DE10036743A1 - Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5 DEG C und 40 DEG C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt; (b) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe, bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase; (c) gegebenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b); (d) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden ...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt; (b) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase; (c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b); (d) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung einer Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist; (b) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden. Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül verlängertem Primer und Polymerase; (c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b); (d) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und (e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.

Die heutzutage hauptsächlich verwendeten Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen beruhen auf dem Prinzip des enzymatischen Sequenzierverfahrens, das 1977 von Sanger et al. entwickelt wurde (Sanger et al. 1977, PNAS 74: 5463). Bei diesem Verfahren wird ein spezifischer Primer an ein zu sequenzierendes einzelsträngiges DNA-Template hybridisiert und mittels einer DNA-Polymerase verlängert. Durch den Einsatz von Didesoxynukleosid­ triphosphaten (ddNTPs) wird dabei die Elongation der Primer basenspezifisch terminiert, wodurch Populationen von DNA-Molekülen entstehen, deren Längen durch den Abstand zwischen dem 5'-Ende des Primers und der Position des basenspezifischen Strangabbruchs bestimmt sind. Werden vier unterschiedliche ddNTPs verwendet (ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP), entstehen Populationen von DNA-Molekülen, deren Elongation statistisch an Positionen abbrechen, die jedem komplementären C, T, A oder G des Template-Stranges entsprechen. Sind die Populationen von DNA-Molekülen unterscheidbar markiert (beispielsweise durch die Verwendung von ddNTP-spezifischen Fluroeszenz-Farbstoffen), kann die enzymatische Reaktion in einem Reaktionsansatz, der alle vier verschiedenen ddNTPs enthält, durchgeführt werden. Sind die Populationen von DNA-Molekülen nicht unterscheidbar markiert, muß die enzymatische Reaktion in vier unterschiedlichen Reaktionsansätzen durchgeführt werden, die jeweils eines der vier verschiedenen ddNTPs enthalten. Die Populationen von markierten DNA- Molekülen können schließlich beispielsweise mittels Polyacrylamid- Gelelektrophorese aufgetrennt und die Sequenz des DNA-Templates bestimmt werden.

Neuere Varianten des Sequenzierverfahrens nach Sanger umfassen den Einsatz der Polymerasekettenreaktion (PCR) und der Massenspektrometrie zur Analyse der Populationen von DNA-Molekülen.

Die basenspezifische Terminierung der Elongationsreaktion durch den Einbau von modifizierten Stopnukleotiden, üblicherweise ddNTPs, wie bei der Sequenzierungsmethode nach Sanger und allen damit verwandten Sequenzierungstechniken praktiziert, ist jedoch mit einer Reihe von Nachteilen verbunden. Beispielsweise ist es für optimale Ergebnisse erforderlich, das Verhältnis von dNTPs und Stopnukleotiden sorgfältig aufeinander abzustimmen. Wurde das zu sequenzierende DNA-Template in einer vorangegangenen PCR- Reaktion amplifiziert, ist es deshalb notwendig, vor der Sequenzierung dNTPs, die in der PCR-Reaktion nicht verbraucht wurden, weitestgehend zu entfernen. Bei einer großen Anzahl von zu sequenzierenden Proben ist dieser Schritt zeitaufwendig und kostenintensiv. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß nur DNA-Polymerasen eingesetzt werden können, die Stopnukleotide als Substrat akzeptieren und korrekt einbauen. Und schließlich sind die kommerziell verfügbaren Stopnukleotide deutlich teurer als unmodifizierte Nukleotide.

Dementsprechend war das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem, eine einfachere, schnellere und kostengünstigere Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen zur Verfügung zu stellen.

Dieses technische Problem wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt; (b) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten.

Der Begriff "partielle Nukleotidsequenz" bedeutet erfindungsgemäß, daß nur der/ein Teil der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls bestimmt wird, der nicht an den Primer hybridisiert. Sofern das Nukleinsäuremolekül einen nicht mit dem Primer hybridisierenden Längenüberschuß von vorzugsweise bis zu 25 Nukleotiden aufweist und der Primer bündig abschließend am 3' Ende des Nukleinsäuremoleküls hybridisiert, kann der gesamte nicht mit dem Primer hybridisierende Teil in seiner Sequenz ermittelt werden. Bei Nukleinsäuremolekülen, die eine Gesamtlänge von vorzugsweise weniger als 50 Nukleotiden aufweisen und die Primer eine Gesamtlänge von vorzugsweise nicht mehr als 25 Nukleotiden haben, kann durch Addition der zum Primer hybridisierenden Sequenz (dis entweder bereits bekannt war und als Grundlage für die Synthese der Primersequenz gedient hat oder die bei vollständiger Hybridisierung des Primers aus der Primersequenz als Komplementärsequenz abgeleitet werden kann) die Gesamtsequenz des Nukleinsäuremoleküls ermittelt werden. In dem hier beschriebenen Verfahren gehören auch diese Ausführungsformen zur Erfindung.

Die Inkubation des Primers erfolgt vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die eine Hybridisierung des Primers nur an dem Bereich des Nukleinsäuremoleküls erlauben, der in seiner Sequenz komplementär zu der Sequenz des Primers ist. Es ist jedoch auch vorstellbar, eine Hybridisierung des Primers unter nicht strirlgenten Hybridisierungsbedingungen durchzuführen, die eine Hybridisierung des Primers an einem Bereich des Nukleinsäuremoleküls erlauben, dessen Sequenz an einer oder mehreren Positionen nicht komplementär zu der Sequenz des Primers ist. Vorzugsweise weist dieser Bereich nicht mehr als drei "Mismatches" auf. Stringente bzw. nicht stringente Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Abhängigkeit von beispielsweise der Länge des zu verwendenden Primers einfach bestimmt werden (siehe, z. B., Sambrook et al., Molecular Gloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, CSH Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York (1989); oder Higgins and Hames, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, EAL Press Oxford, Washington D. C. (1985)). Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C oder in 50% Formamid und 4 × SSC bei 42°C und anschließendes Waschen in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C. Nicht stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Hybridisierung und anschließendes Waschen in 4 × SSC und 1% SDS bei 50°C. Die Stringenz kann auch ausschließlich über die Temperatur reguliert werden. In diesem Fall werden üblicherweise stringente Hybridisierungsbedingungen dadurch erreicht, daß die Hybridisierungstemperatur höher als die Schmelztemperatur der zu hybridisierenden Nukleinsäuremoleküle gewählt wird.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vorzugsweise mindestens 6 × 10⁸ Kopien, stärker bevorzugt mindestens 3 × 10¹⁰ Kopien und am meisten bevorzugt mindestens 3 × 10¹¹ Kopien des zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküls eingesetzt. Die Kopien des zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküls sind mindestens in dem Bereich der zu sequenzierenden Nukleinsäuresequenz und der Primerbindungsstelle identisch. Vorzugsweise handelt es sich um identische Kopien des zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküls.

Der Begriff "Gemisch von Desoxyribonukleotiden" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß in Schritt (a) ausschließlich Nukleotide verwendet werden, deren Einbau eine weitere Elongation des Primers in 5'-3'-Richtung durch die Polymeraseaktivität erlaubt. Mit anderen Worten, dieses Gemisch enthält keine Nukleotide, wie beispielsweise Didesoxyribonukleotide, deren Einbau aufgrund der fehlenden 3'-OH-Gruppe eine weitere Elongation des Primers unterbinden würde. Geeignete Nukleotide sind somit beispielsweise die Desoxyribonukleotide dGTP, dATP, dTTP und dCTP oder Derivate davon. Geeignete dNTP-Derivate sind vor allem solche, die eine verbesserte Ionenstabilität aufweisen wie z. B. 7-deaza- dATP und -dGTP (F. Kirpekar et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 9 (1995) 525; K. Schneider and B. T. Chait, Nucleic Acids Res. 23 (1995) 1570) oder 2'-F- dNTP (W. Tang, L. Zhu, L. M. Smith, Anal. Chem. 69 (1997) 302).

Die theoretische Schmelztemperatur eines beliebigen Primers ist für den Fachmann ohne weiteres bestimmbar (siehe z. B. Sambrook et al., loc. cit.). Vorzugsweise wird die theoretische Schmelztemperatur nach folgender Formel ermittelt: Tm (°C) = 69,3 + (%GC . 0,41) - (650/n), wobei %GC=GC Gehalt in Prozent, n = Anzahl der enthaltenen Nukleotide.

Die Bestimmung der Molekülmasse von Nukleinsäuremolekülen mittels Massenspektrometrie ist im Stand der Technik bekannt und kann vom Fachmann ohne weiteres durchgeführt werden (siehe z. B. Nordhoff et al., Mass Spectrometry of nucleic acids, Mass Spectrometry Reviews, 15 (1996) 67; Nordhoff et al., Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry as a new method for the characterization of nucleic acids, Trends Anal. Chem., 15 (1996) 240; Limbach, Mass Spectrom. Reviews, 15 (1996) 297; Burlingame, Mass Spectrometry, 70 (1998) 647; Nordhoff et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 6, 771 (1992); Wu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 7 (1993) 142; Fitzgerald et al., Rapid Gommun. Mass Spectrom. 7 (1993) 895; Nordhoff et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993) 3347; Nordhoff et al., Nucleic Acids Res. 22 (1994) 2460; Kirpekar et al., Nucleic Acids Res. 22 (1994) 3866; Vestal et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 9 (1995) 1044; Koster et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 1123; Little et al., Nature Med. 3 (1997) 1413; Ross et al., Nature Biotechnol. 16 (1998) 1347; Kirpekar et al., DNA sequence analysis by MALDI mass spectrometry, Nucleic Acids Res. 26 (1998) 2554). Erfindungsgemäß werden die Molekülmassen der in Schritt (a) generierten Nukleinsäurefragmente massenspektrometrisch bestimmt und anschließend die Molekülmassenzuwächse zwischen dem verwendeten Primer und dem Nukleinsäurefragment, das dem um ein Nukleotid verlängerten Primer entspricht, letzterem Nukleinsäurefragment und dem Nukleinsäurefragment, das dem um zwei Nukleotide verlängerten Primer entspricht, usw. ermittelt. Da der Einbau eines Nukleotids einen spezifischen Molekülmassenzuwachs verursacht und der Molekülmassenzuwachs für den Einbau jedes möglichen Nukleotids bekannt ist (nominal: A/313Da, C/289Da, G/329Da und T/304Da), können durch die Bestimmung der Molekülmassenzuwächse die Nukleotide, um die sich zwei Nukleinsäurefragmente in ihrer Größe unterscheiden, einfach und eindeutig bestimmt werden und damit aufgrund der Komplementarität doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle die zugehörige Sequenz des Nukleinsäuremoleküls. Die Molekülmassenzuwächse lassen sich in einfacher Weise aus den massenspektrometrisch bestimmten Molekülmassen der generierten Nukleinsäurefragmente ableiten. Hierzu werden die bestimmten Molekülmassen aufeinanderfolgender Nukleinsäurefragmente, das heißt Nukleinsäurefragmente, die sich nur um den Einbau eines zusätzlichen Nukleotids voneinander unterscheiden, voneinander subtrahiert. Diese Werte werden dann mit den für den Einbau der Nukleotide A, C, G oder T erwarteten Molekülmassenzuwächse verglichen. Die Zuordnung des eingebauten Nukleotids erfolgt innerhalb maximaler Abweichungstoleranzen, z. B. +/- 4 Da. Die geringste Differenz zwischen den vier möglichen Molekülmassenzuwächsen (+A, +C, +G oder +T) beträgt nominal 9 Da und betrifft den Einbau von A (+313 Da) versus T (304 Da). Dies wird durch eine maximale Abweichungstoleranz von +/- 4 Da hinreichend berücksichtigt. Sind größere Abweichungstoleranzen erwünscht, können diese zum Beispiel durch den Einsatz von aus der US Patentschrift 5,691,141 (Koster, 25. November 1997) bekannten Massen-modifizierten Nukleotiden bereitgestellt werden. Alternativ zu dieser Vorgehensweise können auch sukzessive, ausgehend von der bestimmten oder berechneten Molekülmasse des Primers, die Molekülmassen der aus dem Einbau eines der vier möglichen Nukleotide resultierenden Nukleinsäurefragmente durch Addition der damit verknüpften bekannten Molekülmassenzuwächse (nominal: A: +313 Da, C: +289 Da, T: +304 Da, G: +329 Da) berechnet werden. Die so berechneten vier möglichen Molekülmassen werden dann mit dem tatsächlich bestimmten Wert verglichen. Die Zuordnung, welches Nukleotid eingebaut wurde, erfolgt innerhalb vorgegebener Abweichungstoleranzen, z. B. +/- 4 Da. Ausgehend von der bestimmten oder berechneten Molekülmasse des um ein Nukleotid verlängerten Primers werden dann analog die vier möglichen Molekülmassen der um ein weiteres Nukleotid verlängerten Nukleinsäurefragmente mittels Addition berechnet und mit dem zugehörigen experimentellen Wert verglichen.

Die Molekülmassen von Nukleinsäuremolekülen können in einfacher, dem Fachmann bekannter Weise aus den bekannten Atommassen der verschiedenen chemischen Elemente mittels Addition exakt berechnet werden. Diese Rechnung berücksichtigt die chemische Zusammensetzung der Nukleotidmonomere (das heißt die Anzahl der darin enthaltenen Kohlenstoffatome, Sauerstoffatome, Wasserstoffatome und Phosphoratome), die jeweilige Anzahl der verschiedenen enthaltenen Nukleotide (A, C, G und T), die mit jeder Verknüpfung zweier Nukleotide verbundene Stoffbilanz (Austritt eines Wassermoleküls pro Addition eines Nukleotidmonomers), sowie mögliche chemische Modifikationen und Besonderheiten der chemischen Zusammensetzung der endständigen Nukleotide. Je nach Bedarf können für diese Berechnungen die monoisotopischen oder mittleren Atommassen herangezogen werden. Im ersten Fall wird die monoisotopische Molekülmasse berechnet, die zum Vergleich herangezogen wird, wenn es gelingt, die Isotopie der zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle aufzutrennen. Das entsprechend nötige hohe instrumentelle Auflösungsvermögen wird von modernen Massenspektrometern bereitgestellt. Fig. 3a demonstriert dies an einem Beispiel für einen Satz erfindungsgemäß generierter Nukleinsäurefragmente. In diesem Fall wurden die Molekülmassenzuwächse für die Nukleinsäurefragmente auf < 0.1 Da genau bestimmt. Gelingt es nicht im Massenspektrometer, die Isotopie von Nukleinsäuremolekülen aufzutrennen, z. B. weil diese zu groß sind, werden für die Berechnung mittlere Atommassen herangezogen und damit mittlere Molekülmassen berechnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es vorteilhafterweise, Nukleinsäuremoleküle ohne Verwendung von Stopnukleotiden, die zu einer basenspezifischen Terminierung der Elongationsreaktion führen, zu sequenzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf dem überraschenden Befund, daß Oligonukleotide bei einer Temperatur, die weit über deren Schmelztemperatur liegt, noch hinreichend lange an komplementäre Sequenzen größerer Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, um in der Gegenwart einer Polymerase und dNTPs um ein oder mehrere Nukleotide verlängert zu werden, bevor der gebildete Doppelstrang thermisch wieder denaturiert wird. Ohne an eine wissenschaftliche Theorie gebunden wollen zu sein, entstehen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Nukleinsäurefragmente dadurch, daß bei der hohen Annealing- Temperatur die Anlagerung des Primers kurzlebig ist und der Komplex bestehend aus Nukleinsäuremolekül (Template), Primer und Enzym thermisch instabil ist. Infolgedessen zerfallen gebildete Synthesekomplexe nach kurzer Zeit und hinterlassen einen Primer, der nur um ein oder wenige Nukleotid(e) verlängert wurde.

Durch den vollständigen Verzicht auf den Einsatz von Stopnukleotiden müssen Nukleinsäuremoleküle vor der Sequenzierung nicht mehr aufgereinigt werden, um Nukleotidkontaminationen, beispielsweise durch eine vorangegangene PCR- Amplifikation, zu entfernen. Dies vereinfacht und beschleunigt erheblich die Bereitstellung von zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekülen, wodurch sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders für Hochdurchsatz-Anwendungen für die gleichzeitige Durchführung einer Vielzahl von Sequenzierreaktionen eignet. Zudem erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine Automatisierung der Verfahrensschritte, was die Durchführung weiter beschleunigt.

Es ist auch vorstellbar, daß erfindungsgemäße Verfahren für "multiplexing" einzusetzen, d. h. für die gleichzeitige Bestimmung unterschiedlicher partieller Nukleotidsequenzen innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls. In dieser Ausführungsform werden die spezifischen Primer unterschiedlich markiert, so daß die zugehörigen, durch die Elongation der Primer entstehenden Nukleinsäurefragmente beispielsweise über reversible Affinitätsanbindung (Festphasen-Aufreinigung) aufgetrennt werden können. Diese können anschließend getrennt voneinander massenspektrometrisch analysiert werden.

Alternativ dazu können Primer eingesetzt werden, deren Molekülmasse durch eine zusätzliche chemische Gruppe (mass tag, z. B. die halbe Masse eines der vier Nukleotiden) so verändert wird, daß für den Einbau eines oder einiger Nukleotide die Sequenzierleitern im Massenspektrum eindeutig aufgetrennt werden können. Solche Techniken bzw. das spezifische "mass tagging" von Nukleinsäuren sind im Stand der Technik bekannt (z. B. P. Ross et al., High level of multiplex genotyping by MALDI-TOF masspectrometry, Nature Biotechnology 16 (1998) 1347, WO 99/29898, oder WO 99/29897).

Im Gegensatz zu bekannten Sequenzierverfahren, die ebenfalls die Analyse von Nukleinsäurefragmenten mittels Massenspektrometrie umfassen, werden durch den Verzicht auf Stopnukleotide Artefakte und Zweideutigkeiten bei der Interpretation der massenspektrometrischen Daten vermieden. Zweideutigkeiten bei herkömmlichen Verfahren können entstehen, da die Molekülmassen von Didesoxyribonukleotiden und Desoxyribonukleotiden teilweise sehr ähnlich bzw. identisch sind und somit unter Umständen ein Molekülmassenzuwachs schwer einem bestimmten Desoxyribonukleotid zugeordnet werden kann (siehe Beispiel 1 und Fig. 1).

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonderes für die Sequenzierung von kurzen Nukleinsäure-Abschnitten von bis zu 25 Nukleotiden, vorzugsweise von bis zu 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt von bis zu 10 Nukleotiden und am meisten bevorzugt von bis zu 5 Nukleotiden. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders für den Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) geeignet. Beispiele 2 und 3 sowie die zugehörigen Fig. 2 und 3 dokumentieren außerdem mögliche Anwendungen und Charakteristika.

Bei dem zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekül kann es sich natürlich auch beispielsweise um eine cDNA, einen Vektor, ein Plasmid, ein Cosmid, ein artifizielles Bakterien-Chromosom (engl.: Bacterial Artificial Chromosome, BAC), artifizielles Hefe-Chromosom (engl.: Yeast Artificial Chromosome, YAC) oder natürliche genomische DNA oder in Fragment davon handeln. In der modernen Molekularbiologie und Genomforschung werden routinemäßig durch Klonierungstechniken fremde DNA-Abschnitte, z. B. cDNA Kopien isolierter Boten- RNA (engl.: messenger RNA, mRNA) oder Fragmente genomischer DNA, in Vektoren, Plasmide oder Cosmide eingebaut und anschließend in Gastzellen, z. B. E. coli oder Hefezellen, eingeschleust. Auf diese Weise ist es möglich, umfangreiche Klon-Bibliotheken von cDNA oder genomischer DNA zu generieren und für die Sequenzierung, die Expression kodierter Peptid- oder Proteinsequenzen oder die Detektion komplementärer DNA- oder RNA-Moleküle bereitzustellen. Je nach Länge der fremd eingeführten Nukleinsäure (siehe oben) kann somit durch die Bestimmung der partiellen Nukleotidsequenz beispielsweise eines Vektors die komplette Sequenz der fremd eingeführten Nukleinsäure bestimmt werden. Die erfindungsgemäße Sequenziertechnik gestattet es schnell und effizient, partielle Sequenzinformationen (z. B. endständige partielle Nukleotidsequenzen) der in den verschiedenen Klonen eingebauten DNA- Abschnitte zu generieren. Diese Informationen können dann herangezogen werden, um Klone mittels Sequenzvergleich zu identifizieren oder Aussagen über deren Güte zu machen. Für die Expression der eingebauten Fremd-DNA ist für die folgenden Arbeiten insbesondere von Interesse, ob die kodierende Region im richtigen Leseraster kloniert wurde. Für die Beantwortung dieser Frage sind in den meisten Fällen wenige Nukleotide umfassende Sequenzinformationen bereits ausreichend.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zwischen Schritt (a) und (b) folgende Schritte: (aa) Hitzedenaturierung des Komplexes bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer; und (ab) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (aa).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase; (c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b); (d) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten.

Überraschenderweise konnte im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, daß Nukleinsäurefragmente durch unterschiedlich lange Elongation des Primers auch dadurch generiert werden können, daß nach der Hybridisierung des Primers an das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül die Annealing-Temperatur schnell und ohne Unterbrechung so erhöht wird, daß es zu einer Denaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase kommt. Vorzugsweise wird die Temperatur auf über 80°C, stärker bevorzugt auf über 90°C und am stärksten bevorzugt auf über 94°C erhöht. Die Annealing-Temperatur und -dauer in Schritt (a) ist in dieser Ausführungsform von untergeordneter Bedeutung. Vorzugsweise liegt die Annealing-Temperatur unter dem Temperaturoptimum der eingesetzten Polymerase, so daß es während Schritt (a) zu einer vernachlässigbaren Elongation des Primers kommt. Je geringer der Temperaturunterschied zwischen Annealing-Temperatur und Temperaturoptimum der verwendeten Polymerase ist, desto kürzer wird die Hybridisierungsdauer gewählt. Vorzugsweise findet eine Hybridisierung für 1 bis 10 Sekunden statt, stärker bevorzugt für 1 bis 5 Sekunden und am stärksten bevorzugt für 1 Sekunde. Der Fachmann kann ohne weiteres für einen gegebenen Primer die optimale Annealing-Temperatur und -dauer ermitteln.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vor der massenspektrometrischen Analyse die Nukleinsäurefragmente gereinigt/isoliert.

Verfahren zur Aufreinigung und Aufkonzentrierung sind den Fachmann bekannt. Beispielsweise sind verschiedene Festphasen-gestützte Techniken bekannt und auf dem Markt verfügbar und erprobt. Sequenzierprodukte können durch den Einsatz von aus WO 94/11103, EP 0 885 958, US-Patent 5,405,951 und US- Patent 5,705,628 bekannten magnetischen Partikeln und Binde-, Wasch- und Elutionslösungen aufgereinigt und angereichert werden. Geeignete magnetische Partikel, Reagenzien und Protokolle werden auf dem Markt von verschiedenen bekannten Herstellern angeboten (z. B.: Dynal oder PE Biosystems). Weiterhin können Sequenzierungsprodukte durch den Einsatz von der Firma Millipore Corporation, Bedford, MA, USA vertriebenen ZipTips (P10 Pipettierspitzen mit einer kleinen am Ende integrierter Umkehrphasensäule) und den dazugehörigen Aufreinigungsprotokollen sehr schnell und kosteneffizient für die massenspektrometrische Analyse aufgereinigt und aufkonzentriert werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Massenspektometrie Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-off-light Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) oder Electrospray-Ionisations Massenspektrometrie (ESI-MS).

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist; (b) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.

Elektrophoretische oder chromatographische Verfahren zur Auftrennung von Nukleinsäurefragmenten sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise gelelektrophoretische, kapillarelektrophoretische, Ionenaustausch- chromatographische oder Umkehrphasen-chromatographische Verfahren.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase; (c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b); (d) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und (e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Farbstoffe Fluoreszenz-Farbstoffe, wobei die Fluoreszenz mittels eines Lasers angeregt wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die Annealing-Temperatur zwischen 15°C und 30°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Schritte (a) und (b) zwischen 2- und 40mal wiederholt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Schritte (a) und (b) zwischen 5- und 20mal wiederholt.

In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Schritt (b) mittels Mikrowellen oder Infrarotlichtbestrahlung oder in einem Thermo-Cycler durchgeführt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird zwischen Schritt (a) und (b) eine Ultraschallbehandlung durchgeführt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Polymerase eine thermostabile Polymerase.

Thermostabile Polymerasen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise die thermostabile Taq-DNA-Polymerase, die aus dem thermophilen Mikroorganismus Thermus aquaticus isoliert wurde. Weitere Beispiele sind die natürlich vorkommenden thermostabilen DNA-Polymerasen Hot Tub™, Pyrostase™, Pfu, Pwo, Tbr, Tfl sowie die gentechnisch hergestellten thermostabilen Polymerasen Tli, Amplitaq®, Thermo Sequenase™, Vent™, Deep Vent™, Tth und UlTma™.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül doppelsträngig und wird vor Schritt (a) denaturiert.

In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül DNA.

Es ist jedoch auch vorstellbar, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens RNA- Moleküle zu sequenzieren. Dem Fachmann ist klar, daß abhängig vom dem zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekül entweder eine DNA- oder RNA-abhängige DNA-Polymerase eingesetzt wird.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Primer 10 bis 15 Nukleotide lang.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen kurze Primer verwendet werden können. Dies ermöglicht nicht nur sehr stringente Bedingungen bei der Hybridisierung des Primers, wodurch Fehlanlagerungen des Primers ausgeschlossen werden können, sondern reduziert aufgrund der geringeren Synthesekosten darüber hinaus zusätzlich die Kosten, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens anfallen. Zudem wirkt sich die geringe Länge der verwendeten Primer positiv auf die massenspektrometrische Analyse aus. Dies begründet sich darin, daß kürzere Oligonukleotide bei der Massenspektrometrie mit höherer Empfindlichkeit und Massenauflösung nachgewiesen werden als längere.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Primer 10 bis 12 Nukleotide lang.

Die vorstehend zitierten Publikation sind hiermit per Referenz Teil der Beschreibung.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 MALDI-TOF Massenspektrum einer Sanger-Sequenzierreaktion (a) und einer erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion (b).

Die Spektren der in Beispiel 1 generierten Sequenzreaktionsprodukte wurden im Linearbetrieb eines Bruker Scout MTP Reflex III Massenspektrometers aufgenommen. Der gewählte Ausschnitt zeigt die Signale der generierten ersten vier Leiteroligonuleotide (Primer + 1, 2, 3, 4 Nukleotide). Der Einbau der entsprechenden Didesoxy- und Desoxyribonukleotide ist jeweils angezeigt.

Fig. 2 MALDI-TOF Massenspektren der mit verschiedenen Werten T_anneal generierten Sequenzierleitern.

Die Spektren der in Beispiel 2 generierten Sequenzierreaktionsprodukte wurden im Linearbetrieb eines Bruker Scout MTP Reflex III Massenspektrometers aufgenommen. Die einzelnen Werte für T_anneal sind in den zugehörigen Teilabbildungen angegeben. Es ist deutlich ersichtlich, wie die Ausbeute der Sequenzierprodukte mit Erhöhung von T_anneal von 41°C bis zu 63°C zunimmt. Die erwartete (berechnete) Schmelztemperatur für den verwendeten Primer beträgt 45°C. Die Zuordnung der aus den bestimmten Massendifferenzen abgeleiteten Nukleotideinbauten ist für die ersten drei Nukleotide in den oberen Teilabbildungen angezeigt. Für das erste Nukleotid resultiert aufgrund der Insertion von G in einem aber nicht dem anderen Sequenzierstrang ein Signalduplett (Einbau von komplementärem C versus A). Für das zweite Nukleotid fallen die Signale aufgrund gleicher resultierender Summenformel zusammen (Einbau von C gefolgt von A versus Einbau von A gefolgt von C). Es resultiert ein Signal aber zwei Massendifferenzen zum vorherigen Duplett, anhand derer der Einbau von A versus C bestimmt wurde. Für das dritte Nukleotid resultiert wieder ein Duplett, Einbau von G versus C, womit die Insertion von G zwei Nukleotide zuvor bestätigt wird. P indiziert das Signal des verwendeten Primers.

Fig. 3 MALDI-TOF Massenspektren der in Beispiel 3 für DNA-Templates (a-­ d) generierten Sequenzierprodukte.

Die Spektren wurden im hochauflösenden Reflektorbetrieb eines Bruker Scout MTP Reflex III Massenspektrometers aufgenommen. Der gewählte Ausschnitt zeigt das Signal des Primers sowie die Signale der generierten ersten vier Leiteroligonuleotide. Die Einschübe in Fig. 3a zeigen das zugehörige Signal in X- Richtung stark vergrößert. Die Auflösung der den entsprechenden Oligonukleotiden zugrundeliegenden Isotopie ist darin deutlich zu erkennen. Der den verschiedenen Sequenzierprodukten zugrundeliegende Nukleotideinbau, zugeordnet aufgrund der bestimmten Massendifferenzen, ist angezeigt. Die Zuordnungen Substitution (b), Insertion (c) und Deletion (d) ist offensichtlich. P indiziert das Signal des verwendeten Primers.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Sanger versus erfindungsgemäßer Sequenzierreaktion Ausführung: thermische Denaturierung des aktiven Synthesekomplexes bestehend aus DNA-Template, Primer und DNA-Polymerase

Die Reaktionstemperatur wird schnell erhöht, so daß der Synthesekomplex bestehend aus DNA-Template, Primer und DNA-Polymerase während der laufenden Verlängerung des Primers thermisch denaturiert wird. Dieser Prozeß ist statistisch verteilt, in Häufigkeit abnehmend mit der Länge der Syntheseprodukte, und resultiert in einer erfindungsgemäßen Sequenzierleiter.

Beide Sequenzierreaktionen wurden in 10 µl Reaktionsvolumen durchgeführt. Darin enthalten waren jeweils 100 ng DNA Doppelstrang-Template (Sequenzierstrang: 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'), 10 pmol Sequenzierprimer (5'-d(TTG ACA TTC GCA ACC TTC GC)-3'), 1 Einheit Thermosequenase (Amersham, UK), 200 pmol von jedem Nukleosidtriphosphat und 20 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgCl₂, 75 mM Tris- HCl, pH 9.5 (Reaktionspuffer). Im Fall der Sanger-Sequenzierreaktion waren 5% von jedem Nukleosidtriphosphat ddNTP, der Rest dNTP. Im Falle der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion wurden ausschließlich dNTPs eingesetzt. Beide Reaktionsmischungen wurden zwecks Erhöhung der Ausbeute an Sequenzierprodukten 20 Reaktionszyklen unterworfen (zyklisches Sequenzieren). Hierzu wurden die Reaktionsansätze in einem Thermocycler (Eppendorf mastercyler gradient) zunächst für 2 Minuten auf 94°C erhitzt, gefolgt von 20 Temperaturzyklen:
Sanger-Sequenzierreaktion: 54°C/20 s, 72°C/30 s, 94°C/20 s,
erfindungsgemäße Sequenzierreaktion: 54°C/1 s, 94°C/5 s.

Der Vergleich der in Fig. 1 gezeigten Daten zeigt, daß die erfindungsgemäßen Reaktionsprodukte bei Sanger-Sequenzierreaktionen als störende Nebenprodukte anfallen können. Insbesondere der Stop mit dA neben ddA ist für die Detektion von SNPs störend, da die molekularen Massen von dA und ddG identisch sind und somit besagte Nebenreaktion den Austausch von A durch G in einem Allel vortäuschen kann. Diese Problematik wird bei der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion vermieden.

Beispiel 2 Erfindungsgemäße Sequenzierreaktion, Ausführung: T_anneal << T_m

Übersteigt die gewählte Annealing-Temperatur T_anneal signifikant die Schmelztemperatur des Primers T_m, ist dessen Anlagerung und somit auch die Lebensdauer des Synthesekomplexes bestehend aus DNA-Template, Primer und DNA-Polymerase kurzlebig. Als Folge wird der Primer um nur wenige Nukleotide verlängert, bevor die Synthese abbricht. Dieser Prozeß ist statistisch verteilt, in Häufigkeit abnehmend mit der Länge der Syntheseprodukte, und resultiert in einer erfindungsgemäßen Sequenzierleiter.

DNA Doppelstrang-Template: 47/48 bp PCR Produkt. Als Ausgangsmaterial diente humane genomische DNA. Die amplifizierten Regionen (Allele) unterscheiden sich durch Insertion von G an Position 25 des Sequenzierstranges in einem Allel. Für die Sequenzierreaktion wurde ein nur 12 Nukleotide langer Primer gewählt, der sich unmittelbar vor der erwarteten Mutation an den Sequenzierstrang anlagert. Diese Mutation wurde durch die detektierten Sequenzierprodukte eindeutig nachgewiesen (siehe Fig. 2). Alle Sequenzierreaktionen wurden in 10 µl Reaktionsvolumen durchgeführt. Darin enthalten waren jeweils 50 ng DNA-Template, 4 µmol Sequenzierprimer, 1 Einheit Thermosequenase (Amersham, UK), 200 pmol von jedem Nukleosidtriphosphat und 20 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgCl₂, 75 mM Tris-HCl, pH 9.5 (Reaktionspuffer). Alle Reaktionsmischungen wurden zwecks Erhöhung der Ausbeute an Sequenzierprodukten 20 Reaktionszyklen unterworfen. Hierzu wurden die Reaktionsmischungen zunächst für 2 Minuten in einem Thermocycler (Eppendorf mastercycler gradient) auf 94°C erhitzt, gefolgt von 20 Temperaturzyklen: T_anneal/1 s, 94°C. Die verwendeten Werte für T_anneal erstreckten sich innerhalb eines gewählten Gradienten von 41°C bis 80°C (siehe Fig. 2).

Beispiel 3 Einsatz der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion, Ausführung: T_anneal << T_m, zur Detektion von SNPs (single nukleotide polymorphisms).

Zum Nachweis von SNPs ist es günstig mit kurzen Primern zu arbeiten, da die damit verbundenen geringeren Molekulargewichte der Sequenzierprodukte deren Detektion durch MALDI-MS mehrfach positiv beeinflussen. Zum einen werden kleinere DNA Moleküle empfindlicher nachgewiesen als größere (höhere Nachweisempfindlichkeit), zum anderen werden kleinere DNA Moleküle besser aufgelöst als größere. Eine hohe Signalauflösung ist insbesondere dann wichtig, wenn DNA Proben heterozygoter Individuen analysiert werden. Im extremsten Fall gilt es, den Austausch von Adenin durch Thymin oder vice versa in einem Allel aber nicht dem anderen, aufzulösen. Von allen möglichen aus dem Austausch einer Nukleobase resultierenden Massendifferenzen, ist die mit diesem Austausch verbundene die geringste (A/T: 9 Da, C/T: 15 Da, A/G: 16 Da, C/A: 24 Da, C/G: 40 Da, T/G: 25 Da). Die Genauigkeit der Massendifferenzbestimmung wird durch kürzere Primer, sofern der Abstand zwischen Primer und SNP-Position gleich bleibt, ebenfalls günstig beeinflußt. Oligonukleotide < 20 Nukleotide können mit akzeptablen Empfindlichkeitseinbußen im hochauflösenden Reflektormodus von MALDI-Flugzeitmassenspektrometern analysiert werden. In diesem Betriebsmodus ist es möglich, die Isotopie der Analytmoleküle aufzulösen und Molekulargewichtsdifferenzen auf 0.01-0.1 Da genau zu bestimmen (siehe Fig. 3a). Die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion für den Nachweis von SNPs wurde an verschiedenen Systemen erfolgreich erprobt und evaluiert. Es wurden unter anderem in einem 50 Basenpaare langen DNA- Template alle für eine Position möglichen SNPs realisiert. Diese Templates wurden einzeln als auch als Zweikomponenten-Mischungen (Heterozygote) simultan sequenzanalysiert. Hierzu wurde ein nur 12 Nukleotide langer Primer eingesetzt. Das 3'-Ende des Primers wurde mit Absicht 2 Nukleotide vor den SNP plaziert, um so die Vorteile der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion gegenüber der bekannten primer extension reaction (PER) zu demonstrieren. Diese umfassen erhöhte Flexibilität bei der Primerwahl (kann im Gegensatz zur PER mehrere Nukleotide stromabwärts plaziert werden) und die Generierung von Sequenzinformation (mehr als ein Nukleotid) die die richtige Anlagerung des Primers verifiziert und Deletions- und Insertionsmutationen von der Substitution eines Nukleotids eindeutig unterscheidet. Fig. 3 demonstriert dies anhand einer Auswahl, alle bezogen auf den schwierigeren heterozygoten Fall.

Beide Sequenzierreaktionen wurden in 10 µl Reaktionsvolumen durchgeführt. Darin enthalten waren jeweils 100 ng DNA Doppelstrang-Template, 4 pmol Sequenzierprimer (5'-d(CGC AAC CTT CGC)-3'), 1 Einheit Thermosequenase (Amersham, UK), 200 pmol von jedem Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP) und 20 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgCl₂, 75 mM Tris-HCl, pH 9.5 (Reaktionspuffer). Beide Reaktionsmischungen wurden zwecks Erhöhung der Ausbeute an Sequenzierprodukten 20 Reaktionszyklen unterworfen. Hierzu wurden die Reaktionsansätze in einem Thermocycler (Eppendorf mastercyler gradient) zunächst für 2 Minuten auf 94°C erhitzt, gefolgt von 20 Temperaturzyklen: 56°C/1 s, 94°C/5 s.

Verwendete Templates (gezeigt sind die Sequenzierstränge; die entsprechenden Nukleotide, die mit dem Primer einen Doppelstrang ausbilden, sind unterstrichen):

• a) 100% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'
• b) 50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'
  50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TAA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3' (Substitution von T durch A an der Position 29, fett gedruckt)
• c) 50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'
  50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA C TG ATG TCA CGG TTC AGC GAA GGT TGC GAA TGT CAA)-3' (Insertion von C zwischen Position 29 und 30)
• d) 50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'
  50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA C TG ATG TCA CGG TAG CGA AGG TTG CGA ATG TCA A)-3' (Deletion von T 29)

Claims (18)

1. Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte:

• a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt;
• b) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und
• c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das zwischen Schritt (a) und (b) folgende Schritte umfaßt:

• a) Hitzedenaturierung des Komplexes bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer; und
• b) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (aa).

3. Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte:

• a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden;
• b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase;
• c) gegebenenfalls ein oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b);
• d) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und
• e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei vor der massenspektrometrischen Analyse die Nukleinsäurefragmente gereinigt/isoliert werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Massenspektometrie Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of- flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) oder Electrospray-Ionisations Massenspektrometrie (ESI-MS) ist.

6. Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte:

• a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist;
• b) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und
• c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.

7. Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte:

• a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist;
• b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase;
• c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b);
• d) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und
• e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Farbstoffe Fluoreszenz- Farbstoffe sind und die Fluoreszenz mittels eines Lasers angeregt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 4, 5, 6 oder 8, wobei die Annealing-Temperatur zwischen 15°C und 30°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4, 5, 7 oder 8, wobei Schritte (a) und (b) zwischen 2- und 40mal wiederholt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei Schritte (a) und (b) zwischen 5- und 20mal wiederholt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4, 5, 7, 8, 10 oder 11, wobei Schritt (b) mittels Mikrowellen oder Infrarotlichtbestrahlung oder in einem Thermo- Cycler durchgeführt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4, 5, 7, 8 oder 10 bis 12, wobei zwischen Schritt (a) und (b) eine Ultraschallbehandlung durchgeführt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Polymerase eine thermostabile Polymerase ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Nukleinsäuremolekül doppelsträngig ist und vor Schritt (a) denaturiert wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Nukleinsäuremolekül DNA ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Primer 10 bis 15 Nukleotide lang ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Primer 10 bis 12 Nukleotide lang ist.