mM Tris/100 mM Borsäure/2 mM EDTA wurden als Laufpuffer verwendet. Die Elektrophorese wurde bei konstanter Energie, 110 Watt, für ungefähr 2 Stunden durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele für 30 Minuten in 10%-iger Essigsäure fixiert, auf den Glasplatten getrocknet und für 16 h auf Fuji Phospho-Bildschirmen („Fuji phospho image screens") exponiert. Fingerabdrucksmuster wurden unter Verwenden eines Fuji BAS-2000 Phospho-Bildanalysesystems („phospho image analysis System") (Fuji Photo Film Company Ltd, Japan) visualisiert.
  • 2 und 5 illustrieren, dass, der Standard-AFLP-Vorgehensweise folgend, +4-Primer keine Teilmenge der Fragmente erzeugen, die durch den entsprechenden +3-Primer erzeugt werden, jedoch viele kontaminierende Banden in den Fingerabdrücken vorhanden sind. Daher erzeugen die vier +4-Primer mit A, C, G und T als das vierte selektive Nukleosid zusammen nicht den entsprechenden +3-Fingerabdruck.
  • 7 illustriert die Verwendung von MseI-Primern mit alternativen Nukleosiden, um der Fehlpaarungsamplifikation, wie in 1 illustriert, abzuhelfen.
  • BEISPIEL 2: AFLP-REAKTIONEN, DURCHGEFÜHRT AUF DEM GLEICHEN TEMPLATE UNTER VERWENDEN VERSCHIEDENER +4-PRIMER, ERZEUGEN DIE GLEICHEN PRODUKTE
  • In diesem Beispiel wird illustriert, dass verschiedene +4-Primer zum Teil ähnliche Produkte erzeugen und dass viele, wenn nicht alle; Fehlinitialreaktionsprodukte das Ergebnis einer Fehlinitialreaktion an einer Position sind.
  • Die AFLP-Präamplifikationsreaktionen wurden unter Verwenden der folgenden Primer durchgeführt:
    Präamplifikationsprimer:
    EcoRI-Primer A: 5'-GACTGCGTACCAATTC A
    MseI-Primer C: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA C
  • Die AFLP-Reaktionen wurden unter Verwenden der folgenden Primer durchgeführt:
    AFLP-Reaktionsprimer:
    EcoRI-Primer 00AAC: 5'-GACTGCGTACCAATT CAAC-3'
    MseI-Primer CGA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGA-3'
    MseI-Primer CGAA: 5'-GATGRGTCCTGAGTAA CGAA-3'
    MseI-Primer CGCA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGCA-3'
    MseI-Primer CGGA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGGA-3'
    MseI-Primer CGTA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGTA-3'
    MseI-Primer CAAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CAAA-3'
    MseI-Primer CCAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCAA-3'
    MseI-Primer CTAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CTAA-3'
    MseI-Primer CGAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAC-3'
    MseI-Primer CGCC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGCC-3'
    MseI-Primer CGGC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGGC-3'
    MseI-Primer CGTC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGTC-3'
    MseI-Primer CAAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CAAC-3'
    MseI-Primer CCAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCAC-3'
    MseI-Primer CTAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CTAC-3'
    MseI-Primer CGAG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAG-3'
    MseI-Primer CGCG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGCG-3'
    MseI-Primer CGGG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGGG-3'
    MseI-Primer CGTG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGTG-3'
    MseI-Primer CAAG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CAAG-3'
    MseI-Primer CCAG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCAG-3'
    MseI-Primer CTAG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CTAG-3'
    MseI-Primer CGAT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAT-3'
    MseI-Primer CGCT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGCT-3'
    MseI-Primer CGGT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGGT-3'
    MseI-Primer CGTT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGTT-3'
    MseI-Primer CAAT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CAAT-3'
    MseI-Primer CCAT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCAT-3'
    MseI-Primer CTAT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CTAT-3'
  • Es wurden Primer so ausgewählt, dass sie ein Nukleosid verschieden mit einem der Primer besitzen
    MseI-Primer CGAA: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAA-3'
    MseI-Primer CGAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAC-3'
    MseI-Primer CGAG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAG-3'
    MseI-Primer CGAT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CGAT-3'

    dass sie theoretischerweise zusammen lediglich Fragmente erzeugen sollten, die in dem Fingerabdruck mit dem MseI-Primer CGA vorhanden sind. Es wurde gezeigt, dass die oben aufgelisteten MseI-Primer in Kombination mit dem EcoRI-Primer 00AAC fähig sind, ähnliche Banden zu erzeugen wie die MseI-Primer CGAA, CGAC, CGAG, CGAT (3).
  • Durch das Identifizieren der meisten der Fehlpaarungs-Templates, welche die Fehlpaarungsbanden in den mit den MseI-Primern CGAA, CGAC, CGAG und CGAT erzeugten Fingerabdrücken erklären konnten, wurde geschlussfolgert, dass eine Fehlpaarung meistens an einer Position in dem Template-Molekül auftrtt.
  • Ähnliche Experimente wurden mit dem EcoRI-Primer 00AAC und jeweils den MseI-Primern AGC, CAG, CCT und CTG durchgeführt; und die +4-Primer wurden von solchen +3-Primern abgeleitet.
  • Die Fingerabdrücke wurden wiederum mit Fingerabdrücken verglichen, die mit Primern erzeugt wurden, die eine Fehlpaarung mit +4-Primern an den +2- und +3-Positionen besitzen, was zu der gleichen Schlussfolgerung führt, dass verschiedene +4-Primer zum Teil ähnliche Produkte erzeugen, und dass viele, wenn nicht alle, Fehlinitialreaktionsprodukte das Ergebnis von einer Fehlinitialreaktion an einer Position sind.
  • MseI-Primer AGC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA AGC-3'
    MseI-Primer CAG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CAG-3'
    MseI-Primer CCT: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CCT-3'
    MseI-Primer CTG: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA CTG-3'
  • BEISPIEL 3: VERWENDUNG VON PNA, UM DIE AMPLIFIKATION VON FEHLINITIALREAKTIONSPRODUKTEN ZU VERHINDERN
  • In diesem Beispiel wird illustriert, dass die Amplifikation von Produkten, die ein Ergebnis von einer Fehlinitialreaktion sind, durch das Zugeben spezifischer Peptidnukleinsäure(PNA)-Moleküle zu der Reaktion verhindert werden können, solange die Ziel-selektiven-Nukleotide bekannt sind. Hier wird demonstriert, dass einige Fehlinitialreaktionsprodukte in der Tat die Sequenz besitzen, wie in Beispiel 2 (3) abgeleitet, während die Amplifikation durch eine spezifische PNA (4) verhindert wird.
  • Die AFLP-Präamplifikationsreaktionen wurden unter Verwenden der folgenden Primer durchgeführt:
    Präamplifikationsprimer:
    EcoRI-Primer A: 5'-GACTGCGTACCAATTC A
    MseI-Primer C: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA C
  • Die AFLP-Reaktionen wurden unter Verwenden der folgenden Primer durchgeführt:
    AFLP-Reaktionsprimer:
    EcoRI-Primer 00AAC: 5'-GACTGCGTACCAATTCAAC-3'
    MseI-Primer CAAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAACAAC-3'
    MseI-Primer CGA: 5'-GATGAGTCCTGRGTAACGA-3'
    MseI-Primer CGAC: 5'-GATGAGTCCTGAGTAACGAC-3'
  • Die PNA der folgenden Sequenz wurde von PerSeptive Biosystems, Inc, Framingham, MA, erhalten:
    Figure 00530001
  • Die PNA wurde in Mengen von 0 und 35 pMolen zu den AFLP-Reaktionen hinzugefügt unter Verwenden des EcoRI-Primers 00AAC und jeweils der MseI-Primer CGA, +4tot, CGAC und CAAC. Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt. Das PNA-Oligo blockiert spezifisch das Template, das mit dem MseI-Primer CAAC amplifiziert wurde. Der Fingerabdruck zeigt, dass in der Tat ein Teil dieses Templates ebenso amplifiziert wird mit dem MseI-Primer CGAC und +4tot, da ähnliche Banden in dem Fingerabdruck blockiert werden, der AFLP-Reaktionen einschließlich PNA darstellen.
  • BEISPIEL 4: VERWENDUNG VON ALTERNATIVEN NUKLEOSIDEN IN PRIMERN ALS EINE STRATEGIE, UM DIE AMPLFFIKATION VON FEHLPAARUNGSBANDEN ZU INHIBIEREN ODER ZU VERHINDERN.
  • Alternative Nukleosiden mit azyklischen Ribosen wurden an dem Department of Organic Chemistry, Gorlaeus laboratoria, Rijksuniversiteit Leiden, Niederlande synthetisiert (6), alle anderen alternativen Nukleosiden waren kommerziell erhältlich (Glen Research, Sterling, Virginia). Alle alternativen Nukleotide wurden Standardvorgehensweisen folgend in die Primer eingebaut. Die alternativen Nukleotide wurden in einigen verschiedenen Positionen in den Primern eingebaut. Die Oligonukleotide wurden im Allgemeinen als Adapter und Primer für eine AFLP ohne weitere Reinigung verwendet, mit Ausnahme für die Primer mit Nukleosiden mit azyklischer Ribose, die nach der Synthese HPLC-gereinigt wurden.
  • 7 zeigt die Verwendung von MseI-Primern mit alternativen Nukleosiden, um einer Fehlpaarungsamplifikation abzuhelfen.

Claims (16)

  1. Verwendung eines selektiven Primers, enthaltend ein oder mehrere selektive Nukleotide an seinem 3'-Ende in selektiver Restriktions-Fragment-Amplifikation (AFLP), wobei der Primer ein oder mehrere alternative Nukleoside in einer Position 2–10 Basen von dem 3'-Ende der Primersequenz enthält, wobei das alternative Nukleosid ein Nukleosid mit einer Veränderung in dem Basenkern, dem Zuckerrest, der Bindung zwischen dem Basenkern und dem Zuckerrest, der Verknüpfung des Nukleosids mit anderen Nukleosiden in der Primersequenz oder einer beliebigen Kombination davon, verglichen mit den natürlich vorkommenden Nukleosiden A, T, C, G und U ist, und wobei in einem Primer/Template-Duplex das alternative Nukleosid weniger stark an ein Nukleosid in einer gegenüberliegenden Position in dem Template bindet verglichen mit einem natürlich vorkommenden Nukleosid, welches komplementär zu dem Nukleosid in dem Template ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, in welcher das/die eine oder mehreren alternative Nukleoside in einer Position, 8 Basen vom 3' Ende der Primer Sequenz vorhanden sind.
  3. Verwendung nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, in welcher der Primer weniger als 3 alternatives) Nukleosid(e) enthält.
  4. Verwendung nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, in welcher der Primer 2–8 selektive Nukleotide enthält.
  5. Verwendung nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, in welcher das/die eine oder mehreren alternative(n) Nukleosid(e) in einer von beiden oder beiden variablen Regionen der Primersequenz vorhanden sind und die ersten 4 Basenpositionen benachbart zu der variablen Region.
  6. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 1–5, in welcher das alternative Nukleosid ein Nukleosid ist, in welchem, verglichen mit den natürlich vorkommenden Nukleosiden A, T, C, und G der Purin- oder Pyrimidinbasenkern durch ein entsprechendes Aza- oder Deazaanalogon davon ersetzt wurde und/oder ein substituiertes Analogon davon.
  7. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 1–6, in welcher das alternative Nukleosid ein Nukleosid ist, in welchem, verglichen mit den natürlich vorkommenden Nukleosiden A, T, C und G der Purin- oder Pyrimidinbasenkern durch eine Nitro-substituierte heterozyklische Gruppe ersetzt worden ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, in welcher die Nitro-substituierte heterozyklische Gruppe eine 3-Nitro-substituierte Nitropyrrolgruppe, eine 3-Nitrosubstituierte Diazolgruppe oder eine 3-Nitro-substituierte Triazolgruppe ist.
  9. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 1–6, in welcher das alternative Nukleosid ein Nukleosid ist, in welchem verglichen mit den natürlich vorkommenden Nukleosiden A, T, C und G der Zuckerrest durch einen alizyklischen Zuckerrest ersetzt worden ist.
  10. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 1–6, in welcher der Primer eine oder mehrere Peptidnukleinsäuren als das/die alternative(n) Nukleosid(e) enthält.
  11. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 1–6, in welcher der Primer von einem an sich bekannten AFLP-Primer abgeleitet ist, durch Ersetzen eines oder mehrerer der nativen Nukleotide A, T, C oder C, in der Sequenz des genannten bekannten Primers, mit entweder einem destabilisierenden Nukleosidanalogon davon oder durch ein nicht-selektives Nukleosid.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, in welcher der Primer von einem bekannten AFLP-Primer abgeleitet ist, durch Ersetzen von einem oder mehreren der nativen Nukleotide A, T, C oder C in der Sequenz des genannten bekannten Primers, mit einem Nukleosidanalogon, das auf Inosin oder dem Inosinkern basiert.
  13. Verwendung nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, in welcher der Primer von einem bekannten AFLP-Primer abgeleitet ist, durch Ersetzen eines oder mehrerer der nativen Nukleotide A, T, C oder C in der Sequenz des genannten bekannten Primers mit einem detektierbaren und/oder unterscheidbaren Nukleosidanalogon.
  14. Verfahren zur Durchführung von AFLP, in welchem ein bekannter AFLP-Primer durch einen wie in Anspruch 1 definierten Primer ersetzt wird und die Amplifikation und wahlweise die Detektion der amplifizierten Fragmente in einer an sich bekannten Weise durchgeführt wird.
  15. Verfahren zur Durchführung von AFLP, in welchem ein bekannter AFLP-Primer durch einen wie in Anspruch 1 definierten Primer ersetzt wird, wobei die Amplifikation in einer an sich bekannten Weise durchgeführt wird, und wobei die amplifizierten Fragmente detektiert, identifiziert und/oder sichtbar gemacht werden durch eine Detektionstechnik, die auf den physikalischen, chemischen und/oder biologischen Eigenschaften von dem/den einen oder mehreren detektierbaren alternativen Nukleosiden oder von dem Nukleinsäurestrang, in welchen sie eingebaut worden sind, basieren, wobei die Detektionstechnik keine Gelelektrophorese ist.
  16. Kit für AFLP, umfassend einen wie in Anspruch 1 definierten Primer und einen doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotidadapter, wobei ein Ende des Adapters kompatibel zur Ligation an eines der beiden oder beide Enden eines Restriktionsfragments ist, wobei der Primer eine Region enthält, die komplementär zu mindestens einem Teil der Sequenz des Adapters ist, und wobei das Kit wahlweise weitere an sich bekannte Komponenten für AFLP-Kits umfasst.
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