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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenzierung eines RNA-Moleküls mit einer
Länge von
3 bis 30 Nukleotiden, insbesondere eines RNA-Oligonukleotids mittels
Massenspektrometrie, sowie die Verwendung eines derartigen Verfahrens.
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Einleitung
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Die
massenspektroskopische Analyse von RNA-Molekülen wird im Stand der Technik
insbesondere unter Verwendung eines der eigentlichen Massenspektrometrie
vorausgehenden enzymatischen Abbaus beschrieben. Dieser enzymatische
Abbau erfolgt unter Verwendung von Exonukleasen bzw. Endonukleasen
und ist von verschiedenen Autoren beschrieben worden (siehe z. B.
Tolsen et al., Nucleic Acid Res. 26, 1998, 446; Faulstich et al.,
Analytical Chemistry 69, 1997, 4349). Nachteilig an diesem Verfahren
ist, dass immer mehrere Enzyme zum Abbau des RNA-Moleküls verwendet
werden müssen,
um die gesamte Sequenz des Moleküls analysieren
zu können.
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Weiterhin
nachteilig ist, dass der Zeitpunkt des Abbruchs des enzymatischen
Verdaus genau gewählt werden
muss, da er stark von der Basenzusammensetzung des zu analysierenden
RNA-Moleküls
abhängt. Normalerweise
werden daher zu unterschiedlichen Zeiten Proben aus der Verdau-Lösung entnommen,
da es aufgrund der Enzymkinetik sehr selten ist, dass in einer zu
einem bestimmten Zeitpunkt entnommenen Lösung alle zur Sequenzierung
nötigen
Fragmente enthalten sind. Es müssen
also mehrere massenspektrometrische Messungen durchgeführt werden,
um eine Sequenz zu bestimmen.
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Hahner
et al. (Nucleic Acid Res 25, 1997, 1957 bis 1964) beschreibt ein
Verfahren zur massenspektroskopischen Analyse eines RNA-Moleküls mittels
alkalischer Hydrolyse und anschließender Massenspektrometrie.
Dieses Verfahren ist jedoch mit mehreren Nachteilen behaftet.
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Das
Verfahren nach Hahner et al. erlaubt nur die Sequenzierung des zu
untersuchenden RNA-Moleküls von einer
Seite des RNA-Moleküls.
Eine vollständige
Sequenzierung ist nicht möglich,
da unterhalb von ungefähr
1000 Da keine Signale mehr detektiert werden können. Sowohl die alkalische
Hydrolyse als auch der enzymatische Verdau des zu analysierenden
RNA-Moleküls
finden in Pufferlösungen
statt, die Hydroxide oder Detergenzien enthalten. Die direkte massenspektromerische
Analyse dieser Lösungen
führt zu
breiten Peaks mit einer geringen Massenauflösung. Die Massengenauigkeit
leidet darunter, so dass es schwierig ist die beiden Nukleotide
Uridin und Cytidin, die sich nur um 1 Da unterscheiden, eindeutig
zu identifizieren.
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Beschreibung der Erfindung
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Demgemäß liegt
der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde ein Verfahren bereitzustellen,
mittels dessen die Sequenzierung eines RNA-Moleküls unter Verwendung der Massenspektrometrie
erreicht werden kann, ohne dass die oben geschilderten Nachteile
auftreten.
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Dieses
Problem wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Sequenzierung
eines RNA-Moleküls, insbesondere
zur Sequenzierung eines RNA-Oligonukleotids mittels Massenspektrometrie
gelöst.
Ein derartiges Verfahren weist die folgenden Schritte auf:
- 1. Zunächst
wird ein RNA-Molekül
mit einer Länge
von 3 bis 30 Nukleotiden, beispielsweise in Form eines RNA-Oligonukleotids
bereitgestellt.
- 2. Dann wird das RNA-Molekül
einer sauren Hydrolyse unterworfen, so dass genau eine Phosphordiesterbindung
des RNA-Moleküls
gespalten wird.
- 3. Nach erfolgter saurer Hydrolyse wird die Sequenz des RNA-Moleküls massenspektrometrisch
bestimmt.
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Ein
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
sequenzierbares RNA-Molekül
weist als Basen Adenin, Cytosin, Guanin und/oder Uracil auf. Weiterhin
kann das zu sequenzierende RNA-Molekül auch weitere
Basen aufweisen oder modifizierte Basen (etwa methylierte Basen),
soweit sich diese weiteren Basen oder diese modifizierten Basen
in ihrer Masse ausreichend voneinander und ausreichend von den sonst
noch im RNA-Molekül
vorhandenen Basen unterscheiden, so dass sie massenspektrometrisch
unterschieden und identifiziert werden können. Somit können natürlich vorkommende
oder synthetische RNA-Moleküle,
insbesondere RNA-Oligonukleotide mit einer Länge von 6 Nukleotiden bis 22
Nukleotiden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sequenziert werden.
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Bevorzugterweise
wird das zu sequenzierende RNA-Molekül in einer Lösung bereitgestellt.
Vorteilhafterweise handelt es sich dabei um eine wässrige Lösung. Die
Konzentration des RNA-Moleküls
in der Lösung bzw.
der wässrigen
Lösung
beträgt
in einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens 15 μmol/l bis
25 μmol/l,
wobei eine Konzentration von 20 μmol/l
bevorzugt ist. Dabei werden in einer Ausführungsform des Verfahrens 1
pmol bis 1000 pmol, bevorzugt 100 pmol bis 500 pmol, besonders bevorzugt
200 pmol RNA eingesetzt.
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Die
saure Hydrolyse des RNA-Moleküls
wird vorteilhafter Weise mit einer starken Säure durchgeführt. Als
starke Säuren
kommen beispielsweise Ameisensäure,
Trifluoressigsäure
und Salzsäure
in Betracht, wobei Ameisensäure
und Trifluoressigsäure
bevorzugt sind, da sie kommerziell in hoher Reinheit erhältlich sind
und es bei ihrer Verwendung nicht zu einer Kontamination der Probe
mit Salzen oder anderen Verunreinigungen kommen kann.
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Es
sollte so viel Säure
zu der RNA-haltigen Probe zugegeben werden, dass der pH Wert der
Lösung zwischen
0 und 2 liegt. Bevorzugt für
die saure Hydrolyse ist ein pH Wert von < 2, besonders bevorzugt ist ein pH
Wert von 1,5 bis 1,8.
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Die
saure Hydrolyse kann bei unterschiedlichen Temperaturen und abhängig von
der gewählten
Temperatur für
eine unterschiedliche Dauer durchgeführt werden. Im Allgemeinen
sind Temperaturen von etwa 4°C bis
etwa 60°C
möglich,
wobei die jeweilige Inkubationszeit der Probe so eingestellt werden
muss, das die saure Hydrolyse zu der Spaltung jeweils nur einer
Phosphordiesterbindung in einem RNA-Molekül führt. Die Wahrscheinlichkeit
der sauren Hydrolyse ist für
jede Phosphordiesterbindung im RNA-Molekül gleich. Somit muss die saure
Hydrolyse zu einem Zeitpunkt abgebrochen werden, zu dem alle durch
saure Hydrolyse nur einer Phosphordiesterbindung pro Molekül möglicherweise
entstehenden Fragmente in gleicher Häufigkeit in der Lösung vorliegen.
Wird die saure Hydrolyse beispielsweise bei einer Temperatur von
60°C durchgeführt, so
kann die Reaktion schon nach etwa 2 Minuten abgebrochen werden.
Sofern die saure Hydrolyse bei einer Temperatur von 4°C durchgeführt wird,
so kann die nötige
Inkubationszeit 16 Stunden betragen. Ein Fachmann wird die Parameter
Temperatur und Inkubationslänge
mittels routinemäßiger Versuche
feststellen können.
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Nach
dem Beenden der sauren Hydrolyse, etwa durch Lager der Proben auf
Eis, kann die Reaktionslösung
oder ein Teil der Reaktionslösung
direkt zur massenspektroskopischen Sequenzbestimmung eingesetzt
werden, ohne dass ein weiterer Aufreinigungsschritt nötig wäre. In einer
bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Sequenzbestimmung
des RNA-Moleküls mittels
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation) Massenspektrometrie.
Dabei kann die Sequenzierung anhand eines einzelnen Spektrums sowohl
in 5' nach 3', als auch 3' nach 5' Richtung erfolgen.
Bevorzugterweise erfolgt die Sequenzierung in beiden Richtungen,
um eine vollständige
Sequenzierung bis auf die erste und letzte Base des RNA-Moleküls zu ermöglichen.
Außerdem
dient die Sequenzierung in beide Richtungen als interne Kontrolle
der Sequenzierung in der jeweils anderen Richtung.
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Die
massenspektroskopische Analyse des RNA-Moleküls erfolgt mit den aus der
sauren Hydrolyse erhaltenen RNA-Fragmenten in Verbindung mit einer
Matrix. Als Matrix eignen sich alle für MALDI bekannter Weise verwendbaren
Matrixverbindungen, beispielsweise 3-Hydroxy-Picolinsäure (HPA), 6-Aza-2-Thiothymin (ATT)
und 2,4,6-Trihydroxyacetophenon. 6-Aza-2-Thiothymin (ATT) hat sich
für diese
Sequenzierung von RNA-Molekülen,
insbesondere von RNA-Oligonukleotiden als besonders vorteilhaft
erwiesen.
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Die
Durchführung
der MALDI Massenspektrometrie führt
für jede
detektierbare Masse (m/z) zu einem bestimmten Intensitätswert.
In einem Graphen, der die Intensität über die Masse (m/z) zeigt,
ergeben sich somit so genannte Massenpeaks, bei denen die gemessene
Signalintensität
ein lokales Maximum erreicht. Um die Sequenz des RNA-Moleküls zu bestimmen,
wird für
jeweils zwei derartiger Massenpeaks, die einander benachbart sind,
die Massendifferenz ermittelt. Aus dieser Massendifferenz kann auf
die Base an einer bestimmten Position des RNA-Moleküls bzw.
auf das Nukleotid geschlossen werden.
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Das
der Erfindung zugrunde liegende Problem wird auch durch die Verwendung
eines oben beschriebenen Verfahrens zur Sequenzierung eines RNA-Moleküls mit einer
Länge von
3 bis 30 Nukleotiden, insbesondere zur Sequenzierung eines RNA-Oligonukleotids
mittels Massenspektrometrie gelöst.
Insofern wird zur Beschreibung der erfindungsgemäßen Verwendung auf die obige
Beschreibung des Verfahrens verwiesen.
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Das
beschriebene Verfahren und die Verwendung dieses Verfahrens eignen
sich insbesondere zur Qualitätskontrolle
für synthetisch
hergestellte RNA-Moleküle,
insbesondere für
siRNA Moleküle,
antisense Moleküle
und miRNA-Moleküle.
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Die
Erfindung wird nun anhand der Figuren näher beschrieben. Es zeigen:
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1 das
Reaktionsschema der sauren Hydrolyse eines RNA-Moleküls. Beide
erhaltenen Molekülfragmente
können
massenspektrometrisch als protonierte oder deprotonierte Moleküle detektiert
werden;
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2 die
vollständige
Sequenzierung eines siRNA-Moleküls
der Sequenz UAU CAC UUG AUC UCG UAC ATT (SEQ. ID. NO. 1);
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3 den
Vergleich der Sequenzspektren von zwei verschiedenen Matrices, nämlich ATT
und HPA, wobei ATT das bessere Sequenzspektrum liefert.
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Wie
aus 2 entnehmbar ist, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren
die vollständige
Sequenzierung eines RNA-Moleküls
in Form eines RNA-Oligonukleotids von 21 Nukleotiden. Dabei erfolgt
sowohl eine Sequenzierung in 5'-3' Richtung (Leiter
2), als auch eine Sequenzierung in 3'-5' Richtung
(Leiter 1).
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Beispiel
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Ein
RNA-Oligonukleotid der Sequenz UAU CAC UUG AUC UCG UAC ATT (SEQ.
ID. NO. 1) wird in einer wässrigen
Lösung
in einer Konzentration von 20 μmol/l
mit Ameisensäure
als starker Säure
versetzt, dass der pH Wert der Lösung < 2 beträgt. Die
saure Hydrolyse findet bei einer Temperatur von 60°C für 2 Minuten
statt und wird durch schnelle Abkühlung der Probe beendet. Wie
Vorversuche gezeigt haben, erfolgt bei dieser Temperatur und dieser
Inkubationszeit im Mittel die Hydrolyse genau einer Phosphordiesterbindung
pro RNA-Oligonukleotid, so dass alle möglichen, durch Hydrolyse einer
Phosphordiesterbindung erzeugbaren RNA-Oligonukleotidfragmente in
der Lösung
in gleicher Häufigkeit
enthalten sind.
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Für die MS-Analyse
werden 0,5 μL
der RNA-Lösung
mit 2 μL
6-Aza-2-Thiothymin (ATT) auf einem Probenteller gemischt und eingetrocknet.
Das erhaltene Spektrum ist in 2 gezeigt.
Die Sequenz wird ermittelt, indem ausgehend vom intakten Molekülpeak zwischen
zwei im Spektrum benachbarten Massenpeaks die Massendifferenz gebildet
wird. Aus dieser Massendifferenz wird auf das an der betrachteten
Position im RNA-Oligonukleotid enthaltene Nukleotid geschlossen,
da die Massendifferenzen jeweils der Masse eines der vier natürlich vorkommenden
Nukleotidbausteine entsprechen.
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Da
die Sequenz vom 3' und
vom 5'-Ende des
Oligonukleotids gelesen werden kann, spielt das aus dem Stand der
Technik bekannte Problem der schlechten Detektierbarkeit kleiner
Fragmente im niedrigen Massenbereich beim erfindungsgemäßen Verfahren
keine Rolle.
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