DE10001881C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren mittels competitiver PCR - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren mittels competitiver PCRInfo
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Description
Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von Nukleinsäu
ren (DNA oder RNA). Es zeichnet sich dadurch aus, dass es für hohen Proben
durchsatz geeignet ist und sequenzhomologe Competitoren, die zur Proben DNA
identische Masse und identische Basenzusammensetzung und nur einen minimalen
Sequenzunterschied aufweisen, verwendet.
Es ist bereits bekannt, DNA bzw. RNA mittels competitiver PCR bzw. competitiver
RT/PCR zu quantifizieren (Köhler et al., 1995; Heid et al., 1996; Gibson et al., 1996;
Blok et al., 1997; Rupf et al., 1999a; Rupf et al., 1999b). Es ist weiterhin bekannt,
dass homologe Competitoren dazu geeigneter sind als heterologe oder PCR-
MIMICS, da ihr Amplifikationsverhalten dem der Probe ähnlicher ist (Siebert, 1993).
Es ist weiterhin bekannt, dass der ideale homologe Competitor identisch mit der
Proben DNA oder RNA sein müßte (Siebert, 1993). Genau dann aber versagt die
Methode prinzipiell, denn die Amplifikationsprodukte von Probe und Competitor sind
nun nicht mehr zu unterscheiden. Ein Competitor muß sich demzufolge in seiner
Struktur von der Probe unterscheiden und dieser Strukturunterschied muß bei der
Amplifikation sicher weitergegeben werden. Die bisher verwendeten Competitoren
unterscheiden sich alle sowohl in der Masse als auch in der Basenzusammenset
zung als auch in der Basensequenz von der Proben-DNA bzw. -RNA.
Eine Gruppe von Methoden zur Unterscheidung der Amplifikate von Probe und
Competitor beruht auf deren unterschiedlicher Masse. Die Trennschärfe der jeweils
verwendeten Auftrennungsmethode bestimmt den einzustellenden Massenunter
schied zwischen Probe und Competitor. Bei gelelektrophoretischer Auftrennung
werden typischerweise etwa 10% kleinere Competitoren eingesetzt, bei Verwendung
der HPLC oder denaturierender Polyacrylamidgele sind kleinere Massenunterschie
de auflösbar, der methodische Aufwand steigt jedoch mit fallendem Massenunter
schied (Katz & Dong 1990; Diviacco et al., 1992). Um mindestens eine Base müssen
sich Probe und Competitor jedoch mindestens unterscheiden.
Für Competitoren, die sich deutlich in der Masse (und damit auch in Basenzusam
mensetzung und Sequenz) von der Probe unterscheiden, können leicht automati
sierbare Amplifikattrennungs- und quantifizierungsverfahren entwickelt werden.
Jedoch kann aufgrund der Unterschiede zwischen Probe und Competitor nicht
davon ausgegangen werden, dass sich beide hinsichtlich ihrer Amplifikationseffizi
enz in der PCR identisch verhalten (eigene unveröffentliche Experimente). Es ist
daher für jede zu quantifizierende Nukleinsäuresequenz und den dazugehörigen
Competitor erforderlich, beide in umfangreichen Kontrollexperimenten gegeneinan
der zu titrieren, um die relativen Amplifikationseffizienzen zu ermitteln (McCullogh et
al., 1995).
Je probenähnlicher die Competitoren sind, um so eher kann zwar eine identische
Amplifikation von Probe und Competitor angenommen werden, sie ist jedoch zum
einen nicht sicher solange beide bezüglich Masse und Basenzusammensetzung
voneinander abweichen, zum anderen steigt der analytische Aufwand mit geringer
werdenden Differenzen zwischen Probe und Competitor stark an. Insbesondere wird
eine Automatisierung der Auftrennung und quantitativen Analyse, und damit ein
hoher Probendurchsatz, mit den bisher eingesetzten Nukleinsäuretrennmethoden
sehr schwierig. Ein Einsatz masse- und basenzusammensetzungsgleicher, nur
minimal in ihrer Sequenz von der Probe abweichender Competitoren, bei denen von
einem zu dem der Probe identischen Amplifikationsverhalten ausgegangen werden
kann, wäre bei Amplifikatauftrennung unter denaturierenden Bedingungen, wie sie
bei der DNA-Sequenzierung angewendet werden, zwar prinzipiell möglich, ist aber
aus den vorgenannten Gründen bisher nicht beschrieben worden.
Eine zweite Gruppe von Methoden zur Trennung der Amplifikate von Probe und
Competitor beruht darauf, dass der Competitor sich nur geringfügig in seiner Basen
sequenz von der Probe unterscheidet, dies aber erlaubt, bei Restriktionsverdau des
Amplifikatgemisches mit einer oder mehreren Restriktasen Amplifikate von Probe
und Competitor in unterschiedlich große, nach ihrer Masse leicht zu trennende
Spaltstücke zu zerlegen. (Lock et al., 1997). Je sequenzhomologer der Competitor
zur Probe ist, um so wahrscheinlicher bilden sich, besonders in den späten Zyklen
der PCR, jedoch Heteroduplexe zwischen einem Proben- und einem Competi
torstrang aus, die durch die verwendeten Restriktasen nicht geschnitten werden
können und damit eine korrekte Quantifizierung der Amplifikate erschweren. Da das
Ausmaß der Heteroduplexbildung von vielen, nicht vollständig bekannten und
kontrollierbaren Parametern abhängt, erfordern solche Methoden in jedem konkreten
Fall umfangreiche Kontrollexperimente und eignen sich nicht für eine Automatisie
rung und hohen Probendurchsatz (Riesner et al., 1992; McCullogh et al., 1995).
Es ist weiterhin bekannt, dass es massenspektrometrische Methoden gibt, die es
erlauben, Moleküle nach ihrer Masse sehr scharf aufzutrennen und absolute
Molekulargewichte mit höchster Präzision zu bestimmen. Für organische Makromo
leküle ist die Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization-Time-Of-Flight-Massen
spektrometrie (MALDI-TOF-MS) eine geeignete Methode zur Auftrennung von
Gemischen und zur Massenbestimmung der einzelnen Molekülspezies. MALDI-TOF-
MS ist zwar für die Proteinanalytik wohletabliert (Roepstorff, 2000), weist aber bei
DNA-Analyse bisher deutliche Grenzen auf: Die maximale Länge analysierbarer
DNA liegt bei etwa 50 Basen und ist damit für typische PCR-Produkte viel zu kurz
(Fitzgerald & Smith, 1995). Infrarot-MALDI, das größere DNA-Moleküle messen
kann (Berkenkamp et al., 1998), befindet sich in der Entwicklung und ist in der
Praxis noch nicht etabliert. Selbst wenn größere DNA-Moleküle analysiert werden
könnten, würde dann die erforderliche Massenauflösung insbesondere bei gering
sten Massenunterschieden, z. B. A/T-Austausch, nur schwer oder mit sehr hohem
technischen Aufwand (Reflektor, dessen Einsatz begünstigt jedoch wieder DNA-
Fragmentierung und senkt die Empfindlichkeit) erreichbar sein. Bisher wird MALDI-
TOF MS bei Nukleinsäuren ausschließlich qualitativ, hauptsächlich zur DNA-
Sequenzierung (Murray, 1996), zum Nachweis von Sequenzpolymorphismen (Griffin
& Smith, 2000), zur Analyse von "short tandem repeats" (Ross & Belgrader, 1997)
oder zur Analyse von "ligase chain reacton" Produkten (Jurinke et al., 1996) verwen
det. Für MALDI-Analyse zu große DNA-Moleküle wurden gegebenenfalls durch
Restriktionsverdau verkleinert und so meßbar gemacht (Wada, 1998).
MALDI-TOF-MS ist, wie alle massenspektrometrischen Verfahren, eine qualitative (=
massenbestimmende) Methode und nicht ohne weiteres, sondern nur unter ganz
bestimmten, von Problemstellung und massenspektrometrischer Methode beein
flußten Bedingungen zur Quantifizierung von Molekülen geeignet. Bisher existieren
lediglich begrenzte Erfahrungen bei der Quantifizierung von niedermolekularen
Substanzen (Duncan et al., 1993), Proteinen (Camafeita et al., 1997; Gobom et al.,
2000) und synthetischen Polymeren. Nukleinsäuren wurden bisher nicht mittels
MALDI-TOF MS quantifiziert.
Berkenkamp S. Kirpekar F, Hillenkamp F
Science 1998 Jul 10; 281 (5374): 260-2
Blok HJ, Gohlke AM, Akkermans AD (1997). Quantitative analysis of 16s rDNA using competitive PCR and the QPCR System 5000. Biotechniques 22 (4): 700-704.
Camafeita E, Alfonso P, Mothes T, Mendez E J Mass Spectrom 1997 Sep; 32 (9): 940-7
Diviacco S, Norio P, Zentilin L, Menzo S, Clementi M, Biamonti G, Riva S, Falaschi A und Giacca M (1992). A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitve templates. Gene 122; 313-320.
Duncan MW, Matanovic G, Cerpa-Poljak A Rapid Commun Mass Spectrom 1993 Dec; 7 (12): 1090-4
Fitzgerald MC, Smith LM Annu Rev Biophys Biomol Struct 1995; 24: 117-40
Gibson UE, Heid CA, Williams PM (1996). A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res 6 (10): 995-1001. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM (1996). Real time quantitative PCR. Genome Res 6 (10): 986-994.
Gobom J, Kraeuter KO, Persson R, Steen H, Roepstorff P, Ekman R Anal Chem 2000 Jul 15; 72 (14): 3320-6
Griffin TJ, Smith LM Trends Biotechnol 2000 Feb; 18 (2): 77-84
Jurinke C, von den Boom D, Jacob A, Tang K, Worl R, Koster H Anal Biochem 1996 Jun 1; 237 (2): 174-81
Just U, Jones DJ, Auerbach RH, Davidson G, Kappler K J Biochem Biophys Methods 2000 Jul 5; 43 (1-3): 209-21
Katz E. D. und Dong M. W. (1990). Rapid analysis and purification of polymerase chain reaction products by high performance liquid chromatography. Biotechniques 8; 546-555.
Köhler T, Laßner D, Rost AK, Leiblein S und Remke H (1995). Quantitation of mRNA by Polymerase Chain Reaction - Nonradioactive Methods. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag.
Lock MJ, Griffiths PD, Emery VC Development of a quantitative competitive polymerase chain reaction for human herpesvirus 8. J Virol Methods 1997 Feb; 64 (1): 19-26
McCullogh RK, Choong CS, Hurley DM An evaluation of competitor type and size for use in the determination of mRNA by competitive PCR. PCR Methods Appl 1995 Feb; 4 (4): 219-26
Murray KK J Mass Spectrom 1996 Nov; 31 (11): 1203-15 Riesner D, Steger G, Wiese U, Wulfert M, Heibey M, Henco K Temperature-gradient gel electrophoresis for the detection of polymorphic DNA and for quantitative polymerase chain reaction.
Electrophoresis. 1992 Sep-Oct; 13 (9-10): 632-6.
Roepstorff P EXS 2000; 88: 81-97
Ross PL, Belgrader P Anal Chem 1997 Oct 1; 69 (19): 3966-72
Rupf S, Kneist S, Merte K and Eschrich K. Quantitative determination of Streptococcus mutans by using competitive polymer ase chain reaction. Eur J Oral Sci, 107, 75-81 (1999).
Rupf S, Merte K and Eschrich K. Quantification of bacteria in oral samples by competitive polymerase chain reaction. J Dent Res, 78, 850-856 (1999).
Siebert PD (1993). Quantitative PCR. Methods & applications; Book 3. Clontech Laboratories, Inc.
Wada Y J Mass Spectrom 1998 Feb; 33 (2): 187-92
Blok HJ, Gohlke AM, Akkermans AD (1997). Quantitative analysis of 16s rDNA using competitive PCR and the QPCR System 5000. Biotechniques 22 (4): 700-704.
Camafeita E, Alfonso P, Mothes T, Mendez E J Mass Spectrom 1997 Sep; 32 (9): 940-7
Diviacco S, Norio P, Zentilin L, Menzo S, Clementi M, Biamonti G, Riva S, Falaschi A und Giacca M (1992). A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitve templates. Gene 122; 313-320.
Duncan MW, Matanovic G, Cerpa-Poljak A Rapid Commun Mass Spectrom 1993 Dec; 7 (12): 1090-4
Fitzgerald MC, Smith LM Annu Rev Biophys Biomol Struct 1995; 24: 117-40
Gibson UE, Heid CA, Williams PM (1996). A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res 6 (10): 995-1001. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM (1996). Real time quantitative PCR. Genome Res 6 (10): 986-994.
Gobom J, Kraeuter KO, Persson R, Steen H, Roepstorff P, Ekman R Anal Chem 2000 Jul 15; 72 (14): 3320-6
Griffin TJ, Smith LM Trends Biotechnol 2000 Feb; 18 (2): 77-84
Jurinke C, von den Boom D, Jacob A, Tang K, Worl R, Koster H Anal Biochem 1996 Jun 1; 237 (2): 174-81
Just U, Jones DJ, Auerbach RH, Davidson G, Kappler K J Biochem Biophys Methods 2000 Jul 5; 43 (1-3): 209-21
Katz E. D. und Dong M. W. (1990). Rapid analysis and purification of polymerase chain reaction products by high performance liquid chromatography. Biotechniques 8; 546-555.
Köhler T, Laßner D, Rost AK, Leiblein S und Remke H (1995). Quantitation of mRNA by Polymerase Chain Reaction - Nonradioactive Methods. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag.
Lock MJ, Griffiths PD, Emery VC Development of a quantitative competitive polymerase chain reaction for human herpesvirus 8. J Virol Methods 1997 Feb; 64 (1): 19-26
McCullogh RK, Choong CS, Hurley DM An evaluation of competitor type and size for use in the determination of mRNA by competitive PCR. PCR Methods Appl 1995 Feb; 4 (4): 219-26
Murray KK J Mass Spectrom 1996 Nov; 31 (11): 1203-15 Riesner D, Steger G, Wiese U, Wulfert M, Heibey M, Henco K Temperature-gradient gel electrophoresis for the detection of polymorphic DNA and for quantitative polymerase chain reaction.
Electrophoresis. 1992 Sep-Oct; 13 (9-10): 632-6.
Roepstorff P EXS 2000; 88: 81-97
Ross PL, Belgrader P Anal Chem 1997 Oct 1; 69 (19): 3966-72
Rupf S, Kneist S, Merte K and Eschrich K. Quantitative determination of Streptococcus mutans by using competitive polymer ase chain reaction. Eur J Oral Sci, 107, 75-81 (1999).
Rupf S, Merte K and Eschrich K. Quantification of bacteria in oral samples by competitive polymerase chain reaction. J Dent Res, 78, 850-856 (1999).
Siebert PD (1993). Quantitative PCR. Methods & applications; Book 3. Clontech Laboratories, Inc.
Wada Y J Mass Spectrom 1998 Feb; 33 (2): 187-92
Die Erfindung hat das Ziel, eine einfache, schnelle und gut automatisierbare Metho
dik anzugeben, nach der Nukleinsäuren mittels competitiver PCR quantitativ be
stimmt werden können.
Die Aufgabe ist darin zu sehen, ein methodisches Herangehen zu entwickeln, das
auf beliebige mittels PCR bzw. RT/PCR amplifizierbare DNA- bzw. RNA-Sequenzen
(aus Viren, Eubakterien, Archaea und Eukaryonten (Protozoen, Pilzen, Pflanzen,
Tieren, Mensch) anwendbar ist. Dabei soll eine allgemeingültige Vorschrift zur
Erzeugung der Competitoren angegeben werden, die leicht durchführbar ist und
einen Competitor liefert, dessen Amplifikat mit dem der Probe hinsichtlich Masse und
Basenzusammensetzung identisch ist und zu letzterem nur einen minimalen Se
quenzunterschied aufweist. Dies soll dazu dienen, eine experimentelle Überprüfung
der Effizienzen der Amplifikation von Probe und Competitor prinzipiell überflüssig zu
machen. Eine geeignete Trennmethode wird angegeben, die es erlaubt, die mas
segleichen Amplifikate von Probe und Competitor so aufzutrennen, dass der Anteil
der Amplifikate von Probe und Competitor schnell, präzise und automatisierbar
mittels einer massenspektrometrischen Methode zu ermitteln ist. Da bei dieser
Methode als Nebenprodukt die mit hoher Präzision bestimmte absolute Masse eines
definierten, von der Proben-DNA stammenden DNA-Fragmentes anfällt, wird die
Identität des Proben-PCR-Produktes überprüft und macht eine Identifizierung mit
alternativen Methoden, wie sie z. B. in der DIN 58967-60 gefordert wird, überflüssig.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass wie folgt verfahren wird:
Einzige Voraussetzung ist das Vorhandensein eines PCR-Protokolls zur spezifi
schen Amplifikation der zu quantifizierenden DNA oder RNA. Der Competitor wird
dann erzeugt, indem einer der beiden PCR-Primer nach 3' um 10-20 Basen com
plementär zum Template verlängert wird und innerhalb der Verlängerung, minde
stens aber 5 Basen vor deren 3'-Ende wenige, typischerweise nur eine Base, zu
ihrem Complement verändert wird. Mit diesem Primer und dem zweiten, unverän
derten PCR-Primer wird der Competitor mittels PCR unter Verwendung des Proben-
PCR-Produktes als Template erzeugt. Der Competitor kann, muß aber für DNA-
Quantifizierungen nicht, kloniert werden. Klonierung des Competitors sollte jedoch
erfolgen, wenn für RNA-Quantifizierung RNA-Competitoren mittels in vitro-
Transkription hergestellt werden sollen. Der Competitor ist stets massengleich und
basenzusammensetzungsgleich zum Proben-PCR-Produkt. Beide DNA-Stränge
werden durch die gleiche Zahl von Wasserstoffbrückenbindungen zu
sammengehalten. Die Masse beider Einzelstränge des Competitors unterscheidet
sich um die Differenz zwischen A und T (9 Da) bzw. G und C (40 Da) von den
Massen der jeweiligen Proben-DNA-Stränge.
Nach Zugabe einer bekannten Menge des Competitors (entweder Competitor-DNA
zur DNA-Probe oder Competitor-RNA zur RNA-Probe, gefolgt von reverser Tran
skription zur Synthese von cDNA) erfolgt PCR mit dem Vorwärts- und dem Rück
wärts-Primer, die für die normale, qualitative PCR verwendet werden. Der Primer, in
dessen Nachbarschaft sich der Einbasenaustausch befindet, kann vorher entweder
a) 5'-seitig biotinyliert oder b) 5'-seitig über einen Poly-T-Spacer an eine Unterlage
(z. B. für MALDI-TOF-MS und PCR geeigneter Support) kovalent gebunden werden.
Es wird dann, a) in Lösung oder b) an der festen Phase, ein Amplifikatgemisch
erhalten, das aus masse- und basenzusammensetzungsgleichen Homoduplexen
von Proben-DNA, Competitor-DNA und aus nahezu masse- und basenzusammen
setzungsgleichen Heteroduplexen von beiden besteht und dessen Zusammenset
zung aus PCR-Produkt-DNA-Strängen von Probe und Competitor, die sich jeweils im
eine Base unterscheiden, exakt das Verhältnis der Template-DNA-Moleküle von
Proben-DNA und Competitor widerspiegelt. Aus diesem Verhältnis und der be
kannten Menge zugesetzten Competitors kann die in der Probe vorhandene Menge
Bakterien-DNA bestimmt werden.
Zur Bestimmung der Mengenverhältnisse der DNA-Stränge der PCR-Produkte von
Proben- und Competitor-DNA soll wegen der hohen Trennschärfe und der geplanten
Automatisierbarkeit ein massenspektrometrisches Verfahren, vorzugsweise die
Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization-Time-Of-Flight-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF-MS) eingesetzt werden. Dies erfordert eine geeignete Probenvorbe
reitung.
Durch Restriktionsverdau mit einer Restriktase, die weiter innerhalb des PCR-
Produktes spaltet als der Basenaustausch lokalisiert ist, jedoch maximal im Abstand
von 50-55 Basen vom 5'-Ende des Primers, in dessen Nachbarschaft sich der
Basenaustausch befindet, werden (bei (a) nach Primerabtrennung vor dem Restrikti
onsverdau und Bindung des PCR-Produktes an eine Streptavidin-beschichtete
Oberfläche (z. B. für MALDI-TOF-MS geeigneter Support) nach dem Verdau), un
abhängig von der Größe des PCR-Produktes, Amplifikatfragmente erhalten, die
- 1. den Unterschied zwischen Probe und Competitor enthalten
- 2. für die MALDI-TOF-MS-Analyse zugänglich sind und
- 3. bei denen der relative Massenunterschied eine leichte Trennung von Proben- und Competitor-DNA-Strängen erlaubt. Im Gegensatz zu den Verfahren der quantitativen PCR mit homologem Competitor, bei denen die Restriktasen zur Unterscheidung der Amplifikate von Probe und Competitor benutzt werden, und die deshalb durch Heteroduplexbildung gestört werden, schneidet die Restriktase im hier vorgeschla genen Verfahren solche Sequenzen, die in beiden Produkten identisch sind und die, auch in Heteroduplexen, mehrere Basen vom Basen-Mismatch entfernt sind, so dass die Restriktase alle vorhandenen Molekülspezies mit gleicher Effizienz schnei den kann. Das Vorhandensein einer geeigneten Restriktionsschnittstelle muß vor dem Design des Competitors durch geeignete Computeranalyse (z. B. Programm "Webcutter", frei im Internet verfügbar) gesichert werden. Es ist hochwahrscheinlich, dass für nahezu alle möglichen zu quantifizierenden DNA- bzw. RNA-Moleküle eine geeignete Restriktase gefunden werden kann, da an diese keine weiteren Anforde rungen gestellt werden (sie kann mehrmals im verbleibenden Produkt schneiden und es ist unerheblich, welche Enden sie erzeugt) und da von beiden Seiten aus jeweils ca. 25-30 Basen als potentielle Schnittsstellen zur Verfügung stehen.
Nach Entfernen aller Salze und Zugabe einer geeigneten Matrix (z. B. 3-Hydroxy-
Picolinsäure) zu den immobilisierten, doppelsträngigen DNA-Restriktionsfragmenten
kann direkt die MALDI-TOF-MS erfolgen. Dabei wird jeweils nur der komplementäre,
nicht unmittelbar immobilisierte DNA-Strang vom Laser abgelöst. Es erscheinen im
MALDI-TOF-Spektrum nur zwei Peaks, einer vom Proben- und einer vom Competi
tor-Fragment. Beide können auch bei Differenz von nur 9 Da sicher getrennt werden.
Eine Identifizierung der PCR-Produkte durch Hybridisierung mit einer sequenzspezi
fischen Sonde, wie sie in der DIN 58967-60 gefordert wird, ist bei MALDI-TOF-
Analyse der Fragmente nicht erforderlich, weil über die absolute und hochpräzise
Massenbestimmung eine eindeutige Identifizierung der DNAs möglich ist. Die
nahezu identische Zusammensetzung der beiden Peaks von Proben- und Competi
tor-DNA-Strang, ihre enge Nachbarschaft und vor allem die homogene Verteilung
der DNA-Moleküle von Competitor und Probe ineinander (sie wirken gegenseitig als
"innere Standards" in der MALDI-TOF-MS) erlauben eine Quantifizierung über
Integration der Peakflächen. Aus dem Verhältnis der Integrale der Peakflächen kann
auf das Verhältnis der PCR-Produkte von Probe und Competitor eindeutig geschlos
sen werden.
Vorwärts-Primer: GGTCAGGAAAGTCTGGAGTAAAAGGCTA
Rückwärts-Primer: GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC
Gesamtlänge des Fragments: 282 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärts-Primer:
Austausch G/C: GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC- CCGCAAAGGGCCTAACAC
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Rückwärts-Primer: GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC
Gesamtlänge des Fragments: 282 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärts-Primer:
Austausch G/C: GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC- CCGCAAAGGGCCTAACAC
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine
PCR unter Verwendung von S. mutans-DNA oder -Zellen als Template durch
geführt.
Ansatzvolumen: 50 µl
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg S. mutans DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg S. mutans DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
initiale Denaturierung: 3 min 95°C
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 55°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 55°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Nach Prüfung der Homogenität (Agarosegelelektrophorese) und Identität
(DNA-Sequenzierung) des PCR-Produktes (= Competitor) wird dieser mittels
Absorptionsmessung bei 260 nm quantifiziert.
Vorwärts-Primer: GGTCAGGAAAGTCTGGAGTAAAAGGCTA
Rückwärts-Primer: Bio-GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC
Rückwärts-Primer: Bio-GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC
Mit diesen Primern werden parallel drei PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 1.1., aber
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem S. mutans-gehalt der Pro be, z. B. 500 Moleküle)
1 µl Probe (geschätzter S. mutans-gehalt 1000 Zellen/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in sterilem, deio nisierten Wasser verdünnt
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 1.1..
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und des S. mutans 16 S rRNA-Gens.
Reaktionsbedingungen: wie unter 1.1., aber
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem S. mutans-gehalt der Pro be, z. B. 500 Moleküle)
1 µl Probe (geschätzter S. mutans-gehalt 1000 Zellen/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in sterilem, deio nisierten Wasser verdünnt
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 1.1..
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und des S. mutans 16 S rRNA-Gens.
Die Entfernung der Primer erfolgt durch eine geeignete Methode, z. B.
QIAquick-PCR-clean-up-Kit oder Ethanolfällung.
Die am Rückwärts-Primer biotinylierten PCR-Produkte (Gemisch von Amplifi
katen von Competitor und S. mutans 16S rRNA-Gen) werden mittels Eco O109
(MBI Fermentas) an Position 248 der DNA gespalten.
50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer Y+/Tango
4 µl ddH2
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer Y+/Tango
4 µl ddH2
O
1 µl EcoO109I (10 U)
1 µl EcoO109I (10 U)
Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.
Die Immobilisierung der Restriktionsfragmente von 1.3.2. erfolgt durch Bindung
an Streptavidin-markierte super-paramagnetische Partikel.
Nach Waschen der super-paramagnetischen Partikel Zugabe des Reaktions
ansatzes aus 1.3.2.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 1.3.2. durch Magnet separation
Waschen mit deionisiertem Wasser.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 1.3.2. durch Magnet separation
Waschen mit deionisiertem Wasser.
Durch Zugabe von 10%igem NH4OH werden DNA-Einzelstränge gewonnen.
gebundene Restriktionsfragmente aus 1.3.2.
Zugabe von 100 µl 10%iges NH4
Zugabe von 100 µl 10%iges NH4
OH
vorsichtig mischen
5 min Inkubation bei Raumtemperatur
vorsichtig mischen
5 min Inkubation bei Raumtemperatur
Die an die super-paramagnetischen Partikel gebundenen biotinylierten Stränge
werden durch Magnet-Separation abgetrennt.
Der Überstand enthält die nicht-biotinylierten DNA-Einzelstränge von Compe
titor- und S. mutans-Amplifikatfragmenten.
Entfernen des Ammoniaks durch Inkubation bei 80°C.
Einengung des Volumens durch Gefriertrocknung auf 3-5 µl.
1 µl des eingeengten Überstandes aus 1.3.4. werden mit 1 µl Matrix (50 mg/ml
3-Hydroxy-Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhydrogencitrat) gemischt, auf
ein MALDI-Target gebracht und getrocknet.
Die absoluten Massen der beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI-TOF
Massenspektrometer ermittelt und dadurch die Identität der PCR-Produkte
überprüft. Aus dem Verhältnis der durch Integration ermittelten Peakflächen
von Competitor-DNA-Strang und S. mutans-DNA-Strang kann auf das Verhält
nis der DNA-Templatemoleküle von Competitor und S. mutans DNA geschlos
sen werden. Da die Menge Competitor bekannt ist, kann so die Menge S.
mutans DNA berechnet werden. Da bekannt ist, dass S. mutans 5 Kopien des
16S rRNA-Gens im Genom enthält, kann die Zahl der S. mutans-Zellen eben
falls berechnet werden.
Vorwärts-Primer: AAAGAGGGAGCTGGAGATAATCTGT
Rückwärts-Primer: GGCTGAGATACTTATGGACATCCTT
Gesamtlänge des Fragments: 536 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärts-Primer:
Austausch G/C: GGCTGAGATACTTATGGACATCCTT-TAGGGCTCCTAG
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Rückwärts-Primer: GGCTGAGATACTTATGGACATCCTT
Gesamtlänge des Fragments: 536 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärts-Primer:
Austausch G/C: GGCTGAGATACTTATGGACATCCTT-TAGGGCTCCTAG
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine
PCR unter Verwendung klonierter cDNA der LPFK-2 (in Plasmid pUC 18) der
Ratte als Template durchgeführt.
Ansatzvolumen: 50 µl
Primerkonzentration: je 40 µmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg Plasmid-DNA (cDNA der LPFK-2 in pUC 18)
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
Primerkonzentration: je 40 µmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg Plasmid-DNA (cDNA der LPFK-2 in pUC 18)
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
initiale Denaturierung: 3 min 95°C
Denaturierung: 1 min 95°C
Annealing: 1 min 55°C
Extension: 1 min 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Annealing: 1 min 55°C
Extension: 1 min 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Nach Prüfung der Homogenität (Agarosegelelektrophorese) und Identität
(DNA-Sequenzierung) des PCR-Produktes (= DNA-Competitor) wird dieser
mittels Absorptionsmessung bei 260 nm quantifiziert.
Nach Behandlung mit Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I wird das
PCR-Produkt (= Competitor, 536 Basenpaare) in das Plasmid pPCR-Script
Amp SK(+) (Stratagene) kloniert.
Nach Prüfung der Orientierung (DNA-Sequenzierung) des Competitors im
Plasmidvektor und Plasmidpräparation mittels Plasmid-Mini-Kit (Qiagen) wird
das Plasmid mittels Absorptionsmessung bei 260 nm quantifiziert.
Die Herstellung des RNA-Competitors erfolgt durch in-vitro Transkription unter
Verwendung des klonierten Competitors aus 2.1.2.1. unter Nutzung der flan
kierenden T7- und SP6-Promotoren.
Es werden folgende Reagenzien bei Raumtemperatur für einen 20 µl Ansatz
pipettiert:
klonierter Competitor (1 µg) | 5 µl |
10 × Reaktionspuffer | 2 µl |
ATP (75 mmol/l) | 2 µl |
CTP (75 mmol/l) | 2 µl |
GTP (75 mmol/l) | 2 µl |
UTP (75 mmol/l) | 2 µl |
Polymerase-Mix | 2 µl |
RNase-freies Wasser | 3 µl |
Der Ansatz wird 4 h bei 37°C inkubiert. Um die Template-DNA abzubauen,
wird danach 1 µl RNase-freie DNase I (2 U/µl) zugegeben und 15 min bei 37°C
inkubiert. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Isopropanolfällung wird
der RNA-Competitor in RNase-freiem Wasser aufgenommen. Anschließend
wird die Konzentration des RNA-Competitors bestimmt und Aliquote werden
bei -80°C gelagert.
Zu je 5 µg isolierter Gesamt-RNA aus Rattenleber wird jeweils eine definierte
Menge des RNA-Competitors (z. B. 5000, 50 000 und 500 000 Moleküle) zuge
geben.
Zur Umschreibung der RNA in cDNA kann der "First-Strand cDNA Synthesis
Kit" (Pharmacia) eingesetzt werden.
5 µg RNA mit H2
O auf 20 µl auffüllen
10 min bei 65°C inkubieren, danach schnell auf Eis
1 µl DTT,
1 µl Random Primer,
11 µl "bulk" hinzufügen
1 Stunde bei 37°C inkubieren
5 min bei 90°C inaktivieren, danach schnell auf Eis
10 min bei 65°C inkubieren, danach schnell auf Eis
1 µl DTT,
1 µl Random Primer,
11 µl "bulk" hinzufügen
1 Stunde bei 37°C inkubieren
5 min bei 90°C inaktivieren, danach schnell auf Eis
Vorwärts-Primer: AAAGAGGGAGCTGGAGATAATCTGT
Rückwärts-Primer: Bio-GGCTGAGATACTTATGGACATCCTT
Rückwärts-Primer: Bio-GGCTGAGATACTTATGGACATCCTT
Mit diesen Primern werden parallel drei PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 2.1.1., aber
Template: 5 µl cDNA aus 2.2.1.
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 2.1.1..
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und der LPFK-2 cDNA.
Reaktionsbedingungen: wie unter 2.1.1., aber
Template: 5 µl cDNA aus 2.2.1.
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 2.1.1..
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und der LPFK-2 cDNA.
Die Entfernung der Primer erfolgt durch eine geeignete Methode, z. B. Zugabe
von Exonuklease I und Shrimp-Alkalischer-Phosphatase (beide von Amer
sham-Pharmacia).
Zu 15 µl RT/PCR-Produkt werden 1 U Alkalische Phosphatase und 10 U Exo
nuklease I zugegeben, 15 Minuten bei 37°C und danach 15 Minuten bei 85°C
inkubiert.
Die am Rückwärts-Primer biotinylierten PCR-Produkte (Gemisch von Amplifi
katen von Competitor und LPFK-2-cDNA) werden mittels Alw 21I (MBI Fer
mentas) an Position 495 der DNA gespalten.
50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer O+
4 µl ddH2
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer O+
4 µl ddH2
O
1 µl Alw 21I (10 U)
1 µl Alw 21I (10 U)
Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.
Die Immobilisierung der Restriktionsfragmente von 2.3.2. erfolgt durch Bindung
an Streptavidin-markierte super-paramagnetische Partikel.
Nach Waschen der super-paramagnetischen Partikel Zugabe des Reaktions
ansatzes aus 2.3.2.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 2.3.2. durch Magnet separation
Waschen mit deionisiertem Wasser. Aufnehmen der super-paramagnetischen Partikel in 5 µl deionisiertem Wasser.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 2.3.2. durch Magnet separation
Waschen mit deionisiertem Wasser. Aufnehmen der super-paramagnetischen Partikel in 5 µl deionisiertem Wasser.
1 µl der aufgenommenen super-paramagnetischen Partikel aus 1.3.3. werden
mit 1 µl Matrix (50 mg/ml 3-Hydroxy-Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhy
drogencitrat) gemischt, auf ein MALDI-Target gebracht und getrocknet. Durch
den Laser werden nur die nicht-biotinylierten Einzelstränge verdampft.
Die beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI hinsichtlich ihrer absoluten
Massen analysiert (und damit eindeutig identifiziert). Aus dem Verhältnis der
durch Integration ermittelten Peakflächen von Competitor-DNA-Strang und
LPFK-2-DNA-Strang kann auf das Verhältnis der RNA-Templatemoleküle von
Competitor und LPFK-2-mRNA geschlossen werden. Da die Menge Competitor
bekannt ist, kann so die Menge LPFK-2-mRNA berechnet werden.
Vorwärts-Primer: TTGCCTTCTGACTTCTTTCC
Rückwärts-Primer: TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT
Gesamtlänge des Fragments: 441 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Vorwärtsprimer:
Austausch A/T: TTGCCTTCTGACTTCTTTCC-TTCAGTTCGAGATC
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Rückwärts-Primer: TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT
Gesamtlänge des Fragments: 441 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Vorwärtsprimer:
Austausch A/T: TTGCCTTCTGACTTCTTTCC-TTCAGTTCGAGATC
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine
PCR unter Verwendung von Hepatitis B-Virus oder Virus-DNA als Template
durchgeführt.
Ansatzvolumen: 50 µl
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg Hepatitis B-Virus DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg Hepatitis B-Virus DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
initiale Denaturierung: 3 min 95°C
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 48°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 48°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Nach Prüfung der Homogenität (Agarosegelelektrophorese) und Identität
(DNA-Sequenzierung) des PCR-Produktes (= Competitor) wird dieser mittels
Absorptionsmessung bei 260 nm quantifiziert.
Vorwärts-Primer: Bio-TTGCCTTCTGACTTCTTTCC
Rückwärts-Primer: TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT
Rückwärts-Primer: TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT
Mit diesen Primern werden parallel drei PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 3.1., aber
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem Hepatitis B-Virus-Gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle)
1 µl Probe (geschätzter Hepatitis B-Viren-gehalt 1000 Viren/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in steri lem, deionisierten Wasser verdünnt
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 3.1.
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und der Hepatitis B- Virus-DNA.
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem Hepatitis B-Virus-Gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle)
1 µl Probe (geschätzter Hepatitis B-Viren-gehalt 1000 Viren/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in steri lem, deionisierten Wasser verdünnt
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 3.1.
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und der Hepatitis B- Virus-DNA.
Die Entfernung der Primer erfolgt durch eine geeignete Methode, z. B.
QIAquick-PCR-clean-up-Kit oder Ethanolfällung.
Die am Vorwärtsprimer biotinylierten PCR-Produkte (Gemisch von Amplifikaten
von Competitor und Hepatitis B-Virus DNA) werden mittels Bgl II (MBI Fer
mentas) an Position 30 der DNA gespalten.
50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer 0+
4 µl ddH2
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer 0+
4 µl ddH2
O
1 µl Bgl II (10 U)
1 µl Bgl II (10 U)
Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.
Die Immobilisierung der Restriktionsfragmente von 3.3.2. erfolgt durch Bindung
an Streptavidin-markierte super-paramagnetische Partikel.
Nach Waschen der super-paramagnetischen Partikel Zugabe des Reaktions
ansatzes aus 3.3.2.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 3.3.2. durch Magnet separation
Waschen mit deionisiertem Wasser.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 3.3.2. durch Magnet separation
Waschen mit deionisiertem Wasser.
Durch Zugabe von 10%igem NH4OH werden DNA-Einzelstränge gewonnen.
gebundene Restriktionsfragmente aus 3.3.2.
Zugabe von 100 µl 10%iges NH4
Zugabe von 100 µl 10%iges NH4
OH
vorsichtig mischen
5 min Inkubation bei Raumtemperatur
vorsichtig mischen
5 min Inkubation bei Raumtemperatur
Die an die super-paramagnetischen Partikel gebundenen biotinylierten Stränge
werden durch Magnet-Separation abgetrennt.
Der Überstand enthält die nicht-biotinylierten DNA-Einzelstränge von Compe
titor- und Hepatitis B-Virus-Amplifikatfragmenten.
Entfernen des Ammoniaks durch Inkubation bei 80°C.
Einengung des Volumens durch Gefriertrocknung auf 3-5 µl.
1 µl des eingeengten Überstandes aus 3.3.4. werden mit 1 µl Matrix (50 mg/ml
3-Hydroxy-Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhydrogencitrat) gemischt, auf
ein MALDI-Target gebracht und getrocknet.
Die absoluten Massen der beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI-TOF
Massenspektrometer ermittelt und dadurch die Identität der PCR-Produkte
überprüft. Aus dem Verhältnis der durch Integration ermittelten Peakflächen
von Competitor-DNA-Strang und Hepatitis B-Virus-DNA-Strang kann auf das
Verhältnis der DNA-Templatemoleküle von Competitor und Hepatitis B-Virus-
DNA geschlossen werden. Da die Menge Competitor bekannt ist, kann so die
Menge Hepatitis B-Virus-DNA berechnet werden.
Vorwärts-Primer: GCGGCACCAACTGGGGCTGGT
Rückwärts-Primer: GGGCAGCATGAAGGGCTCCC
Gesamtlänge des Fragments: 557 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärts-Primer:
Austausch G/C: GGGCAGCATGAAGGGCTCCC-AATCCATCCAGATGTG
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Rückwärts-Primer: GGGCAGCATGAAGGGCTCCC
Gesamtlänge des Fragments: 557 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärts-Primer:
Austausch G/C: GGGCAGCATGAAGGGCTCCC-AATCCATCCAGATGTG
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine
PCR unter Verwendung von M. organophilum-DNA oder -Zellen als Template
durchgeführt.
Ansatzvolumen: 50 µl
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg S. mutans DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg S. mutans DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
initiale Denaturierung: 3 min 95°C
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 55°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 55°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Nach Prüfung der Homogenität (Agarosegelelektrophorese) und Identität
(DNA-Sequenzierung) des PCR-Produktes (= Competitor) wird dieser mittels
Absorptionsmessung bei 260 nm quantifiziert.
Vorwärts-Primer: GCGGCACCAACTGGGGCTGGT
Rückwärts-Primer: Bio-GGGCAGCATGAAGGGCTCCC
Rückwärts-Primer: Bio-GGGCAGCATGAAGGGCTCCC
Mit diesen Primern werden parallel drei PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 4.1., aber
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem M. organophilum-Gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle)
1 µl Probe (geschätzter M. organophilum-gehalt 1000 Zellen/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in steri lem, deionisierten Wasser verdünnt
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 4.1..
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und des M. organophi lum MDH-Gens.
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem M. organophilum-Gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle)
1 µl Probe (geschätzter M. organophilum-gehalt 1000 Zellen/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in steri lem, deionisierten Wasser verdünnt
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 4.1..
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und des M. organophi lum MDH-Gens.
Die Entfernung der Primer erfolgt durch eine geeignete Methode, z. B.
QIAquick-PCR-clean-up-Kit oder Ethanolfällung.
Die am Rückwärts-Primer biotinylierten PCR-Produkte (Gemisch von Amplifi
katen von Competitor und M. organophilum MDH-Gen) werden mittels Sap I
(New England Biolabs) an Position 550 der DNA gespalten.
50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × NEBuffer 4
4 µl ddH2
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × NEBuffer 4
4 µl ddH2
O
1 µl Sap I (3 U)
1 µl Sap I (3 U)
Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.
Die Immobilisierung der Restriktionsfragmente von 4.3.2. erfolgt durch Bindung
an Streptavidin-markierte super-paramagnetische Partikel.
Nach Waschen der super-paramagnetischen Partikel Zugabe des Reaktions
ansatzes aus 4.3.2.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 4.3.2. durch Magnet separation
Waschen mit deionisiertem Wasser.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 4.3.2. durch Magnet separation
Waschen mit deionisiertem Wasser.
Durch Zugabe von 10%igem NH4OH werden DNA-Einzelstränge gewonnen.
gebundene Restriktionsfragmente aus 4.3.2.
Zugabe von 100 µl 10%iges NH4
Zugabe von 100 µl 10%iges NH4
OH
vorsichtig mischen
5 min Inkubation bei Raumtemperatur
vorsichtig mischen
5 min Inkubation bei Raumtemperatur
Die an die super-paramagnetischen Partikel gebundenen biotinylierten Stränge
werden durch Magnet-Separation abgetrennt.
Der Überstand enthält die nicht-biotinylierten DNA-Einzelstränge von Compe
titor- und M. organophilum-Amplifikatfragmenten.
Entfernen des Ammoniaks durch Inkubation bei 80°C.
Einengung des Volumens durch Gefriertrocknung auf 3-5 µl.
1 µl des eingeengten Überstandes aus 4.3.4. werden mit 1 µl Matrix (50 mg/ml
3-Hydroxy-Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhydrogencitrat) gemischt, auf
ein MALDI-Target gebracht und getrocknet.
Die absoluten Massen der beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI-TOF
Massenspektrometer ermittelt und dadurch die Identität der PCR-Produkte
überprüft. Aus dem Verhältnis der durch Integration ermittelten Peakflächen
von Competitor-DNA-Strang und M. organophilum-DNA-Strang kann auf das
Verhältnis der DNA-Templatemoleküle von Competitor und M. organophilum
DNA geschlossen werden. Da die Menge Competitor bekannt ist, kann so die
Menge M. organophilum DNA berechnet werden. Da bekannt ist, dass M. or
ganophilum 1 Kopie des MDH-Gens im Genom enthält, kann die Zahl der M.
organophilum-Zellen ebenfalls berechnet werden.
Vorwärts-Primer: CCAGATTAGCTTTTGCTGATCGCGGG
Rückwärts-Primer: ACTTTCCAGTAATAGGCTTATCG
Gesamtlänge des Fragments: 379 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärts-Primer:
Austausch G/C: ACTTTCCAGTAATAGGCTTATCG-TTGCGAATAACCCATC
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Rückwärts-Primer: ACTTTCCAGTAATAGGCTTATCG
Gesamtlänge des Fragments: 379 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärts-Primer:
Austausch G/C: ACTTTCCAGTAATAGGCTTATCG-TTGCGAATAACCCATC
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine
PCR unter Verwendung von P. carinii-DNA oder -Zellen als Template durch
geführt.
Ansatzvolumen: 50 µl
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg S. mutans DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µmol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg S. mutans DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)
initiale Denaturierung: 3 min 95°C
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 55°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 55°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.
Nach Prüfung der Homogenität (Agarosegelelektrophorese) und Identität
(DNA-Sequenzierung) des PCR-Produktes (= Competitor) wird dieser mittels
Absorptionsmessung bei 260 nm quantifiziert.
Vorwärts-Primer: CCAGATTAGCTTTTGCTGATCGCGGG
Rückwärts-Primer 5'-seitig kovalent an MALDI-Target gebunden:
MALDI-Target-ACTTTCCAGTAATAGGCTTATCG
Rückwärts-Primer 5'-seitig kovalent an MALDI-Target gebunden:
MALDI-Target-ACTTTCCAGTAATAGGCTTATCG
Mit diesen Primern werden parallel drei Festphasen-PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 5.1., aber
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem P. carinii-gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle), kein Rückwärts-Primer zugegeben.
1 µl Probe (geschätzter P. carinii-gehalt 1000 Zellen/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 1.1..
Produkt: Gemisch von an MALDI-Target gebundenen Amplifikaten des Competitors und des P. carinii 18S rRNA-Gens.
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem P. carinii-gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle), kein Rückwärts-Primer zugegeben.
1 µl Probe (geschätzter P. carinii-gehalt 1000 Zellen/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 1.1..
Produkt: Gemisch von an MALDI-Target gebundenen Amplifikaten des Competitors und des P. carinii 18S rRNA-Gens.
Die über den Rückwärts-Primer immobilisierten PCR-Produkte (Gemisch von
Amplifikaten von Competitor und P. carinii 18 S rRNA-Gen) werden mittels BpiI
(MBI Fermentas) an Position 327 der DNA gespalten.
50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer G+
4 µl ddH2
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer G+
4 µl ddH2
O
1 µl Bbs I (10 U)
1 µl Bbs I (10 U)
Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.
Nach Waschen des MALDI-Targets und Trocknen wird auf die Spots, die im
mobilisierte Amplifikatfragmente tragen 1 µl Matrix (50 mg/ml 3-Hydroxy-
Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhydrogencitrat) gegeben und getrocknet.
Durch den Laser werden nur die nicht am Target immobilisierten DNA-Stränge
abgelöst.
Die absoluten Massen der beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI-TOF
Massenspektrometer ermittelt und dadurch die Identität der PCR-Produkte
überprüft. Aus dem Verhältnis der durch Integration ermittelten Peakflächen
von Competitor-DNA-Strang und P. carinii-DNA-Strang kann auf das Verhältnis
der DNA-Templatemoleküle von Competitor und P. carinii DNA geschlossen
werden. Da die Menge Competitor bekannt ist, kann so die Menge P. carinii
DNA berechnet werden. Da die Anzahl Kopien des 18 S rRNA-Gens im Genom
von P. carinii bekannt ist, kann die Zahl der P. carinii-Zellen ebenfalls be
rechnet werden.
Claims (7)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren,
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die an für einen spezifischen Nachweis der jeweiligen Nukleinsäure geeignete Teilsequenzen, binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusam mensetzungsgleichen Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA aufweist, enthält, die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion erzeugt wurde,
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält, der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterworfen wird
und die Einzelstränge der beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Proben nukleinsäure und Competitor unmittelbar oder nach Behandlung mit an sich bekannten Methoden der Spaltung von DNA,
hinsichtlich ihrer Masse und ihrer Menge mittels einer massenspektrometrischen Methode analysiert werden, so dass
aus ihren Massen ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und aus ihrem Mengenverhältnis und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der Nukleinsäuregehalt der Probe ermittelt wird.
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die an für einen spezifischen Nachweis der jeweiligen Nukleinsäure geeignete Teilsequenzen, binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusam mensetzungsgleichen Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA aufweist, enthält, die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion erzeugt wurde,
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält, der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterworfen wird
und die Einzelstränge der beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Proben nukleinsäure und Competitor unmittelbar oder nach Behandlung mit an sich bekannten Methoden der Spaltung von DNA,
hinsichtlich ihrer Masse und ihrer Menge mittels einer massenspektrometrischen Methode analysiert werden, so dass
aus ihren Massen ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und aus ihrem Mengenverhältnis und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der Nukleinsäuregehalt der Probe ermittelt wird.
2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren,
nach Anspruch 1
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, von denen einer über sein 5'-Ende entweder an eine Unterlage gebunden wurde oder an eine Unterlage gebunden werden kann, und die an für einen spezifischen Nachweis der jeweiligen Nukleinsäure geeignete Teilsequenzen, binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusam mensetzungsgleichen Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA aufweist, enthält,
die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vor wärts- und Rückwärts-Primer erzeugten DNA als Template, von Vorwärts- (oder Rück wärts-) Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rückwärts- (Vorwärts-) Primers trägt, jedoch nach 3' complementär zum Template verlängert wurde und innerhalb der Verlängerung, jedoch mindestens 5 Basen vor deren 3'-Ende, einen Basenaustausch enthält, erzeugt wurde,
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält, der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterworfen wird
und die beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor entweder
unmittelbar oder nach Bindung der Amplifikate an einen Träger
mit einem Restriktionsenzym, das weiter innerhalb des PCR-Produktes spaltet als der Basenaustausch lokalisiert ist, jedoch maximal im Abstand von 50-55 Basen vom 5'- Ende des Primers, in dessen Nachbarschaft sich die den Competitor auszeichnende Strukturabweichung von der Proben-Nukleinsäuresequenz befindet, verdaut werden und danach die DNA-Einzelstränge von Proben- und Competitor-Amplifikatfragment, die complementär zu den den immobilisierten Primer tragenden DNA-Strängen sind, hinsichtlich ihrer Masse und ihrer Menge mittels Matrix-assisted-laser-desorption- ionization-time-of-flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) analysiert werden, so dass aus ihren Massen ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und aus ihrem Mengenverhältnis und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der Nukleinsäuregehalt der Probe ermittelt wird.
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, von denen einer über sein 5'-Ende entweder an eine Unterlage gebunden wurde oder an eine Unterlage gebunden werden kann, und die an für einen spezifischen Nachweis der jeweiligen Nukleinsäure geeignete Teilsequenzen, binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusam mensetzungsgleichen Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA aufweist, enthält,
die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vor wärts- und Rückwärts-Primer erzeugten DNA als Template, von Vorwärts- (oder Rück wärts-) Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rückwärts- (Vorwärts-) Primers trägt, jedoch nach 3' complementär zum Template verlängert wurde und innerhalb der Verlängerung, jedoch mindestens 5 Basen vor deren 3'-Ende, einen Basenaustausch enthält, erzeugt wurde,
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält, der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterworfen wird
und die beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor entweder
unmittelbar oder nach Bindung der Amplifikate an einen Träger
mit einem Restriktionsenzym, das weiter innerhalb des PCR-Produktes spaltet als der Basenaustausch lokalisiert ist, jedoch maximal im Abstand von 50-55 Basen vom 5'- Ende des Primers, in dessen Nachbarschaft sich die den Competitor auszeichnende Strukturabweichung von der Proben-Nukleinsäuresequenz befindet, verdaut werden und danach die DNA-Einzelstränge von Proben- und Competitor-Amplifikatfragment, die complementär zu den den immobilisierten Primer tragenden DNA-Strängen sind, hinsichtlich ihrer Masse und ihrer Menge mittels Matrix-assisted-laser-desorption- ionization-time-of-flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) analysiert werden, so dass aus ihren Massen ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und aus ihrem Mengenverhältnis und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der Nukleinsäuregehalt der Probe ermittelt wird.
3. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren,
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, von denen einer, nämlich der, in dessen Nachbarschaft sich der Basenaustausch im Competitor befindet, entweder 5'-biotinyliert oder 5'-seitig über einen Spacer kovalent an eine Unterlage gebunden wurde, und die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermitteln de, für einen spezifischen Nachweis der jeweiligen Nukleinsäure geeignete Teilse quenzen, binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusam mensetzungsgleichen Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA (ein-Basen-Austausch zwischen beiden DNA-Strängen) aufweist, enthält, die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vor wärts- und Rückwärts-Primer erzeugten DNA als Template, von Vorwärts- (oder Rück wärts-) Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rückwärts- (Vorwärts-) Primers trägt, jedoch nach 3' um 10-20 Basen complementär zum Template verlängert wurde und bei dem innerhalb der Verlänge rung, jedoch mindestens 5 Basen vor deren 3'-Ende, wenige, typischerweise nur eine Base, zu ihrem Complement verändert wird, erzeugt wurde
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält,
der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterworfen wird
und die beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor entweder
unmittelbar (bei kovalent immobilisiertem Primer) oder
nach Entfernung überschüssiger Primer und Bindung der Amplifikate an Streptavidin- beschichtete super-paramagnetische Partikel
mit einem Restriktionsenzym, das weiter innerhalb des PCR-Produktes spaltet als der Basenaustausch lokalisiert ist, jedoch maximal im Abstand von 50-55 Basen vom 5'- Ende des Primers, in dessen Nachbarschaft sich der Einzelbasenaustausch befindet, verdaut werden
und danach die Masse der DNA-Einzelstränge von Proben- und Competitor- Amplifikatfragment, die complementär zu den den immobilisierten Primer tragenden DNA-Strängen sind
mittels MALDI-TOF bestimmt wird
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge
und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der Nuklein säuregehalt der Probe ermittelt wird.
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, von denen einer, nämlich der, in dessen Nachbarschaft sich der Basenaustausch im Competitor befindet, entweder 5'-biotinyliert oder 5'-seitig über einen Spacer kovalent an eine Unterlage gebunden wurde, und die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermitteln de, für einen spezifischen Nachweis der jeweiligen Nukleinsäure geeignete Teilse quenzen, binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusam mensetzungsgleichen Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA (ein-Basen-Austausch zwischen beiden DNA-Strängen) aufweist, enthält, die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vor wärts- und Rückwärts-Primer erzeugten DNA als Template, von Vorwärts- (oder Rück wärts-) Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rückwärts- (Vorwärts-) Primers trägt, jedoch nach 3' um 10-20 Basen complementär zum Template verlängert wurde und bei dem innerhalb der Verlänge rung, jedoch mindestens 5 Basen vor deren 3'-Ende, wenige, typischerweise nur eine Base, zu ihrem Complement verändert wird, erzeugt wurde
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält,
der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterworfen wird
und die beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor entweder
unmittelbar (bei kovalent immobilisiertem Primer) oder
nach Entfernung überschüssiger Primer und Bindung der Amplifikate an Streptavidin- beschichtete super-paramagnetische Partikel
mit einem Restriktionsenzym, das weiter innerhalb des PCR-Produktes spaltet als der Basenaustausch lokalisiert ist, jedoch maximal im Abstand von 50-55 Basen vom 5'- Ende des Primers, in dessen Nachbarschaft sich der Einzelbasenaustausch befindet, verdaut werden
und danach die Masse der DNA-Einzelstränge von Proben- und Competitor- Amplifikatfragment, die complementär zu den den immobilisierten Primer tragenden DNA-Strängen sind
mittels MALDI-TOF bestimmt wird
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge
und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der Nuklein säuregehalt der Probe ermittelt wird.
4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren einer Gruppe von
Spezies,
nach einem der vorangehenden Ansprüche
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, von denen einer, nämlich der, in dessen Nachbarschaft sich der Basenaustausch im Competitor befindet, entweder 5'-biotinyliert oder 5'-seitig über einen Spacer kovalent an eine Unterlage gebunden wurde, und die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermitteln de, für eine Gruppe von Spezies spezifische Teilsequenzen, binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusam mensetzungsgleichen Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA aufweist, enthält,
die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vor wärts- und Rückwärts-Primer unter Verwendung der DNA eines typischen Vertreters der Speziesgruppe erzeugten DNA als Template, von Vorwärts- (oder Rückwärts-) Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rückwärts- (Vorwärts-) Primers trägt, jedoch nach 3' um 10-20 Basen complemen tär zum Template verlängert wird und bei dem innerhalb der Verlängerung, jedoch mindestens 5 Basen vor deren 3'-Ende, wenige, typischerweise nur eine Base, zu ihrem Complement verändert wird, erzeugt wurde
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält, der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterworfen wird
und die beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor entweder
unmittelbar (bei kovalent immobilisiertem Primer) oder
nach Entfernung überschüssiger Primer und Bindung der Amplifikate an Streptavidin- beschichtete super-paramagnetische Partikel
mit einem Restriktionsenzym verdaut werden
und danach die Masse der DNA-Einzelstränge von Proben- und Competitor- Amplifikatfragment, die complementär zu den den immobilisierten Primer tragenden DNA-Strängen sind
mittels MALDI-TOF bestimmt wird
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge, der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards und der mittleren Kopienzahl der DNA pro Zelle die Summe der Zellen aller Vertreter der Speziesgruppe in der Probe ermittelt wird.
nach einem der vorangehenden Ansprüche
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, von denen einer, nämlich der, in dessen Nachbarschaft sich der Basenaustausch im Competitor befindet, entweder 5'-biotinyliert oder 5'-seitig über einen Spacer kovalent an eine Unterlage gebunden wurde, und die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermitteln de, für eine Gruppe von Spezies spezifische Teilsequenzen, binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusam mensetzungsgleichen Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA aufweist, enthält,
die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vor wärts- und Rückwärts-Primer unter Verwendung der DNA eines typischen Vertreters der Speziesgruppe erzeugten DNA als Template, von Vorwärts- (oder Rückwärts-) Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rückwärts- (Vorwärts-) Primers trägt, jedoch nach 3' um 10-20 Basen complemen tär zum Template verlängert wird und bei dem innerhalb der Verlängerung, jedoch mindestens 5 Basen vor deren 3'-Ende, wenige, typischerweise nur eine Base, zu ihrem Complement verändert wird, erzeugt wurde
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält, der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterworfen wird
und die beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor entweder
unmittelbar (bei kovalent immobilisiertem Primer) oder
nach Entfernung überschüssiger Primer und Bindung der Amplifikate an Streptavidin- beschichtete super-paramagnetische Partikel
mit einem Restriktionsenzym verdaut werden
und danach die Masse der DNA-Einzelstränge von Proben- und Competitor- Amplifikatfragment, die complementär zu den den immobilisierten Primer tragenden DNA-Strängen sind
mittels MALDI-TOF bestimmt wird
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge, der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards und der mittleren Kopienzahl der DNA pro Zelle die Summe der Zellen aller Vertreter der Speziesgruppe in der Probe ermittelt wird.
5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren einer Spezies,
nach einem der vorangehenden Ansprüche
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
der Ansatz der competitiven quantitativen PCR Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermittelnde, für eine Spezies wie Tier-, Pflanzen-, Pilz-, Bakterien-, Archeae-, Virus- Spezies oder Zelllinie von Tumoren, Lymphozyten, Stammzellen spezifische DNA- Sequenz, binden
und bei der nach Massenbestimmung der DNA-Einzelstränge der Amplifikate von Probe und Competitor
ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge, der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards und der Kopien zahl der DNA pro Zelle die Zellzahl der Spezies in der Probe ermittelt wird.
nach einem der vorangehenden Ansprüche
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
der Ansatz der competitiven quantitativen PCR Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermittelnde, für eine Spezies wie Tier-, Pflanzen-, Pilz-, Bakterien-, Archeae-, Virus- Spezies oder Zelllinie von Tumoren, Lymphozyten, Stammzellen spezifische DNA- Sequenz, binden
und bei der nach Massenbestimmung der DNA-Einzelstränge der Amplifikate von Probe und Competitor
ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge, der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards und der Kopien zahl der DNA pro Zelle die Zellzahl der Spezies in der Probe ermittelt wird.
6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von DNA,
nach einem der vorangehenden Ansprüche
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird, aus der mit an sich bekannten Methoden DNA wie Gesamt-DNA, chromosomale DNA, Plasmid-DNA, mitochondriale DNA oder Chlo roplasten-DNA isoliert wird,
der Ansatz der competitiven quantitativen PCR Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermittelnde, für die zu bestimmende DNA spezifische Teilsequenz, binden
und bei der nach Massenbestimmung der DNA-Einzelstränge der Amplifikate von Probe und Competitor
ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge
und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der DNA- Gehalt der Probe ermittelt wird.
nach einem der vorangehenden Ansprüche
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird, aus der mit an sich bekannten Methoden DNA wie Gesamt-DNA, chromosomale DNA, Plasmid-DNA, mitochondriale DNA oder Chlo roplasten-DNA isoliert wird,
der Ansatz der competitiven quantitativen PCR Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermittelnde, für die zu bestimmende DNA spezifische Teilsequenz, binden
und bei der nach Massenbestimmung der DNA-Einzelstränge der Amplifikate von Probe und Competitor
ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge
und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der DNA- Gehalt der Probe ermittelt wird.
7. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von RNA,
nach einem der vorangehenden Ansprüche
dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird, aus der
nach Zugabe einer definierten Menge einer mittels in vitro-Transkription synthetisierten,
zur Proben-RNA nur durch ein-Basen-Austausch unterschiedlichen, in einer vorange gangenen RT-PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vorwärts- und Rück wärts-Primer erzeugten cDNA als Template, Vorwärts- (oder Rückwärts-) Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rück wärts- (Vorwärts-) Primers trägt, jedoch nach 3' um 10-20 Basen complementär zum Template verlängert wird und bei dem innerhalb der Verlängerung, jedoch mindestens 5 Basen vor deren 3'-Ende, nur eine Base zu ihrem Complement verändert wird, erzeugten RNA-Competitors, mit an sich bekannten Methoden RNA wie Gesamt-RNA oder mRNA isoliert wird,
eine competitive PCR unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primer durch geführt wird
und bei der nach Massenbestimmung der DNA-Einzelstränge der Amplifikate von Probe und Competitor
die Identität der RNA zweifelsfrei bestimmt
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge
und der bekannten Menge des zum RT-PCR-Ansatz zugegebenen RNA-Standards der RNA-Gehalt der Probe ermittelt wird.
eine biologische Probe entnommen wird, aus der
nach Zugabe einer definierten Menge einer mittels in vitro-Transkription synthetisierten,
zur Proben-RNA nur durch ein-Basen-Austausch unterschiedlichen, in einer vorange gangenen RT-PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vorwärts- und Rück wärts-Primer erzeugten cDNA als Template, Vorwärts- (oder Rückwärts-) Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rück wärts- (Vorwärts-) Primers trägt, jedoch nach 3' um 10-20 Basen complementär zum Template verlängert wird und bei dem innerhalb der Verlängerung, jedoch mindestens 5 Basen vor deren 3'-Ende, nur eine Base zu ihrem Complement verändert wird, erzeugten RNA-Competitors, mit an sich bekannten Methoden RNA wie Gesamt-RNA oder mRNA isoliert wird,
eine competitive PCR unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primer durch geführt wird
und bei der nach Massenbestimmung der DNA-Einzelstränge der Amplifikate von Probe und Competitor
die Identität der RNA zweifelsfrei bestimmt
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge
und der bekannten Menge des zum RT-PCR-Ansatz zugegebenen RNA-Standards der RNA-Gehalt der Probe ermittelt wird.
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---|---|---|---|---|
DE102006003415A1 (de) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Siemens Ag | Verfahren zur Analyse einer Probe |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998014616A1 (en) * | 1996-10-04 | 1998-04-09 | Perseptive Biosystems, Inc. | Methods for determining sequence information in polynucleotides using mass spectrometry |
DE19732086A1 (de) * | 1997-07-25 | 1999-01-28 | Univ Leipzig | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Eubakterien |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998014616A1 (en) * | 1996-10-04 | 1998-04-09 | Perseptive Biosystems, Inc. | Methods for determining sequence information in polynucleotides using mass spectrometry |
DE19732086A1 (de) * | 1997-07-25 | 1999-01-28 | Univ Leipzig | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Eubakterien |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Datenbank BIOSIS bei STN, AN 1996:332410 BIOSIS zu: Analysis of ligase chain reaction products viamatrix-assisted laser desorption/ionization time- of-flight-mass spectrometry. Jurinke, C. et al., Analytical Biochemistry, (1996) Vol. 237, No. 2, pp. 174-181 * |
Datenbank CAPLUS bei STN, AN 1997:623477 CAPLUS zu: Analysis of short tandem repeat polymorphisms in human DNA by matrixassisted laser desorption/ ionization mass spectrometry. Ross, P.L. & Belgrader, P., Anal. Chem. (1997), 69(19), 3966- 3972 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102006003415A1 (de) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Siemens Ag | Verfahren zur Analyse einer Probe |
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