DE69727064T2

DE69727064T2 - Verfahren zum nachweis von polynucleotid-sequenzen mittel massenspektrometrie

Info

Publication number: DE69727064T2
Application number: DE69727064T
Authority: DE
Inventors: A. Lawrence HAFF; Igor Pavlovich Smirnov
Original assignee: PerSeptive Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2004-11-11
Anticipated expiration: 2017-10-04
Also published as: EP0931166B2; DE69727064D1; WO1998014616A1; US5885775A; DE69727064T3; EP0931166B1; EP0931166A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren für die Bestimmung von Sequenzinformation in Polynucleotiden und insbesondere für die Identifizierung von Nucleotidpolymorphismen unter Verwendung von Massenspektrometrie.
Hintergrund der Erfindung
Gensondennachweise, die von der Bindung von DNA-Sonden mit ihren komplementären Basenpaaren auf einem Zielmolekül abhängen, sind unter den gebräuchlichsten durch Molekularbiologen verwendeten Nachweisen. Derartige Nachweise erfordern einen großen Zeitaufwand, um die Sonde an eine Ziel-DNA zu binden, jede überschüssige unhybridisierte Sonde zu entfernen und die hybridisierte Sonde zu analysieren.
Die zur Durchführung dieser Nachweise benötigte Zeit und die die Durchführung dieser Nachweise begleitenden Schwierigkeiten machen solche Nachweise bei einer Suche nach Einzelnucleotid-Polymorphismen (SNPs) ineffizient. Ein SNP ist eine Änderung (eine Deletion, Insertion oder Substitution) einer beliebigen einzelnen Nucleotidbase im Bereich des interessierenden Genoms. Da SNPs so häufig im humanen Genom vorkommen (ungefähr einmal alle 500 Basen), sind SNPs nützliche Marker bei der Untersuchung des humanen Genoms.
Der Nachweis von SNPs wird typischerweise unter Verwendung von automatisierten DNA-Sequenzierern durchgeführt. Jedoch werden solche Sequenzierer zur Bestimmung einer einzelnen Basenänderung innerhalb einer 500-Basen-Sequenz im allgemeinen nicht gut verwendet. Als Ergebnis ist eine SNP-Suche unter Verwendung eines Sequenzierers langsam und teuer.
Die kürzliche Entwicklung von matrixunterstützter Laserdesorptionsionisations-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-TOF MS) ermöglichte die Analyse von geringen Mengen (ungefähr 5 Femtomol) von DNA bei extremer Auflösung (Genauigkeit von 1 Dalton). Die Empfindlichkeit und Massenauflösung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist bei erhöhter Masse verringert, so dass die derzeitige obere praktische Grenze für eine Analyse von DNA ungefähr zwischen ungefähr 50 und 100 Nucleotidbasen liegt. Proben von 500 Nucleotidbasen wurden mit MALDI-TOF, aber mit geringer Auflösung und Empfindlichkeit, analysiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verfahren zur schnellen Bestimmung von Polynucleotidsequenzen mit einer geringen Arbeitsintensität und geringen Kosten pro SNP-Nachweis.
Die WO-A-94 16101 offenbart ein Verfahren zur Sequenzierung von DNA. Das Verfahren verwendet die Sanger-Sequenzierstrategie und fügt die Sequenzinformation durch Analyse der durch basenspezifische Kettentermination erhaltenen "nested"-Fragmente über ihre verschiedenen Molekülmassen unter Verwendung von Massenspektrometrie, beispielsweise MALDI- oder ES-Massenspektrometrie, zusammen. Eine weitere Erhöhung des Durchsatzes kann durch Einführung von Massenmodifikationen in dem Oligonucleotidprimer, Kettenterminationsnucleosidtriphosphaten und/oder Kettenelongationsnucleosidtriphosphaten, sowie auch unter Verwendung von integrierten Tag-Sequenzen, die eine Multiplexbildung durch Hybridisierung von tagspezifischen Sonden mit massendifferenzierten Molekulargewichten ermöglichen, erhalten werden.
Die WO-A-96 29431 offenbart Verfahren auf Grundlage eines Massenspektrometers zur Bestimmung einer besonderen Nucleinsäuresequenz in einer biologischen Probe. In Abhängigkeit von der zu bestimmenden Sequenz können die Verfahren beispielsweise zur Diagnose einer Erbkrankheit oder Chromosomenanomalität, einer Prädisposition für eine Krankheit oder ein Leiden, einer Infektion durch einen pathogenen Organismus oder zur Bestimmung von Identität oder Abstammung verwendet werden.
Die WO-A-96 27681 offenbart ein Verfahren zur Analyse einer Nucleinsäure durch Massenspektrometrie, das die Stufen: (1) Herstellen eines eine negativ-geladene nicht-Phosphat-haltige Zucker-Zucker-Verknüpfung enthaltenden Nucleinsäuremoleküls; (2) Eliminieren der Ladung von allen, oder von allen bis auf zehn Zucker-Zucker-Verknüpfungen des Nucleinsäuremoleküls; (3) Einführen des Nucleinsäuremoleküls, von dem die Ladung im ganzen oder teilweise eliminiert wurde, in ein Massenspektrometer; und (4) Bestimmen der Masse des Nucleinsäuremoleküls umfasst. Vorzugsweise hat die Nucleinsäure keine oder eine Ladung. Es wird dort ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Nucleinsäuremoleküls, das keine oder bis zu zehn negative Ladungen und keine oder bis zu 10 positive Ladungen enthält, beschrieben, wobei das Verfahren die Stufen (1) Synthetisieren einer Nucleinsäure mit einer Phosphorthioatverknüpfung oder einer Phosphorselenoatverknüpfung zwischen Zuckerresten und (2) Umsetzen der Nucleinsäure mit einem Alkylierungsmittel, damit die Ladung auf der Phosphorthioatverknüpfung oder der Phosphorselenoatverknüpfung eliminiert wird, umfasst.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß dem breitesten Aspekt der Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung einer vermuteten Punktmutation in einem Polynucleotid unter Verwendung von Massenspektrometrie nach Anspruch 1 und 2. Weitere bevorzugte Ausführungsformen werden in den abhängigen Ansprüchen 3 bis 12 beschrieben.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer vermuteten Punktmutation in einem Polynucleotid unter Verwendung von Massenspektrometrie. Das Verfahren umfasst Hybridisieren eines Primers an das Polynucleotid mit einer vermuteten Punktmutation derart, dass das 3'-Ende des Primers angrenzend an die vermutete Punktmutation hybridisiert wird; Verlängern des 3'-Endes des Primers durch Addition einer einzigen Nucleotidbase, die zu der vermuteten Punktmutation des Polynucleotids passt, wodurch ein verlängerter Primer gebildet wird, und Identifi zieren der addierten Nucleotidbase des verlängerten Primers unter Verwendung von Massenspektrometrie. In einer Ausführungsform ist die verwendete Massenspektrometrie matrixunterstützte Laserdesorptionsionisations-Flugzeit(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie. In einer Ausführungsform umfasst die Stufe des Hybridisierens des Primers die Stufen Bereitstellen eines Primers mit einer Sequenz, die an eine Polynucleotidsequenz in der Nähe einer vermuteten Punktmutation hybridisiert; Erhitzen des Polynucleotids auf eine zum Schmelzen des Polynucleotids ausreichende Temperatur; und Kühlen des Polynucleotids auf eine Temperatur, die zur Hybridisierung des Primers an das Polynucleotid ausreicht; wodurch eine Duplex, in der das 3'-Ende des Primers angrenzend an die vermutete Punktmutation liegt, gebildet wird. In einer Ausführungsform umfasst die Stufe der Verlängerung die Bereitstellung von mindestens einer Didesoxynucleosidtriphosphatbase (ddNTP) und die Bereitstellung einer Polymerase. In einer Ausführungsform ist das Polynucleotid eine DNA und die Polymerase eine DNA-Polymerase. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polynucleotid eine RNA und die Polymerase eine reverse Transkriptase.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung benützt die Verwendung eines Primers mit einem Massetag am 5'-Ende des Primers. In einer Ausführungsform ist der Massetag eine Thymidin-DNA oder ein Polythymidylatsegment, T_n, worin n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 40 ist.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Multiplexverfahren zur Identifizierung von mehrfachen vermuteten Punktmutationen in einem Polynucleotid unter Verwendung von Massenspektrometrie. Das Verfahren umfasst in einer Ausführungsform das Hybridisieren einer Mehrzahl von Primern an ein Polynucleotid mit mehreren vermuteten Punktmutationen, wobei das 3'-Ende von jedem Primer angren zend an jede vermutete Punktmutation hybridisiert wird; das Verlängern des 3'-Endes von jedem Primer durch Addition einer einzigen Nucleotidbase an jeden Primer, wobei jeweils eine einzige Nucleotidbase zu jeder vermuteten Punktmutation des Polynucleotids passt, wodurch eine Mehrzahl von verlängerten Primern gebildet wird; und das Identifizieren der addierten Nucleotidbase an jedem verlängerten Primer unter Verwendung von Massenspektrometrie. In einer Ausführungsform ist das Polynucleotid eine DNA und die Polymerase ist eine DNA-Polymerase. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polynucleotid eine RNA und die Polymerase eine reverse Transkriptase.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Identifizierung einer vermuteten Punktmutation in einer DNA unter Verwendung von Massenspektrometrie, das die Stufe Hybridisieren von zwei Oligonucleotidsonden an eine einsträngige DNA mit einer vermuteten Punktmutation in derartiger Weise, dass die zwei Sonden zusammen die vermutete Punktmutation überlappen, Ligieren der zwei Sonden zu einem ligierten einzelsträngigen Oligonucleotid nur dann, wenn die die vermutete Punktmutation überlappende Sonde die zu der Nucleotidbase der DNA an der vermuteten Punktmutation komplementäre Nucleotidbase hat, und Bestimmen der Identität der zu der vermuteten Punktmutation passenden Nucleotidbase auf dem ligierten Oligonucleotid unter Verwendung von Massenspektrometrie umfasst. In einer Ausführungsform wird die Massenspektrometrie unter Verwendung von matrixunterstützter Laserdesorptionsionisations-Flugzeit(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie durchgeführt.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein kombinatorisches Verfahren zur Bestimmung von Sequenzinformation in einem Bereich eines Polynucleotids unter Verwendung von Massenspektrometrie. Eine Ausführungsform des Verfahrens umfasst Hybridisieren eines Primers an ein Polynucleotid mit einem interessierenden Bereich derartig, dass das 3'-Ende des Primers angrenzend an den interessierenden Bereich hybridisiert wird, und Verlängern des 3'-Endes des Primers durch Addition einer Mehrzahl von Nucleotidbasen, die zu dem interessierenden Bereich des Polynucleotids passen, wodurch ein verlängerter Primer gebildet wird. In einer Ausführungsform umfasst die Verlängerungsstufe das Bereitstellen einer Mehrzahl von Nucleotidbasen, die aus der aus Desoxynucleosidtriphosphat (dNTP) und Didesoxynucleosidtriphosphat (ddNTP) bestehenden Gruppe so ausgewählt werden, dass mindestens ein Mitglied von ddNTP vorhanden ist, und das Bereitstellen einer Polymerase in einer Pufferlösung. Die Identität der addierten Nucleotidbasen auf dem verlängerten Primer wird dann unter Verwendung von Massenspektrometrie bestimmt. In einer Ausführungsform ist das Polynucleotid eine DNA und die Polymerase eine DNA-Polymerase. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polynucleotid eine RNA und die Polymerase eine reverse Transkriptase. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst das Bereitstellen einer Exonuclease für die aus der Verlängerung erhaltene Mischung, wodurch eine die Mischung von verlängerten Primern definierende Leitersequenz erzeugt wird. In einer Ausführungsform wird die Exonuclease aus der Gruppe, die aus: Phosphodiesterase Typ 1, Exonuclease I, Exonuclease III, Exonuclease V, Exonuclease VII und DNA-Polymerase III besteht, ausgewählt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein kombinatorisches Multiplexverfahren zur Bestimmung von Sequenzinformation in mehreren Bereichen eines Polynucleotids unter Verwendung von Massenspektrometrie. Das Verfahren umfasst das Hybridisieren einer Mehrzahl m von Primern an ein Polynucleotid mit mehreren interessierenden Bereichen derart, dass das 3'-Ende von jedem der Primer angrenzend an einen jeweiligen interessierenden Bereich hybridisiert wird, und das Verlängern des 3'-Endes von jedem der Primer durch einer einer Mehrzahl von Nucleotidbasen an jeden Primer, der zu einem jeweils interessierenden Bereich des Polynucleotids passt, wodurch eine Mehrzahl von verlängerten Primern gebildet wird. In einer Ausführungsform umfasst die Verlängerungsstufe das Bereitstellen einer Mehrzahl von Nucleotidbasen, die aus der aus Desoxynucleosidtriphosphat (dNTP) und Didesoxynucleosidtriphosphat (ddNTP) bestehenden Gruppe so ausgewählt werden, dass mindestens ein Mitglied von ddNTP vorhanden ist, und das Bereitstellen einer Polymerase in einer Pufferlösung. In einer Ausführungsform ist das Polynucleotid eine DNA und die Polymerase eine DNA-Polymerase. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polynucleotid eine RNA und die Polymerase eine reverse Transkriptase. Die Identität der addierten Nucleotidbasen an jedem verlängerten Primer wird unter Verwendung von Massenspektrometrie bestimmt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die obigen und anderen Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie die Erfindung selbst werden aus der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen besser verstanden, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird, wobei:
1 ein hochschematisches Diagramm einer Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung einer einzigen vermuteten Punktmutation oder einer polymorphen Stelle in einer DNA unter Verwendung von PCR ist;
2 die Ergebnisse eines Einzelnucleotidpolymorphismus(SNP)-Nachweises unter Verwendung einer Primerverlängerungsreaktion mit: ddA, Linie A; ddC, Linie B; ddG, Linie C; ddT, Linie D; und die vier ddNTPs, Linie E; darstellt;
3 ein hochschematisches Diagramm einer Ausführungsform des Nachweises, die zur Bestimmung von heterozygoten Einzelnucleotidpolymorphismen verwendet wird, ist;
4 ein Diagramm eines Massenspektrums der Ergebnisse eines durchgeführten Einzelnucleotidpolymorphismusnachweises in Gegenwart von allen vier ddNTPs mit einer heterozygoten Probe mit C und T an der variablen Stelle ist;
5 ein hochschematisches Diagramm einer Ausführungsform eines Nachweises, die zur Bestimmung von mehreren Einzelnucleotidpolymorphismen verwendet wird, unter Verwendung von Massetags ist;
6a ein Massenspektrum von fünf Primern mit Massetags, die bei der Durchführung eines Multiplexnachweises von Einzelnucleotidpolymorphismen für die BRCA1-Einzelpunktmutationen verwendet wurden, R355, R377, R400, R421 und R447, ist;
6b ein Massenspektrum der Ergebnisse des Multiplexnachweises, der in der Gegenwart der fünf Primer, deren Massenspektrum in 6a gezeigt ist, durchgeführt wurde, ist;
6c ein Massenspektrum von sieben Primern mit Massetags, die bei der Durchführung eines Multiplexnachweises von Einzelnucleotidpolymorphismen für die BRCA1-Einzelpunktmutationen verwendet wurden, F320, R355, R377, R400, R421, R480 und R447, ist;
6d ein Massenspektrum der Ergebnisse des in Gegenwart der sieben Primer, deren Massenspektrum in 6c gezeigt ist, durchgeführten Multiplexnachweises ist;
6e ein Massenspektrum von sieben Primern mit Massetags, die bei der Durchführung eines Multiplexnachweises von Einzelnucleotidpolymorphismen für die BRCA1-Einzelpunktmutationen verwendet wurden, R355, R377, R400, R421 und R447, und für die lacz-Einzelpunktmutation verwendet wurde, (b2-1), ist;
6f ein Massenspektrum der Ergebnisse des in Gegenwart der sieben Primer, deren Massenspektrum in 6f gezeigt ist, durchgeführten Multiplexnachweises ist;
7 ein hochschematisches Diagramm einer Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung einer einzigen vermuteten Punktmutation in einer doppelsträngigen DNA unter Verwendung von Ligase ist;
8 ein Massenspektrum der Ergebnisse eines Ligasenachweises unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde mit einem Massetag ist;
9a ein Massenspektrum der Ergebnisse eines Ligasenachweises einer heterozygoten DNA unter Verwendung von mehreren Oligonucleotidsonden mit Massetags ist;
9b ein hochschematisches Diagramm einer Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung einer einzigen vermuteten Punktmutation unter Verwendung von Ligase in einer heterozygoten DNA-Probe ist;
10 ein hochschematisches Diagramm einer Ausführungsform eines kombinatorischen Nachweises, der zur Bestimmung der Gegenwart von mehr als einer Nucleotidmutation an einer vermuteten Mutationsstelle verwendet wurde, ist;
11 ein Massenspektrum der Ergebnisse des kombinatorischen Nachweises unter Verwendung einer Polymerase ist;
12 ein hochschematisches Diagramm eines kombinatorischen Nachweises, der zur Bestimmung der Gegenwart von mehr als einer Nucleotidmutation an einer vermuteten Mutationsstelle, gefolgt von einer Verdauung durch eine Exonuclease verwendet wurde, ist;
13 ein hochschematisches Diagramm eines kombinatorischen Multiplexnachweises an einer DNA, die mehrere vermutete Mutationsstellen von mehr als einer Nucleotidbasenmutation hat, ist;
14 ein hochschematisches Diagramm einer Ausführungsform eines zur Anwendung der Erfindung in der Praxis verwendeten Instruments ist; und
15 ein Flussdiagramm einer Ausführungsform eines Algorithmus, der zusammen mit dem in 14 gezeigten Instrument verwendet wird, ist.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Gemäß dem breitesten Aspekt der Erfindung erfolgt die Bereitstellung einer Familie von Verfahren zur Bestimmung von Sequenzinformation in Polynucleotiden durch Kombination der jungen, ungleichen Verfahren von Massenspektrometrie und Polynucleotidhybridisierungs-, Amplifizierungs-, Verlängerungs- und/oder Ligationsverfahren. Im allgemeinen umfasst das Verfahren zur Bestimmung von Sequenzinformation in einem Probenpolynucleotid in einer ersten Stufe das Hybridisieren eines Probenpolynucleotids mit einer oder einer Mischung von Oligonucleotidsonden mit einer zu einem Teil des Probenpolynucleotids komplementären Nucleotidsequenz, wodurch ein Komplex gebildet wird. Dann wird in einer zweiten Stufe der Komplex in Kontakt mit einem Mitglied, das aus der aus Nucleosiden, Didesoxynucleosiden, Polymerasen, Nucleasen, Transkriptasen, Ligasen und Restriktionsenzymen bestehenden Gruppe ausgewählt wird, gebracht, damit mindestens eine Untergruppe der Oligonucleotidsonden verändert wird. In einer dritten Stufe liefert das Verfahren die Bestimmung des Molekulargewichts von mindestens der Untergruppe von veränderten Sonden durch Massenspektrometrie und die Folgerung der Sequenzinformation des Probenpolynucleotids aus demselben.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Identifizierung von Nucleotidpolymorphismen unter Verwendung von Massenspektrometrie. In der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung werden die Ausdrücke "vermutete Punktmutation" oder "Einzelnucleotidpolymorphismus" austauschbar verwendet und sollen eine beliebige Modifikation in einer Polynucleotidsequenz, die zu einer einzigen Nucleotidbasenmutation wie einer Insertion, Deletion oder Substitution einer einzigen Nucleotidbase, führt, bedeuten. Es ist beabsichtigt, dass der Ausdruck "vermutete Mutationsstelle" eine beliebige Modifikation in einer Polynucleotidsequenz, die zu einer Mutation von mehreren Nucleotidbasen aufgrund einer Insertion, Deletion oder Substitution von mehreren Nucleotidbasen oder einer Kombination derselben führt, bedeutet. Es ist beabsichtigt, dass der Ausdruck "Bereich" einen Teil der Sequenz eines Polynucleotids bedeutet.
In einem kurzen Überblick und unter Bezug auf 1 umfasst das Verfahren zur Identifizierung einer vermuteten Einzelpunktmutation 10 in einer DNA 20 in einer Ausführungsform, zuerst (Stufe 1) das Trennen der Stränge der doppelsträngigen DNA in zwei einzelne Stränge, von denen einer der Zielstrang 22 mit der interessierenden vermuteten Punktmutation 10 ist. Als nächstes (Stufe 2) wird eine Primersequenz 30 mit einer Sequenz von Basen, die komplementär zu den Basen des Zielstrangs 22 bis einschließlich der Base 24, die an die vermutete Punktmutation 10 angrenzt, ist, mit dem Zielstrang 22 assoziiert.
Jede der möglichen komplementären Basen 36, 36', in der Form von Didesoxynucleotiden, wird (Stufe 3) zusammen mit einer DNA-Polymerase zu dem Primer-Target-DNA-Komplex gegeben. Die Didesoxynucleotidbase 36, die komplementär zu der vermuteten Punktmutation 10 ist, wird in die Primersequenz 30 unter Bildung eines verlängerten Primers 30' eingebaut (Stufe 4). Da der Primer 30' nun eine Didesoxynucleotidbase 36 am Ende hat, sind keine weiteren Additionen möglich.
Die Primersequenz 30' mit der addierten Didesoxynucleotidbase 36 wird als nächstes mit einem Massenspektrometer analysiert (Stufe 5). Es wird festgestellt, dass bei Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie der Primer-Target-DNA-Komplex bei dem Laserdesorptionsionisationsverfahren der MALDI-TOF-Massenmessung vollständig dissoziiert wird. Die Masse des Primers 30' mit der zusätzlichen Masse der Didesoxynucleotidbase 36 wird bestimmt (Vergleichsmasse in Tabelle 1 gezeigt), und durch Subtraktion der ursprünglichen Masse des Primers 30 wird die Masse der Didesoxynucleotidbase 36 und damit die Art der Didesoxynucleotidbase 36 bestimmt. Dadurch, dass die Identität der addierten Didesoxynucleotidbase 36 bekannt ist, wird die Identität der komplementären vermuteten Punktmutation 10 gemäß den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung daraus abgeleitet.
Tabelle 1: Didesoxy- und Desoxy-nucleotidbasen
Genauer gesagt, werden die DNA 20 denaturiert (Stufe 1) und die zwei Stränge der DNA 20, beispielsweise durch Erhitzen der nativen DNA auf ungefähr 90–99°C während 10 bis 60 s, getrennt. Der Primer 30 wird dann mit einer Konzentration im Bereich von ungefähr beispielsweise 0,1 μM bis ungefähr 10 μM, vorzugsweise 1 μM, zugegeben. Der Primer 30 enthält vorzugsweise 15–50 Nucleotidbasen und ist so ausgerichtet, dass die Base 26, die komplementär zu der an die vermutete Punktmutation 10 auf dem Zielstrang der DNA 22 angrenzenden Base 24 ist, an dem 3'-Ende des Primers 30 lokalisiert ist. Das Gemisch von Primer 30 und Ziel-DNA 22 wird auf zwischen 37 und 72°C gekühlt, damit der Primer 30 an die Ziel-DNA 22 assoziiert und hybridisiert werden kann (Stufe 2). Die nächste Stufe (Stufe 3) besteht aus der Zugabe von Didesoxynucleotidbasen 36, 36', einer Polymerase und einem geeigneten Puffer zu dem Gemisch, um das 3'-Ende des Primers 30, der an die Ziel-DNA 22 gebunden ist, zu verlängern. Diese Stufe wird unter Verwendung von Standard-DNA-Polymerasetechnologie ausgeführt. Die an den Primer 30 addierte Base 36 ist komplementär zu der vermuteten Punktmutation 10 (Stufe 4).
In bestimmten Ausführungsformen wird die Addition einer Didesoxynucleotidbase 36 an den Primer 30 unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, beispielsweise einer Taq-Polymerase, AmpliTaq-FS oder Thermosequenase, oder al ternativ durch Verwendung einer üblichen thermolabilen DNA-Polymerase, wie Klenow-, T7- oder Sequenase-DNA-Polymerase, durchgeführt. Vorzugsweise wird Thermosequenase verwendet. Bei Verwendung einer thermostabilen Polymerase umfasst der Nachweis, in einer Ausführungsform, eine Primerverlängerungsamplifikation durch wiederholte Zyklen von: 1) DNA-Denaturierung durch Erhitzen über den Schmelzpunkt der DNA-Probe; 2) Binden oder Hybridisieren des Primers an die DNA durch Abkühlen auf eine geeignete Temperatur; und 3) Verlängern des Primers durch Addition einer Nucleotidbase. Eine derartige Amplifikation erhöht das Molekülverhältnis von dem verlängerten Primer 30' zu der DNA-Probe. Dieses führt auch zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit des Nachweises, was den Nachweis einer polymorphen Stelle in einer DNA-Probe mit einer pikomolaren Konzentration (pM) ermöglicht. Jedoch ist, wenn eine übliche thermolabile DNA-Polymerase verwendet wird, im allgemeinen nur ein Thermozyklus möglich, da die Aktivität von diesen Enzymen während der Denaturierungsstufe verloren geht, sofern nicht frisches Enzym bei jedem Thermozyklus zugegeben wird.
Die zur Primerverlängerungsamplifikation benötigte Zahl von Thermozyklen bei einem beliebigen Nachweis hängt von der Anfangskonzentration der DNA-Probe und der Empfindlichkeitsschwelle des Massenspektrometers ab. Bei einem beliebigen Thermozyklus ist der maximale Anstieg der molaren Konzentration des verlängerten Primers gleich der molaren Konzentration der DNA-Probe unter der Annahme, dass alle anderen Komponenten, d. h. der Primer 30 und die Nucleotidbasen 36, 36', im Überschuss vorhanden sind. Die Konzentration des verlängerten Primers wird bei jedem Thermozyklus um eine Menge erhöht (die Mengeneinheit ist die Konzentration der DNA-Probe). In bestimmten Ausführungsformen, bei denen die Konzentration der DNA-Probe unter der Empfindlichkeitsschwelle des Massenspektrometers ist, wird ein großer Überschuss von Primer gegenüber der DNA-Probe in Kombination mit mehreren Thermozyklen verwendet, um das Niveau der Konzentration des verlängerten Primers über die Empfindlichkeitsschwelle des Massenspektrometers zu bringen. In diesem Fall ist das Molekülverhältnis des Primers 30 zu der DNA 20 im Bereich von ungefähr 1 : 1 bis ungefähr 50 : 1, wenn bis zu 50 Thermozyklen verwendet werden, und vorzugsweise von ungefähr 1 : 1 bis ungefähr 25 : 1, wenn bis zu 25 Thermozyklen verwendet werden.
Der in Kombination mit der Polymerase verwendete Puffer ist ein Puffer, der kompatibel mit einem Primerverlängerungsverfahren ist. Jedoch erzeugt die Verwendung eines ein Alkalimetall enthaltenden Puffers DNA-Addukte, die die Interpretation der Massenspektren kompliziert machen, und derart die Identifizierung des Polymorphismus schwieriger machen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Puffer eine flüchtige Säure-Base-Kombination, die keine DNA-Addukte bildet. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Puffer Ammoniumacetat oder Ammoniumformiat. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Puffer Ammoniumacetat in einer Konzentration im Bereich von 25 mM bis 100 mM. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist in dem Puffer ein Polymerase-Cofaktor, wie Magnesiumchlorid oder Magnesiumacetat, enthalten. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform besteht der Puffer aus 25–100 mM Ammoniumacetat mit 1,5 mM Magnesiumacetat.
Nachdem der Primer verlängert wurde, wird die Identität der addierten Nucleotidbase 36 dann durch Massenspektrometrie durch Vergleich der Massen des verlängerten Primers 30' und des Primers 30 bestimmt (Stufe 5). Die Massendifferenz zwischen den zwei Primern kennzeichnet die spezifische Nucleotidbase 36, die an den Primer 30' addiert wurde (siehe Tabelle 1). Nachdem die Identität der Nucleotidbase 36 an dem verlängerten Primer 30' bestimmt wurde, wird die Identität der Nucleotidbase an der vermuteten Punktmutation 10 auf der DNA 22 gemäß den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung leicht abgeleitet. In einer Ausführungsform wird die Massenspektrometrieanalyse unter Verwendung von Elektrospray-, matrixunterstützte Laserdesorptionsionisation (MALDI), Fast-Atom-Bombardment-Ionisation (FAB) oder Plasmadesorptionsionisation durchgeführt. In weiteren Ausführungsformen wird die Massenspektrometrieanalyse unter Verwendung von Flugzeit(TOF)-, Quadrupol-, Ionenfalle- und Sektoranalysemoden durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Massenspektrometrieanalyse unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie ausgeführt.
In Bezug auf 2 werden die Ergebnisse eines Einzelnucleotidpolymorphismus(SNP)-Nachweises unter Verwendung einer Primerverlängerungsreaktion mit einer Polymerase gezeigt. Für dieses Experiment bestand die Ziel-DNA aus der Sequenz lacI (Wildtyp "C") 5'-CTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATT-3' (SEQ ID NO: 1), in der C für die vermutete Punktmutation 10 steht. Zum Zweck einer Primerverlängerungsamplifikation wurde Thermosequenase, eine genetisch veränderte Form von T7-DNA-Polymerase, von Amersham Life Science (Arlington Heights, Illinois, USA) zur wiederholten Verlängerung des Primers 2'-TTGACCGCCCGTTTGTCAGC-5' (SEQ ID NO: 2) verwendet. Der Primer war in 2,5 × molarem Überschuss über die Ziel-DNA vorhanden und es wurde bestimmt, dass ungefähr eine Hälfte des Primers in einem einzigen Thermozyklus von 95°C während 10 s, 37°C während 60 s und 72°C während 60 s umgewandelt wurde. Im wesentlichen der gesamte Primer wurde in drei Zyklen verlängert. Wenn, wie in 2 gezeigt, Didesoxyadenosintriphosphat (ddATP) (Linie A) und Didesoxycytidintriphosphat (ddCTP) (Linie B) individuell als Base 36' zugegeben wurden, wurde im wesentlichen keine der zugegebenen Didesoxy nucleotidbasen in den Primer 30 eingebaut. Wenn Didesoxyguanosintriphosphat (ddGTP) (Linie C) als Base zugegeben wurde, wurde der gesamte Primer 30 zu dem verlängerten Primer 30' mit einer zusätzlichen Didesoxyguanylat(ddG)-Base umgewandelt. Wenn Didesoxythymidintriphosphat (ddTTP) als Base zugegeben wurde (Linie D), wurde ein kleiner Anteil der Didesoxythymidylatbase (ddT) nicht-spezifisch an den Primer addiert. Wenn jedoch alle vier Didesoxynucleotide (Linie E) zusammen zugegeben wurden, wurde wieder nur das Didesoxyguanylat in den Primer eingebaut.
Unter Bezugnahme auf 3 enthalten, wenn das Verfahren zur Untersuchung von Einzelnucleotidpolymorphismen in einer heterozygoten Probe verwendet wird, die DNA-Stränge 22, 22' der heterozygoten Probe jeweils eine unterschiedliche Nucleotidbase 10 bzw. 10' an der vermuteten Punktmutation. In dem gezeigten Beispiel enthält die Probe ein 1 : 1-Gemisch der Ziel-DNA mit Cytosin oder Thymin an den vermuteten Punktmutationen 10 bzw. 10'. Wie oben beschrieben wird die DNA denaturiert und jeder der Ziel-Stränge 22, 22' mit dem Primer 30 hybridisiert (Stufe 1). Die vier Didesoxynucleotidbasen werden dann zusammen mit der Polymerase und einem Puffer, wie oben beschrieben, zugegeben. Die Didesoxynucleotidbasen 36, 36'', die zu den vermuteten Punktmutationen 10 bzw. 10' komplementär sind, verlängern dadurch den Primer 30 (Stufe 2). In dem gezeigten Beispiel wird der Primer 30, der an die Ziel-DNA 22 bzw. 22' hybridisiert ist, durch Didesoxyguanylat (ddG) 36 bzw. Didesoxyadenylat (ddA) 36'' verlängert. Unter Bezug auf 4 ist bei einer wie oben beschriebenen Analyse durch Massenspektroskopie das Ergebnis ein Massenspektrum mit zwei Peaks, die sich um eine Masse von 16,050 Da unterscheiden, was nahe der erwarteten Molekulargewichtsdifferenz von 15,999 Da zwischen den zwei Didesoxynucleotidbasen dG und dA, die jeweils Primer 30' und 30'' verlängern, ist, und was innerhalb des experi mentellen Fehlers des Massenspektrometers ist.
In einer weiteren Ausführungsform und unter Bezug auf 5 enthält der Primer 56 ein Massetag 54. Das Massetag 54 ist vorzugsweise eine beliebige Form einer Masseverlängerung des Primers 56, die nicht mit der Ziel-DNA 60 hybridisiert und die auch nicht die Stabilität des Hybrids oder die Verlängerung des Primers unter Verwendung von DNA-Polymerase stört. Daher ist in einer Ausführungsform das Massetag 54 aus zwei oder mehreren an das 5'-Ende des Primers 56 addierten Nucleotidbasen 54, die nicht komplementär zu der Ziel-DNA 60 sind, aufgebaut. Für eine bequeme Synthese kann das Massetag 54 aus einem Homopolymerschwanz 54, der an das 5'-Ende des Primers 56 synthetisiert ist, aufgebaut sein. In einer Ausführungsform ist der Homopolymerschwanz 54 ein Polydesoxythymidylat, T_n, worin n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 40 ist.
Der Zweck des Massetags ist, die Primer und die verlängerten Primer, die sonst durch Massenspektrometrie unauflösbar sein könnten, zu trennen. Da zwei Primer oder verlängerte Primer dieselbe Anzahl von Basen und daher ungefähr das gleiche Molekulargewicht haben können und daher durch Massenspektrometrie unauflösbar sein können, fügt die Addition eines Massetags an einen der Primer genügend Masse zur Ermöglichung ihrer Auflösung zu. Das ermöglicht die Verwendung von zwei oder mehreren Primern in demselben Nachweis zur gleichzeitigen Sondierung von mehreren Einzelnucleotidpolymorphismen.
Um einen derartigen Nachweis, beispielsweise ein Sondieren für zwei Einzelnucleotidpolymorphismen, durchzuführen, werden zwei Primer 30, 56, die jeweils entsprechend komplementär zu den Basen, die an die auf dem Einzelstrang von DNA 60 vorhandenen unterschiedlichen Einzelnucleotidpolymor phismen 10, 50 angrenzen, sind, bereitgestellt (Stufe 1). Die Primer 30, 56 haben durch mindestens die Addition eines Massetags 54 an einen der Primer 30, 56 eine unterschiedliche Masse. Wie im vorhergehenden beschrieben, wird jeder Primer 30, 56 an seinem komplementären Bereich der Ziel-DNA 60 hybridisiert und die Didesoxynucleotidbasen 36, Polymerase und Puffer (nicht gezeigt) werden dem Gemisch zugesetzt (Stufe 2). Jede Didesoxynucleotidbase 64, 68, die komplementär zu ihrem entsprechenden Einzelnucleotidpolymorphismus 10, 50 ist, verlängert dann, wie oben beschrieben, die Primer 30 bzw. 56 (Stufe 3). Die Ziel-DNA 60 und die Primer 30, 56, die durch die Basen 64 bzw. 68 verlängert wurden, werden, wie im vorhergehenden beschrieben, durch Massenspektrometrie analysiert.
Der Nachweis für mehrfache SNPs ist gleich gut anwendbar, wenn sich die SNPs auf demselben DNA-Segment, aber an verschiedenen Orten, oder auf zwei oder mehreren DNA-Segmenten befinden. Die mehreren DNA-Segmente können komplementäre Stränge sein oder völlig verschiedene Nucleotidsequenzen haben. Einige Nachweise können so gestaltet werden, dass die Primer entweder an einem oder dem anderen der zwei zu sondierenden komplementären DNA-Stränge hybridisieren. Dieses ist besonders gut geeignet für Multiplexnachweisexperimente, bei denen zwei SNPs voneinander durch eine Zahl von Nucleotidbasen, die kleiner ist als die Zahl der Nucleotidbasen der stromabwärtigen Primer, getrennt sind, wodurch eine Überlappung ihrer Bindestelle auf der DNA vermieden wird. Da die 3'-Enden der Sequenzen von zwei komplementären DNA-Strängen zueinander gegensätzlich angeordnet sind, ist es möglich, zwei Primer zum Sondieren von zwei nahe beieinander gelegenen SNPs derartig zu entwerfen, dass ein Primer an einem Strang einer DNA bindet und der stromabwärtige an den anderen Strang bindet, wobei jeweils ihre 5'-Enden von den zwei vermuteten Punktmutationen weggerichtet sind und ihre 3'-Enden an eine vermutete Punktmutation angrenzen, und dass die Primer keine komplementären Segmente in ihren Sequenzen haben.
Die Ergebnisse von derartigen Nachweisen für mehrfache Einzelnucleotidpolymorphismen werden in 6a, 6b, 6c, 6d, 6e und 6f gezeigt. In 6a und 6b werden fünf Primer des Experiments (R377, R400, R421, R447, R355), die zur Untersuchung von fünf Orten des Brustkrebsempfindlichkeitsgens BRCA1 entworfen wurden, gezeigt. Wie es unten in Tabelle 2 gezeigt ist, sind die fünf Primer jeweils zu einem unterschiedlichen Bereich des Gens komplementär. Jeder Primer hat dieselbe Basislänge von 18 komplementären Basen, aber jeder Primer, bis auf einen, hat ein von den anderen unterschiedliches Massetag; ein Primer hat kein Massetag. Daher hat jeder Primer eine von allen anderen Primern deutlich unterschiedliche Masse. Das Massenspektrum der fünf Primer vor einer Verlängerung wird in 6a gezeigt. Wenn die Primer unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens mit 25 Thermozyklen verlängert werden und die Massenspektren aufgenommen werden, ist die Masse von jedem Primer um die Masse des addierten Nucleotids erhöht. Es wird angemerkt, dass der Primer R355 durch die Addition von Didesoxyguanin vollständig umgesetzt wurde und deshalb ist kein dem unverlängerten Primer entsprechender Peak in 6b vorhanden. Unerwarteterweise störte die Addition eines Decadesoxythymidylat-Rests (dT₁₀) an dem 5'-Ende von R355 offensichtlicherweise nicht die Verlängerung von Primer R377, obwohl die zwei Primer an die DNA innerhalb weniger Nucleotidbasen binden.
Die 6c und 6d zeigen ein Experiment mit sieben Primern, die zur Untersuchung von sieben Orten auf dem Brustkrebsempfindlichkeitsgen BRCA1 entworfen wurden (R355, R377, R400, R421, R447, R480 auf einem Strang und F320 auf dem anderen Strang). Alle der in 6c gezeigten Primer wurden durch die erwarteten Nucleotidbasen innerhalb 25 Thermozyklen verlängert. In 6d sind alle 14 Peaks der sieben Primer und der sieben verlängerten Primer aufgelöst, aber zwei Primer, R355 und F320, wurden fast quantitativ verlängert. Es wird angemerkt, dass der Primer F320 zu zwei Produkten führte: eines, das der Addition von ddT entspricht, und das andere, das der Addition von dT und ddC entspricht. T und C passen zu den zwei Nucleotidbasen, die stromabwärts der Bindestelle von Primer F320 auf BRCA1 liegen. Diese Zweibasenverlängerung geschieht aufgrund eines Übertrags von restlichen Desoxynucleotidbasen aus der PCR-Amplifikation von der Ziel-DNA BRCA1. Restliche Desoxynucleotidbasen können durch eine Reinigung der Ziel-DNA nach einer PCR eliminiert werden.
Tabelle 2: SNP-Primer für Multiplex-Nachweise
Tabelle 2: (Fortsetzung)
Amplifikation durch Präzipitierung mit Ethanol, Gelfiltration oder Inkubation mit alkalischer Phosphatase aus Krabben.
Die 6e und 6f zeigen sieben Primer des Experiments, die zur Untersuchung von fünf Orten auf dem Brustkrebsempfindlichkeitsgen BRCA1 (R355, R377, R400, R421, R447) und einem Ort auf einer synthetischen Sequenz von 60 Basen des lacz-Gens (b2-1 mit einem 15-mer und einem 20-mer) entworfen wurden. Zwei Primer, die an dieselbe Stelle hybridisieren (b2-1), aber eine um fünf Basen unterschiedliche Länge haben, werden zur Bestimmung der Wirkung der Grundlänge der Primer auf ihre Fähigkeit, mit ihrer Zielstelle zu hybridisieren, und daher ihre Fähigkeit zum Erfahren einer Nucleotidbasenverlängerung, einbezogen. Alle sieben in 6e gezeigten Primer wurden durch die erwartete Nucleotidbase verlängert. Drei der Primer wurden quantitativ innerhalb 25 Thermozyklen verlängert. In 6f sind alle 14 Peaks der sieben Primer und der sieben verlängerten Primer aufgelöst, jedoch werden drei Primer (beide b2-1 und R355) quantitativ verlängert, während bei zwei Primern, R400 und R421, deutlich geringere Mengen der verlängerten Primer als bei den anderen Primern erzeugt wurden. Es wird angemerkt, dass beide Primer b2-1 ferner zu jeweils zwei verlängerten Primern führten: die erwartete Nucleotidbase ddG und eine Zweibasenverlängerung, dGddT, die der stromabwärts der Bindestelle der Primer b2-1 gelegenen Sequenz des lacz-Gens entspricht.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Einzelnucleotidpolymorphismus unter Verwendung eines Ligase-Kettenreaktionsnachweises (LCR) an entweder einer einzelsträngigen oder einer doppelsträngigen DNA. Unter Bezug auf 7 wurde eine Gruppe von 10 Oligonucleotidsonden 70, 71, 71', 71'', 71''', 72, 73, 73', 73'' und 73''' für die zwei Stränge einer DNA 20, 22 mit einer einzigen vermuteten Punktmutation 9, 10 bereitgestellt. In dem ersten Zyklus werden die Oligonucleotidsonden an der vermuteten Punktmutation 9, 10 an jedem Strang von DNA 20, 22 so hybridisiert, dass die Sonden 70 und 71 zusammen die vermutete Mutationsstelle 9 auf dem DNA-Strang 20 und die Sonden 72 und 73 zusammen die vermutete Mutationsstelle 10 auf dem DNA-Strang 22 überlappen (Stufe 1). Jede Gruppe von Sonden 70, 71 und 72, 73 auf jedem DNA-Strang 20, 22 wird dann unter Verwendung einer Ligase und eines geeigneten Puffers ligiert (Stufe 2). In den Folgezyklen dienen die ligierten Sonden 80 und 81 als Templat zusammen mit den DNA-Strängen 20 und 22, um die Sonden 70, 71, 72 und 73 zu ligieren, was zu einer Amplifikation der im DNA-Segment 20, 22 enthaltenen, in den ligierten Sonden 80 und 81 exprimierten, genetischen Information führt. Die erhaltenen zwei ligierten Oligonucleotidsonden 80, 81 werden durch Massenspektrome trie analysiert. Die Ligationsstufe erzeugt die ligierten Sonden 80 und 81 nur dann, wenn die zu der vermuteten Punktmutation 9, 10 passenden Sonden 71 und 73 an ihren entsprechenden DNA-Strang hybridisiert sind. Wenn eine der Sonden, beispielsweise 71', 71'', 71''', 73', 73'' und 73''', nur teilweise an die DNA im Bereich der vermuteten Mutation hybridisiert ist, wird dann die Ligase keine ligierte Sonde erzeugen. Daher wird die Identität der Basen 76 und 78 der ligierten Sonden 80 oder 81, die zu der vermuteten Punktmutation 9, 10 passen, durch Ermitteln ihrer Masse und Vergleichen derselben mit der Summe der Massen von 70 und 71, 70 und 71', 70 und 71'' und 70 und 71''' für die ligierte Sonde 80 und der Summe der Massen von 72 und 73, 72 und 73', 72 und 73'' und 72 und 73''' für die ligierte Sonde 81 abgeleitet. Nachdem die Identität der Basen 76, 78 in den ligierten Sonden 80, 81 bestimmt wurde, wird die Identität der Basen an der vermuteten Punktmutation 9, 10 gemäß den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung abgeleitet. Es wird angemerkt, dass die durch die ligierte Sonde 81 bereitgestellte Information in Bezug auf die durch die ligierte Sonde 80 bereitgestellte Information redundant ist, was die Ableitung der Identität der Base an der vermuteten Mutationsstelle des DNA-Strangs 20 ermöglicht. Die Identität der Base an dem zweiten Strang 22 kann auch aus der Identität der Base an dem Strang 20 gemäß den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung abgeleitet werden. Diese Redundanz stellt eine größere Zuverlässigkeit bei der Bestimmung durch den Nachweis durch Bereitstellung einer zweiten analysierbaren Datengruppe bereit.
Unter Verwendung einer einzelsträngigen DNA 20 mit LCR wird in dem ersten Zyklus nur eine ligierte Sonde 80 aus den Sonden 70 und 71 mit einer komplementären Sequenz erzeugt. Dann werden in den anschließenden Zyklen jeweils die ligierte Sonde 80 und der Einzelstrang 20 als Templat für die Ligation der Sonden 70, 71, 72 und 73 dienen, wodurch die ligierten Sonden 80 und 81 erzeugt werden. Die anschließenden Zyklen werden eine Amplifikation der genetischen Information durch Erzeugen von großen Mengen von jeweils den ligierten Sonden 80 und 81 bewirken, als ob eine doppelsträngige DNA ursprünglich verwendet wurde.
In einer Ausführungsform wird ein Massetag an eine der Sonden angefügt, beispielsweise um eine Sonde mit Tag zu bilden (nicht gezeigt). Das Massetag kann entweder an das 3'-Ende oder das 5'-Ende einer Sonde angefügt werden, sofern es an das Ende, das nicht an der Ligation zwischen zwei Sonden teilnimmt, angefügt wird. Die Zahl der Basen in der erhaltenen ligierten Sonde (nicht gezeigt) ist nun durch die Zahl der Basen, die in dem Tag des Primers angefügt sind, erhöht. Dieses Anfügen eines Massetags erhöht den Unterschied der Massen von ligierten Sonden und ermöglicht derartig eine größere Auflösung der Ergebnisse eines Ligationsnachweises, in dem sonst die Massen von ligierten Sonden für ein Erreichen einer guten Auflösung ihrer entsprechenden Peaks durch Massenspektrometrie zu nahe sein würden. Dieses Anfügen eines Massetags kann auch zur Erleichterung der Interpretation des Nachweisexperiments durch Differenzierung zwischen den Primern 71, 71', 71'' und 71''' oder zwischen den Primern 73, 73', 73'' und 73''' verwendet werden.
In Bezug auf 8 werden die Ergebnisse eines Einzelnucleotid(SNP)-Nachweises unter Verwendung einer Ligasereaktion an einer homozygoten DNA-Probe durch Analyse mit Massenspektrometrie gezeigt. Für dieses Experiment hatte die Ziel-DNA die folgende Nucleotidsequenz: 5'-CTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATT-3' (SEQ ID NO: 1), worin C die Punktmutation ist. Zwei konstante Sonden und acht variable Sonden wurden hergestellt. Die Sequenzen der Sonden (in Tabelle 3 gezeigt) wurden so entworfen, dass eine Sonde von 19 Basen mit einer Sonde von 21 Basen unter Bildung einer ligierten Oligonucleotidsonde von 40 Basen und eine Sonde von 20 Basen mit einer Sonde von 21 Basen unter Bildung einer ligierten Sonde von 41 Basen ligiert wurde.
Tabelle 3: Sonden für einen Ligasenachweis
Die erwartete Masse für jede ligierte Sonde (mit G/C an der variablen Base) ist 12326,93 Da und 12574,15 Da. Wie aus 8 ersehen werden kann, werden die ligierte Sonde von 40 Basen und die von 41 Basen leicht voneinander mit einer Massendifferenz von ungefähr 248 Da unterschieden. Unter Bezugnahme auf 9a werden die Ergebnisse eines SNP-Nachweises unter Verwendung einer Ligase an einer heterozygoten DNA-Probe, die sowohl C/T als auch T/A an der Punktmutation hat, durch Analyse mit Massenspektrometrie gezeigt. Dieser erzeugte zwei ligierte Sonden von 41 Basen mit einer Massendifferenz von 15,999 Da aufgrund von G und A, und zwei ligierte Sonden von 40 Basen mit einer Massendifferenz von 15,011 Da aufgrund von C und T. Unter Bezug auf 9b wird ein hochschematisches Diagramm eines SNP-Nachweises unter Verwendung einer Ligase an einer hetero zygoten DNA-Probe gezeigt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Einzelnucleotidpolymorphismus unter Verwendung eines Oligonucleotidligationsnachweises (OLA) an nur einem DNA-Strang 20 mit einer vermuteten Punktmutation 9. Das Verfahren umfasst Bereitstellen einer Gruppe von fünf Sonden 70, 71, 71', 71'' und 71''', einer konstanten Sonde 70 und vier variablen Sonden 71–71''', wobei die konstante Sonde und nur eine der vier variablen Sonden an der DNA 20 so hybridisieren, dass die zwei hybridisierenden Sonden die vermutete Mutationsstelle überlappen und mit der Base an der vermuteten Punktmutation 9 der DNA 20 perfekt zusammenpassen; Ligieren der zwei hybridisierten Sonden unter Verwendung eines Oligonucleotidligationsnachweises; Identifizieren der ligierten Sonden durch Massenspektrometrie in ähnlicher Weise wie in dem Nachweis unter Verwendung einer Ligationskettenreaktion mit der doppelsträngigen DNA.
Eine noch weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst kombinatorische Verfahren für die Identifizierung der Nucleotidbasen an einer vermuteten Mutationsstelle, die von einer Deletion, Insertion oder einer Substitution von mehreren Nucleotidbasen herrührt, durch Sondieren von mehr als einer Nucleotidbase an der vermuteten Mutationsstelle. Im allgemeinen umfasst das kombinatorische Verfahren die Stufen Herstellen einer Kombination von verlängerten Primern von verschiedener Länge, wobei die Kombination von verlängerten Primern ein eine Leitersequenz definierendes Gemisch von kurzen DNA-Segmenten ist, wobei jede Stufe der Leitersequenz eine Base an der vermuteten Mutationsstelle darstellt, und Analysieren der Kombination von verlängerten Primern durch Massenspektrometrie (wobei die Masse von jedem verlängerten Primer von spezifischer Länge eine Stufe der Leitersequenz definiert). Die Identität der Sequenz an der vermuteten Mutationsstelle wird durch die aufeinanderfolgende Bestimmung der Massenunterschiede zwischen jeder Stufe der Leitersequenz abgeleitet, wobei entweder mit dem längsten verlängerten Primer begonnen und zu dem in dem Nachweis verwendeten ursprünglichen Primer weitergegangen wird oder mit dem ursprünglichen Primer begonnen und zu dem längsten verlängerten Primer weitergegangen wird.
Genauer und unter Bezug auf 10 umfasst eine Ausführungsform der kombinatorischen Verfahren zuerst das Hybridisieren eines Primers 30 mit einer Sequenz, die komplementär zu einem Ziel-DNA-Segment 22 mit einer vermuteten Mutationsstelle 11 ist (Stufe 1). Das 3'-Ende des Primers 30 wird angrenzend an die vermutete Mutationsstelle 11 positioniert. Als nächstes wird der Primer 30 durch Addition einer Mehrzahl von Nucleotidbasen 36, 38 an den Primer 30 verlängert (Stufe 2). Dafür wird jede der möglichen komplementären Basen in Form von Desoxynucleotiden 38 und Didesoxynucleotiden 36 dem Gemisch zusammen mit einer DNA-Polymerase und einer geeigneten Pufferlösung zugesetzt (nicht gezeigt). Der verlängerte Primer 30', 42, 42' oder 42'' wird dann von der DNA 22 geschmolzen (Stufe 3) und die DNA 22 wird dann mit überschüssigem Primer 30 in den Kreislauf bei Stufe 1 wieder eingeführt. In jedem Thermozyklus (Stufen 1, 2 und 3) verlängert die Polymerase den Primer 30 mit den verfügbaren Nucleotidbasen 38 und 36 durch Anpassen der zugegebenen Basen an die Basen der vermuteten Mutationsstelle 11, wobei die DNA 22 als Templat dient, bis die Polymerase entweder in den wachsenden Primer eine Stoppbase (Didesoxynucleotid 36) einbaut oder die Polymerase die verfügbaren Nucleotidbasen 38 verbraucht hat. Durch Bereitstellung eines Gemischs von allen Nucleotidbasen 36 und 38 wird das Verfahren derartig bei jedem Thermozyklus einen verlängerten Primer 42 mit einer Zufallslänge erzeugen. Durch mehrmaliges Wiederholen des Thermozyklus erzeugt das Verfahren eine Kombination von verlängerten Primern 30', 42, 42' und 42'' von verschiedenen Längen, wobei die Sequenz des verlängerten Teils 15 der verlängerten Primer aus Desoxynucleotidbasen plus der terminalen Didesoxynucleotidbase, die alle zu der Sequenz der vermuteten Mutationsstelle 11 von DNA 22 passen, besteht.
Vorzugsweise wird eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet, jedoch kann eine beliebige DNA-Polymerase unter der Voraussetzung, dass, falls eine Amplifikation erforderlich ist, eine zusätzliche Menge der Polymerase vor jedem Thermozyklus zugegeben wird, verwendet werden. Ein Thermozyklus umfasst eine Hybridisierungsstufe, die vorzugsweise bei 37°C während 60 s durchgeführt wird, eine Primerverlängerungsstufe; und eine Denaturierungsstufe, bei der die DNA-Probe auf eine Temperatur von vorzugsweise 95°C während 10 s erhitzt wird, was ausreichend ist, dass jede DNA/DNA(20, 22)-Helix, jedes DNA/Primer-Hybrid (22, 30) oder jede der DNA/verlängerter Primer(22, 42)-Duplexe geschmolzen wird. Das Verhältnis von Didesoxynucleotidbasen 36 zu Desoxynucleotidbasen 38 (ddNTP : dNTP) für jede Base kann von 1000 : 1 bis 0,025 : 1 variiert werden. Der bevorzugte Bereich beträgt ungefähr 2 : 1 bis 0,05 : 1, wenn Thermosequenase verwendet wird.
Die Kombination von verlängerten Primern 30', 42, 42' und 42'' erzeugt ein eine Leitersequenz definierendes Gemisch, worin jeder der verlängerten Primer 30', 42, 42' und 42'' für eine Stufe der Leitersequenz steht. Jeder der verlängerten Primer 30', 42, 42' und 42'' hat eine der vier Didesoxynucleotidbasen 36 am Ende. Die Massendifferenz zwischen jeder Stufe der Leitersequenz entspricht daher der Masse von einer der vier Didesoxynucleotidbasen 36. Die Identität der Sequenz an der polymorphen Stelle wird dann durch Messung der Massendifferenz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Stufen der Leitersequenz, Korrelieren der Masse mit einer der vier Didesoxynucleotidbasen und Wiederholen desselben für jede Stufe der Leitersequenz bestimmt (Stufe 4). Nachdem die addierte Sequenz 15 an den verlängerten Primern identifiziert wurde, wird die Identität der Sequenz an der vermuteten Mutationsstelle 11 durch Befolgung der Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung abgeleitet.
Unter Bezugnahme auf 11 werden die Ergebnisse eines kombinatorischen Nachweises, der an der Oligonucleotidzielsequenz: 5'-CTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATT-3' (SEQ ID NO: 1), worin GTGGCACAAC (Teil der SEQ ID NO: 1) die vermutete Mutationsstelle 11 darstellt, durchgeführt wurde, gezeigt. Die zwanzig Basen lange Sequenz: 3'-TTGACCGCCCGTTTGTCAGC-5' (SEQ ID NO: 2) wird als Primer verwendet.
Die Thermozyklen wurden an 0,4 μM einer Oligonucleotidzielsequenz in Gegenwart von 2 μM von Primer 30, 20 μM von jeder Triphosphatbase (einer Kombination von Didesoxy und Desoxy) in einem Verhältnis von ddNTP : dNTP von 0,1 und 30 Units/ml von Thermosequenase in 25 mM Ammoniumacetat bei pH 9,3 und 2 mM Magnesiumchlorid-Pufferlösung durchgeführt. Der Thermozyklus wurde mit dem Reaktionsgemisch bei 95°C während 10 s, 37°C während 30 s und 72°C während 60 s in 20 Zyklen in einem Perkin Elmer 9600 DNA Thermal Cycler durchgeführt. Eine Menge von 10 μl der Reaktionsmischung wurde als Probe entnommen und durch eine Pipettenspitze, die mit ein paar Mikrolitern von POROS^® R1 gepackt war, appliziert, mit 100 mM Triethylammoniumacetatlösung gewaschen und in ungefähr 2 μl einer Acetonitril : Wasser(80 : 20)-Lösung eluiert. Die erhaltene Lösung wurde dann durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert. Wie in 11 gezeigt, wurde der gesamte ursprüngliche Primer 30 innerhalb der 20 Zyklen verlängert, und kein Peak, der dem ursprünglichen Primer 30 entspricht, wurde in dem Massenspektrum beobachtet. Das Massenspektrum zeigt die Masse von zehn verlängerten Primern ausgehend von einem Primer mit einundzwanzig Basen bis zu einem Primer mit dreißig Basen. Die Sequenz des addierten Teils 15 wird durch Messung der Massendifferenz zwischen jeder Stufe der Leitersequenz abgeleitet und als 5'-GTTGTGCCAC-3' (SEQ ID NO: 15) dargestellt. Daher wird die Sequenz der vermuteten Mutationsstelle 11 als die komplementäre Sequenz abgeleitet: 3'-CAACACGGTG-5' (Teil von SEQ ID NO: 1).
In einer weiteren Ausführungsform und unter Bezugnahme auf 12 umfasst das kombinatorische Verfahren Hybridisieren eines Primers 30, der eine komplementäre Sequenz aufweist, an ein Ziel-DNA 22-Segment mit einer vermuteten Mutationsstelle 11 (Stufe 1). Das 3'-Ende des PrimerS 30 grenzt an die vermutete Mutationsstelle 11 an. Der Primer 30 wird durch Zugabe einer vollständigen Gruppe von Desoxynucleotidbasen 38 mit nur einer der vier Didesoxynucleotidbasen 36, beispielsweise ddG, zusammen mit einer DNA-Polymerase und einer geeigneten Pufferlösung (nicht gezeigt) verlängert (Stufe 2). Mit dem Gemisch wird ein Thermozyklus zur Amplifikation des Primers 30 zu messbaren Mengen von verlängerten Primern 43, 43' und 43'' durchgeführt. Wieder ist die letzte Base von jedem verlängerten Primer die Didesoxynucleotidbase 36. Da die Massendifferenz zwischen jedem der verlängerten Primer 43, 43' und 43'' wahrscheinlich größer als die Masse einer Didesoxynucleotidbase 36 sein wird, können keine Sequenzdaten an diesem Punkt des Verfahrens extrahiert werden. Das Gemisch der verlängerten Primer 43, 43' und 43'' wird einer Verdauung durch eine Exonuclease unterworfen (Stufe 4), damit ein eine Leitersequenz definierendes Gemisch von verlängerten Primern von verschiedenen Längen, das die verlängerten Primer 43, 43' und 43'' und die neu gebildeten verdauten Primer 44, 44', 44'', 45, 45', 45'', 46 und 46' umfasst, erzeugt wird. Die Addition einer Base 36 wird zur Steuerung der Länge der verlängerten Primer durchgeführt, andernfalls würde der Primer 30 zu einer langen und undefinierten Länge verlängert werden und seine molare Konzentration würde für eine Detektion durch Massenspektrometrie zu gering werden. Durch Beschränken der Primerverlängerung auf eine relativ geringe Länge kann eine hohe molare Konzentration der verlängerten Primer erhalten werden. Ferner kann eine gesteuerte Längenverteilung der verdauten Primer mit nachweisbaren molaren Konzentrationen durch Erzeugen einer gesteuerten Längenverteilung der verlängerten Primer vor der Verdauungsstufe erhalten werden. Die Kombination von verlängerten Primern und verdauten Primern definiert eine Leitersequenz, bei der die Massendifferenz zwischen beispielsweise dem verlängerten Primer 43 und dem ersten verdauten Primer 44 die Masse der Didesoxynucleotidbase 36 ist und die Massendifferenz zwischen jeder aufeinanderfolgenden Stufe der Leitersequenz, die durch die verdauten Primer, beispielsweise 44 und 44' oder 44' und 44'', gebildet wird, die Masse einer der vier Desoxynucleotidbasen 38 ist. Um das Lesen des aus der Verdauung resultierenden Massenspektrums zu erleichtern, wird vorzugsweise ein Massenspektrum des Gemischs von den verlängerten Primern 43, 43' und 43'' als Hilfe zur Lokalisierung ihrer Peaks in dem aus der Verdauung resultierenden Massenspektrum aufgenommen, bevor die Verdauung durchgeführt wird. Nachdem jede Stufe der Leitersequenz entweder einer Base 36 oder 38 zugeordnet wurde (Stufe 5), wird die Sequenz der vermuteten Mutationsstelle durch Befolgung der Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung abgeleitet. Dieses Verfahren ist besonders gut geeignet, wenn die zu bestimmende Zahl von Basen an der vermuteten Mutationsstelle 11 größer als 10 ist.
Die Verdauung des Gemischs der verlängerten Primer 43, 43' und 43'' kann mit einer beliebigen bekannten Exonuclease, wie Phosphodiesterase Typ I, Exonuclease I, Exonuclease III, Exonuclease V, Exonuclease VII und DNA-Polymerase III, durchgeführt werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines kombinatorischen Multiplexverfahrens zur Identifizierung von mehrfachen vermuteten Mutationsstellen, die von einer Deletion, Insertion oder einer mehrfachen Substitution einer Nucleotidbase herrühren. Unter Bezugnahme auf 13 umfassen die Verfahren das Hybridisieren einer Mehrzahl m von Primern 30 und 57, die jeweils eine Sequenz, die komplementär zu einer DNA 62 ist, an eine vermutete Mutationsstelle 11 bzw. 11' einer DNA 62, die mehr als eine vermutete Mutationsstelle hat (Stufe 1). Als nächstes wird in dem Verfahren die Mehrzahl m von Primern in Gegenwart einer Mehrzahl von Nucleotidbasen 36 und 38 mit einer DNA-Polymerase und einer geeigneten Pufferlösung (nicht gezeigt) so verlängert, dass jeder Primer durch mehr als eine Nucleotidbase verlängert wird (Stufe 2). Die Mehrzahl von verlängerten Primern 30' und 58 wird von der DNA 62 (Stufe 3) geschmolzen und die DNA 62 wird in den Kreislauf wieder eingeführt (Stufe 1), damit sie mit den überschüssigen Primern 30 und 57 hybridisiert. In jedem Zyklus verlängert die Polymerase die Mehrzahl der Primer 30 und 57 mit den verfügbaren Nucleotidbasen 36 und 38 durch Anpassen der zugesetzten Basen an den polymorphen Stellen 11 und 11', wobei die DNA 62 als ein Templat dient, wodurch eine Vielzahl von verlängerten Primern 53', 42, 42'', 58, 58', 58'' und 58''' erzeugt wird. Schließlich wird die Kombination von verlängerten Primern durch Massenspektrometrie identifiziert (Stufe 4). Die Kombination von verlängerten Primern definiert eine Reihe von Leitersequen zen, wobei jede Leitersequenz ein Abdruck von jeder vermuteten Mutationsstelle 11 und 11' ist. Die Sequenz von jeder vermuteten Mutationsstelle wird dann durch Subtrahieren der Massen zwischen zwei angrenzenden Stufen von jeder Leitersequenz und Zuordnen der Massendifferenz zu einer Nucleotidbase bestimmt. Die Base an der vermuteten Mutationsstelle wird dann gemäß den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung abgeleitet. Dieses wird für jede Stufe einer Leitersequenz wiederholt.
In einer noch weiteren Ausführungsform umfasst das kombinatorische Multiplexverfahren die Kombination von Primerverlängerung und Verdauung. Zuerst wird eine Mehrzahl m von Primern, die jeweils eine komplementäre und an eine vermutete Mutationsstelle einer DNA aus einer Probe, die mehr als eine vermutete Mutationsstelle hat, angrenzende Sequenz haben, an die DNA hybridisiert. Als nächstes wird die Mehrzahl m von Primern in Gegenwart einer Mehrzahl von Desoxynucleotidbasen und mindestens einer Didesoxynucleotidbase mit einer Polymerase und einer geeigneten Pufferlösung so amplifiziert, dass jeder Primer durch mehr als eine Nucleotidbase verlängert wird. Drittens wird mit der Mehrzahl von verlängerten Primern eine Verdauung unter Verwendung einer Exonuclease durchgeführt. Schließlich wird die Kombination von verlängerten und verdauten Primern durch Massenspektrometrie analysiert. Die Sequenz von jeder vermuteten Mutationsstelle wird dann wie früher beschrieben bestimmt. Um eine gute Auflösung des Massenspektrums, das von der Kombination von verlängerten Primern erhalten wurde, zu erreichen, wird vorzugsweise eine Mehrzahl m von Primern verwendet, wobei (m – 1) Primer ein Massetag an ihrem 5'-Ende haben.
In noch weiteren Ausführungsformen betreffen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Identifizierung von Nucleo tidpolymorphismen in RNA-Zielsequenzen. Jedes der oben beschriebenen Verfahren kann zur Bestimmung von einem Polymorphismus in einer RNA durch Substitution einer Ziel-DNA durch eine Ziel-RNA und von DNA-Polymerase durch eine reverse Transkriptase angewendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Thermozyklen unter Verwendung einer thermostabilen reversen Transkriptase, wie beispielsweise von Thermus termophilus(rTth)-DNA-Polymerase, durchgeführt.
Ein hochschematisches Diagramm eines Instruments, das zur Durchführung der verschiedenen Verfahren der Erfindung verwendet wurde, wird in 14 gezeigt. Jeder der zu verwendenden Primer wird getrennt zu einer Probenplatte 90, die eine Reihe von Probenorten enthält, einen für jeden Primer, gegeben. Die Probenplatte 90 wird in ein MALDI-TOF-Spektrometer 100, das die Masse von jedem der individuellen Primer, die beim Sequenzieren verwendet wurden, bestimmt, gegeben. Als nächstes werden der hybridisierte modifizierte Primer und ein Zielpolynucleotid zu der Probenplatte 90 gegeben und diese Probenplatte 90 wird in das MALDI-TOF-Spektrometer 100 gegeben. Die Masse des modifizierten Primers und die Masse des Zielpolynucleotids werden dann bestimmt; die Hybridisierung wird durch das Laserlicht während des Desroption-Ionisationsprozesses, der innerhalb des MALDI-TOF 100 geschieht, zerstört.
Ein Prozessor 120, der ein Computer für einen allgemeinen Zweck oder ein spezialisierter Prozessor sein kann, sammelt die Massendaten von dem MALDI-TOF 100 und gibt die Daten zu einem Speicher 124 und optional auf eine Diskette oder eine andere Offline-Speichereinheit 126. Der Prozessor 120 bestimmt dann die Massendifferenz zwischen jedem Primer und seinem entsprechenden modifizierten Primer. Der Prozessor 120 vergleicht dann die Massendifferenz für jeden Primer mit einer Tabelle von Nucleotidmassen, die auf der Diskette 126 gespeichert sind und in den Speicher 124 eingelesen wurden. Von diesem Vergleich der Massendifferenz des Primers und des modifizierten Primers mit den Massen der Nucleotidbasen in der Tabelle werden die an den Primer addierten Nucleotide dann bestimmt. Die Ergebnisse werden entweder einem Anwender 130 angezeigt oder auf einer Diskette 126 für eine spätere Analyse abgespeichert.
In Kürze und unter Bezug auf 15 umfasst eine Ausführungsform eines Algorithmus zur Bestimmung von Sequenzdaten die Stufe Aufnehmen der Massendaten von dem MALDI-TOF 100 (Stufe 150) und aufgrund der Daten Bestimmen der Masse von jedem verwendeten Primer (Stufe 154) und jedem gebildeten modifizierten Primer (Stufe 158). Die im Speicher 124 befindliche Tabelle von Nucleotidmassen wird mit den in der vorhergehenden Stufe bestimmten Massenunterschieden verglichen (Stufe 162). Durch Kenntnis der individuellen Massen der Nucleotide wird die Nucleotidsequenz erzeugt (Stufe 166). Nachdem die Daten und die Sequenz bestimmt wurden, werden die Daten und/oder die Sequenz an der I/O-Vorrichtung des Anwenders, wie ein Endgerät 130, angezeigt oder offline in der Speichervorrichtung 126 gespeichert.
Nachdem die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurden, ist es einem Fachmann nun klar, dass andere, die hier offenbarten Konzepte umfassenden Ausführungsformen verwendet werden können. Es wird daher angenommen, dass diese Ausführungsformen nicht durch die offenbarten Ausführungsformen beschränkt werden sollen, sondern nur durch die Idee und Umfang der folgenden Ansprüche beschränkt sein sollen.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer vermuteten Punktmutation in einem Polynucleotid unter Verwendung von Massenspektrometrie, das die folgenden Stufen umfasst: a. Bereitstellen eines Primers mit einer Sequenz, die angrenzend an die vermutete Punktmutation des Polynucleotideinzelstrangs hybridisiert; b. Erhitzen des Polynucleotids und des Primers auf eine zum Schmelzen des Polynucleotids ausreichende Temperatur; und c. Kühlen des geschmolzenen Polynucleotids und des Primers auf eine zum Hybridisieren des Primers an dem Polynucleotideinzelstrang ausreichende Temperatur; wodurch eine Duplex gebildet wird, bei dem das 3'-Ende des Primers angrenzend an die vermutete Punktmutation des Polynucleotideinzelstrangs hybridisiert ist; d. Verlängern des 3'-Endes des Primers durch Anfügen einer einzigen Didesoxynucleotidbase, die zu der vermuteten Punktmutation des Polynucleotids komplementär ist, unter Verwendung einer hitzestabilen Polynucleotidpolymerase, die im wesentlichen die gleiche relative Einbaurate für Didesoxynucleotidbasen wie für Desoxynucleotidbasen aufweist, wodurch ein verlängerter Primer gebildet wird; und e. Analysieren des verlängerten Primers unter Verwendung der Massenspektrometrie, um die Identität der Didesoxynucleotidbase an der vermuteten Punktmutation zu bestimmen, wobei die Stufen a–d eine derart ausreichende Zahl von Malen wiederholt werden, dass der Nachweis des verlängerten Primers durch Massenspektrometrie möglich wird.
Verfahren zur Identifizierung einer vermuteten Punktmutation in einem Polynucleotid unter Verwendung von Massenspektrometrie, das die folgenden Stufen umfasst: a. Hybridisieren eines Primers, der ein Massetag umfasst, mit einem Einzelstrang des Polynucleotids mit einer vermuteten Punktmutation, wobei das 3'-Ende des Primers angrenzend an die vermutete Punktmutation hybridisiert wird; b. Verlängern des 3'-Endes des Primers durch Anfügen einer einzigen Didesoxynucleotidbase, die komplementär zu der vermuteten Punktmutation des Polynucleotids ist, unter Verwendung einer hitzestabilen Polynucleotidpolymerase mit im wesentlichen der gleichen relativen Einbaurate für Didesoxynucleotidbasen wie für Desoxynucleotidbasen, wodurch ein verlängerter Primer gebildet wird; und c. Analysieren des verlängerten Primers unter Verwendung der Massenspektrometrie, um die Identität der Didesoxynucleotidbase an der vermuteten Punktmutation zu bestimmen, wobei die Stufen a und b eine derart ausreichende Anzahl von Malen wiederholt werden, dass der Nachweis des verlängerten Primers ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Massetag ein Polythymidylat T_n am 5'-Ende des Primers ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 40 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid eine DNA ist und die Polynucleotidpolymerase eine Taq-DNA-Polymerase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polymerase in einem unter den in einem Massenspektrometer vorhandenen Bedingungen flüchtigen Puffer bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufe (e) unter Verwendung von Matrixunterstützter Laserdesorptionsionisierungs-Flugzeit(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Mehrzahl von vermuteten Punktmutationen identifiziert wird, das die folgenden Stufen umfasst: a. Bereitstellen einer Mehrzahl von Primern, die jeweils eine Sequenz aufweisen, die angrenzend an eine entsprechende vermutete Punktmutation des mindestens einen Polynucleotids hybridisiert; b. Erhitzen des mindestens einen Polynucleotids und der Mehrzahl von Primern auf eine zum Schmelzen des mindestens einen Polynucleotids ausreichende Temperatur; und c. Kühlen des mindestens einen Polynucleotids und der Mehrzahl von Primern auf eine Temperatur, die zum Hybridisieren der Mehrzahl von Primern mit dem mindestens einen Einzelstrang von mindestens einem Polynucleotid ausreichend ist, wodurch eine Multiplex gebildet wird, bei dem das 3'-Ende von jedem der Mehrzahl von Primern angrenzend an die entsprechende vermutete Punktmutation der Mehrzahl von vermuteten Punktmutationen hybridisiert wird; d. Verlängern des 3'-Endes der Mehrzahl von Primern durch Anfügen von einer von einer Mehrzahl von Didesoxynucleotidbasen an die Mehrzahl der hybridisierten Primer unter Verwendung einer hitzesta bilen Polynucleotidpolymerase, die im wesentlichen die gleiche relative Einbaurate für Didesoxynucleotidbasen wie für Desoxynucleotidbasen aufweist, wodurch eine der Mehrzahl der Didesoxynucleotidbasen, die zu jeweils einer vermuteten Punktmutation der Mehrzahl von vermuteten Punktmutationen komplementär ist, an den entsprechenden hybridisierten Primer der Mehrzahl von hybridisierten Primern angefügt wird, wodurch eine Mehrzahl von verlängerten Primern, die jeweils eine angefügte Didesoxynucleotidbase aufweisen, gebildet wird; und e. Analysieren der Mehrzahl von verlängerten Primern unter Verwendung der Massenspektrometrie, um die Identität der Didesoxynucleotidbase an jeder vermuteten Punktmutation zu bestimmen, wobei die Stufen a–d eine derart ausreichende Zahl von Malen wiederholt werden, dass der Nachweis der verlängerten Primer durch Massenspektrometrie möglich wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei eine Mehrzahl von vermuteten Punktmutationen identifiziert wird, das die folgenden Stufen umfasst: a. Hybridisieren einer Mehrzahl von Primern, die jeweils ein 3'-Ende und ein 5'-Ende aufweisen, mit mindestens einem Einzelstrang des mindestens einen Polynucleotids mit der Mehrzahl von vermuteten Punktmutationen, wobei das 3'-Ende von jedem der Mehrzahl von Primern angrenzend an eine entsprechende vermutete Punktmutation der Mehrzahl von vermuteten Punktmutationen hybridisiert wird; b. Verlängern des 3'-Endes der Mehrzahl von Primern durch Anfügen von einer von einer Mehrzahl von Didesoxynucleotidbasen an die Mehrzahl von hybridisierten Primern unter Verwendung einer hitze stabilen Polynucleotidpolymerase, die im wesentlichen die gleiche relative Einbaurate für Didesoxynucleotidbasen wie für Desoxynucleotidbasen aufweist, wobei eine der Mehrzahl von Didesoxynucleotidbasen, die zu der entsprechenden der Mehrzahl von vermuteten Punktmutationen komplementär ist, an den entsprechenden der Mehrzahl von hybridisierten Primern angefügt wird, wodurch eine Mehrzahl von verlängerten Primern, die jeweils eine angefügte Didesoxynucleotidbase aufweisen, gebildet wird; und c. Analysieren der Mehrzahl von verlängerten Primern unter Verwendung der Massenspektrometrie, um die Identität der Didesoxynucleotidbase an jeder vermuteten Punktmutation zu bestimmen, wobei die Stufen a und b eine derart ausreichende Anzahl von Malen wiederholt werden, dass der Nachweis der verlängerten Primer durch Massenspektrometrie möglich wird, und wobei mindestens ein Primer ein Massetag umfasst.
Multiplexverfahren nach Anspruch 8, wobei das Massetag ein Polythymidylat T_n am 5'-Ende des mindestens einen Primers ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 40 ist.
Multiplexverfahren nach Anspruch 7, wobei das mindestens eine Polynucleotid eine DNA ist und die Polymerase eine Taq-DNA-Polymerase ist.
Multiplexverfahren nach Anspruch 7, wobei die Polymerase in einem unter den in einem Massenspektrometer vorhandenen Bedingungen flüchtigen Puffer bereitgestellt wird.
Multiplexverfahren nach Anspruch 7, wobei die Stufe (e) unter Verwendung von Matrixunterstützter Laserdesorptionsionisierungs-Flugzeit(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie durchgeführt wird.