DE10001881A1

DE10001881A1 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren

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Publication number: DE10001881A1
Application number: DE10001881A
Authority: DE
Inventors: Klaus Eschrich; Stefan Rupf
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2000-01-19
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2001-10-11
Anticipated expiration: 2020-01-20
Also published as: DE10001881C2

Abstract

Es ist gängige Praxis, DNA und RNA mittels competitiver PCR zu quantifizieren. Der Competitor muß sich in seiner Struktur von der Probe unterscheiden, der Strukturunterschied muß bei der Amplifikation sicher weitergegeben werden. Bisher verwendete Competitoren unterscheiden sich in der Masse, in der Basenzusammensetzung und in der Basensequenz von den Proben-DNA bzw. -RNA. DOLLAR A Ziel ist ein einfaches, schnelles, automatisierbares Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren mittels competitiver PCR. DOLLAR A Die Erfindung betrifft ein solches Verfahren, bei dem ein Competitor erzeugt wird, dessen Amplifikat mit dem der Probe hinsichtlich Masse und Basenzusammensetzung identisch ist und zu letzterem nur einen minimalen Sequenzunterschied aufweist. Eine Trennmethode wird angegeben, die es erlaubt, die massegleichen Amplifikate von Probe und Competitor schnell, präzise und automatisierbar zu ermitteln. Dazu wird nach entsprechender Probenvorbereitung die MALDI-TOF-MS eingesetzt. DOLLAR A Die Erfindung wird angewendet zur Quantifizierung von Nukleinsäuren bei hohem Probedurchsatz.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von Nukleinsäuren (DNA oder RNA). Es zeichnet sich dadurch aus, daß es für hohen Probendurchsatz geeignet ist und sequenzhomologe Competitoren, die zur Proben DNA identische Masse und identische Basenzusammensetzung und nur einen minimalen Sequenzunterschied aufweisen, verwendet.

Es ist bereits bekannt, DNA bzw. RNA mittels competitiver PCR bzw. competitiver RT/PCR zu quantifizieren. Es ist weiterhin bekannt, daß homologe Competitoren dazu geeigneter sind als heterologe oder PCR-MIMICS, da ihr Amplifikationsverhalten dem der Probe ähnlicher ist. Es ist weiterhin bekannt, daß der ideale homologe Competitor identisch mit der Proben DNA oder RNA sein müßte. Genau dann aber versagt die Methode prinzipiell, denn die Amplifikations produkte von Probe und Competitor sind nun nicht mehr zu unterscheiden. Ein Competitor muß sich demzufolge in seiner Struktur von der Probe unterscheiden und dieser Strukturunterschied muß bei der Amplifikation sicher weitergegeben werden. Die bisher verwendeten Competitoren unterscheiden sich alle sowohl in der Masse als auch in der Basenzusammensetzung als auch in der Basensequenz von der Proben-DNA bzw. -RNA.

Eine Gruppe von Methoden zur Unterscheidung der Amplifikate von Probe und Competitor beruht auf deren unterschiedlicher Masse. Die Trennschärfe der jeweils verwendeten Auf trennungsmethode bestimmt den einzustellenden Massenunterschied zwischen Probe und Competitor. Bei gelelektrophoretischer Auftrennung werden typischerweise etwa 10% kleinere Competitoren eingesetzt, bei Verwendung der HPLC oder denaturierender Polyacrylamidgele sind kleinere Massenunterschiede auflösbar, der methodische Aufwand steigt jedoch mit fallendem Massenunterschied. Um eine Base müssen sich Probe und Competitor jedoch mindestens unterscheiden.

Für Competitoren, die sich deutlich in der Masse (und damit auch in Basenzusammensetzung und Sequenz) von der Probe unterscheiden, können leicht automatisierbare Amplifikattrennungs- und quantifizierungsverfahren entwickelt werden. Jedoch kann aufgrund der Unterschiede zwischen Probe und Competitor nicht davon ausgegangen werden, daß sich beide hinsichtlich ihrer Amplifikationseffizienz in der PCR identisch verhalten. Es ist daher für jede zu quantifizierende Nukleinsäuresequenz und den dazugehörigen Competitor erforderlich, beide in umfangreichen Kontrollexperimenten gegeneinander zu titrieren, um die relativen Amplifikationseffizienzen zu ermitteln.

Je probenähnlicher die Competitoren sind, um so eher kann zwar eine identische Amplifikation von Probe und Competitor angenommen werden, sie ist jedoch zum einen nicht sicher, solange beide bezüglich Masse und Basenzusammensetzung voneinander abweichen, zum anderen steigt der analytische Aufwand mit geringer werdenden Differenzen zwischen Probe und Competitor stark an. Insbesondere wird eine Automatisierung der Auftrennung und quantitativen Analyse, und damit ein hoher Probendurchsatz, mit den bisher eingesetzten Nukleinsäuretrennmethoden sehr schwierig. Ein Einsatz masse- und basenzusammensetzungsgleicher, nur minimal in ihrer Sequenz von der Probe abweichender Competitoren, bei denen von einem zu dem der Probe identischen Amplifikationsverhalten ausgegangen werden kann, wäre bei Amplifikatauftrennung unter denaturierenden Bedingungen, wie sie bei der DNA-Sequenzierung angewendet werden, zwar prinzipiell möglich, wahrscheinlich aber aus den vorgenannten Gründen bisher nicht beschrieben worden.

Eine zweite Gruppe von Methoden zur Trennung der Amplifikate von Probe und Competitor beruht darauf, daß der Competitor sich nur geringfügig in seiner Basensequenz von der Probe unterscheidet, dies aber erlaubt, bei Restriktionsverdau des Amplifikatgemisches mit einer oder mehreren Restriktasen Amplifikate von Probe und Competitor in unterschiedlich große, nach ihrer Masse leicht zu trennende Spaltstücke zu zerlegen. Je sequenzhomologer der Competitor zur Probe ist, um so wahrscheinlicher bilden sich, besonders in den späten Zyklen der PCR, jedoch Heteroduplexe zwischen einem Proben- und einem Competitorstrang aus, die durch die verwendeten Restriktasen nicht geschnitten werden können und damit eine korrekte Quantifizierung der Amplifikate erschweren. Da das Ausmaß der Heteroduplexbildung von vielen, nicht vollständig bekannten und kontrollierbaren Parametern abhängt, erfordern solche Methoden in jedem konkreten Fall umfangreiche Kontrollexperimente und eignen sich nicht für eine Automatisierung und hohen Probendurchsatz.

Es ist weiterhin bekannt, daß es massenspektrometrische Methoden gibt, die es erlauben, Moleküle nach ihrer Masse sehr scharf aufzutrennen und absolute Molekulargewichte mit höchster Präzision zu bestimmen. Für organische Makromoleküle ist die Matrix-Assisted-Laser- Desorption-Ionization-Time-Of-Flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) eine geeignete Methode zur Auftrennung von Gemischen und zur Massenbestimmung der einzelnen Molekül spezies. MALDI-TOF-MS ist zwar für die Proteinanalytik wohletabliert, weist aber bei DNA- Analyse bisher deutliche Grenzen auf: Die maximale Länge analysierbarer DNA liegt bei etwa 50 Basen und ist damit für typische PCR-Produkte viel zu kurz. Selbst wenn größere DNA- Moleküle analysiert werden könnten, würde dann die erforderliche Massenauflösung ins besondere bei geringsten Massenunterschieden, z. B. A/T-Austausch, nur schwer oder mit sehr hohem technischen Aufwand (Reflektor, dessen Einsatz begünstigt jedoch wieder DNA- Fragmentierung und senkt die Empfindlichkeit) erreichbar sein. Zudem ist die MALDI-TOF-MS, wie alle massenspektrometrischen Verfahren, nicht ohne weiteres, sondern nur unter bestimmten Bedingungen zur Quantifizierung von Molekülen geeignet.

Die Erfindung hat das Ziel, eine einfache, schnelle und gut automatisierbare Methodik anzugeben, nach der Nukleinsäuren mittels competitiver PCR quantitativ bestimmt werden können.

Die Aufgabe ist darin zu sehen, ein methodisches Herangehen zu entwickeln, das auf beliebige mittels PCR bzw. RT/PCR amplifizierbare DNA bzw. RNA-Sequenzen (aus Viren, Eubakterien, Archaea und Eukaryonten (Protozoen, Pilzen, Pflanzen, Tieren, Mensch) anwendbar ist. Dabei soll eine allgemeingültige Vorschrift zur Erzeugung der Competitoren angegeben werden, die leicht durchführbar ist und einen Competitor liefert, dessen Amplifikat mit dem der Probe hinsichtlich Masse und Basenzusammensetzung identisch ist und zu letzterem nur einen minimalen Sequenzunterschied aufweist. Dies soll dazu dienen, eine experimentelle Überprüfung der Effizienzen der Amplifikation von Probe und Competitor prinzipiell überflüssig zu machen. Eine geeignete Trennmethode soll angegeben werden, die es erlaubt, die massegleichen Amplifikate von Probe und Competitor so aufzutrennen, daß der Anteil der Amplifikate von Probe und Competitor schnell, präzise und automatisierbar zu ermitteln ist. Da bei dieser Methode als Nebenprodukt die mit hoher Präzision bestimmte absolute Masse eines definierten, von der Proben-DNA stammenden DNA-Fragmentes anfällt, wird die Identität des Proben-PCR- Produktes überprüft und macht eine Identifizierung mit alternativen Methoden, wie sie z. B. in der DIN 58967-60 gefordert wird, überflüssig.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß wie folgt verfahren wird:

1) Erzeugung des homologen Competitors

Einzige Voraussetzung ist das Vorhandensein eines PCR-Protokolls zur spezifischen Am plifikation der zu quantifizierenden DNA oder RNA. Der Competitor wird dann erzeugt, indem einer der beiden PCR-Primer nach 3' um etwa 10-20 Basen complementär zum Template verlängert wird und bei dem am 5'-Ende der Verlängerung wenige, typischerweise nur eine Base, zu ihrem Complement verändert wird. Mit diesem Primer und dem zweiten, unveränderten PCR- Primer wird der Competitor mittels PCR unter Verwendung des Proben-PCR-Produktes als Template erzeugt. Der Competitor kann, muß aber für DNA-Quantifizierungen nicht, kloniert werden. Klonierung des Competitors sollte jedoch erfolgen, wenn für RNA-Quantifizierung RNA-Competitoren mittels in vitro-Transkription hergestellt werden sollen. Der Competitor ist stets massengleich und basenzusammensetzungsgleich zum Proben-PCR-Produkt. Beide DNA- Stränge werden durch die gleiche Zahl von Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten. Die Masse beider Einzelstränge des Competitors unterscheidet sich um die Differenz zwischen A und T (9 Da) bzw. G und C (40 Da) von den Massen der jeweiligen Proben-DNA-Stränge.

2) Competitive PCR

Nach Zugabe einer bekannten Menge des Competitors (entweder Competitor-DNA zur DNA- Probe oder Competitor-RNA zur RNA-Probe, gefolgt von reverser Transkription zur Synthese von cDNA) erfolgt PCR mit dem Vorwärts- und dem Rückwärts-Primer, die für die normale, qualitative PCR verwendet werden. Lediglich wurde der Primer, in dessen Nachbarschaft sich der Einbasenaustausch befindet, vorher entweder a) 5'-seitig biotinyliert oder b) 5'-seitig über einen Poly-T-Spacer an eine Unterlage (z. B. für MALDI-TOF-MS und PCR geeigneter Sup port) kovalent gebunden. Es wird dann, a) in Lösung oder b) an der festen Phase, ein Am plifikatgemisch erhalten, das aus masse- und basenzusammensetzungsgleichen Homoduplexen von Proben-DNA, Competitor-DNA und aus nahezu masse- und basenzusammensetzungsgleichen Heteroduplexen von beiden besteht und dessen Zusammensetzung aus PCR-Produkt-DNA- Strängen von Probe und Competitor, die sich jeweils im eine Base unterscheiden, exakt das Verhältnis der Template-DNA-Moleküle von Proben-DNA und Competitor widerspiegelt. Aus diesem Verhältnis und der bekannten Menge zugesetzten Competitors kann die in der Probe vorhandene Menge Bakterien-DNA bestimmt werden.

3) Quantifizierung der PCR-Produkt-DNA von Probe und Competitor

Zur Bestimmung der Mengenverhältnisse der DNA-Stränge der PCR-Produkte von Proben- und Competitor-DNA soll wegen der hohen Trennschärfe und der geplanten Automatisierbarkeit ein massenspektrometrisches Verfahren, vorzugsweise die Matrix-Assisted-Laser-Desorption- Ionization-Time-Of-Flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) eingesetzt werden. Dies erfordert allerdings eine geeignete Probenvorbereitung.

Durch Restriktionsverdau mit einer Restriktase, die 3'-seitig vom Basenaustausch, maximal im Abstand von 50 Basen vom 5'-Ende des Primers spaltet, in dessen Nachbarschaft sich der Einzelbasenaustausch befindet, werden (bei (a) nach Primerabtrennung vor dem Restriktionsverdau und Bindung des PCR-Produktes an eine Streptavidin-beschichtete Oberfläche (z. B. für MALDI-TOF-MS geeigneter Support) nach dem Verdau), unabhängig von der Größe des PCR-Produktes, Amplifikatfragmente erhalten, die

1. 1.) den Unterschied zwischen Probe und Competitor enthalten
2. 2.) für die MALDI-TOF-MS-Analyse zugänglich sind und
3. 3.) bei denen der relative Massenunterschied eine leichte Trennung von Proben- und Competitor- DNA-Strängen erlaubt. Im Gegensatz zu den Verfahren der quantitativen PCR mit homologem Competitor, bei denen die Restriktasen zur Unterscheidung der Amplifikate von Probe und Competitor benutzt werden, und die deshalb durch Heteroduplexbildung gestört werden, schneidet die Restriktase im hier vorgeschlagenen Verfahren solche Sequenzen, die in beiden Produkten identisch sind und die, auch in Heteroduplexen, mehrere Basen vom Basen-Mismatch entfernt sind, so daß die Restriktase alle vorhandenen Molekülspezies mit gleicher Effizienz schneiden kann. Das Vorhandensein einer geeigneten Restriktionsschnittstelle muß vor dem Design des Competitors durch geeignete Computeranalyse (z. B. Programm "Webcutter", frei im Internet verfügbar) gesichert werden. Es ist hochwahrscheinlich, daß für nahezu alle möglichen zu quantifizierenden DNA- bzw. RNA-Moleküle eine geeignete Restriktase gefunden werden kann, da an diese keine weiteren Anforderungen gestellt werden (sie kann mehrmals im verbleibenden Produkt schneiden und es ist unerheblich, welche Enden sie erzeugt) und da von beiden Seiten aus jeweils ca. 25-30 Basen als potentielle Schnittsstellen zur Verfügung stehen. Nach Entfernen aller Salze und Zugabe einer geeigneten Matrix (z. B. 3-Hydroxy-Picolinsäure) zu den immobilisierten, doppelsträngigen DNA-Restriktionsfragmenten kann direkt die MALDI- TOF-MS erfolgen. Dabei wird jeweils nur der compelmentäre, nicht unmittelbar immobilisierte DNA-Strang vom Laser abgelöst. Es erscheinen im MALDI-TOF-Spektrum nur zwei Peaks, einer vom Proben- und einer vom Competitor-Fragment. Beide können auch bei Differenz von nur 9 Da sicher getrennt werden. Eine Identifizierung der PCR-Produkte durch Hybridisierung mit einer sequenzspezifischen Sonde, wie sie in der DIN 58967-60 gefordert wird, ist bei MALDI-TOF-Analyse der Fragmente nicht erforderlich, weil über die absolute und hochpräzise Massenbestimmung eine eindeutige Identifizierung der DNAs möglich ist. Die nahezu identische Zusammensetzung der beiden Peaks von Proben- und Competitor-DNA-Strang, ihre enge Nachbarschaft und vor allem die homogene Verteilung der DNA-Moleküle von Competitor und Probe ineinander (sie wirken gegenseitig als "innere Standards" in der MALDI-TOF-MS) erlauben eine Quantifizierung über Integration der Peakflächen. Aus dem Verhältnis der Integrale der Peakflächen kann auf das Verhältnis der PCR-Produkte von Probe und Competitor eindeutig geschlossen werden.

Beispiele 1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von bakterieller DNA am Beispiel des 16S rRNA- Gens des Bakteriums Streptococcus mutans 1.1. Synthese des homologen Competitors

Vorwärts-Primer: GGTCAGGAAAGTCTGGAGTAAAAGGCTA
Rückwärts-Primer: GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC
Gesamtlänge des Fragments: 282 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärtsprimer:
Austausch G/C: GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC-CCGCAAAGGGCCTAACAC
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine PCR unter Verwendung von S. mutans-DNA oder -Zellen als Template durchgeführt.

Reaktionsbedingungen

Ansatzvolumen: 50 µl
Primerkonzentration: je 40 µmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nMol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µMol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg S. mutans DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)

Temperaturprofil

initiale Denaturierung: 3 min 95°C
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 55°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.

Nach Prüfung der Homogenität (Agarosegelelektrophorese) und Identität (DNA- Sequenzierung) des PCR-Produktes (= Competitor) wird dieser mittels Absorptionsmessung bei 260 nm quantifiziert.

1.2. Competitive PCR 1.2.1. Quantifizierung von S. mutans

Vorwärts-Primer: GGTCAGGAAAGTCTGGAGTAAAAGGCTA
Rückwärts-Primer: Bio-GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC
Mit diesen Primern werden parallel drei PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 1.1., aber
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem S. mutans-Gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle)
1 µl Probe (geschätzter S. mutans-Gehalt 1000 Zellen/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 1.1.
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und des S. mutans 16S rRNA- Gens.

1.3. Quantitative Analyse der PCR-Produkte 1.3.1. Entfernen der Primer

Die Entfernung der Primer erfolgt durch eine geeignete Methode, z. B. QIAquick-PCR- clean-up-Kit oder Ethanolfällung.

1.3.2. Verkürzung der PCR-Produkte

Die am Rückwärtsprimer biotinylierten PCR-Produkte (Gemisch von Amplifikaten von Competitor und S. mutans 16S rRNA-Gen) werden mittels Eco O109 (MBI Fermentas) an Position 248 der DNA gespalten.

Reaktionsansatz

50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer Y+/Tango
4 µl ddH₂

O
1 µl EcoO109I (10 U)

Reaktionsbedingungen

Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.

1.3.3. Immobilisierung der biotinylierten Restriktionsfragmente

Die Immobilisierung der Restriktionsfragmente von 1.3.2. erfolgt durch Bindung an Streptavidin-markierte super-paramagnetische Partikel.

Reaktionsbedingungen

Nach Waschen der super-paramagnetischen Partikel Zugabe des Reaktionsansatzes aus 1.3.2.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser,
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 1.3.2. durch Magnetseparation,
Waschen mit deionisiertem Wasser.

1.3.4. Trennung der Einzelstränge

Durch Zugabe von 10%igem NH₄OH werden DNA-Einzelstränge gewonnen.

Reaktionsbedingungen

gebundene Restriktionsfragmente aus 1.3.2.
Zugabe von 100 µl 10%iges NH₄

OH,
vorsichtig mischen,
5 min Inkubation bei Raumtemperatur.

Die an die super-paramagnetischen Partikel gebundenen biotinylierten Stränge werden durch Magnet-Separation abgetrennt.

Der Überstand enthält die nicht-biotinylierten DNA-Einzelstränge von Competitor- und S. mutans-Amplifikatfragmenten.
Entfernen des Ammoniaks durch Inkubation bei 80°C.
Einengung des Volumens durch Gefriertrocknung auf 3-5 µl.

1.3.5. Bestimmung des Verhältnisses der PCR-Produkte von Competitor und S. mutans durch MALDI-TOF-Analyse

1 µl des eingeengten Überstandes aus 1.3.4. werden mit 1 µl Matrix (50 mg/ml 3- Hydroxy-Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhydrogencitrat) gemischt, auf ein MALDI- Target gebracht und getrocknet.

Die absoluten Massen der beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI-TOF Massenspektrometer ermittelt und dadurch die Identität der PCR-Produkte überprüft. Aus dem Verhältnis der durch Integration ermittelten Peakflächen von Competitor-DNA- Strang und S. mutans-DNA-Strang kann auf das Verhältnis der DNA-Templatemoleküle von Competitor und S. mutans DNA geschlossen werden. Da die Menge Competitor bekannt ist, kann so die Menge S. mutans DNA berechnet werden. Da bekannt ist, daß S. mutans 7 Kopien des 16S rRNA-Gens im Genom enthält, kann die Zahl der S. mutans- Zellen ebenfalls berechnet werden.

2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Säuger-RNA am Beispiel der mRNA des Gens der Leber-6-Phosphofrukto-2-Kinase der Ratte 2.1. Synthese der homologen Competitoren

Vorwärts-Primer: AAAGAGGGAGCTGGAGATAATCTGT
Rückwärts-Primer: GGCTGAGATACTTATGGACATCCTT
Gesamtlänge des Fragments: 536 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärtsprimer:
Austausch G/C: GGCTGAGATACTTATGGACATCCTT-TAGOGCTCCTAG
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)

2.1.1. DNA-Competitor

Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine PCR unter Verwendung klonierter cDNA der LPFK-2 (in Plasmid pUC 18) der Ratte als Template durchgeführt.

Reaktionsbedingungen

Ansatzvolumen: 50 µl
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nMol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µMol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg Plasmid-DNA (cDNA der LPFK-2 in pUC 18)
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)

Temperaturprofil

initiale Denaturierung: 3 min 95°C

Zyklen

Denaturierung: 1 min 95°C
Annealing: 1 min 55°C
Extension: 1 min 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.

Nach Prüfung der Homogenität (Agarosegelelektrophorese) und Identität (DNA- Sequenzierung) des PCR-Produktes (= DNA-Competitor) wird dieser mittels Absorptionsmessung bei 260 nm quantifiziert.

2.1.2. RNA-Competitor 2.1.2.1. Klonierung des DNA-Competitors

Nach Behandlung mit Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I wird das PCR-Produkt (= Competitor, 536 Basenpaare) in das Plasmid pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene) kloniert.

Nach Prüfung der Orientierung (DNA-Sequenzierung) des Competitors im Plasmidvektor und Plasmidpräparation mittels Plasmid-Mini-Kit (Qiagen) wird das Plasmid mittels Absorptionsmessung bei 260 nm quantifiziert.

2.1.2.2. Erzeugung des RNA-Competitors

Die Herstellung des RNA-Competitors erfolgt durch in-vitro Transkription unter Verwendung des klonierten Competitors aus 2.1.2.1. unter Nutzung der flankierenden T7-und SP6-Promotoren.

Nutzung des MEGAscript in vitro Transcriptions-Kits (Ambion).

Es werden folgende Reagenzien bei Raumtemperatur für einen 20 µl Ansatz pipettiert:

klonierter Competitor (1 µg)	5 µl
10 × Reaktionspuffer	2 µl
ATP (75 mM)	2 µl
CTP (75 mM)	2 µl
GTP (75 mM)	2 µl
UTP (75 mM)	2 µl
Polymerase-Mix	2 µl
RNase-freies Wasser	3 µl

Der Ansatz wird 4 h bei 37°C inkubiert. Um die Template-DNA abzubauen, wird danach 1 µl RNase-freie DNase I (2 U/µ1) zugegeben und 15 min bei 37°C inkubiert. Nach Phenöl-Chloroform-Extraktion und Isopropanolfällung wird der RNA-Competitor in RNase-freiem Wasser aufgenommen. Anschließend wird die Konzentration des RNA- Competitors bestimmt und Aliquote werden bei -80°C gelagert.

2.2. Competitive RT/PCR

Zu je 5 µg isolierter Gesamt-RNA aus Rattenleber wird jeweils eine definierte Menge des RNA-Competitors (z. B. 5000, 50000 und 500000 Moleküle) zugegeben.

2.2.1. Reverse Transkription

Zur Umschreibung der RNA in cDNA kann der "First-Strand cDNA Synthesis Kit" (Pharmacia) eingesetzt werden.

Reaktionsbedingungen

5 ìg RNA mit H₂

O auf 20 ìl auffüllen,
10 min bei 65°C inkubieren, danach schnell auf Eis,
1 ìl DTT,
1 ìl Random Primer,
11 ìl "bulk" hinzufügen,
1 Stunde bei 37°C inkubieren,
5 min bei 90°C inaktivieren, danach schnell auf Eis.

2.2.2. Quantifizierung der LPFK-2-cDNA

Vorwärts-Primer: AAAGAGGGAGCTGGAGATAATCTGT
Rückwärts-Primer: Bio-GGCTGAGATACTTATGGACATCCTT
Mit diesen Primern werden parallel drei PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 2.1.1., aber
Template: 5 µl cDNA aus 2.2.1.
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 2.1.1.
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und der LPFK-2 cDNA.

2.3. Quantitative Analyse der RT/PCR-Produkte 2.3.1. Entfernen der Primer

Die Entfernung der Primer erfolgt durch eine geeignete Methode, z. B. Zugabe von Exonuklease I und Shrimp-Alkalischer-Phosphatase (beide von Amersham-Pharmacia).

Reaktionsbedingungen

Zu 15 µl RT/PCR-Produkt werden 1 U Alkalische Phosphatase und 10 U Exonuklease I zugegeben, 15 Minuten bei 37°C und danach 15 Minuten bei 85°C inkubiert.

2.3.2. Verkürzung der PCR-Produkte

Die am Rückwärtsprimer biotinylierten PCR-Produkte (Gemisch von Amplifikaten von Competitor und LPFK-2-cDNA) werden mittels Alw 21I (MBI Fermentas) an Position 495 der DNA gespalten.

Reaktionsansatz

50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer O+
4 µl ddH₂

O
1 µl Alw 21I (10 U)

Reaktionsbedingungen

Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.

2.3.3. Immobilisierung der biotinylierten Restriktionsfragmente

Die Immobilisierung der Restriktionsfragmente von 2.3.2. erfolgt durch Bindung an Streptavidin-markierte super-paramagnetische Partikel.

Reaktionsbedingungen

Nach Waschen der super-paramagnetischen Partikel Zugabe des Reaktionsansatzes aus 2.3.2.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser,
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 2.3.2. durch Magnetseparation,
Waschen mit deionisiertem Wasser. Aufnehmen der super-paramagnetischen Partikel in 5 µl deionisiertem Wasser.

2.3.5. Bestimmung des Verhältnisses der PCR-Produkte von Competitor und LPFK-2 der Ratte durch MALDI-TOF-Analyse

1 µl der aufgenommenen super-paramagnetischen Partikel aus 1.3.3. werden mit 1 µl Matrix (50 mg/ml 3-Hydroxy-Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhydrogencitrat) gemischt, auf ein MALDI-Target gebracht und getrocknet. Durch den Laser werden nur die nicht-biotinylierten Einzelstränge verdampft.

Die beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI hinsichtlich ihrer absoluten Massen analysiert (und damit eindeutig identifiziert). Aus dem Verhältnis der durch Integration ermittelten Peakflächen von Competitor-DNA-Strang und LPFK-2-DNA-Strang kann auf das Verhältnis der RNA-Templatemoleküle von Competitor und LPFK-2-mRNA geschlossen werden. Da die Menge Competitor bekannt ist, kann so die Menge LPFK-2- mRNA berechnet werden.

3. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von viraler DNA am Beispiel der DNA des Hepatitis B Virus 3.1. Synthese des homologen Competitors

Vorwärts-Primer: TTGCCTTCTGACTTCTTTCC
Rückwärts-Primer: TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT
Gesamtlänge des Fragments: 441 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Vorwärtsprimer:
Austausch A/T: TTGCCTTCTGACTTCTTTCC-TTCAGTTCGAGATC
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine PCR unter Verwendung von Hepatitis B-Virus oder Virus-DNA als Template durchgeführt.

Reaktionsbedingungen

Ansatzvolumen: 50 µl
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nMol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µMol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg Hepatitis B-Virus DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)

Temperaturprofil

initiale Denaturierung: 3 min 95°C
Zyklen: 35
Denaturierung: 30 s 95°C
Annealing: 30 s 48°C
Extension: 45 s 72°C
Final Extension: 10 min 72°C.

3.2. Competitive PCR 3.2.1. Quantifizierung von Hepatitis B-Virus-DNA

Vorwärts-Primer: Bio-TTGCCTTCTGACTTCTTTCC
Rückwärts-Primer: TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT
Mit diesen Primern werden parallel drei PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 3.1., aber
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem Hepatitis B-Virus-Gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle),
1 µl Probe (geschätzter Hepatitis B-Viren-Gehalt 1000 Viren/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt,
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 3.1.
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und der Hepatitis B-Virus-DNA.

3.3. Quantitative Analyse der PCR-Produkte 3.3.1. Entfernen der Primer

Die Entfernung der Primer erfolgt durch eine geeignete Methode, z. B. QIAquick-PCR clean-up-Kit oder Ethanolfällung.

3.3.2. Verkürzung der PCR-Produkte

Die am Vorwärtsprimer biotinylierten PCR-Produkte (Gemisch von Amplifikaten von Competitor und Hepatitis B-Virus DNA) werden mittels Bgl II (MBI Fermentas) an Position 30 der DNA gespalten.

Reaktionsansatz

50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer 0+
4 µl ddH₂

O
1 µl Bgl II (10 U)

Reaktionsbedingungen

Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.

3.3.3. Immobilisierung der biotinylierten Restriktionsfragmente

Die Immobilisierung der Restriktionsfragmente von 3.3.2. erfolgt durch Bindung an Streptavidin-markierte super-paramagnetische Partikel.

Reaktionsbedingungen

Nach Waschen der super-paramagnetischen Partikel Zugabe des Reaktionsansatzes aus 3.3.2.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser,
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 3.3.2. durch Magnetseparation,
Waschen mit deionisiertem Wasser.

3.3.4. Trennung der Einzelstränge

Durch Zugabe von 10%igem NH₄OH werden DNA-Einzelstränge gewonnen.

Reaktionsbedingungen

gebundene Restriktionsfragmente aus 3.3.2.,
Zugabe von 100 µl 10%iges NH₄

OH,
vorsichtig mischen,
5 min Inkubation bei Raumtemperatur.

Der Überstand enthält die nicht-biotinylierten DNA-Einzelstränge von Competitor- und Hepatitis B-Virus-Amplifikatfragmenten.
Entfernen des Ammoniaks durch Inkubation bei 80°C.
Einengung des Volumens durch Gefriertrocknung auf 3-5 µl.

3.3.5. Bestimmung des Verhältnisses der PCR-Produkte von Competitor und Hepatitis B- Virus-DNA durch MALDI-TOF-Analyse

1 µl des eingeengten Überstandes aus 3.3.4. werden mit 1 µl Matrix (50 mg/ml 3- Hydroxy-Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhydrogencitrat) gemischt, auf ein MALDI- Target gebracht und getrocknet.

Die absoluten Massen der beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI-TOF Massenspektrometer ermittelt und dadurch die Identität der PCR-Produkte überprüft. Aus dem Verhältnis der durch Integration ermittelten Peakflächen von Competitor-DNA- Strang und Hepatitis B-Virus-DNA-Strang kann auf das Verhältnis der DNA- Templatemoleküle von Competitor und Hepatitis B-Virus-DNA geschlossen werden. Da die Menge Competitor bekannt ist, kann so die Menge Hepatitis B-Virus-DNA berechnet werden.

4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Archaea-DNA am Beispiel der DNA des Methanol-Dehydrogenase (MDH)-Gens des Archaeas Methylobacterium organophilum 4.1. Synthese des homologen Competitors

Vorwärts-Primer: GCGGCACCAACTGGGGCTGGT
Rückwärts-Primer: GGGCAGCATGAAGGGCTCCC
Gesamtlänge des Fragments: 557 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärtsprimer:
Austausch G/C: GGGCAGCATGAAGGGCTCCC-AATCCATCCAGATGTG
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine PCR unter Verwendung von M. organophilum-DNA oder -Zellen als Template durchgeführt.

Reaktionsbedingungen

Ansatzvolumen: 50 µl
Primerkonzentration: je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nMol/Ansatz
Magnesiumchlorid: je 0,1 µMol/Ansatz
Puffer: 5 µl 10 × Taq-Puffer
Template: 10 pg S. mutans DNA
Taq-Polymerase: 1,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems)

Temperaturprofil

4.2. Competitive PCR 4.2.1. Quantifizierung von M. organophilum

Vorwärts-Primer: GCGGCACCAACTGGGGCTGGT
Rückwärts-Primer: Bio-GGGCAGCATGAAGGGCTCCC

Mit diesen Primern werden parallel drei PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 4.1., aber
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem M. organophilum-Gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle),
1 µl Probe (geschätzter M. organophilum-Gehalt 1000 Zellen/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt,
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 4.1.
Produkt: Gemisch von Amplifikaten des Competitors und des M. organophilum MDH- Gens.

4.3. Quantitative Analyse der PCR-Produkte 4.3.1. Entfernen der Primer

4.3.2. Verkürzung der PCR-Produkte

Die am Rückwärtsprimer biotinylierten PCR-Produkte (Gemisch von Amplifikaten von Competitor und M. organophilum MDH-Gen) werden mittels Sap I (New England Biolabs) an Position 550 der DNA gespalten.

Reaktionsansatz

50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × NEBuffer 4
4 µl ddH₂

O
1 µl Sap I (3 U)

Reaktionsbedingungen

Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.

4.3.3. Immobilisierung der biotinylierten Restriktionsfragmente

Die Immobilisierung der Restriktionsfragmente von 4.3.2. erfolgt durch Bindung an Streptavidin-markierte super-paramagnetische Partikel.

Reaktionsbedingungen

Nach Waschen der super-paramagnetischen Partikel Zugabe des Reaktionsansatzes aus 4.3.2.
Zugabe von 50 µl deionisiertem Wasser,
Abtrennung der biotinylierten Restriktionsfragmente aus 4.3.2. durch Magnetseparation,
Waschen mit deionisiertem Wasser.

4.3.4. Trennung der Einzelstränge

Durch Zugabe von 10%igem NH₄OH werden DNA-Einzelstränge gewonnen.

Reaktionsbedingungen

gebundene Restriktionsfragmente aus 4.3.2.
Zugabe von 100 µl 10%iges NH₄

OH,
vorsichtig mischen,
5 min Inkubation bei Raumtemperatur.

Der Überstand enthält die nicht-biotinylierten DNA-Einzelstränge von Competitor- und M. organophilum-Amplifikatfragmenten.
Entfernen des Ammoniaks durch Inkubation bei 80°C.
Einengung des Volumens durch Gefriertrocknung auf 3-5 µl.

4.3.5. Bestimmung des Verhältnisses der PCR-Produkte von Competitor und M. organophilum durch MALDI-TOF-Analyse

1 µl des eingeengten Überstandes aus 4.3.4. werden mit 1 µl Matrix (50 mg/ml 3- Hydroxy-Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhydrogencitrat) gemischt, auf ein MALDI- Target gebracht und getrocknet.

Die absoluten Massen der beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI-TOF Massenspektrometer ermittelt und dadurch die Identität der PCR-Produkte überprüft. Aus dem Verhältnis der durch Integration ermittelten Peakflächen von Competitor-DNA- Strang und M. organophilum-DNA-Strang kann auf das Verhältnis der DNA- Templatemoleküle von Competitor und M. organophilum DNA geschlossen werden. Da die Menge Competitor bekannt ist, kann so die Menge M. organophilum DNA berechnet werden. Da bekannt ist, daß M. organophilum 1 Kopie des MDH-Gens im Genom enthält, kann die Zahl der M. organophilum-Zellen ebenfalls berechnet werden.

5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung eukaryotischer DNA am Beispiel der DNA des 18S rRNA-Gens des Protozoons Pneumocystis carinii 5.1. Synthese des homologen Competitors

Vorwärts-Primer: CCAGATTAGCTTTTGCTGATCGCGGG
Rückwärts-Primer: ACTTTCCAGTAATAGGCTTATCG
Gesamtlänge des Fragments: 379 bp
Primer für Competitorsynthese = modifizierter Rückwärtsprimer:
Austausch G/C: ACTTTCCAGTAATAGGCTTATCG-TTGCGAATAACCCATC
(fett gedruckt: ausgetauschte Base)
Mit dem Primer für Competitorsynthese und dem Vorwärtsprimer wird eine PCR unter Verwendung von P. carinii-DNA oder -Zellen als Template durchgeführt.

Reaktionsbedingungen

Temperaturprofil

5.2. Competitive PCR 5.2.1. Quantifizierung von P. carinii

Vorwärts-Primer: CCAGATTAGCTTTTGCTGATCGCGGG
Rückwärts-Primer 5'-seitig kovalent an MALDI-Target gebunden:
MALDI-Target-ACTTTCCAGTAATAGGCTTATCG
Mit diesen Primern werden parallel drei Festphasen-PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 5.1., aber
Template: Competitor (Menge je nach erwartetem P. carinii-Gehalt der Probe, z. B. 500 Moleküle), kein Rückwärtsprimer zugegeben.
1 µl Probe (geschätzter P. carinii-gehalt 1000 Zellen/µl, 1 µl Probe (1 : 10 in sterilem, dejonisierten Wasser verdünnt), 1 µl Probe (1 : 100 in sterilem, deionisierten Wasser verdünnt,
Thermocycler, Temperaturprofil und Zyklen wie unter 1.1.
Produkt: Gemisch von an MALDI-Target gebundenen Amplifikaten des Competitors und des P. carinii 18S rRNA-Gens.

5.3. Quantitative Analyse der PCR-Produkte 5.3.1. Verkürzung der PCR-Produkte

Die über den Rückwärtsprimer immobilisierten PCR-Produkte (Gemisch von Amplifikaten von Competitor und P. carinii 18S rRNA-Gen) werden mittels BpiI (MBI Fermentas) an Position 327 der DNA gespalten.

Reaktionsansatz

50 µl Gesamtvolumen
40 µl des PCR-Produkts
5 µl 10 × Puffer G+
4 µl ddH₂

O
1 µl Bbs I (10 U)

Reaktionsbedingungen

Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C für 3 Stunden.

5.3.2. Bestimmung des Verhältnisses der PCR-Produkte von Competitor und P. carinii durch MALDI-TOF-Analyse

Nach Waschen des MALDI-Targets und Trocknen wird auf die Spots, die immobilisierte Amplifikatfragmente tragen 1 µl Matrix (50 mg/ml 3- Hydroxy-Picolinsäure, 10 mg/ml Diammoniumhydrogencitrat) gegeben und getrocknet. Durch den Laser werden nur die nicht am Target immobilisierten DNA-Stränge abgelöst.

Die absoluten Massen der beiden DNA-Molekülspezies werden im MALDI-TOF Massenspektrometer ermittelt und dadurch die Identität der PCR-Produkte überprüft. Aus dem Verhältnis der durch Integration ermittelten Peakflächen von Competitor-DNA- Strang und P. carinii-DNA-Strang kann auf das Verhältnis der DNA-Templatemoleküle von Competitor und P. carinii DNA geschlossen werden. Da die Menge Competitor bekannt ist, kann so die Menge P. carinii DNA berechnet werden. Da die Anzahl Kopien des 18S rRNA-Gens im Genom von P. carinii bekannt ist, kann die Zahl der P. carinii- Zellen ebenfalls berechnet werden.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die an für einen spezifischen Nachweis der jeweiligen Nukleinsäure geeignete Teilsequenzen binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusammensetzungs gleiche Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA aufweist, enthält, die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion erzeugt wurde,
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält,
der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterwor fen wird
und die Einzelstränge der beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor unmittelbar oder nach Behandlung mit an sich bekannten Methoden der Spaltung von DNA,
hinsichtlich ihrer Masse und ihrer Menge mit einer geeigneten Methode analysiert werden, so dass
aus ihren Massen ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und aus ihrem Mengenverhältnis und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der Nukleinsäuregehalt der Probe ermittelt wird.

2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, von denen einer über sein 5'-Ende entweder an eine Unterlage gebunden wurde oder an eine Unterlage gebunden werden kann, und die an für einen spezifischen Nachweis der jeweiligen Nukleinsäure geeignete Teilsequenzen binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusammensetzungsgleiche Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA aufweist, enthält,
die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vorwärts- und Rückwärtsprimer erzeugten DNA als Template, von Vorwärts- (oder Rückwärts-)Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5-Ende die Sequenz des Rückwärts- (Vorwärts-)Primers trägt, jedoch nach 3' complementär zum Template verlängert wird und am 5'-Ende der Verlängerung einen Basenaustausch enthält, erzeugt wurde,
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält,
der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterwor fen wird
und die beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor entweder
unmittelbar oder nach Bindung der Amplifikate an einen geeigneten Träger
mit einem geeigneten Restriktionsenzym, das 3'-seitig vom Basenaustausch, maximal im Abstand von 50 Basen vom 5'-Ende des Primers spaltet, in dessen Nachbarschaft sich die den Competitor auszeichnende Strukturabweichung von der Proben-Nukleinsäuresequenz befindet, verdaut werden
und danach die DNA-Einzelstränge von Proben- und Competitor-Amplifikatfragment, die komplementär zu den den immobilisierten Primer tragenden DNA-Strängen sind, hinsichtlich ihrer Masse und ihrer Menge mittels Matrix-assisted-laser-desorption-ionization-time-of-flight- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) analysiert werden, so dass
aus ihren Massen ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und aus ihrem Mengenverhältnis und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der Nukleinsäuregehalt der Probe ermittelt wird.

3. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, von denen einer entweder 5'-biotinyliert oder 5'-seitig über einen Spacer kovalent an eine Unterlage gebunden wurde, und die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermittelnde, für einen spezifischen Nach weis der jeweiligen Nukleinsäure geeignete Teilsequenzen binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusammensetzungs gleiche Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA (ein-Basen- Austausch zwischen beiden DNA-Strängen) aufweist, enthält,
die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vorwärts- und Rückwärtsprimer erzeugten DNA als Template, von Vorwärts- (oder Rückwärts-)Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rückwärts- (Vorwärts-)Primers trägt, jedoch nach 3' um etwa 10-20 Basen complementär zum Template verlängert wird und bei dem am 5'-Ende der Verlängerung wenige, typischerweise nur eine Base, zu ihrem Complement verändert wird, erzeugt wurde
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält,
der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterwor fen wird
und die beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor entweder
unmittelbar (bei kovalent immobilisiertem Primer) oder
nach Entfernung überschüssiger Primer und Bindung der Amplifikate an Streptavidin-beschichte te super-paramagnetische Partikel
mit einem geeigneten Restriktionsenzym, das 3'-seitig vom Basenaustausch, maximal im Abstand von 50 Basen vom 5'-Ende des Primers spaltet, in dessen Nachbarschaft sich der Einzelbasen austausch befindet, verdaut werden
und danach die Masse der DNA-Einzelstränge von Proben- und Competitor-Amplifikatfragment, die komplementär zu den den den immobilisierten Primer tragenden DNA-Strängen sind,
mit einer massenspektrometrischen Methode bestimmt wird
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der Nukleinsäuregehalt der Probe ermittelt wird.

4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren einer Gruppe von Spezies, nach Ansprüchen 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
in einen Ansatz einer competitiven quantitativen PCR gegeben wird, der Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, von denen einer entweder 5'-biotinyliert oder 5'-seitig über einen Spacer kovalent an eine Unterlage gebunden wurde, und die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermittelnde, für eine Gruppe von Spezies spezifische Teilsequenzen, binden
und der eine definierte Menge einer zum Proben-Amplifikat masse- und basenzusammensetzungs gleiche Competitor-DNA, die nur einen minimalen Unterschied zur Proben-DNA aufweist, enthält,
die in einer vorangegangenen PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vorwärts- und Rückwärtsprimer unter Verwendung der DNA eines typischen Vertreters der Speziesgruppe erzeugten DNA als Template, von Vorwärts- (oder Rückwärts-)Primer und einem Primer für Competitorsynthese, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rückwärts- (Vorwärts-)Primers trägt, jedoch nach 3' um etwa 10-20 Basen complementär zum Template verlängert wird und bei dem am 5'-Ende der Verlängerung wenige, typischerweise nur eine Base, zu ihrem Complement verändert wird, erzeugt wurde
und der an sich bekannte, für die PCR erforderliche Hilfs- und Nebenstoffe enthält,
der Ansatz einschließlich der biologischen Probe wiederholt einem Temperaturregime unterwor fen wird
und die beiden entstandenen Amplifikationsprodukte von Probennukleinsäure und Competitor entweder
unmittelbar (bei kovalent immobilisiertem Primer) oder
nach Entfernung überschüssiger Primer und Bindung der Amplifikate an Streptavidin-beschichte te super-paramagnetische Partikel
mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut werden
und danach die Masse der DNA-Einzelstränge von Proben- und Competitor-Amplifikatfragment, die komplementär zu den den den immobilisierten Primer tragenden DNA-Strängen sind,
mittels MALDI-TOF bestimmt wird
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge, der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards und der mittleren Kopienzahl der DNA pro Zelle die Summe der Zellen aller Vertreter der Speziesgruppe in der Probe ermittelt wird.

5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren einer Spezies, nach Ansprüchen 1, 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird,
der Ansatz der competitiven quantitativen PCR Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermittelnde, für eine Spezies (Tier-, Pflanzen-, Pilz-, Bakterien-, Archeae-, Virus-Spezies oder Zelllinie von Tumoren, Lymphozyten, Stammzellen o. ä.), spezifische DNA-Sequenz, binden
und bei der nach Massenbestimmung der DNA-Einzelstränge der Amplifikate von Probe und Competitor
ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge, der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards und der Kopienzahl der DNA pro Zelle die Zellzahl der Spezies in der Probe ermittelt wird.

6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von DNA, nach Ansprüchen 1, 2, 3, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird, aus der mit an sich bekannten Methoden DNA (je nach Methode Gesamt-DNA, chromosomale DNA, Plasmid-DNA, mitochondriale DNA oder Chloroplasten-DNA) isoliert wird,
der Ansatz der competitiven quantitativen PCR Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält, die an entweder bekannte oder vorher mit Hilfe an sich bekannter Methoden zu ermittelnde, für die zu bestimmende DNA spezifische Teilsequenz, binden
und bei der nach Massenbestimmung der DNA-Einzelstränge der Amplifikate von Probe und Competitor
ihre Identität zweifelsfrei bestimmt
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge und der bekannten Menge des zum PCR-Ansatz zugegebenen Standards der DNA-Gehalt der Probe ermittelt wird.

7. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von RNA, nach Ansprüchen 1, 2, 3, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass
eine biologische Probe entnommen wird, aus der
nach Zugabe einer definierten Menge einer mittels in vitro-Transkription synthetisierten, zur Proben-RNA nur durch ein-Basen-Austausch unterschiedlichen, in einer vorangegangenen RT- PCR-Reaktion unter Verwendung von einer mit Vorwärts- und Rückwärtsprimer erzeugten cDNA als Template, Vorwärts-(oder Rückwärts-)Primer und einem Primer für Competitorsyn these, der an seinem 5'-Ende die Sequenz des Rückwärts-(Vorwärts-)Primers trägt, jedoch nach 3' um etwa 10-20 Basen complementär zum Template verlängert wird und bei dem am 5'-Ende der Verlängerung nur eine Base, zu ihrem Complement verändert wird, erzeugten RNA-Competi tors, mit an sich bekannten Methoden RNA (je nach Methode Gesamt-RNA oder mRNA) isoliert wird,
eine competitive PCR unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimer durchgeführt wird und bei der nach Massenbestimmung der DNA-Einzelstränge der Amplifikate von Probe und Competitor
die Identität der RNA zweifelsfrei bestimmt
und anschließend aus dem Verhältnis der Peakflächen der beiden DNA-Einzelstränge und der bekannten Menge des zum RT-PCR-Ansatz zugegebenen RNA-Standards der RNA-Gehalt der Probe ermittelt wird.