-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage des
Risikos zur Entwicklung eines chronischen Lungenemphysems.
-
Chronisches
Lungenemphysem (hier im Folgenden als "CPE" bezeichnet)
hat aufgrund veränderter Umstände in der
japanischen Gesellschaft, gewohnheitsmäßiges Rauchen und Alterung,
zugenommen. Wenn eine Person unter chronischer Dyspnoe leidet, ist
das tägliche
Leben eingeschränkt.
Ferner führt
eine Infektion der Atemwege zu Atemnot (respiratorischer Insuffizienz).
Deshalb ist es ein dringendes Anliegen, die Pathogenese und Prophylaxe
von CPE zu klären.
-
Rauchen
wird als ein Hauptrisikofaktor für
die Verursachung von CPE betrachtet. Jedoch beträgt das Risiko von Rauchern,
CPE zu entwickeln, nur 10–15
%. Deshalb mögen
Umweltfaktoren und genetische Faktoren außer Rauchen für die Verursachung
von CPE verantwortlich sein.
-
Eine
Protease/Antiprotease-Ungleichgewichts-Theorie wurde als ätiologischer
Faktor für
CPE postuliert. Beispielsweise wurde berichtet, dass ein α1-Antitrypsin-Mangel
CPE verursacht. Kürzlich
wurde auch eine Theorie der Alveolen-Zerstörung aufgrund eines Oxidans/Antioxidans-Ungleichgewichts
als Ursache vorgeschlagen.
-
Obwohl
es in westlichen Ländern
verschiedene Prozentsätze
von Patienten gibt, die unter dem α1-Antitrypsin-Mangel leiden,
wurden jedoch nur wenige Fälle
in Japan berichtet. Dementsprechend mag es es nicht gefahrlos sein,
sich darauf festzu legen, dass der α1-Antitrypsin-Mangel eine hauptsächliche ätiologische
Ursache von CPE ist, zumindest in Japan.
-
N.
Yamada et al. ("Am.
J. Hum. Gen.", Band
56, 2000, Seiten 187–195)
haben festgestellt, dass der Mikrosatelliten-Polymorphismus in dem Hämoxygenase-1-Gen-Promotor
mit einer Anfälligkeit
für Emphyseme assoziiert
ist.
-
Die
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten
Verfahrens zur Vorhersage des möglichen
Risikos eines Individuums, CPE zu entwickeln.
-
Diese
Aufgabe wird mit einem Verfahren, welches die Merkmale von Anspruch
1 umfasst, gelöst.
Vorteilhafte Ausführungsformen
der Erfindung sind in den abhängigen
Ansprüchen
definiert.
-
Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vorhersage
des möglichen
Risikos eines Individuums, CPE zu entwickeln, indem festgestellt
wird, wie viele Male GT in einer GT-Repeat-Sequenz wiederholt ist,
welche stromaufwärts
eines für
Hämoxygenase-1
kodierenden Gens gelegen ist, vorstellbar als ätiologischer Faktor für CPE.
-
Die
Erfindung lässt
sich vollständiger
anhand der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit
den Begleitzeichnungen verstehen, worin:
die einzige Figur
eine Verteilung der Anzahl von GT-Repeats bei CPE-Individuen und
Nicht-CPE-Individuen darstellt.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage des
möglichen
Risikos eines Individuums, CPE zu entwickeln.
-
Die
Erfindung erfolgte auf Grundlage epidemiologischer Forschung, die
von den Erfindern durchgeführt
wurde. Als Ergebnis stellten sie fest, dass ein Polymorphismus der
GT-Repeat-Sequenz,
die stromaufwärts
einer Hämoxygenase-1
(hier im Folgenden als HO-1 bezeichnet), welche die erste Reaktion
des Häm-Metabolismus
katalysiert, gelegen ist, im Bezug zum Auftreten von CPE steht.
-
Konkreter
ist es nach dem Verfahren der Erfindung möglich, das mögliche Risiko
eines Individuums, CPE zu entwickeln, vorherzusagen, indem die Anzahl
der GT-Repeats innerhalb der stromaufwärts des HO-1-Gens gelegenen
GT-Repeat-Sequenz festgestellt wird.
-
Der
Begriff "GT-Repeat-Sequenz", wie hier verwendet,
bedeutet eine Sequenz, in der eine GT-Einheit, bestehend aus Guanin
(G) und Thymin (T), wiederholt auftritt. Der Begriff "die Anzahl der GT-Repeats", wie hier verwendet,
bedeutet die Anzahl der GT-Wiederholungseinheiten, die in der GT-Repeat-Sequenz
vorliegen.
-
Bei
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird zuerst eine Probe
präpariert,
welche die stromaufwärts
des HO-1-Gens gelegene GT-Repeat-Sequenz enthält. Eine beliebige biologische
Probe, einschließlich Blut,
kann als Probe verwendet werden, solange sie von einem Individuum
genommen wird, welches ein Ziel-Individuum für das Verfahren der Erfindung
ist. Die Probe wird vorzugsweise einer Nukleinsäureextraktion unterworfen.
Ein Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren aus der biologischen Probe
ist Fachleuten wohl bekannt und wird durch Phenolextraktion, Ethanolfällung und
dgl. durchgeführt.
-
Als "Individuum", welches ein Ziel
für das
Verfahren der Erfindung ist, werden vorzugsweise Säuger, einschließlich Men schen,
eingesetzt. Nachdem jedoch bekannt ist, dass der Polymorphismus
der GT-Repeat-Sequenz in vielen anderen Spezies als Säugern auftritt,
können
alle Tierspezies mit HO-1 in das "Individuum" eingeschlossen werden.
-
Der
Begriff "Präparieren
einer Probe", wie
hier verwendet, umfasst nicht nur das Präparieren einer Probe durch
diejenigen, welche das Verfahren der Erfindung ausführen, sondern
auch das Erhalten einer gebrauchsfertigen Probe.
-
Nachdem
die Probe präpariert
ist, wird die Anzahl der Wiederholungseinheiten in der stromaufwärts des
HO-1-Gens gelegenen GT-Repeat-Sequenz festgestellt. Nachdem die
stromaufwärts
des HO-1-Gens gelegene Sequenz (Seq. ID Nr. 1) und ein Verfahren
zur Bestimmung der Anzahl von Wiederholungseinheiten in einer Repeat-Sequenz
wohlbekannt sind, ist es Fachleuten auf dem Gebiet unschwer möglich, die
Anzahl der Wiederholungseinheiten innerhalb der GT-Repeat-Sequenz
festzustellen.
-
Vorzugsweise
wird die Anzahl der Wiederholungseinheiten innerhalb der Repeat-Sequenz
durch ein Verfahren unter Anwendung einer Polymerasekettenreaktion
(hier im Folgenden als "PCR" bezeichnet) festgestellt.
Zur Feststellung der Anzahl von Wiederholungseinheiten innerhalb
der GT-Repeat-Sequenz unter Anwendung der PCR wird die GT-Repeat-Sequenz
amplifiziert unter Verwendung eines Primerpaars, bestehend aus nur
einmal vorkommenden Sequenzen, die sich stromaufwärts und
stromabwärts
der GT-Repeat-Sequenz befinden, und danach wird ein PCR-Produkt
der Elektrophorese unterworfen, um die Mobilität zu überprüfen. In einem Falle, in dem
eine große
Anzahl von Proben zu messen sind, kann die Anzahl der GT-Wiederholungseinheiten
mit einem DNA-Chip bestimmt werden.
-
Wenn
der DNA-Chip eingesetzt wird, wird eine Probe, welche die GT-Wiederholungseinheit
enthält,
in den DNA-Chip, auf dem aus CA-Wiederholungseinheiten bestehende
Sonden immobilisiert sind, injiziert. Anschließend wird die Anzahl der Wiederholungseinheiten
innerhalb der GT-Repeat-Sequenz festgestellt auf Grundlage des Unterschieds
in den Denaturierungsbedingungen (z.B. Schmelztemperatur (Tm)),
welcher in Abhängigkeit
von der Anzahl von Wiederholungseinheiten variiert.
-
Ferner
kann erforderlichenfalls die Anzahl der Repeats durch direkte Sequenzierung
der GT-Repeat-Sequenz bestimmt werden.
-
Wie
speziell in den später
beschriebenen Beispielen beschrieben, hat das Individuum ein hohes
Risiko, unter CPE zu leiden, wenn das Individuum mindestens ein
Allel mit der GT-Repeat-Sequenz
aufweist, welche nicht weniger als 30 Wiederholungseinheiten einschließt und stromaufwärts des
HO-1-Gens gelegen ist. Deshalb ist es möglich, das Risiko eines Individuums,
CPE zu entwickeln, durch Feststellung der Anzahl von Wiederholungseinheiten
innerhalb der GT-Repeat-Sequenz vorherzusagen. Konkreter war gemäß einer
epidemiologischen Studie zur Untersuchung der Korrelation zwischen
dem Risiko zur Entwicklung von CPE und der Anwesenheit des Allels
das Chancenverhältnis
2,4, was bedeutet, dass das Risiko eines Individuums mit mindestens
einem Allel, das nicht weniger als 30 GT-Repeats aufweist, etwa
2,4 mal größer ist
als dasjenige des Individuums ohne ein solches Allel.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Sammlung von
Daten zur Vorhersage des Risikos, CPE zu entwickeln. Das Verfahren
ist dasselbe wie das Verfahren zur Vorhersage des Risikos, CPE zu
entwickeln. Nachdem dieses ein Verfahren zur Sammlung von Daten
ist, ist der Ausführende, welcher
dieses Verfahren durchführt,
nicht auf diejenigen beschränkt,
welche in medizinischen Berufen beschäftigt sind.
-
Ferner
wird eine Vorrichtung zur Vorhersage des Risikos zur Entwicklung
von CPE beschrieben, welche umfasst:
- (a) DNA-Amplifizierungsmittel
zur spezifischen Amplifizierung der GT-Repeat-Sequenz, die stromaufwärts des
HO-1-Gens gelegen
ist; und
- (b) DNR-Größen-Bestimmungsmittel
zur Bestimmung der DNA-Größe (DNA-Größen-Bestimmungsmittel), um
die Anzahl von GT-Repeats innerhalb der wie oben amplifizierten
GT-Repeat-Sequenz
festzustellen.
-
Das
GT-Repeat-Amplifizierungsmittel kann umfassen eine Reaktionszelle
zur Unterbringung der von einem Individuum entnommenen Probe, ein
Erwärmungsmittel
zur Erwärmung
der Reaktionszelle und ein Temperaturkontrollmittel zur Kontrolle
der Temperatur der Reaktionszelle.
-
Das
DNA-Amplifizierungsmittel und die Verfahrensweise sind dieselben
wie bei einem Thermocycler, der allgemein bei der PCR eingesetzt
wird, und somit Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt.
-
Die
Größe der amplifizierten
GT-Repeat-Sequenz wird mit dem DNA-Größen-Bestimmungsmittel bestimmt.
Das DNA-Größen-Bestimmungsmittel
kann ein elektrophoretisches Gel, Gelfiltration oder ein automatischer
Nukleotidsequenzierer sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die
Anzahl der Wiederholungseinheiten innerhalb der GT-Repeat-Sequenz
kann anhand der oben beschriebenen DNA-Größe abgeschätzt werden.
-
Nunmehr
wird die vorliegende Erfindung konkreter in den folgenden Beispielen
beschrieben werden.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
In
diesem Beispiel wird ein Verfahren zur Vorhersage des Risikos zur
Entwicklung von CPE erläutert werden.
-
DNA
wurde aus einer Blutprobe extrahiert, welche jedem der Individuen
(CPE-Individuen: 101, und Nicht-CPE-Individuen: 100, alle Individuen
sind gewohnheitsmäßige Raucher)
entnommen worden war, und einer PCR unter Verwendung der DNA als
Matrize unterworfen.
-
Primerpaare
eines p1-s-Primers (Nukleotide 249–268 von Seq. ID Nr. 1) und
eines p1-as-Primers (Nukleotide 356–375 von Seq. ID Nr. 1) und
eines p2-s-Primers (GACGCGTGCAAGCAGTCAGCAGAGGAT) und eines p2-as-Primers
(Nukleotide 591–611
von Seq. ID Nr. 1) wurden synthetisiert als Primer zur Amplifizierung der
stromaufwärts
des HO-1-Gens gelegenen GT-Repeat-Sequenz (Nukleotide 285–344) von
Seq. ID Nr. 1).
-
Nach
Abschluß der
PCR-Amplifizierung wurden die PCR-Produkte einer Elektrophorese
unter Verwendung eines 15 eigen Polyacrylamidgels unterworfen. Auf
diese Weise wurde die Anzahl der GT-Repeats innerhalb der GT-Repeat-Sequenz
bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
-
Jedes
der Diagramme von 1 zeigt eine Verteilung der
Anzahl der GT-Repeats in der GT-Repeat-Sequenz. Die Diagramme der
oberen, mittleren und unteren Abschnitte entsprechen Nicht-CPE-Individuen,
CPE-Individuen bzw. einer Gesamtkombination.
-
Wie
aus 1 ersichtlich, gab es in den Verteilungsdiagrammen
Peaks bei den Repeat-Anzahlen von 22, 27 und 30. Dann wird die Anzahl
der GT-Repeats in der GT-Repeat-Sequenz in drei Gruppen klassifiziert: (1)
weniger als 25, (2) 25 bis 30, und (3) nicht weniger als 30 (diese
drei Gruppen werden hier im Folgenden als S, M bzw. L bezeichnet),
und die Korrelation zwischen den Gruppen und CPE wurde untersucht.
Die Individuen werden ebenfalls in Gruppe 1 (L/L, L/M, L/S; mit
mindestens einem L-Typ Allel) und Gruppe 2 (M/M, M/S, S/S; ohne
L-Typ-Allel) klassifiziert und dann wurde die Korrelation zwischen
einem L-Typ Allel und CPE untersucht.
-
Wie
in Tabelle 1 unten gezeigt, betrug das Chancenverhältnis (Wahrscheinlichkeitsverhältnis des
Auftretens) von L-Typ-Allel
zu einem Nicht-L-Typ-Allel (M-Typ- und S-Typ-Allele) 20/180 (= 20/88+92))
bei den Nicht-CPE-Individuen (Kontrolle), während das Chancenverhältnis (Wahrscheinlichkeitsverhältnis des
Auftretens) 42/180 (= 42/93+67)) bei CPE-Individuen (Fall) betrug. Das Chancenverhältnis des
L-Typs zu dem Nicht-L-Typ betrug (42/160) / (20/180)= 2, 4 (p<0, 004) . Als Ergebnis
haben die Individuen, welche mindestens ein L-Typ-Allel aufweisen,
ein etwa 2,4 mal höheres
Risiko, CPE zu entwickeln, als die Individuen ohne das L-Typ-Allel.
Man beachte, dass das Chancenverhältnis eines L-Typ-Allels zu
dem S-Typ- und dem
M-Typ-Allel 2,9 (p<0,001)
bzw. 2,0 (p<0,03)
betrug.
-
-
Wie
in Tabelle 2 gezeigt, betrug das Chancenverhältnis der Gruppe 1 (L/L, L/M,
L/S) zu der Gruppe 2 (M/M, M/S, S/S) ebenfalls 2,4 (p<0,008).
-
-
Die
Ergebnisse demonstrieren, dass, falls ein Individuum mindestens
ein Allel mit einer GT-Repeat-Sequenz aufweist, welche nicht weniger
als 30 GT-Repeats besitzt und stromaufwärts des HO-1-Gens gelegen ist,
es vorhergesagt werden kann, dass das Individuum ein hohes Risiko
zur Entwicklung von CPE aufweist.
-
Gemäß dem Verfahren
der Erfindung ist es möglich,
das Risiko zur Entwicklung von CPE leicht und genau vorherzusagen.
