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Diese
Erfindung bezieht sich auf eine massenspektrometrische Analyse von
bekannten Mutationsstellen in dem Genom, wie „single nucleotide polymorphisms
(SNPs = Einzel-Nukleotid-Polymorphismen).
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Bei
der Erfindung werden geringe Mengen von Primern mit photospaltbaren
Linkern verwendet, die mit großen
Mengen von Primern ohne Linker vermischt werden, um kurze, eine
Mutation enthaltende DNA-Sequenzen durch enzymatische Verstärkungsverfahren,
wie Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) zu erzeugen. Nach diesem einzelnen
Verstärkungsverfahren
werden die Linker enthaltenden PCR-Nebenprodukte extrahiert, gewaschen
und photolytisch gespalten. Kurze Oligonukleotide werden erzeugt, welche
die massenspektrometrische Analyse vereinfachen. Außer der
Verwendung von Linkern können einige
Arten von Primern Blocker enthalten, die den Polymerase-Kopiervorgang stoppen,
um noch kürzere
Oligonukleotide für
die Analyse zu erhalten.
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Stand der Technik
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Gegenstand
dieser Erfindung ist ein Diagnoseverfahren zum Detektieren von tatsächlichen
Mutationszuständen
in der Genom-DNA, wobei die mögliche
Mutationsstelle vorher bekannt sein muss. Diese Mutationssequenzänderungen
können
im Vergleich zu der Standardsequenz eines „Wildtyps" entweder ein Basenaustausch („Punktmutation") oder das Einsetzen
von Nukleotiden („Insertion") oder Entfernen
von Nukleotiden („Deletion") sein. Punktmutationen
mit einer Frequenz oberhalb eines Prozents in einer Population werden
Einzel-Nukleotid-Polymorphismen
(single nucleotide polymorphisms) genannt. Die Abkürzung SNP
hat sich in den neuen Literatur besonders stark verbreitet. Bei
Menschen wird angenommen, dass es ca. 10 Millionen SNPs gibt, die
die meisten der individuell vererbten Unterschiede zwischen Menschen
kennzeichnen. Sie steuern die individuellen Phänotypen. Es wird geschätzt, dass
ungefähr
drei Millionen SNPs mit einer Häufigkeit
von 30 bis 70 % bei der Bevölkerung
anzutreffen sind. Ende 2001 wurden mehr als 1 1/4 Millionen SNPs
entdeckt und in der öffentlichen
Datenbank NBCI des weltweit tätigen
SNP-Konsortiums aufgelistet.
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Für das Genom
einer Art wird normalerweise ein „Wildtyp", welcher als mutationsfrei betrachtet wird,
und ein „Mutant" definiert, der eine
Mutation enthält.
In Anbetracht der Häufigkeit
von Mutationen wie SNPs und der gleichen Ausprägung von Mutanten und Wildtypen,
ist die Definition des Wildtyps willkürlich oder zumindest rein zufällig, was
bereits in dem Begriff „Polymorphismus" reflektiert ist.
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Beinahe
alle DNA-Mutationen, einschließlich der
oben definierten, erzeugen Unterschiede in der Masse des DNA-Segments,
welches die Mutation enthält,
im Vergleich zu der Masse eines entsprechenden Segments des Wildtyps.
Die genaue Massenbestimmung eines DNA-Segments kann deshalb zum
Bestimmen einer Mutation verwendet werden. Ausnahmen dieser Regel
sind die relativ seltenen „Rotationen", ein Austausch von
zwei Basen in einer Sequenz.
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Massenspektrometrie
ist ein sehr starkes und genaues Werkzeug zum Bestimmen der Masse eines
Biomoleküls.
Durch Verwenden eines massenspektrometrischen Verfahrens, wie z.
B. Laufzeitmassenspektrometrie (time-of-flight mass spectrometry
(TOF-MS)) mit Ionisierung durch Matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisierung
(MALDI) können
die Massen der Ionen analysiert werden. Ionisierung kann jedoch
auch erreicht werden durch Verwendung von Elektrospray-Ionisierung
(electrospray ionization ESI), im letzteren Fall mit Massenspektrometern,
die oft von anderer Art sind.
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Bei
Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) mittels eines Paars „Selektions-Primern", d.h. einzelstrangigen,
ca. 20 Basen langen Oligonukleotiden, können Mengen im Bereich von
Milliarden von doppelsträngigen
PCR-Produkten mit einer Länge
von mindestens 40 Basenpaaren in wohlbekannter Weise erzeugt werden.
Der Herstellungsprozess für
diese Oligonukleotide erhöht
die Anzahl der Produkte exponentiell durch Anwenden von Temperaturzyklen („Thermozyklen"). Solche Prozesse
sind unter dem allgemeinen Begriff „Verstärkung" (amplification) bekannt geworden. Die
Mutationsstelle kann in den Produkten enthalten sein durch entsprechende
Auswahl der Sequenzen der zwei Selektions-Primer.
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Das
naheliegende Verfahren, um die Masse der PCR-verstärkten Oligonukleotide
als solche durch Massenspektrometrie einfach zu messen, hat sich
als beinahe unausführbar
herausgestellt. Die genaue Messung dieser DNA-Produkte mit mehr
als 40 Basenpaaren stellte sich als beinahe unmöglich heraus. Die Gründe hierfür sind die
extrem geringe Sensitivität
für lange
DNA-Produkte aufgrund schwieriger Ionisierung, die hohe Wahrscheinlichkeit
von Adduktbildung mit nicht definierten Anzahlen an Natrium- oder
Kalium-Anionen und die einfache Fragmentierung der zerbrechlichen
DNA-Produkte. Diese Oligonukleotide haben einen polyanionischen
Charakter. Jede Phosphatgruppe des DNA-Rückgrats bildet ein Anion und
muss während
der Ionisierung durch ein Proton neutralisiert werden (welche leicht
durch Alkalikationen ersetzt werden, sofern vorhanden). Ein Verfahren
musste hierfür
gefunden werden, um Oligonukleotide bereitzustellen, die so kurz
wie möglich sind
und immer noch die Mutationsstelle enthalten.
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Hierzu
wurden mehrere Verfahren von beschränkter, mutationsabhängiger Primer-Extension unter
Verwendung von abschließenden
Derivaten der Nukleotid-Triphosphate entwickelt, um verlängerte Primer
von einer Länge
von nur ca. 12 bis 25 Nukleotiden zu erzeugen, die besser geeignet
sind, um die Art der Mutation durch Massenspektrometrie zu identifizieren.
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Diese
Verfahren bestehen im Wesentlichen aus folgenden Schritten: Erstens
wird eine ausreichende Anzahl an Kopien des DNA-Segments, das die
Mutationsstelle enthält,
durch PCR hergestellt mittels eines Paars Selektions-Primer. Nach
dem Extrahieren und Waschen dienen diese DNA-Segmente zweitens als
Matrizen für
die enzymatische mutationsabhängige
Extension eines „Extensions-Primers" durch eine zweite
Thermozyklusphase. Bei dieser zweiten Thermozyklusphase werden ein
bis vier der Nukleotid-Triphosphate so derivatisiert, dass sie als Terminatoren
für die
Extension dienen, d.h. wenn der Terminator am 3' Ende eingebaut ist, ist keine Verlängerung
mehr möglich,
da die bindende Seite besetzt ist. Der Extensions-Primer kann identisch
mit einem der zwei Selektions- Primer
sein. Es ist normalerweise jedoch viel besser, einen Extensions-Primer
zu verwenden, der nicht identisch ist.
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Der
Extensions-Primer ist eine kurze DNA-Kette von ca. 10 bis 20 Nukleotiden
und funktioniert als Erkennungssequenz für den Ort einer möglichen
Mutation. Der Extensionsprimer ist mit einer Basensequenz synthetisiert,
so dass er auf den Matrizenstrang „hybridisiert" oder „annealt" werden kann, was
ein exaktes Komplement der Basensequenz in der Nähe einer bekannten Punktmutationsstelle
ist. (Die Anbringung eines komplementären Strangs ist als „Hybridisierung" oder „Annealen" bekannt).
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Unterschiedliche
Arten von Primer-Extensionsverfahren wurden entwickelt, die entweder
Produkte mit der gleichen Anzahl von Basen für Mutanten und Wildtypen, die
sich nur durch die Gewichtsunterschiede der unterschiedlichen Basen
unterscheiden (Unterschied zwischen 9 und 40 Atommasseeinheiten),
oder Produkte mit unterschiedlichen Anzahlen von Basen (Unterschied
von mindestens ca. 300 Atommasseeinheiten) für Mutanten und Wildtypen erzeugen.
Die letzteren können
durch Massenspektrometrie einfacher gemessen werden, sind jedoch
etwas komplizierter zu erzeugen. In beiden Fällen jedoch müssen die
PCR-Produkte des ersten Verstärkungszyklus
von den Nukleotid-Triphosphaten und Primern gereinigt werden, neue
Nukleotid-Triphosphate (einschließlich der abschließenden Derivate)
und Extensions-Primer müssen
hinzugefügt werden
und ein weiterer Satz von Kopier-Thermozyklen muss angewendet werden.
Die Endprodukte von einer Länge
von ca. 12 bis 25 Basen müssen wiederum
vor der massenspektrometrischen Analyse sorgfältig gewaschen werden. Primer-Extensionsverfahren
sind kompliziert, bei welchen zwei unterschiedliche Thermozyklus-
und Waschverfahren nacheinander verwendet werden, wodurch der Aufwand
einer reinen PCR-Verstärkung
ca. verdoppelt wird.
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Die
Primer-Extensionsverfahren sind weitgehend durch die
US 6,258,538 (H. Köster et al.) abgedeckt.
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Bei
allen Primer-Extensionsverfahren müssen ziemlich teuere Arten
von Polymerasen verwendet werden, da nicht alle Polymerasen die
abschließenden
dNTP-Derivate handhaben können.
Die Verwendung von Thermosequenase, die speziell für das Sanger-Sequenzierverfahren
entwickelt wurde, wird wärmstens
empfohlen. Billigere Polymerasen binden die Terminatoren nicht richtig.
Billige Polymerasen, wie tac Polymerase, können nur bei der ersten Verstärkung durch
PCR verwendet werden.
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Leider
ist eine genaue Bestimmung der Masse selbst dieser relativ kurzen
Primer-Extensions-Oligonukleotiden
immer noch schwierig. Bei einem Primer-Extensionsverfahren, das Produkte mit
derselben Anzahl von Basen liefert, betragen die Massenunterschiede
zwischen dem Wildtyp-Oligonukleotid und dem Mutanten-Oligonukleotid
nur zwischen 9 und 40 Atommasseeinheiten. Aufgrund des polyanionischen
Charakters der DNA ist es besonders wahrscheinlich, dass sich unterschiedlichen
Anzahlen an ubiquitärem
Natrium (23 Atommasseeinheiten) oder Kaliumionen (39 Atommasseeinheiten)
an die die Oligonukleotide (anstelle Protonen) binden, und sich
sogenannte „Addukte" bilden. Die Ungewissheit über das
Maß, in
welchem sich die Addukte bilden, macht jegliche genaue Massenbestimmung
außergewöhnlich schwierig – allermindestens
bedeutet es, dass das Reinigen extrem sorgfältig erfolgen muss, um die normalerweise
ubiquitäre
Präsenz
jeglicher Natrium- oder Kaliumkationen zu vermeiden und alle relevanten
Verfahrensparameter müssen
sorgfältig überwacht
werden, um sie konstant zu halten.
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Deshalb
wurde nach Verfahren gesucht, die die relativ kurzen Primer-Extensionsprodukte
noch mehr verkürzen,
inklusive partiellem enzymatischem Aufschluss und chemischer oder
enzymatischer Spaltung. Bei diesen Verkürzungsverfahren müssen noch
mehr Waschvorgänge
ausgeführt
werden, auch wenn das Waschen nicht so sorgfältig sein muss.
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Eines
der Verfahren zum Kürzen
der Produkte, die massenspektrometrisch analysiert werden müssen, wurde
von Monforte et al. (J.A. Monforte, C.H. Becker, T. A. Shaler, D.J.
Pollart, WO 96/37630) vorgeschlagen. Die Autoren schlugen die Verwendung
von Linkern vor, die chemisch oder enzymatisch gespalten werden
können.
Die erforderliche Einbringung von Chemikalien für den Spaltvorgang hat jedoch
immer den Nachteil, dass Spuren von Verunreinigungen eingebracht
werden, die wiederum Addukte bilden können. Außerdem erfordert die chemische
Spaltung die Einstellung anderer Parameter der Lösung, wie z.B. pH-Werte, wodurch
mehr Chemikalien hinzugefügt
werden müssen,
was die Gefahr birgt, dass z.B. Alkaliionen eingebracht werden. Enzymatisches
Spalten, z.B. durch Restriktionsendonukleasen, bedeutet einen sehr
eingeschränkten Aufbau
der Primer, die ein Erkennungsmuster für die Nukleasen bieten müssen, und
erfordert auch eingestellte Pufferbedingungen für das Spalten, wodurch das
Waschen nach dem Spalten erforderlich wird.
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Ein
weiteres Verfahren zum Kürzen
der DNA-Produkte durch teilweisen Aufschluss wurde von Gut und Beck
(WO 96/27681) zusammen mit einer Neutralisierung der DNA-Produkte
entwickelt, wodurch mehr Peptid-ähnliche
Produkte erzeugt werden.
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US-A
5 830 655 (BECKER CHRISTOPHER HANK ET AL; 0111.1998) offenbart ein
Verfahren für die
massenspektrometrische Analyse von bekannten Mutationsstellen in
der DNA, welches die Schritte aufweist: Verstärken der Ziel-DNA mittels Primern, die
photospaltbare Linker enthalten, Entnehmen, Spalten und Analysieren
der Spaltprodukte durch Massenspektrometrie. Die Erzeugung von kleinen Nukleinsäurefragmenten,
die für
die Massenspektrometrie geeignet sind, wird durch Spalten der Extensions/Verstärkungsprodukte
erzielt.
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US-B
6 258 5381 (BRAUN ANDREAS ET AL, 10.07.2001) offenbart ähnliche
Verfahren für
die massenspektrometrische Analyse von bekannten Mutationsstellen
in der DNA mit den Schritten: PCR-Verstärkung mittels Primern mit photospaltbaren
Linkern, Extrahieren, Spalten und Analysieren der Spaltprodukte
durch Massenspektrometrie.
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Das
MALDI-Präparier-
und Messverfahren besteht aus: erstens Einbetten von Analytmolekülen auf
einem Probenträger
in kleine Kristalle einer festen UV-absorbierenden Matrix, normalerweise
einer organischen Säure.
Der Probenträger
wird in die evakuierte Innenquelle des Massenspektrometers eingeführt. Die
Matrix wird dann durch einen kurzen Laserimpuls von ca. 3 Nanosekunden
bedampft, wodurch eine sogenannte Wassersäule entsteht, die aus einem
schwach ionisierten Plasma besteht, welches ca. einige Dutzend Nanosekunden
besteht, bevor es schnell in das umgebende Vakuum expandiert. Der Verdampfungsvorgang
transportiert auch die Analyt-Moleküle in die Plasma- Wassersäule. Die
Analytmoleküle
werden als Folge von Kollisionen mit Matrixionen der Wassersäule ionisiert,
jedoch leider wird ein Prozentsatz der fragilen DNA-Analytmoleküle, der
von der Bedingung und Länge
abhängt,
fragmentiert. Die Spannung, die an die Ionenquellenöffnungen
angelegt wird, beschleunigt die Ionen in das Flugrohr, welches kein
elektrisches Feld hat. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Massen werden
die Ionen auf unterschiedliche Geschwindigkeiten beschleunigt. Die
kleineren Ionen erreichen den Detektor schneller als die größeren Ionen.
Die Flugzeiten werden gemessen und zu Innenmassen konvertiert.
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MALDI
ist ideal geeignet zum Analysieren von Peptiden und Proteinen. Die
Analyse von Nukleinsäureketten
ist etwas schwieriger. Selbst bei kurzen Nukleinsäureketten
ist eine Ionisierung in dem MALDI-Verfahren ca. 100 mal weniger
erfolgreich als bei Peptiden. Die Sensitivität sinkt überproportional zur steigenden
Masse. Der Grund hierfür
liegt darin, dass nur ein einziges Proton gefangen werden muss, um
ein Peptid oder ein Protein zu fangen. Bei Nukleinsäuren mit
mehreren negativen Ladungen an dem polyanionischen Zucker-Phosphat-Rückgrat (eine negative
Ladung für
jedes Nukleotid), ist der Ionisierungsprozess, der diese Menge von
Protonen umfasst, beträchtlich
weniger effektiv. Die DNA-Produkte, die detektiert werden müssen, müssen deshalb
so kurz wie möglich
sein, so dass sie gut detektiert werden können.
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In ähnlicher
Weise kann auch ein Ionisierungsverfahren verwendet werden, bei
welchem eine Flüssigkeit
mit gelösten
Proben als Ausgangspunkt verwendet wird. Dies ist unter Elektrospray-Ionisierung
(electrospray ionization (ES)) bekannt. Es gibt unterschiedliche
Arten von Massenspektrometern, die ESI-Ionenquellen haben, wie Innenfallen,
FTMS und Laufzeit (time-of-flight)- Massenspektrometer mit orthogonaler
Inneneinspritzung. Das Verfahren ist auch ideal geeignet für die Detektion
von Peptiden und Proteinen. Bei Oligonukleotiden gibt es jedoch ähnliche
Probleme. Auch hier müssen
die Oligonukleotide, die detektiert werden sollen, so kurz wie möglich sein.
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Aufgabe der Erfindung
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein einfaches Verfahren zu
finden, welches ausreichende Mengen an ultrakurzen und ultrareinen DNA-Produkten
für die
massenspektrometrische Analyse erzeugt, möglichst mit nur einem einzigen Verstärkungs-
und einem einzigen Waschvorgang, wodurch Zeit, Kosten und Aufwand
der Probenvorbereitung im Vergleich zu bisher verwendeten Verfahren
der Primer-Extension reduziert werden.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung basiert auf einer einzigen Anwendung eines zyklischen
enzymatischen Verstärkungsprozesses,
wie die Polymerasekettenreaktion (PCR), wobei jedoch bei diesem
Prozess eine Mischung von Primern ohne und mit eingebauten photospaltbaren „Linkern" mit spezifischen
Eigenschaften verwendet wird. Die die Linker enthaltenden Primer
bewirken die Erzeugung von kurzen Nebenprodukten während des
Verstärkungsverfahrens,
die nicht weiter verstärkt
werden können.
Nach der Verstärkung
werden die kurzen Nebenprodukte z.B. durch eine Affinitätsbindung
mit Substraten extrahiert, gewaschen und durch UV-Licht gespalten,
um noch kürzere
analytische Produkte herzustellen, die für eine massenspektrometrische
Analyse bereit sind. Die Verwendung von „Blockern" mit spezifischen Eigenschaften bei
einer Art von Primer ermöglicht
noch kürzere
analytische Produkte.
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Somit
besteht das erfindungsgemäße Verfahren
nur aus einem Thermozyklus und einem Waschvorgang, gefolgt von einem
einfachen, umweltverträglichen
Spaltverfahren mittels einer einfachen UV-Lampe, die die endgültigen analytischen DNA-Produkte
für die
massenspektrometrische Analyse liefert.
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Die
photospaltbaren Linker haben die folgenden Eigenschaften:
- 1) Der Linker kann ein jegliches Nukleotid
in einem Primer ersetzen und behält
ungefähr
denselben Abstand zwischen den benachbarten Nukleotiden wie das
ersetzte Nukleotid bei;
- 2) der Linker behindert nicht das ordnungsgemäße Annealen
des Primers zu einem komplementären
Gegenstrang, wobei der Primer zu einem komplementären Gegenstrang
annealen kann, mit einem beliebigen Nukleotid gegenüber dem Linker;
- 3) der Linker behindert nicht die enzymatische Verlängerung
am 3' Ende durch
den Polymerase-Kopiervorgang, wenn der Linker ein paar Nukleotide
von dem 3' Ende
weg ist;
- 4) der Linker stoppt den Polymerase-Kopier-Vorgang, falls dieser
in einer Matrize angetroffen wird; und
- 5) der Linker kann durch UV-Licht gespalten werden, wodurch
die DNA-Sequenz gespalten wird.
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Als
photospaltbare Linker mit den obengenannten zusätzlichen Merkmalen sind Bausteine
der Klasse von Verbindungen der o-Nitrobenzyl-Derivate besonders
geeignet. Nach Konvertieren der o-Nitrobenzyl-Derivate in DNA-Bausteine
oder ähnliches, können diese
in den Primer an jeglicher Position eingebaut werden, wobei sie
ein normales Nukleotid ersetzen. Solche o-Nitrobenzyl-Derivate stören das
Annealen nicht und reduzieren nur geringfügig die optimale Annealtemperatur
während
einer DNA-Polymerasereaktion. Sie werden von unterschiedlichen Polymerasen
als die Verlängerung
am 3' Ende nicht
störend
akzeptiert, wenn sie eine geringe Anzahl von Nukleotiden von dem
3' Ende entfernt
angeordnet sind. Die Synthese und der Mechanismus der photospaltbaren
1-(2-Nitrophenyl)ethyl-Estern von verschiedenen unterschiedlichen
Phosphaten und Thiophosphaten wurden bereits im Detail von Walker
et a. untersucht (3. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 7170-7177) und Ordoukhanian
und Taylor (3. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9570-9571), jedoch wird
keine Anwendung bei der Massenspektrometrie erwähnt. Es sollte klar sein, dass
diese Linker in keinster Weise Derivate von Nukleotiden sind, indem
einfach andere Gruppen anstelle der gewöhnlichen Basen eingebracht
werden. Der Linker behindert nicht die Verlängerung des Primers am 3' Ende durch Polymerasen,
wodurch einige Polymerasen vier Nukleotide am 3' Ende erfordern. Andere können den
Kopiervorgang zuverlässig
mit nur drei Nukleotiden zwischen dem Linker und dem 3' Ende beginnen. Es
ist bevorzugt, wenn der Linker so nahe wie möglich am 3' Ende angeordnet ist.
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Die
Blocker, die alternativ bei einer Art der analytischen Primer eingebaut
sind, sind durch folgende Eigenschaften definiert:
- 1) der Blocker kann ein Nukleotid in einem Primer ersetzen;
- 2) der Blocker behindert nicht das Annealen des Primers zu einem
komplementären
Gegenstrang;
- 3) der Blocker behindert nicht die enzymatische Verlängerung
am 3' Ende durch
den Polymerase-Kopiervorgang, selbst wenn der Blocker in der 3' Position bleibt;
und
- 4) der Blocker stoppt den Polymerase-Kopiervorgang, falls er
in einer Matrize angetroffen wird.
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Als
Blocker können
viele unterschiedliche Derivate verwendet werden. Es kann jeweils
ein Blocker für
jede der vier Arten von Nukleotiden vorgesehen sein, dies ist jedoch
nicht erforderlich. Eines der einfachsten Derivate, die als Blocker
verwendet werden können,
ist das Nukleosid-Thiophosphat, welches richtig annealt, durch die
Polymerase verlängert werden
kann und den Kopiervorgang stoppt, falls er in einer Matrize angetroffen
wird. Vorzugsweise wird nicht nur ein Nukleotid-Thiphosphat als
Blocker verwendet, sondern zwei oder drei in einer Reihe, um den
Polymerase-Kopiervorgang einer Matrize zuverlässig zu stoppen.
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Andere
Arten von Blocker sind Nukleotid-Derivate, bei welchen die Base,
die mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat
verbunden ist, durch eine chemische Gruppe ersetzt ist, die Wasserstoffbrücken zu
den Gegennukleotiden fehlerhaft bilden, oder gar keine Wasserstoffbrücken bilden.
Die Blocker werden bevorzugt direkt an dem 3' Ende des Primers angeordnet. Wenn die
Polymerase Schwierigkeiten hat, die Verlängerung zu beginnen, kann ein einzelnes
normales Nukleotid in der Position an dem 3' Ende direkt benachbart zu dem Blocker-Nukleotid oder
-Nukleotiden verwendet werden.
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PCR-Verstärkung wird
so mit einer Mischung von zwei Paaren von Primern ausgeführt: einem
ersten Paar von „Auswahl"-Primern, die den
PCR-Vorgang steuern und einem zweiten Paar von „analytischen" Primern, wobei einer
der analytischen Primer des Paars einen Linker enthält und der
andere analytische Primer des Paars entweder einen Linker oder einen
Blocker enthält.
Die zwei Paare von Primern können
identisch sein mit Ausnahme des Linker- oder Blockerorts, jedoch
ist das den Linker/Blocker enthaltende analytische Primerpaar in
den PCR-Produkten „verschachtelt", die von dem Paar
Selektions-Primer
erzeugt werden. Die Linker enthaltenden analytischen Primer können an
ihrem 5' Ende zur
einfachen Immobilisierung an einer Streptavidin-beschichteten Oberfläche und
zum Waschen biotinyliert werden. Natürlich kann anstelle des Biotins
jegliche andere Affinitäts-Einfanggruppe
verwendet werden oder ein Teil der Sequenz selber kann für die Immobilisierung
durch Hybridisierung verwendet werden.
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Vorzugsweise
enthalten die Primer den photospaltbaren Linker an einer Position
ungefähr
ca. 2 bis 5 Nukleotide von der 3' Position
weg. Wenn der zweite Primer des Paars einen Blocker enthält, sollte der
Blocker an dem 3'-Ende
oder zumindest in der Position nahe des 3' Endes angeordnet sein.
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Die
PCR-Verstärkung
mit der Mischung der zwei Primerpaare führt zu einer hohen Anzahl an
Linker enthaltenden DNA-Nebenprodukten, die bereits über die
Mutationsstelle hinaus gekürzt
sind, da einer der früheren
Kopiervorgänge
bereits einen Linker oder Blocker in der zu kopierenden Matrize
gefunden hatte (siehe 2 und 3). Wenn
die Linker enthaltenden Primer biotinyliert sind, können die
Endprodukte an einer Oberfläche,
die mit Streptavidin überzogen
ist, immobilisiert, gewaschen und gespalten werden. Der gesamte
Vorgang erzeugt die erwarteten kurzen DNA-Produkte, die mit Produkten
vermischt sind, die beträchtlich
länger
sind, da sie immer noch an ihrem 3' Ende das Komplement des ganzen Selektionsprimers
enthalten. Diese beträchtlich
längeren
DNA-Produkte können durch
größenspezifische
Absorption weggewaschen werden. Dies ist jedoch nicht wirklich erforderlich,
da sie normalerweise die MALDI oder ESI-Analyse nicht stören.
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Bei
Verwendung eines Paars analytischer Primer, die jeweils Linker in
der fünften
Position von der 3' Position
enthalten, summiert sich die Länge des
kurzen Produkts aus vier Basen eines analytischen Primers, aus vier
Basen komplementär
zu dem anderen analytischen Primer und aus der Länge der Sequenz zwischen den
Primern. Mit nur der Mutationsstelle zwischen den Primern beträgt die Länge des
kurzen Produkts genau 9 Basen. Wenn der Linker näher an dem 3' Ende angeordnet
werden kann, kann das Produkt sogar noch kürzer sein. Proben von beiden
Strängen
werden gleichzeitig erzeugt: das analytische Ergebnis von einem
Strang wird durch das analytische Ergebnis des anderen Strangs bekräftigt. Wenn
nur ein einen Linker enthaltender analytischer Primer biotinyliert
wird, wird nur ein Strang analysiert.
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Wenn
ein Linker enthaltender Primer und ein Blocker enthaltender Primer
als analytisches zweites Paar von Primern verwendet werden, ist
das Endprodukt für
die massenspektrometrische Analyse noch kürzer: es kann vier Basen von
dem Linker enthaltenden Primer plus der Länge des Strangs zwischen den analytischen
Primern enthalten. Bei nur der Mutationsstelle zwischen den Primern
und mit dem Blocker in der 3' Position,
beträgt
die Gesamtlänge
nur fünf Basen:
ein Pentamer wird hergestellt.
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Der
PCR Ertrag für
die kurzen Produkte und die Menge der längeren Ketten in den Endprodukten hängt sehr
stark von dem Verhältnis
der Linker/Blocker enthaltenden Primer zu Linker/Blocker-freien Primern
in dem Gemisch ab. Wenn beide Primer des analytischen Paars von
Primern nur Linker enthalten, und wenn der Annealprozess aller Primer
dieselbe Wahrscheinlichkeit hat, dann treffen die folgenden Verhältnisse
zu: der höchste
Ertrag der gewünschten kurzen
DNA-Proben für die Analyse,
die mit der geringsten Anzahl an Thermozyklen erhalten wird, wird mit
einer Mischung von grob 7% Linker-enthaltenden analytischen Primern
erreicht. Eine 1,5-fach größere Menge
von längeren
PCR-Produkten wird gemischt, diese Oligonukleotide erscheinen jedoch
nicht in der MALDI-Analyse. Die PCR-Produkte, erzeugt durch die
Selektions-Primer betragen 16 mal mehr. Der Überschuss der PCR-Produkte
kann durch größere Prozentsätze der
analytischen Primer verringert werden, jedoch das Verhältnis der
analytischen Primer zu PCR-Selektions-Primern stellt sich als nicht
sehr kritisch heraus. Ein Kompromiss ist eine Mischung von 10 bis
20 % von Linker enthaltenden analytischen Primern. Verhältnisse
im Bereich von 3 bis 30 Prozent sind jedoch ohne Probleme akzeptierbar.
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Einer
der speziellen Vorteile dieser Erfindung besteht darin, dass die
photolytische Spaltung keine zusätzlichen
Verunreinigungen einbringt, was bei allen chemischen oder enzymatischen
Spaltverfahren der Fall ist.
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Nach
diesem PCR-Verfahren werden die analytischen Nebenprodukte für eine gründliche
Waschung immobilisiert, z.B. durch Streptavidin-beschichteten Oberflächen, wenn
die Produkte biotinyliert sind. Nach dem Waschen werden die Linker
aller immer noch immobilisierten Produkte mit einer UV-Lampe gespalten.
Freie Spaltprodukte bestehen nun aus den gewünschten kurzen Oligonukleotiden von
ca. fünf
bis elf Basen Länge
für ein
analytisches Paar von Primern nur mit Linkern oder mit vier bis sechs
Basen Länge
für ein
analytisches Paar von Primern mit Linkern und Blockern, die beide
mit einer geringfügig
größeren Menge
an Produkten gemischt sind, die die volle Primerlänge über die
Mutationsstelle hinaus enthalten.
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Bei
der MALDI-Ionisierung kann die Immobilisierung direkt an der Probenträgerplatte
stattfinden, wenn die biotinylsierten Primer mit Linker verwendet werden
und die Probenorte mit Streptavidin beschichtet sind. Solche Probenträgerplatten
können mit
einer höchst
hydrophoben Beschichtung beschichtet werden, wobei nur Hunderte
von kleinen hydrophilen Ankern zur Probenerzeugung verbleiben. Die
Anker sind mit Streptavidin beschichtet und die PCR-Lösung wird
einfach von einem Loch der Mikrotitrierplatte pipettiert, die für PCR an
einem solchen Probenanker verwendet wird. Aufgrund der Hydrophobie
der den Anker umgebenden Platte werden die Proben von unterschiedlichen
Löchern
auf der Platte separat gehalten. Die letzten analytischen biotinylierten
Oligonukleotide werden an den Ankern immobilisiert und die Platte
mit Hunderten von Proben wird gründlich
gewaschen. Nach dem Spalten und Trocknen werden die freien Spaltprodukte
von einem pipettierten Tropfen Lösungsmittel
mit Matrixsubstanz für
den MALDI-Prozess aufgenommen. Nach dem zweiten Trocknungsprozess
ist die Stützplatte bereit
für die
MALDI-Analyse in einem Laufzeitmassenspektrometer.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1 zeigt
die Struktur des bevorzugten Linkers, β-Cyanethylphosphoramidit kann
verwendet werden, um während
der Primersynthese ein komplettes Nukleotid zu ersetzen. Der Linker überbrückt die
benachbarten Nukleotide mit derselben Distanz wie ein echtes Nukleotid,
enthält
jedoch keinen Zucker (Ribose). Hybridisierung des Linker enthaltenden
Primers mit der komplementären
Mastermatrize ist mit einem jeglichen Gegen-Nukleotid möglich, wobei
nur eine kleine Herabsetzung des Schmelzpunkts beobachtet wird.
R1 und R2 sind zwei
DNA-Sequenzen. Spaltung erzeugt die R2-Sequenz
für massenspektrometrische
Messungen, wodurch die R2-Sequenz an eine
Phosphatgruppe mit doppelt negativem Anionen-Charakter gebunden
ist. Nach der Protonisierung dieser zwei Anionen in dem MALDI-Verfahren
fügt die
Phosphatgruppe 80 Atommasseeinheiten zum Gewicht der protonisierten
R2-Sequenz hinzu.
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2 stellt
einige Anfangs-, Zwischen- und Endprodukte des PCR-Verfahrens dar,
wenn zwei Primerpaare zum Ausführen
von PCR verwendet werden, ein Paar (vorzugsweise ca. 80 bis 90%) ohne
Linker und ein Paar mit Linker. Das Oligomer (2a) ist ein
Teil der ursprünglichen
DNA mit Nukleotiden "N", die die Mutationsstelle
enthalten, bezeichnet mit "P". Oligomer (2b)
stellt den Gegenstrang dar. Hier werden die komplementären Nukleotide
als "M" bezeichnet und die
komplementären
Nukleotide der Mutationsstelle werden "Q" genannt.
(2c) und (2d) stellen das erste Primerpaar mit
Nukleosiden "1" und "2" dar (das 3' Ende ist gekennzeichnet durch „–„), was
in dem PCR-Verfahren ausreichende Mengen an einzelstrangigen DNA-Segmenten
(2e) und (2f) erzeugt. Das zweite Paar (2g)
und (2i) der analytischen Primer, mit Nukleotiden "3" bzw. "4" tragen
die Linker „L
nahe der 3' Position
und Affinitätsgruppen "A" an den entsprechenden 5' Positionen. Diese
Primer liefern die Produkte (2h) und (2j), falls
sie zu den Produkten (2e) und (2f) annealt und
komplementär viele
Male durch die Polymerase kopiert werden. Wenn in den folgenden
Thermozyklen die Primer (2g) und (2i) des zweiten
Paars nun mit den Linker enthaltenden Produkten (2h) und
(2j) als Matrizen annealt werden, entstehen die relativ
kurzen Produkte (2k) und (2l), da der Kopierprozess
an der Position des Linkers in der Matrize stoppt. Nach ausreichenden
Thermozyklen des PCR-Verfahrens, werden die Linker-enthaltenden
Produkte (2h), (2j), (2k) und (2l) (plus
einiger nicht verwendeter zweiter Primer) durch Affinitätsbindung
der Affinitätsgruppe "A" zu einem geeigneten Substrat extrahiert.
Waschen und Spalten unter einer UV-Lampe erzeugt die Endprodukte (2m),
(2n), (2o) und (2p), die von MALDI analysiert werden.
Der Spaltprozess hinterlässt
eine Phosphatgruppe (bezeichnet durch "+"),
wobei 80 Atommasseeinheiten nach der Protonisierung hinzugefügt werden.
Da die längeren
Produkte (2m) und (2o) aufgrund ihrer geringen
Sensitivität
nicht sichtbar sind, erscheinen nur die Massesignale der Produkte
(2n) und (2p) in dem Spektrum (möglicherweise
zusammen mit Signalen der gespalteten restlichen Primer), was die
Masse der kurzen Produkte (2n) und (2p) zeigt
(hier 10 Basen lang), von welchen die Nukleotide der Mutationsstelle
bestimmt werden können.
Da der Strang und Gegenstrang der ursprünglichen DNA gleichzeitig untersucht
werden, stellt die Bestimmung der Mutation in dem Gegenstrang eine
Qualitätsverbesserung
des Analyseverfahrens durch automatische Doppelbestimmung dar. Wenn
die Primer (2g) und (2i) nicht vollständig während des
PCR aufgebraucht werden, werden diese auch extrahiert und liefern
einige DNA-Quadrumer-Ionen.
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3 stellt
ein ähnliches
PCR-Verfahren dar, bei welchem analytische Primer mit Linkern "1" und analytische Primer mit Blockern "B" als analytische zweites Paar Primer
verwendet werden. Hier bestehen die endgültigen Produkte aus den längeren Produkten
(3l) und den kürzeren
Produkten (3m), wodurch die Produkte (3m) nur
fünf Basen
lang sind. Diese werden Pentameter genannt.
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4 zeigt
drei Massenspektren von DNA-Pentamern, die hier von Proben hergestellt sind,
die durch die Extension der Primer mit Linkern, gezeigt in 1,
und nachfolgender Spaltung erhalten werden, weshalb sie eine zusätzliche
Phosphatgruppe tragen (80 Atommasseeinheiten nach Protonisierung).
Das SNP wird PAI1 genannt. Das obere Spektrum zeigt den heterozygoten
Fall, die zwei unteren Spektren stellen die zwei homozygoten Fälle dar.
Bei allen drei Spektren sind die Überbleibsel der nicht verlängerten
Extensions-Primer als DNA-Quadrumer-Ionen
sichtbar. Diese können
als einfache Massenreferenzen dienen.
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Besonders bevorzugte Ausführungsformen
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Eine
erste bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung besteht aus PCR-Verstärkung, welche
mit einer Mischung eines Paars normaler PCR-Selektions-Primer ohne Linker
(2c) und (2d) von 2 und einem
Paar biotinylierten, Linker enthaltenden analytischen Primern (2g)
und (2i) ausgeführt
wird. Vorzugsweise beläuft
das Selektions-Primerpaar auf ca. 90 Prozent und das analytische
Primerpaar auf ca. 10 Prozent aller Primerpaare. Beide Paare von
Primern können
dieselbe Sequenz haben mit Ausnahme des Linkers. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform
ist jedoch das Linker enthaltende Primerpaar in dem DNA-Produkt
des ersten Selektions-Primerpaars „verschachtelt", und somit viel
näher zu
der Mutationsstelle annealt als in 2 gezeigt
ist. Vorzugsweise werden die analytischen Linker enthaltenden Primer
direkt neben der Mutationsstelle annealt, was für den Primer (2i)
in 2 gezeigt ist.
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Bei
den 90 Prozent Selektions-Primern (2c) und (2d)
ohne Linker erzeugt das Verstärkungs-PCR-Verfahren
DNA-Sequenzen von beiden Strängen,
die die Mutationsstelle einbeziehen, wodurch die Anzahl an normalen
PCR-Produkten (2e) und (2f) in jedem Thermozyklus
um einen Faktor von 1,8 steigt. Außer dieser exponentiellen PCR-Verstärkung durch
das Linker-freie Primerpaar (2c) und (2d) erzeugen
die 10 Prozent Linker enthaltenden Primer (2g) und (2i)
die Sequenzen (2h) und (2j) als Linker enthaltende
Nebenprodukte, die nicht weiter in voller Länge verstärkt werden können.
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Diese
Nebenprodukte (2h) und (2j) können nur linear verstärkt werden
(bis zu der Linkerposition) durch Selektions-Linker (2c)
bzw. (2d), wobei Produkte erhalten werden, die in 2 aus Übersichtlichkeitsgründen nicht
gezeigt sind. Wenn dann ein Linker enthaltender Primer (2g)
oder (2j) an diese Produkte oder die Produkte (2h)
oder (2j) annealt wird und durch die Polymerase verlängert wird,
werden kurze Produkte der Typen (2k) oder (2l)
erzeugt. Eine weitere Verstärkung
dieser Produkte (2k) und (2l) ist nicht mehr möglich. Somit
wird das gesamte PCR-Verfahren mit einer Art von kurzen biotinylierten Linker
enthaltenden DNA-Nebenprodukten (2k) und (2l)
beendet, die bereits auf vier oder fünf Basen am anderen Ende der
Mutationsstelle gekürzt
sind.
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Die
PCR-Verstärkung
wird normalerweise in sogenannten Thermozyklen ausgeführt mittels
Mikrotitrierplatten mit jeweils 384 Löchern. Die Thermozykler werden
so gesteuert, dass sie die Thermozyklen automatisch ausführen. Der
Thermozyklus besteht aus jeweils drei Phasen: Schmelzen (Trennen des
Strangs und Gegenstrangs) durch eine Temperatur im 90° Bereich,
Annealen des Primers im 50° Bereich
und Polymerase-Komplementär-Kopieren durch
Verlängern
des Primers an seinem 3' Ende
im 70° Bereich.
Nach Beenden des PCR Thermozyklus mit ca. 30 bis 40 Zyklen werden
die PCR-Lösungen von
den Löchern
in den Mikrotitrierplatten als kleine Tröpfchen auf speziellen Probenstellen
an einer Probenträgerplatte
für das
Massenspektrometer pipettiert. Vorzugsweise haben diese Probenträgerplatten die
Größe von Mikrotitrierplatten
und enthalten 384 kleine hydrophile Probenanker auf einer ansonsten hydrophoben
Plattenfläche.
Die Anker haben Durchmesser von ca. einem Millimeter, und sind mit
Streptavidin beschichtet. Die biotinylisierten Produkte, die aus
den längeren
Oligonukleotiden (2h) und (2j) und den kürzeren Oligonukleotiden
(2k) und (2l) bestehen, sind durch Affinitätsverbindungen
zwischen dem Biotin und Streptavidin immobilisiert.
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Die
Probenträgerplatten
werden nun sorgfältig
gewaschen und die Linker werden durch Exposition an eine UV-Lampe
gespalten. Die freien Spaltprodukte haben die Form von Oligonukleotiden
(2m), (2n), (2o) und (2p) mit
Zugabe einer Phosphatgruppe, die jeweils von den Linkern stammt.
Diese freien Analytprodukte werden von einem Lösungsmitteltropfen, der die
Matrixsubstanz für
den MALDI-Prozess enthält,
aufgenommen. Durch das Trocknen entstehen kleine Matrixkristalle
mit eingebauten Analytmolekülen
für die
MALDI-Analyse. Während des
MALDI-Prozesses in der Innenquelle des Massenspektrometers werden
die kurzen Produkte (2n) und (2p), die ca. 40
Prozent der freien Spaltprodukte betragen, vorzugsweise ionisiert
und analysiert.
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Die
freien Produkte (2n) und (2p) bestehen aus jeweils
vier Basen von dem 3' Ende
des Primers (oder dessen Gegenstück)
und einer bis drei Basen einschließlich der Mutationsstelle.
Eine optimale Länge
für das
kurze Produkt beträgt
ca. neun bis elf Basen.
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Bei
der bevorzugten Ausführungsform,
bei welcher beide Linker enthaltenden Primer die Biotingruppe enthalten,
werden beide Stränge
automatisch für
die Mutation analysiert, was die Genauigkeit des analytischen Ergebnisses
durch Bestätigung
erhöht. Wenn
nur ein Linker enthaltender Primer des analytischen Primerpaars
biotinylisiert ist, wird nur die Mutation in einem Strang analysiert.
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Der
PCR-Ertrag und die Anzahl der längeren Ketten
(2m) und (2o) in dem Endproduktgemisch hängen etwas
von dem Verhältnis
des Linker enthaltenden und Linker-freien Primers in dem Gemisch
ab. Wenn die Wahrscheinlichkeit zum Annealen für alle vier Primer gleich ist,
erhält
man den höchsten
Ertrag von kurzen DNA-Proben für
eine Analyse mit der geringsten Anzahl an Thermozyklen, wenn eine
Mischung mit ungefähr
7 % des Linker enthaltenden Primers verwendet wird (genau 6,9%).
Dies ist das Ergebnis einer mathematischen Simulation unter Annahme
von gleichen Hybridisierraten für
beide Primerpaare. In diesem Fall ist jedoch ein 1,5-facher Überschuss
von längeren
PCR-Produkten (2m) und (2o) mit den kurzen Ketten
(2n) und (2p) gemischt. Bei höheren Prozentsätzen von
Linker enthaltenden Primern (2g) und (2i) kann
das Verhältnis
der kurzen Produkte (2n) und (2p) zu den langen
Produkten (2m) und (2o) etwas reduziert werden,
jedoch der Gesamtertrag für
diese Produkte ist etwas niedriger und erfordert mehr Temperaturzyklen.
Bei einem höheren
Prozentsatz von Linker enthaltenden Primern wird der PCR-Ertrag
reduziert. Ein Kompromiss ist eine Mischung von 10 bis 20 % von
Linker enthaltenden Primern. Die langen Produkte (2m) bzw.
(2o) sind bei der MALDI-Massenspektrometrie nicht sichtbar
aufgrund ihrer viel niedrigeren Sensitivität. Bei Simulationen wird mit
diesen Mischverhältnissen
ein Produktionsfaktor von ca. 109 für die kurzen
Produkte (2n) und (2p) in ca. 35 Temperaturzyklen
erreicht.
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Die
Immobilisierung durch Biotin-Streptavidin-Bindung kann in einfacher
Weise durch andere Bindungsarten ersetzt werden, die dem Fachmann auf
diesem Gebiet wohlbekannt sind. Eine spezielle Art von Immobilisierung
kann durch Verwendung von größenspezifischer
Adsorption, gesteuert durch Puffer, erreicht werden. Magnetic Beads
und entsprechende Puffer für
diesen Zweck sind erhältlich
(z.B. GenopureTM von Bruker Saxonia Analytik
GmbH, Leipzig).
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Wie
oben aufgezeigt ist, dürfen
die Linker enthaltenden Primer (2g) und (2i) nicht
mit den Linker-freien Primern (2c) und (2d) in
der Basen-Sequenz mit Ausnahme des Linkers identisch sein. Sie können sogar
beträchtlich
kurzer sein. Es können Linker
enthaltende Primer verwendet werden, die viel näher zu der Mutationsstelle
auf einer oder beiden Seiten hybridisieren. Dadurch können nicht-interferierende,
nichtfaltende PCR-Selektionsprimer für den exponentiellen Verstärkungsprozess
und ein Paar von verschachtelten kurzen Primern, die die Linker enthalten
und die endgültigen
kurzen Produkte produzieren ausgewählt werden.
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Es
gibt natürlich
mehrere Varianten für
dieses Verfahren. Um die Anzahl von Thermozyklen zu reduzieren,
um nicht die Effektivität
der Polymerase auszublenden, die eine Halbwertszeit von nur ca.
20 Zyklen hat, kann das wohlbekannte „touch-down PCR Verfahren" verwendet werden:
wenn die analytischen Primer kürzer
sind als die Selektionsprimer und deshalb eine geringere optimale
Annealtemperatur zeigen, können
die ersten PCR-Zyklen mit einer höheren Annealtemperatur ausgeführt werden,
was die analytischen Primer am Annealen hindert. Normale PCR-Verstärkungsraten
mit den Selektions-Primern
werden somit erreicht. Nur in späteren
Zyklen wird die Annealtemperatur herabgesetzt, um die analytischen
Primer mit Linkern zu hybridisieren (und mit Blockern, siehe nächsten Absatz).
Der Prozentsatz der analytischen Primer kann beträchtlich
größer gewählt werden
mit diesem touch-down
Verfahren und ausreichende Mengen an endgültigen Nebenprodukten können mit
einer geringeren Anzahl von Zyklen erzeugt werden. Der Prozentsatz
der analytischen Primer kann im Bereich von 20 bis 50 Prozent liegen, es
sollte jedoch beachtet werden, dass die analytischen Primer fast
vollständig
in dem PCR-Verfahren aufgebraucht werden sollten, da die nicht verwendeten
Primer in den Endprodukten für
massenspektrometrische Messungen enthalten sind (siehe unten). Kommerziell
erhältliche
Thermozykler können
so programmiert werden, dass sie dieses „touch-down" Verfahren automatisch
ausführen.
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Eine
zweite bevorzugte Ausführungsform
mit „Blockern" erzeugt noch kürzere Oligonukleotide
für Mutationsanalysen
durch Massenspektrometrie. Die Blocker werden bei einer Art (3g)
von analytischem Primerpaar verwendet, wohingegen der andere Primer
(3i) des Paars einen Linker enthält. Die ursprünglichen Stränge (3a)
und (3b), einige Zwischenprodukte und die Endprodukte (3l)
und (3m) dieses Verfahrens sind in 3 gezeigt.
Dieses Verfahren erzeugt nach dem Spalten extrem kurze Oligonukleotide
(3m) von nur vier bis sechs Basen Länge, die am besten für massenspektrometrische
Messungen geeignet sind.
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Im
Detail sind Teile der ursprünglichen DNA-Stränge (3a)
und (3b) durch die Selektions-Primer (3c) und
(3d) zu den Produkten (3e) und (3f) exponentiell
verstärkt.
Der den Blocker enthaltende analytische Primer (3g) produziert
das Nebenprodukt (3h), das einen Blocker enthält. Wenn
der den Linker enthaltende analytische Primer (3i) an das
Nebenprodukt (3h) annealt, erzeugt die Polymerase das den
Linker enthaltende Nebenprodukt (3k). Dieses Produkt kann
aufgrund seiner Affinitätsgruppe „A" zu einem geeigneten
Substrat immobilisiert, gewaschen und gespalten werden, wodurch
das freie Oligonukleotid (3m) gebildet wird. Das Produkt
(3m) besteht aus nur fünf
Basen (plus einer Phosphatgruppe von dem Linker) und enthält die Informationen,
welche Base in der Mutationsstelle des ursprünglichen Strangs (3a) eingebaut
war.
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Wenn
die biotinylisierten Primer (3i) nicht vollständig von
dem PCR Verfahren aufgebraucht werden, werden diese Primer auch
extrahiert, gewaschen und gespalten, zusammen mit den Oligomeren
(3j) und (3k), wodurch einige Tetramerionen gebildet
werden. Diese Tetramerionen haben genau bekannte Massen und können deshalb
als Massenreferenzen für
den Massenbestimmungsvorgang dienen. 4 zeigt
diese Situation mit Linker enthaltender DNA, deren Spaltprodukte
Pentamere liefern, und die übrigen,
Linker enthaltenden Primer liefern bei ihrer Spaltung Tetramere,
die die dann als Massereferenzen dienen. Die Messungen von 4 basieren auf
genau den in 1 gezeigten Linkern.
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Als
Blocker können
Derivate von Nukleotiden verwendet werden, die den Kopiervorgang
der Polymerase, falls dieser in einer Matrize angetroffen wird,
behindern. Der Verlängerungsvorgang
durch die Polymerase wird von den Wasserstoffverbindungen zwischen
dem Nukleotid in der Matrize und dem Baustein, der in die zu verlängernde
DNA-Kette gebaut werden soll, gesteuert. Es ist wohlbekannt, dass der
Hybridisier- oder Annealprozess zwischen Strang und Gegenstrang
entweder zwei oder drei eindeutig definierte Wasserstoffbrücken zwischen
Paaren von Nukleotiden bildet. Wenn nun ein Nukleotid-Derivat anstelle
einer der vier Basen eine Gruppe enthält, die stark fehlerhafte Wasserstoffbrücken oder
nur eine oder überhaupt
keine Wasserstoffbindung bildet, wird es nun einen Blocker bilden.
Der Blocker enthaltende Primer wird immer noch annealen und der
Blocker kann sogar verlängert
werden, wenn er an dem 3' Ende
des Primers angeordnet ist. Wenn es jedoch in der Matrize angetroffen
wird, zeigt das Blocker-Nukleotid-Derivat nicht die richtige Wasserstoffbrückenmotiv,
um ein Gegennukleotid zu finden. Der Kopiervorgang wird gestoppt.
Der kundige Biochemiker kann mit den hier gegebenen Informationen
hunderte von unterschiedlichen Arten von Derivaten von Nukleotiden
finden, die als Blocker verwendet werden können.
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Eine
weitere Art von Blocker wird erhalten, wenn das Rückgrat derivatisiert
wird, um den Kopiervorgang zu stoppen, z.B. durch eine Phosphor-Thioatgruppe
anstelle der normalen Phosphatgruppe. Diese Gruppe bildet einen
etwas schwächeren
Blocker und muss für
einige Arten von Polymerase in doppelten oder sogar dreifachen Positionen
verwendet werden, um den Kopiervorgang zuverlässig zu stoppen.
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Die
Blocker enthaltenden Primer dürfen
nicht in genau derselben Menge wie die Linker enthaltenden Primer
angewandt werden. Es kann vorteilhaft sein, viel mehr Blocker enthaltende
Primer als Linker enthaltende Primer zu verwenden.
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Der
touch-down Vorgang mit einem PCR Vorgang, der zuerst bei einer höheren Annealtemperatur
beginnt, und dann auf Annealtemperaturen für die Linker und Blocker enthaltenden
analytischen Primern kommt, kann hier sicherlich auch verwendet werden.
Auch Extraktionsverfahren mit absorptiven Magnetic Beads (z.B. GenoPureTM) können
hier verwendet werden anstelle von Affinitätsgruppen, die mit den analytischen
Linker enthaltenden Primern verbunden sind.
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Der
hier umrissene Vorgang für
die Herstellung von analytischen Oligonukleotiden von kurzer Länge für die Untersuchung
von Mutationsstellen durch Massenspektrometrie zeigt mehrere Vorteile. Erstens
muss nur eine einzelne thermozyklische Phase angewendet werden,
was Zeit und Aufwand spart. Zweitens ist die teure Thermosequenase
als Polymerase für
die Primer- Extension
nicht mehr erforderlich. Die billige tac Polymerase kann wie gewöhnlich für diese
Verstärkung
verwendet werden. Drittens ist der Waschvorgang durch Binden der
Produkte an ein Substrat und nachfolgendes Spalten extrem einfach.
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Das
PCR-Verfahren zum Herstellen von Produkten, die für massenspektrometrische
Mutationsmessungen geeignet sind, kann auch gemultiplext werden,
damit es mehr als ein Mutations-abhängiges Produkt in demselben
Verfahren liefert. Das Multiplexverfahren für PCR ist dem Fachmann auf
diesem Gebiet wohlbekannt.