DE10112387A1 - Massenspektrometrische Genotypisierung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen für die massenspektroskopische Messung einer größeren Anzahl von Genotypierungsprofilen, die jeweils durch einige zehn bis einige hundert SNPs (Single Nucleotide Polymorphismus) in einer DNA-Probe gegeben sind, und für die entsprechende Probenvorbereitung. DOLLAR A Gegenstand der Erfindung ist eine Anordnung für die einfache, synchrone Prozessierung von Chips, die Felder mit oberflächengebundenen Oligonucleotidsonden für Mutationen tragen und jeweils das genotypische Profil der Analysenaufgabe repräsentieren. Die Chips werden so auf Platten angebracht, dass sie einerseits in ein Raster von Gefäßen mit zu analysierenden DNA-Proben eingetaucht und dort prozessiert werden können, und andererseits direkt als Probenträger im Massenspektrometer dienen können. Das Raster der Gefäße kann beispielsweise in der Form von Mikrotiterplatten gegeben sein. DOLLAR A In einer besonderen Ausführungsform können Primer verwendet werden, die einen photolytisch oder chemisch spaltbaren Linker besitzen, der ein Basenpaar überbrückt und weder die Hybridisierbarkeit noch die enzymatische Verlängerung verhindert. Durch Licht oder Chemikalien können von den mutationsspezifisch verlängerten Primern kurze Ketten mit nur vier bis sechs Nucleotiden Länge abgespalten werden, die sich hervorragend für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption und eine massenspektrometrische Analyse mit Flugzeitmassenspektrometer eignen.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen für die massenspektrometrische Messung einer größeren Anzahl von Genotypierungsprofilen, die jeweils durch einige Zehn bis einige Hundert SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) in einer DNA-Probe gegeben sind, und für die entsprechende Probenvorbereitung.

Gegenstand der Erfindung ist eine Anordnung für die einfache, synchrone Prozessierung von Chips, die Felder mit oberflächengebundenen Oligonucleotidsonden für Mutationen tragen und jeweils das genotypische Profil der Analysenaufgabe representieren. Die Chips werden so auf Platten angebracht, dass sie einerseits in ein Raster von Gefäßen mit zu analysierenden DNA- Proben eingetaucht und dort prozessiert werden können, und andererseits direkt als Probenträ­ ger im Massenspektrometer dienen können. Das Raster der Gefäße kann beispielsweise in der Form von Mikrotiterplatten gegeben sein.

In einer besonderen Ausführungsform können Primer verwendet werden, die einen photoly­ tisch oder chemisch spaltbaren Linker besitzen, der ein Basenpaar überbrückt und weder die Hybridisierbarkeit noch die enzymatische Verlängerung verhindert. Durch Licht oder Chemi­ kalien können von den mutationsspezifisch verlängerten Primern kurze Ketten mit nur vier bis sechs Nucleotiden Länge abgespalten werden, die sich hervorragend für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption und eine massenspektrometrische Analyse mit Flugzeitmas­ senspektrometern eignen.

Stand der Technik

Es besteht ein wachsender Bedarf für die einfache, schnelle und kostengünstige Erstellung von vorgegebenen Genotypisierungs-Profilen, die jeweils die Bestimmung von einigen Zehn bis einigen Hundert SNPs einer DNA-Probe umfassen.

Ein solches Profil kann beipielsweise die Identität eines Menschen oder Tieres betreffen, zum Nachweis einer Täterschaft oder zum Ausschluss von Unterschiebungen (etwa bei Zuchtpfer­ den, Rindern, Rassehunden oder Brieftauben). Mit etwa 50 SNPs kann ein Mensch anhand einer winzigen Probe an DNA eindeutig identifiziert werden. Ein solches Profil kann aber auch zum Nachweis der Abstammung dienen, etwa als Vaterschaftsnachweis oder für den Nachweis des Stammbaums eines Rindes.

Ein genotypisches Profil kann aber auch ganz vorrangig für die vorsorgende Erkennung von Krankheitsanlagen, beispielsweise die Neigung zur Thrombose, oder aber für eine individuali­ sierte Medikation (die "persönliche Pille") erstellt werden. Es ist vorauszusehen, dass die Messungen von solchen Genotyp-Profilen unter der Anforderung einer hohen Analysensicher­ heit in Zukunft eine überragende Rolle in der Medizin spielen wird. Die dabei zu fordernde hohe Analysensicherheit kann bisher nur von der Massenspektrometrie garantiert werden.

Grundlage dieser Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis von vielen konkreten mutativen Veränderungen der genomischen DNA in einem einzigen, einfachen Analysengang, wobei die Mutationsstellen an sich bekannt sind und für die Genotypisierungsaufgabe festlie­ gen. Bei den mutativen Sequenzveränderungen wird hier vor allem auf den einfachen Basen­ austausch ("Punktmutation") abgestellt, der in letzter Zeit unter der Abkürzung "SNP" (Single Nucleotide Polymorphism) bekannt geworden ist. Für den Menschen werden mindestens drei Millionen häufiger vorkommende SNPs vermutet, die den größten Teil der individuellen Unterschiede zwischen den Menschen charakterisieren und die genetischen Individualanlagen steuern.

Gewöhnlich wird für ein Genom ein "Wildtyp" definiert, der als mutationsfrei angesehen wird. Gemessen an der Häufigkeit von Mutationen, beispielsweise SNPs, und an der Gleichberechti­ gung von mutiertem Typ (Mutante) und Wildtyp ist die Definition des Wildtyps willkürlich oder zumindest rein zufällig.

Alle hier betrachtenen Mutationen der DNA erzeugen einen Unterschied der Masse eines DNA-Ausschnitts, das diese Mutation enthält, gegenüber der Masse des entsprechenden Aus­ schnitts des Wildtyps. Daher kann eine genaue Bestimmung der Masse eines DNA-Ausschnitts für eine Bestimmung einer Mutation herangezogen werden.

Massenspektrometrie ist eine sehr leistungsfähige Methode für die Massenbestimmung von Biomolekülen. Die Ionen können massenspektrometrisch, beispielsweise in Flugzeitmassen­ spektrometern mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), auf ihre Masse hin analysiert werden. Aber auch eine Ionisierung durch Elektrosprühen (ESI) kann angewendet werden, in der Regel dann mit Massenspektrometern anderer Art.

Mit Polymerase-Kettenreaktionen (PCR = polymerase chain reaction) können unter Verwen­ dung eines Paares von "Selektionsprimern", das sind Einzelstrang-Oligonucleotide mit einer Länge von etwa 20 Basen, in bekannter Weise ausgewählte doppelsträngige DNA-Produkte mit einer Mindestlänge von etwa 40 Basenpaaren hergestellt werden. Durch die Wahl der Sequenzen dieser beiden Selektionsprimer kann man die Mutationsstelle einschließen.

Das naheliegende Verfahren, für die Mutationsbestimmung einfach die Masse von PCR-ver­ vielfältigten DNA-Produkten massenspektrometrisch zu messen, hat sich als fast undurchführ­ bar herausgestellt, da sich eine präzise Massenbestimmung an DNA-Produkten mit mehr als 40 Basenpaaren Länge als praktisch unmöglich erwiesen hat. Die Gründe dafür sind unten ange­ geben.

Somit hat man nach Verfahren gesucht, die zu kürzeren DNA-Fragmenten führen. Es ist dafür zunächst das Verfahren der beschränkten, mutationsabhängigen Primerverlängerung entwickelt worden, das zu verlängerten Primern mit etwa 15 bis 25 Nucleotiden Länge führt, aus deren Masse die Art der Mutation bereits besser bestimmt werden kann. Weitere Verbesserungen bestehen in der Entfernung eines großen Teilstücks dieser verlängerten Primer, beispielsweise durch enzymatischen Verdau eines Teilstücks; auf Details werde hier nicht näher eingegangen.

Ein großer Fortschritt ist mit der Erfindung von photospaltbaren Linkem gelungen, dargestellt in Patentanmeldung DE 101 08 453.6. Die Linker werden in die Verlängerungsprimer einge­ baut, überbrücken dabei ein Nucleotid, stören weder die Hybridisierung noch die enzymatische Verlängerung, und lassen sich nach der Probenpräparation durch UV-Licht spalten. Es können damit kurze Spaltstücke von nur 4, 5 oder 6 Nucleotiden Länge gewinnen, die sich hervorra­ gend durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization) ionisieren lassen.

Das MALDI-Präparations- und Messverfahren besteht darin, dass zunächst die Analytmoleküle auf einem Probenträger in eine feste, UV-absorbierende Matrix, meist eine organische Säure, eingebettet werden. Der Probenträger wird in die Ionenquelle eines Massenspektrometers eingeführt. Durch einen kurzen Laserpuls von etwa 3 Nanosekunden Länge wird die Matrix ins Vakuum verdampft; das Analytmolekül wird dabei weitgehend, aber leider nicht völlig unfrag­ mentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit gleichzeitig entstehenden Matrixionen wird die Ionisation des Analytmoleküls erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen in der Ionenquelle auf unterschiedliche Geschwindigkeiten beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere. Die gemessene Flugzeit wird in die Masse der Ionen umge­ rechnet.

MALDI eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nucleinsäureketten ist schwieriger, sie gelingt nur für kurzkettige Nucleinsäuren ausreichend gut. Der Grund ist, dass für die Ionisation von Peptiden und Proteinen lediglich ein einziges Proton eingefangen werden muß, für Nucleinsäuren dagegen, die ein Poly-Anion mit einem vielfach negativ geladenen Zucker-Phosphatrückgrat bilden (pro Nucleotid eine negative Ladung), ist der Ionisationprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. Er gelingt nur für sehr kurze Ketten ausreichend gut, also beispielsweise für die Spaltprodukte der verlängerten Primer, wie sie durch die photospaltbaren Linker geschaffen werden können.

Es ist bekanntermaßen zweckmäßig, für die Analyse der Genotypisierungsprofile von DNA- Proben Chips zu verwenden, auf deren Oberfläche genügend viele verschiedenartige Verlänge­ rungsprimer als Sonden für die ausgesuchten SNPs des Genotypisierungsprofils örtlich ge­ trennt angebunden sind. In Verbindung mit der oben besprochenen Verwendung von spaltba­ ren Primern steht damit ein mächtiges Werkzeug für die massenspektrometrische Analyse von Genotypisierungsprofilen zur Verfügung.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein einfaches, sicheres und kostengünstiges Verfahren für die synchrone und schnelle Aufbereitung und massenspektrometrische Vermessung von vielen DNA-Proben für die Bestimmung vorgegebener Genotypisierungsprofile aus jeweils einigen Zehn bis einigen Hundert SNPs zu finden.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung besteht darin, für die Analyse von vielen Genotypisierungsprofilen viele durch eine verbindende Struktur gehaltene Chips gleichzeitig einer Probenvorbereitung in einem Raster von Prozessierungsgefäßen und anschließend gemeinsam einer massenspektrometri­ schen Analyse zuzuführen. Die Chips werden dafür durch die verbindende Struktur so gehal­ ten, dass sie dem Raster an Gefäßen mit DNA-Proben und auch der massenspektrometrischen Analyse als starre Einheit zugeführt werden können. Das Raster an Gefäßen kann beispielswei­ se eine Mikrotiterplatte sein.

Die verbindende Struktur kann dabei eine ebene Platte sein, die die Chips als Teilflächen enthält, und die auf die Prozessierungsgefäße, beispielsweise die Gefäße einer Mikrotiterplatte, dicht aufgedrückt werden, um bei Umdrehen der Struktur mit den Prozessierungsgefäßen mit der Flüssigkeit im Inneren der Gefäße in Berührung zu kommen.

Die verbindende Struktur ist aber vorzugsweise eine Platte, auf der die Chips fest auf kleinen Stielen oder Säulen sitzen, so dass die Chips nach Umdrehen dieser Chipträgerplatte gemein­ sam in die Gefäße, also beispielsweise in die Gefäße einer Mikrotiterplatte, eingetaucht werden können, wobei sie gleichzeitig die Gefäße verschließen können.

Beide Arten von Trägerplatten können - als solche oder mit jeweils ergänzenden Rahmen - in das Massenspektrometer eingeführt werden. Ein elektrisch leitender Überrahmen ist besonders für die Chipträgerplatte mit gestielten Chips notwendig, um für die Verwendung im Massen­ spektrometer die elektrischen Potentiallücken zwischen den Chips zu füllen und die Chips elektrisch zu kontaktieren. Für die Beschleunigung der durch gepulste Laserdesorptionen auf den Chips erzeugten Ionen ist es günstig, eine weite Ebene gleichen elektrischen Potentials zu haben.

Damit die Chips im Überrahmen gut für die massenspektrometrische Analyse positioniert werden und gut in einer Ebene liegen, ist es zweckmäßig, die Stiele der Chips elastisch zu machen und die Chips präzise so zu formen, dass sie formschlüssig in entsprechende Negativ­ formen des Überrahmens passen. Der Überrahmen wird dann die Chips seitlich und in Bezug auf die Ebene sehr genau justieren.

Die Chips tragen jeweils in einer Vielzahl von Feldgefachen die an der Oberfläche gebundenen Oligonucleotidsonden, die mit dem Chip der Prozessierung zugeführt und für die massenspek­ trometrische Analyse vorbereitet werden müssen. Eine bekannte Prozessierungsmethode ist die beschränkte, mutationsabhängige Primerverlängerung, wobei die Oligonucleotide nach Anlagerung von Templatsträngen, die die Mutation tragen, genau um ein Nucleotid enzymatisch verlängert werden. Das zur Verlängerung benutzte Nucleotid trägt dabei die Information über die Mutation. Sehr zweckmäßig tragen die Oligonucleotide einen spaltbaren Linker, nicht weit vom 3'-Ende entfernt, der nach dem Prozessieren gespalten werden kann und gleichmäßig kurze, beipielsweise nur 5 Nucleotide lange Spaltprodukte liefert, die die Mutationsinformation tragen und sich leicht massenspektrometrisch messen lassen.

Um die restlichen Unterschiede in der Höhenposition der Chips in der Potentialebene zu erkennen und auszugleichen, ist es zweckmäßig, Referenzsignale mit genau bekannter Masse im Spektrum jeden Gefachs der Chips zu haben. Diese bilden eine Hilfe für die Massenbestim­ mung, da sich die Flugzeiten von MALDI-Ionen mit wechselnden Abständen zur nächsten Beschleunigungselektrode gemeinsam verschieben. Diese Massenreferenzen können leicht bereits bei der Herstellung der Chips den einzelnen Gefachen beigegeben werden. Sie bestehen aus terminierend abgeschlossenen Referenzprimern mit ebenfalls spaltbaren Linkem. Diese werden nicht verlängert, liefern aber Spaltprodukte mit genau bekannten Massen. Bereits ein einziger solcher Referenzprimer in jedem Gefach erscheint ausreichend, besser sind aber zwei Referenzprimer pro Gefach, möglichst nahe an den Enden des Massenbereichs gelegen.

Es ist ein weiterer Erfindungsgedanke, für die Bestimmung eines Genotypisierungsprofils eine vorgefertigte Anwendungspackung bereitzustellen, in der sich zumindest die Chipträgerplatten mit Chips, die jeweils mit den Oligonucletidsonden für eine vollständige Genotypisierung belegt sind, und die dazu notwendigen Primerpaare film die Multiplex-PCR-Amplifikation der DNA-Probe zur Herstellung der Template befinden.

Es können in einer Packung aber auch zusätzlich die NTPs für den amplifizierenden PCR- Prozess, die Reinigungsmedien, die Mischung der terminierenden ddNTPs nebst den Daten der Massen der zu erwartetenden Spaltstücke in jedem Gefach auf einem computerlesbaren Medium vorhanden sein. Es kann sogar ein ausführbares Computerprogramm beigegeben werden, das aus den gemessenen Genotypisierungs-Profilen die medizinisch, züchterisch oder sonst relevanten Ergebnisse nach dem jeweils letzten Stand der Erkenntnis berechnet. Es können des weiteren auch die günstigsten Polymerasen für die primäre PCR-Amplifizierung der Template und für die Primerverlängerung sowie gereinigte Matrixsubstanzen für die MALDI-Ionisierung beigegeben werden.

Für Eilanalysen kann es zweckmäßig sein, Chipträgerplatten mit kleineren Anzahlen an Chips zur Verfügung zu haben. Dadurch verkürzt sich die Messzeit im Massenspektrometer. So kann eine Trägerplatte mit nur 12 Chips bei einer Sekunde Messzeit pro Gefach in einer halben Stunde durchgemessen werden, während die Messung einer Trägerplatte mit 96 Chips vier Stunden dauert, was ohnehin nur mit modernsten Massenspektrometern möglich ist. Die Zeit der Probenvorbereitung verkürzt sich allerdings dadurch nur wenig.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 zeigt einen einzelnen Chip (stark vergrößert) mit den Feldgefachen, die die Oligonucleotidsonden für die Mutationen des Genotypisierungsprofils tragen. Der Chip hat eine Form, die leichtes Einführen und gute Justierung in einem Überrahmen gewährleistet.

Abb. 2 stellt eine erfindungsgemäße Chipträgerplatte dar. 96 Chips (1) befinden sich auf leicht elastischen Stielen (2), die sie in einem Raster auf der Basisplatte (3) halten. Das Raster entspricht dem Raster der Gefäße, in denen die Oligonucleotidsonden auf den Chips prozes­ siert werden sollen, hier dem Raster einer 96-Mikrotiterplatte.

Abb. 3 zeigt die Chipträgerplatte eingesetzt in einem elektrisch leitfähigen Überrahmen, der für die massenspektrometrische Analyse ein ebenes Potential und die Kontaktierung der Chips herstellt. Der Überrahmen kann Größe und Form einer Mikrotiterplatte haben.

Besonders günstige Ausführungsformen

Die analytische Aufgabe, die hier behandelt wird, ist die einfache, schnelle und kostengünstige Erstellung von vorgegebenen Genotypisierungs-Profilen aus einigen Zehn bis einigen Hundert SNPs je aus einer Anzahl von DNA-Proben.

Die Erfindung dient der synchronen Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Messung von vielen Genotypisierungsprofilen, die jeweils durch eine größere Anzahl von Mutationen, vorwiegend Punktmutationen, gegeben sind. Die Punktmutationen werden häufig als SNPs bezeichnet (SNP = Single Nucleotide Polymorphism).

Es werde hier besonders auf die erfindungsgemäße Chipträgerplatte eingegangen, die die Chips mit den Oligonucleotid-Gefachen auf Stielen trägt, so dass die Chips durch Umdrehen der Chipträgerplatte in die Gefäße einer Mikrotiterplatte eingetaucht werden können. Diese Beschränkung soll aber keine Einschränkung der Erfindungsgedanken sein.

Es werde hier ein Verfahren mit zugehörigen Vorrichtungen geschildert, das mit extrem hoher Analysensicherheit das genotypische Profil aus 288 SNPs einer DNA-Probe zeitsparend misst und einfach durchzuführen ist. Diese Anzahl von SNPs und die besonderen Einzelheiten des Verfahrens werden hier nur als Beispiel betrachtet, ein Umsetzen auf andere Anzahlen und leicht abgeänderte Verfahren wird dem Fachmann auf diesem Gebiet in Kenntnis dieser Erfin­ dung leicht fallen.

Dazu werde die DNA-Probe zunächst für eine Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR = polymerase chain reaction) vorbereitet, indem zusammen mit einer Lösung von Polymerase, der vier dNTPs (Desoxinucleosid-Triphosphate) und Puffern auch 288 Primerpaare hinzugege­ ben werden. Die Primerpaare sind so ausgewählt, dass sie alle den gleichen PCR-Bedingungen für eine erfolgreiche Amplifizierung genügen; für diese Auswahl gibt es heute erfolgreiche Computerprogramme. Je ein Primerpaar erzeugt dabei als PCR-Produkt ein DNA-Segment, das eine SNP-Mutationsstelle des genotypischen Profils umfasst. Das PCR-Produkt soll eine Länge von etwa 60 bis 100 Nucleotiden haben.

Die anschließende Amplifizierung durch die bekannten Thermozyklen der PCR liefert also für jede der ausgesuchten SNPs ein doppelsträngiges PCR-Produkt, das nicht weit von seiner Mitte entfernt die charakterisierende SNP-Stelle trägt. Von diesen PCR-Produkten sind nach der Amplifizierung jeweils viele Milliarden Stück vorhanden. Diese PCR-Produkte werden dann durch Waschen von allen Beimengungen gereinigt, beipielsweise adsorptiv an entspre­ chend aktivierte magnetische Kügelchen gebunden. Lösungen mit solchen magnetischen Kügelchen für die Reinigung von Oligonucleotiden sind kommerziell erhältlich. Anschließend an die Reinigungsschritte werden den dann abgelösten PCR-Produkten wiederum Polymerase, Puffer und NTPS für eine beschränkte Primerverlängerung zugegeben, wobei es sich bei den NTPs dieses Mal um terminierende Didesoxinucleosid-Triphosphate (ddNTPs) handelt, die bei ihrem Anbau an die Verlängerungsprimer jede weitere Verlängerung verhindern und damit die Verlängerung terminieren.

Alle diese Prozesse werden in so genannten Mikrotiterplatten (MTPs) durchgeführt. Sie haben beipielsweise 96 Einzelgefäße im Raster von neun Millimeter in einer weitgehend normierten Platte der Größe von ca. acht mal zwölf Zentimeter.

Diesen Gefäßen werden nun jeweils Chips zugeführt, die das Feld der Verlängerungsprimer tragen und auf denen die weitere Probenvorbereitung bis zur massenspektrometrischen Analyse abläuft.

In einer Ausführungsform sind die Chips etwa 3,5 mal 3,5 Millimter groß und tragen auf einem Feld von 3 mal 3 Millimeter insgesamt 144 Gefache. Jedes quadratische Gefach hat eine Kantenlänge von 200 Mikrometern; zwischen den Gefachen sind hydrophobe Stege von je 50 Mikrometer Breite. Auf jedem der neun Quadratmillimeter des Gesamtfeldes befinden sich somit 16 Gefache.

Jedes Gefach ist nun für je eine Multiplexanalyse für vier SNPs mit insgesamt je vier verschie­ denartigen Verlängerungsprimern belegt. Die Verlängerungsprimer sind so ausgewählt, dass sie jeweils mit ihrem 3'-Ende genau benachbart zu einer Mutationsstelle eines der aus den Doppel­ strang-Segmenten der PCR-Produkte gewonnenen DNA-Einzelstränge hybridisieren können. Dabei sind in unserem Falle jeweils zwei Verlängerungsprimer für eine Punktmutation des DNA Doppelstrangsegments vorgesehen: je einer für die beiden Einzelstränge. Durch diese beiden Primer wird jede Einzelmutation unabhängig voneinander zweimal gemessen; durch diese interne Kontrolle wird eine ungewöhnlich hohe Analysensicherheit auch ohne die sonst in der Medizin üblichen Doppelbestimmungen gewonnen. Damit ist mit den 144 Gefachen eines Chips die Analyse eines genotypischen Profils aus 288 SNPs mit sehr hoher Analysensicherheit möglich.

Diese Primer sind mit ihrem 5'-Ende über eine elastische Brücke an die Oberfläche der Chips gebunden. Sie sind gewöhnlich etwa 20 Nucleotide lang, tragen aber genau 4 Nucleotide von ihrem 3'-Ende entfernt einen spaltbaren Linker, der genau ein Nucleotid überbrückt und weder die Hybridisierung noch die enzymatische Verlängerung durch speziell angewendete Polymera­ se stört. Es werde hier ein photospaltbarer Linker eingesetzt, der durch UV-Licht spaltet, es kann sich aber verallgemeinernd auch um einen chemisch spaltbaren Linker handeln.

Die 96 Chips für die Analyse der Genotypisierungsprofile von 96 DNA-Proben aus einer Mikrotiterplatte sind in unserem Falle einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung auf einer Trägerplatte, die die Größe einer Mikrotiterplatte hat, mit kleinen Stielen befestigt. Die Säulen haben einen Abstand voneinander, der genau dem Raster der Gefäße auf der Mikrotiterplatte entspricht. Die 96 Chips können durch Umdrehen der Trägerplatte ohne Schwierigkeiten in die 96 Probelösungen eingetaucht und dort prozessiert werden. Dabei ist die Trägerplatte so geformt, dass sie die Gefäße der Mikrotiterplatte jeweils dicht verschließt. Die 96 Probelösungen enthalten insbesondere die mutationstragenden Template für die Hybri­ disierung an den Olegonucleotidsonden. Die Trägerplatte mit den 96 Chips auf den kleinen Säulen kann dann nach dem Prozessieren direkt als Probenplatte für das Massenspektrometer benutzt werden. Dabei kann ein metallischer oder metallisierter Rahmen benutzt werden, um damit um die Chips herum jeweils das notwendigerweise gleiche elektrische Beschleunigungs­ potential bereitzustellen.

Das Verfahren der Mutationsanalse mit photospaltbaren Primern ist in der Patentanmeldung BSAX 09/01 näher beschrieben.

Das Anbinden der als Mutationssonden dienenden Verlängerungsprimer an die Gefache des Feldes auf der Chipoberfläche bei der Herstellung der Chips kann auf mehrere bekannte Weisen geschehen, beispielsweise über eine Streptavidin-Biotin-Bindung, die sich bei Aufpi­ pettieren von Lösungen mit biotinylierten Primern auf eine mit Strepatividin belegte Oberfläche automatisch bildet.

Die spaltbaren Linker werden als Brücke zwischen zwei Nucleotiden in die Verängerungspri­ mer bei deren Herstellung eingebaut, sie müssen verhältnismäßig genau ein Nucleotid überbrü­ cken und für die Polymerase ähnlich wie ein Nucleotid aussehen. Als photospaltbare Linker können dabei insbesondere Bausteine aus der Verbindungsklasse der o-Nitrobenzyl-Derivate eingesetzt werden.

Vorzugsweise sind die Primer alle in demselben Abstand zum 3'-Ende spaltbar, da dann Spaltbruchstücke gleicher Länge (gezählt in Nucleotiden) entstehen, die eine praktisch gleiche MALDI-Empfindlichkeit besitzen und somit massenspektrometrische Signale gleicher Intensi­ tät ergeben. Die günstigste Länge der Spaltprodukte liegt bei fünf Nucleotiden, was eine spaltbare Brücke an der fünften Position vom 3'-Ende der unverlängerten Primer aus erfordert. Der Massenbereich für Spaltstücke aus fünf Nucleotiden liegt etwa bei 1600 bis 1800. Zur Summe der Massen der Nucleotide kommt die Masse des Spaltungsrests hinzu, den der Linker am Spaltprodukt hinterlässt.

Natürlich kann in jedem Gefach des Feldes auf dem Chip auch eine Multiplex-Analyse stattfin­ den. Dazu sind mehrere Arten von Verlängerungsprimern in einem gleichmäßigen Gemisch dort anzubinden. Die Verlängerungsprimer der SNPs sind dabei so auszuwählen, dass die Massenbereiche der einzelnen Spaltprodukte keine störende Überlappungen zeigen. Da jedes Spaltprodukt nur ein oder zwei Ionensignale liefert (nur je ein Signal für Homozygot A oder B, zwei Signale für den heterozygoten Fall), die sich über einen Massenbereich von 200 atomaren Masseneinheiten verteilen, ist diese Einschränkung nicht sehr schwerwiegend. Es sind durchaus Multiplexanalysen für 2 bis 10 SNPs in je einem Gefach machbar.

Das Massenspektrometer braucht keine hohe Massenauflösung zu besitzen. Eine Auflösung von etwa m/Δm = R = 600 ist ausreichend; das Isotopenmuster aus zwei oder drei Einzelsig­ nalen im Abstand von je einer Masseneinheit wird dabei nicht aufgelöst, sondern wirkungsvoll geglättet. Die so geglätteten Signale lassen durchaus eine Massenbestimmung auf eine oder zwei atomare Masseneinheiten zu. Das ist für die analytische Aufgabe ausreichend, da der Abstand der beiden homozygoten Signale, deren Masse es zu unterscheiden gilt, mindestens neun Masseneinheiten beträgt.

Es ist aber zweckmäßig, Referenzsignale mit genau bekannter Masse im Spektrum zu haben. Diese bilden eine Hilfe für die Massenbestimmung, da sich die Flugzeiten von MALDI-Ionen oft aus sehr verschiedenartigen Gründen gemeinsam verschieben. Diese Massenreferenzen können leicht bereits bei der Herstellung der Chips den einzelnen Gefachen beigegeben werden. Sie bestehen aus terminierend abgeschlossenen Referenzprimern mit ebenfalls spaltbaren Linkem. Diese werden nicht verlängert, liefern aber Spaltprodukte mit genau bekannten Massen. Bereits ein einziger solcher Referenzprimer in jedem Gefach erscheint ausreichend, besser sind aber zwei Referenzprimer pro Gefach, möglichst nahe an den Enden des Massenbe­ reichs gelegen.

Für die Herstellung der Chips reichen insgesamt vier Arten von Referenzprimern aus: besteht die Aussicht, dass ein Referenzprimer mit einem analytischen Signal in Kollision gerät, so kann an jedem Ende des Massenbereichs auf einen Ersatzreferenzprimer ausgewichen werden. Die Massen der zu erwarteten analytischen Signale sind ja im Vorhinein bekannt.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung befinden sich die Felder gemeinsam auf einer großen, ebenen Chip-Platte, die hier auch als Chipträgerplatte bezeichnet werden wird. Diese Chip-Platte wird mit der Seite, auf der sich die Felder befinden, auf die Mikrotiterplatte dicht aufgepresst. Durch Umdrehen dieser Sandwich-Einheit kommen die Felder mit den Lösungen in den Gefäßen in Berührung, die Primer können prozessiert werden.

Nach dem Verbringen der Chips in oder an die Gefäße mit den amplifizierten DNA-Segmenten beginnt nun die beschränkte Primerverlängerung. Durch die üblichen Temperaturzyklen eines PCR-Prozesses werden nunmehr die DNA-Einzelstränge an die Verlängerungsprimer gebun­ den, und die Verängerungsprimer werden durch die Arbeit einer Polymerase um genau ein Nucleotid verlängert. Mehrere Temperaturzyklen sichern dabei den Erfolg der Verlängerung, der sich in einem Zyklus oft nicht genügend zuverlässig einstellt. Da die Ausgangs-DNA als Kopiervorlage ("Templat") für die Verlängerung dient und die Verlängerungsprimer direkt benachbart zu einer Mutationsstelle hybridisieren, spiegelt dieses terminierende Nucleotid genau den Typ der Mutation wieder.

Nach der beschränkten Verlängerung der an die Chips angebundenen Verlängerungsprimer werden die Chips gewaschen und von allen Polymerasen, Puffern, ddNTPS und Templaten befreit. Dieses Waschen kann für alle Chips der Trägerplatte gemeinsam vorgenommen werden, da ja alle nunmehr verlängerten Primer fest an die Chips angebunden sind. Die Chips auf der Trägerplatte werden sodann getrocknet und einer UV-Bestrahlung ausgesetzt. Diese Bestrahlung spaltet die Linker; es werden die Enden der Primer frei. Diese nunmehr freien Spaltprodukte aber tragen die Information über die Mutationsstelle, und zwar messbar in ihrer Masse, da sich die verschiedenen Nucleotide um mindestens neun, höchstens 40 atomare Masseneinheiten unterscheiden. Die Massen dieser Spaltprodukte liegen zwischen etwa 1600 und 1800 atomaren Masseneinheiten. Für jedes SNP des Genotyp-Profils sind die Massen für Homozygot A und Homozygot B genau bekannt.

Diese freien Spaltprodukte werden durch Aufbringen einer Matrix-Lösung auf die einzelnen Gefache für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization) vorbereitet. Die für alle Gefache gleiche Matrixlö­ sung kann dabei durch Mikropipettierung aufgebracht werden, beipielsweise durch Piezo- oder Solenoid-Pipetten. Es kann die Matrixlösung aber auch als feiner Nebel aufgsprüht werden, wobei die hydrophoben Stege zwischen den Gefachen eine Vermischung der Proben verhin­ dern. Durch abschließendes Trocknen werden die Spaltprodukte in die sich bildenden Matrix­ kriställchen eingelagert und sind so für die massenspektrometrische Analyse vorbereitet.

Besteht die Trägerplatte aus Chips mit Säulen, so kann die Trägerplatte jetzt mit einem elekt­ risch leitendem Rahmen versehen werden, der die einzelnen Chips umschließt, sie kontaktiert, und zusammen mit den Chips eine ebene, elektrisch leitende Oberfläche bildet, die in der Laserdesorptionsmassenspektrometrie für ein gleichmäßiges Beschleunigungsfeld notwendig ist. Mit diesem Rahmen hat die Trägerplatte die Größe einer normalen Mikrotiterplatte. Sie läßt sich in ein Massenspektrometer, das für die Aufnahme von Probenträgerplatten in der Größe von Mikrotiterplatten geeignet ist, einbringen und analysieren.

Ist dagegen die Trägerplatte eine dünne Chip-Plaxte, so kann sie auf einen Rahmen aufgespannt werden, der sie auf eine für das Massenspektrometer geeignete Größe bringt.

Die DNA-Spaltstücke von nur fünf Nucleotiden Länge lassen sich durch MALDI sehr gut analysieren; man braucht für die Aufnahme eines guten Summenspektrums nur 10 Einzelspekt­ ren, erzeugt durch 10 Laserschüsse. Moderne Massenspektrometer arbeiten mit Desorptionsla­ sern, die eine Wiederholrate von 20 Hertz haben und weitgehend im Dauerbetrieb arbeiten können. Damit ist es möglich, Die Analysen der Proben in den Gefachen in je etwa einer Sekunde durchzuführen. Die Massenspektren werden dabei überhaupt nur im Massenbereich von etwa 1600 bis 1800 atomaren Masseneinheiten aufgenommen und sofort nach ihrer Summierung in einem Transientenrekorder an eine weiterverarbeitende Recheneinheit überge­ ben.

Trotz der schnellen Spektrennahme dauert die massenspektrometrische Analyse der 96 Chips mit je 144 Proben zu je vier gemultiplexten SNPs etwa vier Stunden. Zusammen mit der Probenvorbereitung, die etwa in zwei Stunden abgeschlossen sein kann, kann die Messung des genotypischen Profils in einer einzigen Schicht bewältigt werden. Die massenspektrometrische Messung lässt sich durch geringere Anzahlen von Gefachen auf einem Chip (Beispiel: 9 mal 9 = 81 Gefache statt 144 Gefache) bei höherem Multiplex-Grad erheblich beschleunigen. So bietet ein Chip mit 81 Gefachen und einer 8-fachen Multiplexanalyse in jedem Gefach 648 SNP-Messungen (oder 324 SNP-Messungen mit erhöhter Sicherheit durch zusätzliche Mes­ sung auf dem Gegenstrang), lässt sich aber in etwa 2,25 Stunden messen.

Für Eilanalysen ist das immer noch erheblich zu lange. Es ist daher zweckmäßig, für Eilanaly­ sen Chipträger mit nur wenigen Chips bereitzustellen, die sich zwar in der Probenvorbereitung nicht beschleunigt prozessieren lassen, aber die massenspektrometrische Messzeit erheblich verkürzen.

Die Analysenmethode eignet sich hervorragend dazu, aus gut geplanten Anwendungspackun­ gen heraus angewendet zu werden. Diese Anwendungspackungen müssen vor allem die Chipträger für ein bestimmtes Genotypisierungsprofil und die dazu notwendigen Primerpaare für die Multiplex-PCR-Amplifizierung der DNA-Ausgangsprobe enthalten.

Es können in einer Packung aber auch die zusätzlich benötigten Chemikalien, wie die NTPs für den amplifizierenden PCR-Prozess, die Reinigungsmedien, und die Mischung der terminieren­ den ddNTPs enthalten sein. Es können des weiteren auch die günstigsten Polymerasen für die primäre PCR-Amplifizierung der Template und für die Primerverlängerung sowie gereinigte Matrixsubstanzen für die MALDI-Ionisierung beigepackt werden.

Dazu können die Daten aller Massen der zu erwartetenden Spaltstücke für jeweils beide Allele in jedem Gefach auf einem computerlesbaren Medium beigegeben werden. Es kann sogar ein ausführbares Computerprogramm beigegeben werden, das aus den gemessenen Genotypisie­ rungs-Profilen die medizinisch, züchterisch oder sonst relevanten Ergebnisse nach dem jeweils letzten Stand der Erkenntnis berechnet. Dieses Programm kann beispielsweise sofort die erhöhte Gefährdung für Thrombose durch mutative Veränderung des Thrombose-Faktors V (Leiden-Allel) oder der anderen Thrombose-Faktoren und deren Zusammenwirken berechnen.

Schließlich ist es auch möglich, verschiedene Genotypisierungsprofile zu kombinieren. So kann ein Anfälligkeitsprofil für eine Krankheit mit einem Profil kombiniert werden, das einen genetischen Pass darstellt und so sicherstellt, dass Patientenproben verwechselt werden.

Claims (21)

1. Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von größeren Anzahlen von Genotypisie­ rungsprofilen durch Messungen von jeweils mehreren Mutationen auf jeweils einem Chip, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Chips auf einem Chipträger so zusammengefasst sind, dass sich die Chips ei­ nerseits einzeln in verschiedenen Gefäßen prozessieren und andererseits gemeinsam auf dem Chipträger massenspektrometrisch analysieren lassen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Chips jeweils gestielt auf einer Grundplatte des Chipträgers befinden und dabei so in einem Raster angeordnet sind, dass sie zum Prozessieren in ein Raster von Gefäßen eingetaucht werden können.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Raster von Gefäßen um eine Mikrotiterplatte handelt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Chipträ­ ger für die massenspektrometrische Messung mit einem metallischen Rahmen abgedeckt wird, der die Lücken zwischen den Chips ausfüllt und diese elektrisch kontaktiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Chips auf elastischen Stielen des Chipträgers befinden und eine Passform besitzen, so dass die Chips durch Ge­ genpassformen im Rahmen in Höhe und Abständen justiert für die massenspektrometri­ sche Analyse bereitstehen.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass alle Proben in den verschiedenen Gefachen eines Chips mit Amplifikationsprodukten einer ein­ zigen DNA-Probe zusammen prozessiert werden und bei der massenspektrometrischen A­ nalyse ein Genotypisierungsprofil dieser DNA-Probe liefern.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Prozessieren um eine beschränkte, mutationsabhängige Primerverlängerung von verschiedenartigen Primern handelt, die als Mutationssonden dienen und die sich jeweils oberflächengebunden in örtlich getrennten Gefachen des Feldes auf einem Chip befinden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer spaltbare Linker besitzen, dass diese Linker vor der massenspektrometrischen Analyse gespalten werden, und dass die Spaltstücke massenspektrometrisch analysiert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Linker drei, vier, oder fünf Nucleotide vom 3'-Ende entfernt befinden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um photospaltbare Linker handelt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben für die massenspektrometrische Analyse durch Laserdesorption ionisiert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Ionisierung um matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) handelt.

13. Chipträger für die massenspektrometrische Analyse von Genotypisierungsprofilen auf den einzelnen Chips, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Chips jeweils gestielt auf einer Grundplatte des Chipträgers befinden und da­ bei so in einem Raster angeordnet sind, dass sie zum Prozessieren in ein Raster von Gefä­ ßen eingetaucht werden können.

14. Chipträger nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Stiele elastisch sind und die Chips jeweils eine Passform haben, die in die Passformen eines Überrahmens passen.

15. Chipträger nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Chipraster dem Raster der Gefäße auf einer Mikrotiterplatte entspricht.

16. Chipträger nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Chip Felder mit oberflächengebundenen Primern als mutationsspezifische Sonden für eine mas­ senspektrometrische Analyse eines Genotypisierungsprofils enthält.

17. Chipträger nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer spaltbare Linker enthalten.

18. Chipträger nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass alle Chips des Chipträgers für das gleiche Genotypisierungsprofil vorbereitet sind.

19. Anwendungspaket, bestehend mindestens aus mehreren Chipträgern nach Anspruch 16 und den zugehörigen Mischungen an Primerpaa­ ren für die PCR-Amplifizierung der DNA-Proben als Vorbereitung für das weitere Pro­ zessieren der Chips für die Analyse des Genotypisierungsprofils.

20. Anwendungspaket nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es auch die Daten über die massenspektrometrisch vermessenen Endprodukte der Primer in den Gefachen und ihre Zuordnung zu den Allelen der Mutationen in computerlesbarer Form enthält.

21. Anwendungspaket nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es auch ein computerausführbares Programm enthält, dass die gemessenen Daten des Ge­ notypisierungsprofils für den Anwender so aufbereitet, dass die für ihn relevanten Aussa­ gen erhalten werden