DE602004008916T2

DE602004008916T2 - Verfahren zur herstellung eines genexpressionsprofils

Info

Publication number: DE602004008916T2
Application number: DE602004008916T
Authority: DE
Inventors: Abe; Inage-ku Chiba -shi c/o National Institute of
Original assignee: National Institute of Radiological Sciences
Current assignee: National Institute of Radiological Sciences
Priority date: 2003-06-19
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2024-06-17
Also published as: EP1634950B1; CA2500209C; JP2005006554A; WO2004113526A1; EP1634950A1; AU2004250012B2; AU2004250012A1; CA2500209A1; EP1634950B8; DE602004008916D1; EP1634950A4; JP4217780B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils.
Technischer Hintergrund
Im Jahre 2002 wurde die menschliche Genomsequenz nahezu vollständig entschlüsselt. Aus den erhaltenen Daten bezüglich der Basen erhoffte man sich maßgeschneiderte Therapien und dergleichen. Zu diesem Zweck ist es sehr wichtig, Gene zu identifizieren und den Grad ihrer Expression in vivo zu bestimmen oder das Netzwerk der Genexpression aufzuklären. Zur Aufklärung des Netzwerks der Genexpression ist es außerdem erforderlich, ein Genexpressionsprofil zu erstellen, das exprimierte Gene identifiziert und den Grad ihrer Expression in vivo zu einem vorgegebenen Zeitpunkt bestimmt.
Zu den Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils zählen gegenwärtig ein Verfahren zum Nachweis differentiell exprimierter Gene, die Reihenanalyse der Genexpression (serial analysis of gene expression: SAGE), ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroarrays oder DNA-Chips, ein Verfahren zum High-Coverage Expression Profiling (HiCEP), das in der internationalen Veröffentlichung WO 02/48352 A1 offenbart ist, und so weiter.
Von diesen Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils ist das HiCEP-Verfahren insofern ein ausgezeichnetes Verfahren, als das Genexpressionsprofil zur Abdeckung eines weiten Bereichs von Genen, darunter auch unbekannten Genen, in einfacher Weise erstellt werden kann.
Bei einer PCR, die als einer der Schritte beim HiCEP-Verfahren angewandt wird, liegt die für das Annealing eines Primers an eine Matrize angewandte Temperatur üblicherweise bei der Schmelztemperatur (Tm) des Primers, zum Beispiel 55°C, wenn der jeweilige eingesetzte Primer aus einem 20mer mit einem GC-Gehalt von 50% zusammengesetzt ist ("Protocol 15: Quantitative PCR 8.86" in Sambrook und Russell, "Molecular Cloning", 3. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press (USA), 2001).
Die Expressionsstärke eines Gens variiert je nach Art der Gene und dem Zeitpunkt der Expression derselben. Zur Aufklärung des Netzwerks der Genexpression ist daher als eine Voraussetzung dafür ein Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils erwünscht, das hohe Nachweisempfindlichkeit für exprimierte Gene erbringt.
Für ein HiCEP-Verfahren, mit dem ein Genexpressionsprofil in einfacher Weise erstellt werden kann, das einen weiten Bereich von Genen abdeckt, hat der hier tätige Erfinder demgemäß eingehende Untersuchungen durchgeführt, um zu einer weiteren Verbesserung der Empfindlichkeit beim Nachweisen exprimierter Gene zu kommen.
Offenbarung der Erfindung
Im Ergebnis hat der hier tätige Erfinder gefunden, dass beim PCR-Schritt des HiCEP-Verfahrens eine dramatische Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit exprimierter Gene erreicht werden kann, indem die Temperatur beim Annealing eines Primers an eine bei der PCR verwendete Matrize auf einen bestimmten Bereich eingestellt wird. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Befunde verwirklicht.
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich somit um ein Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes umfasst:

(a) Synthetisieren einer einzelsträngigen cDNA unter Verwendung einer Poly(A)-RNA als Matrize, wobei eine einzelsträngige cDNA synthetisiert wird, die eine Markierungssubstanz an der Seite des 5'-Endes bezogen auf die einzelsträngige cDNA trägt;
(b) Synthetisieren einer doppelsträngigen cDNA unter Verwendung der in Schritt (a) synthetisierten einzelsträngigen cDNA als Matrize, wobei eine doppelsträngige cDNA erhalten wird, die eine Markierungssubstanz an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA trägt;
(c) Spalten der in Schritt (b) erhaltenen doppelsträngigen cDNA mit einem ersten Restriktionsenzym X;
(d) Gewinnen eines Fragments, das die Markierungssubstanz trägt, aus den in Schritt (c) erhaltenen Fragmenten durch Verwendung einer Substanz, die hohe Affinität zur Markierungssubstanz aufweist;
(e) Ligieren eines Adaptors X, der eine zur Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz und eine zur Sequenz eines Primers X komplementäre Sequenz enthält, an die Spaltungsstelle des wie in Schritt (d) gewonnenen Fragments, das durch das erste Restriktionsenzym X erzeugt wurde, um ein Fragment zu erhalten, das mit dem Adaptor X an der Seite des 5'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert ist;
(f) Spalten des in Schritt (e) gewonnenen Fragments mit einem zweiten Restriktionsenzym Y, das den Adaptor X nicht spaltet;
(g) Abtrennen eines Fragments, das die Markierungssubstanz trägt, von den in Schritt (f) erhaltenen Fragmenten durch Verwendung einer Substanz, die hohe Affinität zur Markierungssubstanz aufweist, um ein Fragment zu gewinnen, das die durch das zweite Restriktionsenzym Y erzeugte Spaltungsstelle an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA enthält;
(h) Ligieren eines Adaptors Y, der eine zur Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz und eine zur Sequenz eines Primers Y komplementäre Sequenz enthält, an die Spaltungsstelle des wie in Schritt (g) gewonnenen Fragments, das durch das zweite Restriktionsenzym Y erzeugt wurde, um ein Fragment einer doppelsträngigen Sequenz zu erhalten, das mit dem Adaptor Y an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert ist;
(i) Durchführen einer PCR mit dem Fragment der in Schritt (h) erhaltenen doppelsträngigen Sequenz als Matrize unter Verwendung eines Primersatzes, bestehend aus einem Primer X, der eine zur Sequenz des Adaptors X komplementäre Sequenz enthält, die eine Sequenz aus 2 Basen N₁N₂ (N₁ und N₂ können gleiche oder verschiedene Basen sein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) am 3'-Ende bezogen auf den Primer X aufweist, und einem Primer Y, der eine zur Sequenz des Adaptors Y komplementäre Sequenz enthält, die eine Sequenz aus 2 Basen N₃N₄ (N₃ und N₄ können gleiche oder verschiedene Basen sein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) am 3'-Ende bezogen auf den Primer Y aufweist; und
(j) Durchführen einer Elektrophorese mit dem erhaltenen PCR-Produkt und Erfassen der Wanderungsstrecke und der Peaks zur Erstellung eines Genexpressionsprofils,

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematisches Diagramm, das ein Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils zeigt, bei dem es sich um eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt;
2 ist ein Diagramm, das ein Genexpressionsprofil zeigt, welches gemäß vorliegender Erfindung erstellt wurde;
3 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Annealing-Temperatur und der Peak-Fluoreszenzintensität zeigt.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils soll anhand von 1 als eine Ausführungsform beschrieben werden. Die Buchstabenkennzeichnung der obigen Schritte (a) bis (j) entspricht jeweils derjenigen der Schritte (a) bis (j) in 1.
Die jeweilige Buchstabenkennzeichnung der in 1 gezeigten Sequenzen steht für die Basen, die eine Basensequenz bilden. A bedeutet Adenin (im Folgenden mit A abgekürzt); G bedeutet Guanin (im Folgenden mit G abgekürzt); C steht für Cytosin (im Folgenden mit C abgekürzt); und T steht für Thymin (im Folgenden mit T abgekürzt). Die N₁, N₂, N₃ und N₄ können gleich oder verschieden sein und sind Basen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus A, C, G und T.
Solange nichts anderes angegeben ist, soll bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung die Seite des 5'-Endes eines Sinnstrangs (ein Strang, der eine zu einer Poly(A)-RNA als Matrize homologe Sequenz aufweist) einer doppelsträngigen cDNA gegeben sein als das 5'-Ende der doppelsträngigen cDNA, und das 3'-Ende der Sinnsequenz soll gegeben sein als das 3'-Ende der doppelsträngigen cDNA.
Schritt (a)
Bei diesem Schritt wird eine Poly(A)-RNA als Matrize verwendet, um eine einzelsträngige cDNA zu synthetisieren.
Zunächst wird eine Poly(A)-RNA 11 aus einer Zelle extrahiert, für die ein Genexpressionsprofil erstellt werden soll.
Ein Oligo-dT-Primer, der komplementär ist zu einem Poly(A)-Schwanz an der Seite des 3'-Endes der extrahierten Poly(A)-RNA 11, der mit einer Markierungssubstanz 12 markiert ist, wird als Primer zur Synthese einer einzelsträngigen cDNA 13 (in 1 zusammen mit der Poly(A)-RNA 11 gezeigt) mit der Poly(A)-RNA 11 als Matrize verwendet. Die Markierungssubstanz 12 wird an der Seite des 5'-Endes bezogen auf die einzelsträngige cDNA 13 angefügt.
Schritt (b)
Die in Schritt (a) synthetisierte einzelsträngige cDNA 13 wird als Matrize zur Synthese einer doppelsträngigen cDNA 14 verwendet. Die Markierungssubstanz 12 wird an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA 14 angefügt.
Schritt (c)
Die in Schritt (b) erhaltene doppelsträngige cDNA wird mit einem ersten Restriktionsenzym X gespalten.
Schritt (d)
Unter Verwendung einer Substanz, die hohe Affinität zur Markierungssubstanz 12 aufweist, wird die Markierungssubstanz 12 abgefangen, um aus den in Schritt (c) erhaltenen Fragmenten ein Fragment zu gewinnen, das die Markierungssubstanz 12 trägt.
Schritt (e)
An die Spaltungsstelle des wie in Schritt (d) gewonnenen Fragments, die durch das erste Restriktionsenzym X erzeugt wurde, wird ein Adaptor X 16 ligiert, der eine zur Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz und eine zur Sequenz eines Primers X komplementäre Sequenz enthält, um ein Fragment zu erhalten, das mit dem Adaptor X 16 an der Seite des 5'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert ist.
Schritt (f)
Das in Schritt (e) gewonnene Fragment wird mit einem zweiten Restriktionsenzym Y gespalten.
Schritt (g)
Die Substanz 15 mit hoher Affinität zur Markierungssubstanz 12 wird zur Abtrennung eines Fragments, das die Markierungssubstanz 12 trägt, von den in Schritt (f) erhaltenen Fragmenten verwendet, um so ein Fragment zu gewinnen, das die durch das zweite Restriktionsenzym Y erzeugte Spaltungsstelle an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA enthält.
Schritt (h)
An die Spaltungsstelle des wie in Schritt (g) gewonnenen Fragments, die durch das zweite Restriktionsenzym Y erzeugt wurde, wird ein Adaptor Y 17 ligiert, der eine zur Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz und eine zur Sequenz eines Primers Y komplementäre Sequenz enthält, um ein Fragment 18 einer doppelsträngigen Sequenz zu erhalten, das mit dem Adaptor Y 17 an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert ist. Das erhaltene Fragment 18 der doppelsträngigen Sequenz enthält den Adaptor X 16 an der Seite des 5'-Endes und den Adaptor Y 17 an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA 14.
Schritt (i)
Unter Verwendung eines Primersatzes, bestehend aus einem Primer X 19, der eine zur Sequenz des Adaptors X 16 komplementäre Sequenz enthält, die eine Sequenz aus 2 Basen N₁N₂ (wobei N₁ und N₂ gleiche oder verschiedene Basen sein können, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus A, T, G und C) am 3'-Ende (d.h., an der Amplifikationsseite) bezogen auf den Primer X 19 aufweist und mit einer fluoreszierenden Substanz 20 am 5'-Ende bezogen auf den Primer X 19 gebunden ist, und einem Primer Y 21, der eine zur Sequenz des Adaptors Y 17 komplementäre Sequenz enthält, die eine Sequenz aus 2 Basen N₃N₄ (wobei N₃ und N₄ gleiche oder verschiedene Basen sein können, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus A, T, G und C) am 3'-Ende (d.h., an der Amplifikationsseite) bezogen auf den Primer Y 21 aufweist, wird eine PCR mit dem Fragment 18 der in Schritt (h) erhaltenen doppelsträngigen Sequenz als Matrize durchgeführt.
Dabei liegt die Temperatur für das Annealing des Primersatzes an die Matrize im Bereich von TmMAX + 6°C bis TmMAX + 14°C der Primer.
Schritt (j)
Mit dem erhaltenen PCR-Produkt wird eine Elektrophorese durchgeführt, um die Wanderungsstrecke und die Peaks zu erfassen, und es wird ein Genexpressionsprofil erstellt.
In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet "Genexpressionsprofil" alle diejenigen, die Informationen zeigen wie z.B. das Expressionsmuster eines Gens in einer bestimmten Zelle unter bestimmten Bedingungen, das Vorhandensein oder Fehlen der Expression eines bekannten oder unbekannten Gens, die Expressionsstärke aller exprimierten Gene und so weiter. Außerdem kann das Genexpressionsprofil als Hilfsmittel zum Analysieren der Expression von Genen herangezogen werden.
"Poly(A)-RNA" bezeichnet eine mRNA mit einer Sequenz am 3'-Ende, die allgemein polyA genannt wird. Zudem kann eine cDNA aus der Poly(A)-RNA mit einem "Oligo-dT-Primer" synthetisiert werden, der eine Sequenz aufweist, die zur Poly(A)-RNA komplementär ist. Der hier verwendete "Oligo-dT-Primer" wird im Allgemeinen auch als Oligo-dT-Primer bezeichnet. Die Synthese einer einzelsträngigen cDNA aus der Poly(A)-RNA unter Verwendung des Oligo-dT-Primers (Schritt (a)) kann unter jeden der allgemein angewandten Bedingungen erreicht werden. Die Synthese einer doppelsträngigen cDNA aus der einzelsträngigen cDNA (Schritt (b)) kann ebenfalls unter jeden der allgemein angewandten Bedingungen erreicht werden.
Eine "Markierungssubstanz" oder eine "Substanz mit hoher Affinität zur Markierungssubstanz" bezeichnet die beiden Substanzen, die ein Bindungspaar bilden und imstande sind, mit hoher Affinität spezifisch aneinander zu binden. Bei dem in Beispiel 1 gezeigten Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Biotin als Markierungssubstanz und Streptavidin als Substanz mit hoher Affinität zur Markierungssubstanz verwendet, doch ist das Verfahren nicht darauf beschränkt. Es können beliebige Bindungspaare verwendet werden, die mit hoher Affinität spezifisch aneinander zu binden imstande sind. Zu den Beispielen für die bei der vorliegenden Erfindung verfügbaren Kombinationen aus Markierungssubstanz und Substanz mit hoher Affinität zur Markierungssubstanz zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Biotin und Streptavidin, Biotin und Avidin, FITC und FITC-Antikörper, DIG und Anti-DIG, Protein A und Maus-IgG, Latex-Teilchen und so weiter. Das Anfügen der Markierungssubstanz an eine DNA-Sequenz kann unter jeden der allgemein angewandten Bedingungen erreicht werden. Des Weiteren kann die Gewinnung eines DNA-Fragments auf der Grundlage der Affinität zwischen der "Markierungssubstanz" und der "Substanz mit hoher Affinität zur Markierungssubstanz" (Schritte (d) und (g)) unter jeden der allgemein angewandten Bedingungen erreicht werden.

Ein "Restriktionsenzym" ist ein Enzym, das im Allgemeinen als Restriktionsendonuclease bezeichnet wird und eine doppelsträngige DNA in einer bestimmten Sequenz hydrolysiert und spaltet. Bei der vorliegenden Erfindung werden zwei Restriktionsenzyme X und Y in Kombination eingesetzt, um geeignete Fragmente zu erhalten. Vorzugsweise ist das bei der vorliegenden Erfindung brauchbare Restriktionsenzym ein Enzym, das eine von einem exprimierten Gen, d.h., einer mRNA, synthetisierte doppelsträngige cDNA in Fragmente spalten kann, die jeweils eine erkennbare Länge aufweisen. Ebenfalls bevorzugt ist ein Enzym, das soviele wie möglich der erhaltenen Doppelstränge spalten kann, vorzugsweise nahezu alle Doppelstränge. Beispiele für ein solches Enzym sind in nachstehender Tabelle 1 gezeigt.

Name des Restriktionsenzyms	Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms	Name des Restriktionsenzyms	Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms
AccII	CG/CG	HpaII	C/CGG
AfaI	GT/AC	Hsp92II	CATG/
AluI	AG/CT	HspAI	G/CGC
AspLEI	GCG/C	Kzo9I	/GATC
BfaI	C/TAG	MaeI	C/TAG
BscFI	/GATC	MboI	/GATC
Bsh1236I	CG/CG	MseI	T/TAA
BshI	GG/CC	MspI	C/CGG
BsiSI	C/CGG	MvnI	CG/CG
Bsp143I	/GATC	NdeII	/GATC
BstUI	CG/CG	NlaIII	CATG/
BsuRI	GG/CC	PalI	GG/CC
CfoI	GCG/C	RsaI	GT/AC
Csp6I	G/TAC	Sau3AI	/GATC
DpnII	/GATC	Sse9I	/AATT
FnuDII	CG/CG	TaqI	T/CGA
HaeIII	GG/CC	ThaI	CG/CG
HapII	C/CGG	Tru1I	T/TAA
HhaI	GCG/C	Tru9I	T/TAA
Hin2I	C/CGG	Tsp509I	/AATT
Hin6I	G/CGC	TspEI	/AATT
HinP1I	G/CGC	TthHB8I	T/CGA

Es können je zwei Enzyme aus den Enzymen von Tabelle 1 ausgewählt und in Kombination eingesetzt werden. Obwohl die in Tabelle 1 gezeigten Enzyme solche Enzyme sind, die 4 Basen erkennen, können auch andere Enzyme, die 4 Basen erkennen, oder Enzyme, die 6 Basen erkennen, verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Enzyms bevorzugt, das 4 Basen erkennt, und besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Kombination von MspI und MseI. Bei dem in Beispiel 1 gezeigten Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird MspI als Restriktionsenzym X und MseI als Restriktionsenzym Y verwendet, doch sind die Enzyme nicht darauf beschränkt. Die Spaltung einer doppelsträngigen DNA durch das Restriktionsenzym (Schritte (c) und (f)) kann unter jeden der allgemein angewandten Bedingungen erreicht werden.
Zur Bindung des bei der PCR in Schritt (l) verwendeten Primers wird ein "Adaptor" verwendet. Der Adaptor ist gemäß den verwendeten Restriktionsenzymen und Primern ausgelegt. Das heißt, ein Adaptor X, der an eine erkannte Spaltungsstelle eines Restriktionsenzyms X ligiert werden soll, enthält eine Sequenz, die zur erkannten Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms X komplementär ist, und besitzt des Weiteren eine Sequenz, die zur Sequenz eines Primers X komplementär ist. Vorzugsweise kann der Adaptor X so ausgelegt sein, dass er etwa 30 Basen aufweist. Dies ermöglicht die Durchführung einer stabilen PCR. Ein Adaptor Y, der an eine erkannte Spaltungsstelle eines Restriktionsenzyms Y ligiert werden soll, enthält eine Sequenz, die zur erkannten Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms y komplementär ist, und besitzt des Weiteren eine beliebige Sequenz, die zur Sequenz eines Primers Y komplementär ist. Vorzugsweise kann der Adaptor Y so ausgelegt sein, dass er etwa 30 Basen aufweist. Dies ermöglicht die Durchführung einer stabilen PCR.
Bei dem Verfahren von Beispiel 1 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden als Adaptor X solche verwendet, die eine Sequenz enthalten, die zur Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms MspI komplementär ist (SEQ ID NO 1 und 2), und als Adaptor Y werden solche verwendet, die eine Sequenz enthalten, die zur Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms MseI komplementär ist (SEQ ID NO 3 und 4), doch sind die Adaptoren nicht darauf beschränkt. Die Bindung des Adaptors an eine doppelsträngige DNA (Schritte (e) und (h)) kann unter jeden der allgemein angewandten Bedingungen erreicht werden.
Bei den jeweiligen X- und Y-Primersequenzen, die einen Satz Primer bilden, die bei der PCR in Schritt (i) verwendet werden, ist es erwünscht, dass der Teil der Sequenz des jeweiligen Primers außer dem Teil der Zweibasensequenz (N₁N₂ für Primer X und N₃N₄ für Primer Y) am 3'-Ende des jeweiligen Primers nicht mit der Sequenz der fraglichen RNA übereinstimmt. Allerdings ist es schwierig, diese Bedingung zu erfüllen, da die gesamte RNA-Sequenz bis jetzt noch in keinem Organismus aufgeklärt wurde. Wird daher beispielsweise ein Mensch als Proband für Studien eingesetzt, so ist es vorzuziehen, eine Sequenz auszuwählen, die nicht vorhanden ist oder mit äußerst geringer Häufigkeit in der menschlichen Genomsequenz vorkommt.
Um die vorstehend beschriebene Bedingung zu erfüllen, ist es bevorzugt, dass der Primer X und der Primer Y jeweils eine Länge von 16 Basen oder mehr aufweisen. Wird zum Beispiel ein Primer mit einer Länge von 16 Basen unter dem Gesichtspunkt konstruiert, dass die menschliche Genomsequenz eine Länge von etwa 3 Milliarden Basen aufweist, so sind 4¹⁶ (etwa 4 Milliarden verschiedene) Primer aus den 4 Basen (A, C, G und T) möglich, die den Primer bilden, und daher tritt ein beliebiger Primer mit 16 Basen, der aus diesen Primern ausge wählt ist, in der menschlichen Genomsequenz mit einer Häufigkeit von 1 oder kleiner auf. Durch Vergleichen der Sequenz eines Primers mit einer Länge von 16 Basen oder mehr, der konstruiert wird unter Berücksichtigung der nachstehend beschriebenen, für einen Primer erforderlichen allgemeinen Bedingungen, mit den Sequenzen, die in einer öffentlich zugänglichen Basensequenz-Datenbank registriert sind, kann somit ein Primer mit einer Sequenz ausgewählt werden, die nicht mit den im menschlichen Genom vorhandenen Sequenzen übereinstimmt oder mit äußerst geringer Häufigkeit vorkommt.
Daneben muss der in Schritt (i) verwendete Primer Bedingungen erfüllen, die allgemein für einen PCR-Primer erforderlich sind (z.B. Bedingungen, die beschrieben sind bei Hiroki Nakayama, "Bio Experiment Illustrated (3), Neuauflage, PCR capable of really amplifying (Hontouni Fueru PCR im Japanischen)," 2. Aufl., 4. Nachdruck, Shunjunsha, 2002):

1. Es ist nicht zu erwarten, dass es zwischen den Primern X, zwischen den Primern Y und zwischen einem Primer X und einem Primer Y zur Bildung eines Primerdimers kommt.
2. Es ist nicht zu erwarten, dass es in einem Primer X und in einem Primer Y zur Bildung einer intramolekularen Struktur höherer Ordnung kommt.
3. Es ist nicht zu erwarten, dass zwischen den Primern X, zwischen den Primern Y und zwischen einem Primer X und einem Primer Y Komplementarität der Sequenzen am 5'-Ende auftritt.

Was den Tm-Wert des Primers anbelangt, so steigt die Annealing-Temperatur mit steigendem Tm-Wert des Primers, da der Tm-Wert die Annealing-Temperatur definiert (von TmMAX + 6°C bis TmMAX + 14°C des Primers). Daher ist der Tm-Wert des Primers vorzugsweise gleich der maximalen oder niedriger als die maximale Temperatur minus 6°C, bei der die verwendete thermoresistente Polymerase während der gesamten Reaktionszeit in einer PCR hinreichend arbeitet, so dass die Annealing-Temperatur nicht die Temperatur übersteigt, bei der die thermoresistente Polymerase während der gesamten Reaktionszeit in der PCR hinreichend funktioniert. Demgemäß ist es bevorzugt, dass die Tm-Werte der in Schritt (i) eingesetzten Primer X und Y jeweils im Bereich von 59°C bis 69°C liegen, insbesondere im Bereich von 60°C bis 64°C. Liegt der Tm-Wert des jeweiligen Primers X und Primers Y im Bereich von 60 bis 64°C, so kann eine PCR mit der nachstehend beschriebenen Annealing-Temperatur (von TmMAX + 6°C bis TmMAX + 14°C) durchgeführt werden, um eine im Wesentlichen hohe Nachweisempfindlichkeit der exprimierten Gene zu erhalten.
Die Sequenz der 2 Basen an der Seite des 3'-Endes eines jeden der Primer X und Y (N₁N₂ für Primer X und N₃N₄ für Primer Y) kann gleich oder verschieden sein, und es sind Basen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin.
Primer X und Primer Y lassen sich synthetisieren unter Anwendung eines allgemeinen Verfahrens zur Synthese von Primern, zum Beispiel mit dem Verfahren zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden mit Hilfe der Phosphoramidit-Methode (Letsinger et al., Nucleic Acids Research, 20, 1879-1882, 1992) und einem Verfahren, das beschrieben ist in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. 11-08018 .
Zur Erleichterung des Nachweises nach einer PCR ist es außerdem bevorzugt, vorher eine fluoreszierende Substanz an das Ende der beiden Primer zu binden. Vorzugsweise wird die fluoreszierende Substanz an das 5'-Ende des Primers X gebunden. Zu den fluoreszierenden Substanzen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, zählen 6-Carboxyfluorescein (FAM), 4,7,2',4',5',7'-Hexachlor-6-carboxyfluorescein (HEX), NED (Applied Biosystems, Japan), 6-Carboxy-X-rhodamin (Rox) und so weiter.
"Primersatz" bezieht sich auf einen Satz von Primern, der zusammengesetzt ist aus einem Primer X und einem Primer Y und zur Durchführung einer PCR mit einem in Schritt (h) erhaltenen Fragment einer doppelsträngigen Sequenz als Matrize eingesetzt wird.
Werden dabei als Primer X und Y, die den Primersatz bilden, Primer verwendet, die jeweils eine festgelegte Struktur der Sequenzen außer der Sequenz der 2 Basen (N₁N₂ für Primer X und N₃N₄ für Primer Y) an der Seite des 3'-Endes der jeweiligen Primersequenz aufweisen (z.B. ein MspI-Primer, gezeigt als SEQ ID NO 5, als Primer X, der in Beispiel 1 verwendet wird, und ein MseI-Primer, gezeigt als SEQ ID NO 6, als Primer Y, der in Beispiel 1 verwendet wird), so können je nach Art der Basen, die die 2-Basensequenz bilden, 16 verschiedene Primer X und 16 verschiedene Primer Y erhalten werden. Kombinationen aus diesen Primern X und Y führen zu 256 verschiedenen Primersätzen. Es ist bevorzugt, diese 256 verschiedenen Primersätze zu verwenden, da Genexpressionsprofile in einfacher Weise erstellt werden können, die die Expression nahezu aller Gene abdecken.
In Schritt (k) kann das Hilfsmittel "Durchführen einer Elektrophorese mit dem erhaltenen PCR-Produkt und Erfassen der Wanderungsstrecke und der Peaks zur Erstellung eines Genexpressionsprofils" irgendeines derjenigen sein, mit denen das Molekulargewicht (die Länge einer Basensequenz) und die Menge eines PCR-Produkts gemessen werden kann. Unter diesen ist die Elektrophorese im Hinblick auf hohe Auflösung vorzuziehen, und besonders bevorzugt ist die Gelelektrophorese. Wird eine Gelelektrophorese angewandt, so kann ein Gelelektrophorese-Gerät mit einer Analysen-Software kombiniert werden, um die Ergebnisse der Gelelektrophorese in Form eines Peak-Musters zu erhalten, das die Wanderungsstrecke und die Menge des abgetrennten PCR-Amplifikationsprodukts angibt. In diesem Peak-Muster steht die Wanderungsstrecke eines amplifizierten PCR-Produkts für ein bestimmtes Gen, und die Menge des ampli fizierten PCR-Produkts ist Ausdruck der Expressionsstärke des Gens. Demgemäß ist das Genexpressionsprofil bereits durch das Peak-Muster gegeben.
Als Gelelektrophorese-Gerät kann zum Beispiel ein ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, Japan), ein ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems, Japan) und ein MegaBASE 1000 (Amersham Pharmacia) verwendet werden, die man als Sequenzierungsautomaten bezeichnet. Als Analysen-Software kann zum Beispiel das GeneScan^TM (Applied Biosystems, Japan) verwendet werden.
Des Weiteren sei darauf verwiesen, dass jeder der vorstehend beschriebenen Schritte auch gemäß einem Verfahren durchgeführt werden kann, das in der internationalen Veröffentlichung WO 02/48352 A1 beschrieben ist.
Zudem ist die Größe eines Peaks, der in dem gemäß vorliegender Erfindung erstellten Genexpressionsprofil erscheint, Ausdruck der Expressionsstärke eines in einer Zelle von Interesse exprimierten Gens. Somit kann die Frequenz der Genexpression durch Beobachten der Änderungen der Größe des Peaks analysiert werden. Beispielsweise ist es möglich, Vergleiche zwischen einer normalen Zelle und einer abnormen Zelle, Vergleiche zwischen einer normalen Zelle und einer Krebszelle, Vergleiche zwischen verschiedenen Zellen und Vergleiche zwischen Zellen anzustellen, die unter verschiedenen Bedingungen behandelt wurden, und so weiter.
Im Folgenden soll die Annealing-Temperatur in Schritt (i), die ein Kennzeichen der vorliegenden Erfindung ist, ausführlich beschrieben werden.
In der PCR von Schritt (i) wird das Annealing eines Primersatzes an Matrizen, d.h., das Annealing eines Primers X und eines Primers Y, die den Primersatz bilden, an jeden der entsprechenden Stränge des in Schritt (h) erhaltenen Fragments einer doppelsträngigen Sequenz im Temperaturbereich TmMAX + 6°C bis TmMAX + 14°C des Primers durchgeführt, vorzugsweise im Bereich von TmMAX + 6°C bis TmMAX + 10°C des Primers und besonders bevorzugt im Bereich von TmMAX + 6°C bis TmMAX + 9°C des Primers.
Dabei bezieht sich die "TmMAX" des Primers auf den höheren der Tm-Werte eines Primer X und eines Primers Y, die den Primersatz bilden.
Darüber hinaus bezeichnet die "Tm" des Primers eine Temperatur, bei der sich ein aus einem Primer und einem Adaptor gebildeter Doppelstrang entknäuelt. Die Tm kann experimentell bestimmt werden gemäß einem Verfahren, das zum Beispiel bei Shoji Mizushima, Tairo Oshima, et al., "Basic Experiment of Life Science (Raifu Saiensu no Kiso Jikken im Japanischen)", Maruzen, beschrieben ist. Ist die Anzahl der Basen, die einen Primer bilden, kleiner als 20, so kann alternativ die Tm sehr einfach zum Beispiel nach folgender Formel berechnet werden, die in Kapitel 10,3 in Sambrook und Russel, "Molecular Cloning" 3. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press (USA), 2001, beschrieben ist: Tm (°C) = 2(A + T) + 4(G + C) (Formel 1)worin (A + T) die Summe aus der Anzahl der Adenin(A)- und Thymin(T)-Reste ist, die einen Primer bilden, und (G + C) die Summe aus der Anzahl der Cytosin(C)- und Guanin(G)-Reste ist.
Obwohl – wie vorstehend beschrieben – Tm experimentell und rechnerisch bestimmt werden kann und verschiedene Methoden zur Bestimmung verfügbar sind, kann irgendeine dieser Methoden angewandt werden, solange es die gleiche Methode ist, die zur Bestimmung der Tm eines Primers X und der Tm eines Primers Y angewandt wird.
Werden mehrere verschiedene Primersätze gleichzeitig verwendet, so ist es der größte der Tm-Werte eines Primers X und eines Primers Y, die den jeweils verwendeten Primersatz bilden, der als TmMAX gegeben ist. Wird das Annealing des Primersatzes der vorliegenden Erfindung im Temperaturbereich TmMAX + 6°C bis TmMAX + 14°C des Primers durchgeführt, so kann fehlerhaftes Annealing vermieden werden, was zu einer Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit eines exprimierten Gens führt.
Will man lediglich fehlerfreies Annealing von Primern an Matrizen, so sei darauf hingewiesen, dass dieser Zweck erreicht wird, indem man eine Annealing-Temperatur von TmMAX + 6°C des Primers oder mehr anwendet.
Allerdings wird die Enzymaktivität einer bei einer PCR verwendeten thermoresistenten Polymerase durch die Temperatur beeinflusst, und die thermoresistente Polymerase büßt ihre Funktion bei hohen Temperaturen ein, bei denen Enzyme denaturieren (z.B. 90°C oder mehr für eine Taq-Polymerase), wodurch sich der Wirkungsgrad der PCR verringert. Es ist daher notwendig, die Annealing-Temperatur auf eine Temperatur einzustellen, bei der eine thermoresistente Polymerase während der gesamten Reaktionszeit in der PCR hinreichend arbeiten kann (z.B. 75°C für Taq-Polymerase), oder darunter.
In Lichte des oben Gesagten wird bei der vorliegenden Erfindung die Annealing-Temperatur in Schritt (i) auf einen Temperaturbereich von TmMAX + 6°C bis TmMAX + 14°C des Primers und vorzugsweise auf einen Bereich von TmMAX + 6°C bis TmMAX + 9°C des Primers eingestellt, in dem fehlerfreies Annealing von Primern an Matrizen erzielt werden kann, wobei eine thermoresistente Polymerase hinreichend funktionieren und eine erhebliche Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit eines exprimierten Gens erreicht werden kann. Als Bedingungen für die PCR können im Übrigen solche Bedingungen angewandt werden, die üblicherweise für eine PCR angewandt werden, mit der Ausnahme der vorstehend erwähnten Annealing-Temperatur.
In Beispiel 1 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als Primer X ein Primer mit einer Sequenz verwendet, die komplementär ist zu ei nem Adaptor X, der eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einer Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms MspI (SEQ ID NO 5), und als Primer Y wird ein Primer mit einer Sequenz verwendet, die komplementär ist zu einem Adaptor Y, der eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einer Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms MseI (SEQ ID NO 6). In diesem Falle liegen die Tm-Werte des Primers X und des Primers Y, berechnet nach obiger Formel (1), im Bereich von 60 bis 64°C (d.h., TmMAX = 64°C), und somit liegt die Annealing-Temperatur im Bereich von 70°C (TmMAX + 6°C) bis 78°C (TmMAX + 14°C), ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (i)
durch Verwendung eines Adaptors mit den unter SEQ ID NO 1 und 2 gezeigten Sequenzen als Adaptor X und eines Adaptors mit den unter SEQ ID NO 3 und 4 gezeigten Sequenzen als Primer Y, und
durch Verwendung 256 verschiedener Primersätze, die zusammengesetzt sind aus einem Primer mit der unter SEQ ID NO 5 gezeigten Sequenz als Primer X und einem Primer mit der unter SEQ ID NO 6 gezeigten Sequenz als Primer Y, eine PCR bei einer Temperatur für das Annealing der Primer im Bereich von 70°C (TmMAX + 6°C) bis 73°C (TmMAX + 9C) durchgeführt.
Beispiele
Als nächstes soll die Wirkung der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen genau erklärt werden. Die vorliegende Erfindung soll jedoch nicht darauf beschränkt sein.
Als Indikator für die Nachweisempfindlichkeit eines exprimierten Gens wird das Vorhandensein eines falschen Peaks in einem Genexpressionsprofil genommen.
Ein Peak im Genexpressionsprofil ist ein Peak, der der Menge eines PCR-Produkts (ein Gen-Transkript) entspricht, das erhalten wird durch Amplifikation in einer PCR in Schritt (i) der vorliegenden Erfindung und nachgewiesen werden kann beispielsweise auf der Grundlage eines fluoreszierenden Farbstoffs, der an der Seite des 5'-Endes eines Primers X gebunden ist.
Ein falscher Peak bezeichnet einen Peak, der durch fehlerhaftes Annealing von 2 Basen (N₁N₂ für Primer X und N₃N₄ für Primer Y) am 3'-Ende der jeweiligen, einen Primersatz bildenden Primer an eine entsprechende nichtkomplementäre Basensequenz entsteht. Das Vorhandensein eines falschen Peaks bedeutet, dass zwar im Grunde genommen ein Gen-Transkript durch einen einzigen Peak nachgewiesen werden sollte (echter Peak), der durch einen einzigen spezifischen Primersatz erzeugt wird, der eine zu dem Gen-Transkript komplementäre Sequenz enthält, aber auch ein weiterer Peak durch einen nichtkomplementären Primersatz erzeugt wird (falscher Peak), was dazu führt, dass mehrere Peaks für ein Gen-Transkript erzeugt werden. Das Vorhandensein dieser mehreren Peaks für ein Gen-Transkript beeinflusst die Empfindlichkeit des Nachweises eines exprimierten Gens. Dadurch werden die analytischen Verfahren für die Genexpression auf der Grundlage eines Genexpressionsprofils komplizierter. Benötigt wird somit ein Verfahren zur Unterdrückung falscher Peaks oder ein Verfahren zum Ausschluss falscher Peaks aus der Analyse durch Unterscheidung derselben. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung besteht in der Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit eines exprimierten Gens, wobei das Auftreten falscher Peaks unterdrückt wird durch Festlegen der Art der in der PCR zu verwendenden Primer und der Temperatur des Annealings von Primern an Matrizen auf einen bestimmten Bereich.
Verfahren zur Abschätzung der Echtheit von Peaks
Die Echtheit eines Peak wurde abgeschätzt durch Vergleichen der Basensequenz eines einem bestimmten Gen entsprechenden amplifizierten PCR-Pro dukts, erhalten durch Verwendung von Primern mit bekannten Sequenzen, mit der Basensequenz des Gens einer bekannten, in bestehenden Datenbanken registrierten Sequenz, um zu bestimmen, ob es eine Übereinstimmung bei den Teilen in beiden Basensequenzen gibt, die den 2 Basen (N₁N₂ für Primer X und N₃N₄ für Primer Y) am 3'-Ende eines jeden der Primer entsprechen, oder nicht.
Im Einzelnen wurde die Echtheit eines Peaks gemäß folgenden Verfahren abgeschätzt:

1. Unter Verwendung eines bestimmten Primersatzes, zusammengesetzt aus den Primern X und Y mit bekannten Sequenzen, wurde ein Genexpressionsprofil mit Hilfe eines HiCEP-Verfahrens erstellt, um die Sequenz eines amplifizierten PCR-Produkts zu bestimmen, das einem im Profil erscheinenden Peak entspricht.
2. Eine den Basensequenzen der verwendeten Primer X und Y entsprechende Region wurde anhand der Sequenz des amplifizierten PCR-Produkts identifiziert, und es wurde nur der Teil der Basensequenz ausgewählt, der die identifizierten Regionen enthielt und sandwichartig zwischen diesen Regionen eingeschlossen war, wofür eine computergestützte Suche auf Homologie von Basensequenzen (BLAST) bezüglich der bestehenden Datenbank durchgeführt wurde. Die Echtheit wurde dann anhand der drei nachstehend beschriebenen Kriterien (1) bis (3) abgeschätzt. Ein in der nachstehenden Beschreibung erwähnter "Sinnstrang eines in der Datenbank registrierten Gens" in der "Basensequenz des in der Datenbank registrierten Gens" bezieht sich im Übrigen auf einen Strang mit einer Sequenz, die homolog ist zum Sinnstrang eines in Schritt (h) erhaltenen Fragments einer doppelsträngigen Sequenz, das als Matrize in der PCR verwendet werden soll. "Antisinnstrang eines in der Datenbank registrierten Gens" bezieht sich auf einen Strang mit einer Sequenz, die homolog ist zum Antisinnstrang des in Schritt (h) erhaltenen Fragments der doppelsträngigen Sequenz, das als Matrize in der PCR verwendet werden soll. Ein in der nachstehenden Beschreibung erwähnter "Sinnstrang eines amplifizierten PCR-Produkts" in dem "amplifizierten PCR-Produkt" bezieht sich zudem auf einen Strang mit einer Sequenz, die homolog ist zum Sinnstrang eines in Schritt (h) erhaltenen Fragments einer doppelsträngigen Sequenz, das als Matrize in der PCR verwendet werden soll, und "Antisinnstrang des amplifizierten PCR-Produkts" bezieht sich auf einen Strang mit einer Sequenz, die homolog ist zum Antisinnstrang des in Schritt (h) erhaltenen Fragments der doppelsträngigen Sequenz, das als Matrize in der PCR verwendet werden soll.
(1) Die Basensequenzen des Sinnstrangs und des Antisinnstrangs des anhand der Homologiesuche identifizierten amplifizierten PCR-Produkts (allerdings mit der Ausnahme des Teils, der dem jeweiligen Primer entspricht) stimmen jeweils zu 100% mit den Basensequenzen des Sinnstrangs und des Antisinnstrangs eines bestimmten, in der Datenbank registrierten Gens (dem gesamten oder einem Teil desselben) überein.
(2) Im Sinnstrang des amplifizierten PCR-Produkts liegt die Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms X in der Nähe der Seite des 5'-Endes der Region vor, die die in (1) erhaltene Übereinstimmung aufweist, und im Antisinnstrang des amplifizierten PCR-Produkts liegt die Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms Y in der Nähe der Seite des 5'-Endes der Region vor, die die in (1) erhaltene Übereinstimmung aufweist.
(3) Die Sequenz der 2 Basen (entsprechend der Basensequenz N₁N₂ des Primers X) an der Seite des 3'-Endes in unmittelbarer Nachbarschaft zur Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms X im Sinnstrang des in (2) ausgewerteten amplifizierten PCR-Produkts stimmt überein mit der Sequenz der 2 Basen (entsprechend der Basensequenz N₁N₂ des Primers X) an der Seite des 3'-Endes in unmittelbarer Nachbarschaft zur Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms X im Sinnstrang des in der Datenbank registrierten Gens, und die Sequenz der 2 Basen (entsprechend der Basensequenz N₃N₄ des Primers Y) an der Seite des 3'-Endes in unmittelbarer Nachbarschaft zur Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Y im Antisinnstrang des in (2) ausgewerteten amplifizierten PCR-Produkts stimmt überein mit der Sequenz der 2 Basen (entsprechend der Basensequenz N₃N₄ des Primers Y) an der Seite des 3'-Endes in unmittelbarer Nachbarschaft zur Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Y im Antisinnstrang des in der Datenbank registrierten Gens,
3. Erfüllt ein amplifiziertes PCR-Produkt, das einen bestimmten Peak ergibt, alle drei der vorstehend erwähnten Bedingungen, so wird der Peak als echter Peak angesehen, wie erhalten auf der Grundlage eines fehlerfreien Annealings von Primern.

Andererseits gibt es auch Peaks, die von einem PCR-Produkt gebildet werden, das den obigen Bedingungen (1) und (2), nicht aber der Bedingung (3) genügt. Verläuft eine Amplifikationsreaktion gemäß fehlerfreiem Annealing, so sollte das "amplifizierte PCR-Produkt" und das "in der Datenbank registrierte Gen" identische Sequenzen in dem Bereich aufweisen, welcher der Sequenz der 2 Basen (N₁N₂ für Primer X und N₃N₄ für Primer Y) an der Seite des 3'-Endes eines jeden Primers entspricht. Verläuft dagegen eine Amplifikationsreaktion nach einem fehlerhaften Annealing, so muss das letztlich erhaltene "amplifizierte PCR-Produkt" und das "in der Datenbank registrierte Gen" unterschiedliche Sequenzen in dem Teil aufweisen, der der Sequenz der 2 Basen an der Seite des 3'-Endes eines jeden der Primer entspricht, weil die Amplifikationsreaktion in deren nachfolgenden Zyklen mit dem Primer als Matrize abläuft, der das fehlerhafte Annealing verursacht hat. Daher wurde ein "amplifiziertes PCR-Produkt", das eine andere Sequenz in dem der Sequenz der 2 Basen an der Seite des 3'-Endes eines je den Primers entsprechenden Teil als das "in der Datenbank registrierte Gen" aufweist (d.h., ein PCR-Produkt, das der Bedingung (3) nicht genügt) als PCR-Produkt angesehen, das aus fehlerhaftem Annealing der Primer erhalten wurde, und somit wurde ein aus einem solchen PCR-Produkt gebildeter Peak als falscher Peak beurteilt.
Beispiel 1
Ein Genexpressionsprofil für Mausembryo-Fibroblasten (MEF) wurde mit Hilfe der folgenden Verfahren erstellt:
(a) Synthese einer eine Markierungssubstanz tragenden einzelsträngigen cDNA
Aus 107 Embryo-Fibroblasten (MEF), präpariert aus der C3H-Mauslinie, wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung eines RNAeasy MiniKit (Qiagen) extrahiert, und daraus wurde des Weiteren die Poly(A)-RNA unter Verwendung des Micro Fast Track Kit (Invitrogen) extrahiert. Ein am 5'-Ende mit Biotin als Markierungssubstanz modifizierter Oligo-dT-Primer (ein von Invitrogen synthetisiertes, spezielles Oligonucleotid), wurde unter Verwendung eines SuperScript First-Strand Systems (Invitrogen) zusammen mit der extrahierten Poly(A)-RNA als Matrize für die Synthese einer einzelsträngigen cDNA eingesetzt, die Biotin am 5'-Ende bezogen auf die einzelsträngige cDNA trug.
(b) Synthese einer doppelsträngigen cDNA
DNA-Polymerase I, Second Strand-Puffer und E. coli-DNA-Ligase (alle zu beziehen durch Invitrogen) wurden zusammen mit der in Schritt (a) synthetisierten einzelsträngigen cDNA als Matrize eingesetzt, um nach einem von Invitrogen empfohlenen Verfahren zur Synthese doppelsträngiger cDNA eine doppelsträn gige cDNA zu synthetisieren, die Biotin an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA trug.
(c) Spaltung mit Restriktionsenzym X
Die in Schritt (b) erhaltene doppelsträngige cDNA wurde mit MspI als erstem Restriktionsenzym X (TaKaRa) 4 Stunden bei 37°C gespalten.
(d) Gewinnung eines Fragments, das die Markierungssubstanz trägt
Ein Biotin tragendes Fragment wurde unter Verwendung von Magnetkügelchen, auf die Streptavidin als Substanz mit hoher Affinität zu Biotin (DYNAL) nach den von DYNAL empfohlenen Bedingungen immobilisiert worden war, aus den in Schritt (c) erhaltenen doppelsträngigen cDNA-Fragmenten gewonnen.
(e) Ligation eines Adaptors X
An die durch das Restriktionsenzym MspI erzeugte Spaltungsstelle des in Schritt (d) gewonnenen doppelsträngigen cDNA-Fragments wurde der MspI-Adaptor als Adaptor X, der eine zu der Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz enthielt (spezielle Oligo-Synthese von Invitrogen), (Basensequenz des MspI-Adaptors):
5'-AACACGAATGGCTACATGACACTCGGTT-3' (an der Sinnstrang-Seite der doppelsträngigen cDNA) (SEQ ID NO 1);
5'-CGAACCGAGTGTCATGTAGCCATTCGTGTT-3' (an der Antisinnstrang-Seite der doppelsträngigen cDNA) (SEQ ID NO 2),
unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (NEB (New England Biolabs)) bei 16°C über 16 Stunden oder länger ligiert, um ein Fragment zu erhalten, das mit dem MspI-Adaptor an der Seite des 5'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert war.
(f) Spaltung mit einem zweiten Restriktionsenzym Y
Das in Schritt (e) gewonnene Fragment der doppelsträngigen cDNA wurde mit MseI als zweitem Restriktionsenzym Y (NEB) 4 Stunden bei 37°C gespalten.
(g) Gewinnung eines Fragments, das die Spaltungsstelle des zweiten Restriktionsenzyms Y enthält
Das Biotin tragende Fragment wurde unter Verwendung von Magnetkügelchen (DYNAL), auf die Streptavidin nach den von DYNAL empfohlenen Bedingungen immobilisiert worden war, von den in Schritt (f) erhaltenen cDNA-Fragmenten abgetrennt, und es wurde das Fragment gewonnen, das die Spaltungsstelle des zweiten Restriktionsenzyms Y enthielt. Das erhaltene doppelsträngige cDNA-Fragment enthielt den MspI-Adaptor am 5'-Ende und die Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms MspI am 3'-Ende.
(h) Ligation eines Adaptors Y
An die durch das Restriktionsenzym MseI erzeugte Spaltungsstelle des in Schritt (g) gewonnenen doppelsträngigen cDNA-Fragments wurde der MseI-Adaptor als Adaptor Y, der eine zu der Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz enthielt (spezielle Oligo-Synthese von Invitrogen), (Basensequenz des MseI-Adaptors):
5'-AGTCACGAGTATCATACTGCGGGCGTCC-3' (an der Antisinnstrang-Seite der doppelsträngigen cDNA) (SEQ ID NO 3);
5'-TAGGACGCCCGCAGTATGATACTCGTGACT-3' (an der Sinnstrang-Seite der doppelsträngigen cDNA) (SEQ ID NO 4);
unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (NEB) bei 25°C über 16 Stunden oder länger ligiert, um ein Fragment zu erhalten, das mit dem MseI-Adaptor an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert war. Überschüssige Mengen Adaptor wurden mittels Ethanol-Präzipitation entfernt.
(i) PCR mit den Primer X und Y
(1) Synthese der Primer X und Y
Als Primer X wurden 16 verschiedene MspI-Primer, jeweils zusammengesetzt aus 20 Basen (Basensequenz des MspI-Primers):
5'-ACATGACACTCGGTTCGGN₁N₂-3'
(worin N₁N₂ CC, CT, CG, CA, TC, TT, TA, TG, AC, AA, AG, AT, GT, GC, GA oder GG ist) (SEQ ID NO 5), je nach Art von N₁N₂ mit Hilfe der speziellen Oligo-Synthese (Invitrogen) synthetisiert.
Als Primer Y wurden 16 verschiedene MseI-Primer, jeweils zusammengesetzt aus 20 Basen (Basensequenz des MseI-Primers):
5'-ATACTGCGGGCGTCCTAAN₃N₄-3'
(worin N₃N₄ CC, CT, CG, CA, TC, TT, TA, TG, AC, AA, AG, AT, GT, GC, GA oder GG ist) (SEQ ID NO 6), nach dem gleichen Verfahren wie beim MspI-Primer je nach Art von N₃N₄ synthetisiert.
Zudem wurden die MspI-Primer mit Hilfe der speziellen Oligo-Synthese (Invitrogen) mit den FAM, NED oder HEX genannten fluoreszierenden Markierungssubstanzen markiert.
Die resultierenden MseI-Primer (16 verschiedene Typen) und MspI-Primer (16 verschiedene Typen) wurden kombiniert, um insgesamt 256 (16·16) verschiedene Primerpaare (Primersätze) zu konstruieren.
Die Tm-Werte der Primer, die die insgesamt 256 (16·16; MseI-Primer (16 verschiedene Typen) und MspI-Primer (16 verschiedene Typen)) verschiedenen Primersätze bilden, waren je nach der jeweiligen Sequenz der 2 Basen (N₁N₂ für Primer X und N₃N₄ für Primer Y) an der Seite des 3'-Endes unterschiedlich. Gemäß der vorstehend beschriebenen Berechnungsformel (1) lagen die Werte jedoch im Bereich von 60°C bis 64°C. Folglich wurde der TmMAX-Wert auf 64°C festgelegt.
(2) PCR
Die erhaltenen 256 verschiedenen Primersätze wurden verwendet, um eine PCR mit dem in Schritt (h) erhaltenen Fragment der doppelsträngigen Sequenz als Matrize und TITANIUM Taq-DNA-Polymerase (Clontech) unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchzuführen. Die optimale Temperatur der verwendeten Polymerase liegt im Bereich von 72°C bis 74°C. Die Annealing-Temperatur war 70°C (TmMAX + 6°C).
PCR-Bedingungen:

1 min bei 95°C;
(20 s bei 98°C, 30 s bei 70°C und 1 min bei 72°C) × 28; und
30 s bei 60°C.

(j) Erstellung eines Genexpressionsprofils
Mit den in Schritt (h) erhaltenen PCR-Produkten wurde eine Elektrophorese mit einem PRISMA 3100 Kapillarelektrophorese-Gerät (Applied Biosystems) nach der von POP4 empfohlenen Vorschrift durchgeführt, um die Wanderungsstrecke und die Peaks zu erfassen. Auf der Grundlage der Ergebnisse der Elektrophorese wurde die Software GeneScan^TM (Applied Biosystems, Japan) eingesetzt, um ein Genexpressionsprofil zu erstellen, das die Wanderungsstrecke auf der horizontalen Achse zeigt, die das Molekulargewicht angibt, und die Fluoreszenzintensität auf der vertikalen Achse, die die Expressionsstärke angibt.
2 zeigt ein Genexpressionsprofil, das erhalten wurde durch Verwendung eines aus den folgenden Primern MspI (Primer X) und MseI (Primer Y) zusammengesetzten Primersatzes:
(MspI-Primer) 5'-ACATGACACTCGGTTCGGCG-3' (SEQ ID NO 7);
(MseI-Primer) 5'-ATACTGCGGGCGTCCTAATA-3' (SEQ ID NO 8).
In 2 gibt die vertikale Achse die Fluoreszenzintensität eines Peaks an, die ein amplifiziertes PCR-Produkt anzeigt und mit der Endmenge des amplifizierten PCR-Produkts korreliert. Die horizontale Achse gibt die Wanderungsstrecke des amplifizierten PCR-Produkts an und korreliert mit der Anzahl der Nucleotid-Reste, die das amplifizierte PCR-Produkt (entsprechend einem Gen) eines jeden Peaks bilden. Das heißt, die Größe eines im Profil erscheinenden Peaks zeigt die Menge eines amplifizierten PCR-Produkts an, das dem Peak entspricht, d.h., die Expressionsstärke eines Gens, das dem amplifizierten PCR-Produkt entspricht. Durch Beobachten der Veränderungen der Größe eines bestimmten Peaks kann daher die Expressionsfrequenz des entsprechenden Gens analysiert werden.
Beispiel 2
Ein Primersatz, bestehend aus den nachstehend gezeigten Primern X und Y, wurde verwendet, um ein Genexpressionsprofil für Mausembryo-Fibroblasten (MEF) nach ähnlichen Schritten wie in Beispiel 1 zu erstellen, mit der Ausnahme, dass die Temperatur für das Annealing der Primer an die Matrizen zu 70°C bis 76°C geändert wurde (in Inkrementen von 1°C).

MspI-Primer als Primer X (20 Basen): 5'-ACATGACACTCGGTTCGGTA-3' (SEQ ID NO 9);
MseI-Primer als Primer Y (20 Basen): 5'-ATACTGCGGGCGTCCTAACC-3' (SEQ ID NO 10).

Da gemäß der vorstehend beschriebenen Berechnungsformel (1) die Tm des MspI-Primers 60°C war und die Tm des MseI-Primers 64°C, wurde die Primer-TmMAX auf 64°C festgesetzt. Somit entspricht die in Beispiel 2 angewandte Annealing-Temperatur von 70°C bis 76°C einer TmMAX + 6°C bis TmMAX + 12°C des Primers.
Vergleichsbeispiel 1
Die gleichen Primer wie in Beispiel 2 wurden verwendet, um ein Genexpressionsprofil für die Mausembryo-Fibroblasten (MEF) nach ähnlichen Schritten wie in Beispiel 2 zu erstellen, mit der Ausnahme, dass die Temperatur für das Annealing der Primer an die Matrizen zu 67°C (TmMAX + 3°C) bis 69°C (TmMAX + 5°C) geändert wurde (in Inkrementen von 1°C).
Testbeispiel 1
Anhand von sechs Peaks, die willkürlich aus den in Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen Genexpressionsprofilen ausgesucht sind (wobei jedoch jeder der Peaks der Expression des identischen Gens in Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 1 entspricht), wird die Beziehung zwischen Annealing-Temperatur und Fluoreszenzintensität der Peaks erläutert (3A). In der Figur gibt die horizontale Achse die Annealing-Temperatur an und die vertikale Achse die Fluoreszenzintensität des Peaks des amplifizierten PCR-Produkts (entsprechend der Menge des amplifizierten PCR-Produkts und damit der Expressionsstärke des Gens).
Die sechs Peaks wurden grob in 2 Gruppen eingeteilt, d.h., Gruppe 1 und Gruppe 2. In der Gruppe 1 behielten die Peaks hohe Fluoreszenzintensität (hohe Nachweisempfindlichkeit) selbst bei Annealing-Temperaturen von 70°C oder höher bei (Legenden in der Figur: ∎, ⦁ und
, wobei die Zahlen neben den Legenden das Ausmaß der Wanderung eines amplifizierten PCR-Produkts entsprechend dem jeweiligen Peak zeigen (der Wert wird erhalten aus der Kalibrierung mit einem Größenstandard-Marker, der gleichzeitig mit der Probe des amplifizierten PCR-Produkts einer Elektrophorese unterzogen wird, das heißt, der Wert entspricht ungefähr der Länge eines dem amplifizierten PCR-Produkt entsprechenden Gen-Fragments)). In der Gruppe 2 nahm die Fluoreszenzintensität der Peaks bei einer Annealing-Temperatur von 70°C bis unter die Nachweisgrenze ab (Wert der Fluoreszenzintensität, der vom Hintergrund noch zu unterscheiden ist; d.h., eine Fluoreszenzintensität von 50 oder weniger) (Legenden in der Figur: ♢, ☐ und O).
Zur Abschätzung der Echtheit eines jeden Peaks wurde die Sequenz des dem jeweiligen Peak entsprechenden PCR-Produkts mit einem PRISMA 3100 Sequenzierungsautomaten bestimmt. Auf der Grundlage der erhaltenen Basensequenz wurde die Echtheit eines jeden Peaks gemäß dem vorstehend beschrie benen Verfahren zur Abschätzung der Echtheit eines Peaks bewertet. Die zur Bewertung genutzte, bestehende Datenbank war im Übrigen die öffentlich zugängliche Maus-EST-Datenbank (Genbank, EMBL und DDBJ).
Im Ergebnis wurde gefunden, dass der Peak von Gruppe 1 ein echter Peak ist, der von dem amplifizierten PCR-Produkt stammt, das allen Bedingungen (1) bis (3) in dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Abschätzung der Echtheit eines Peaks genügt, und dass der Peak von Gruppe 2 ein falscher Peak ist, der von dem amplifizierten PCR-Produkt stammt, das die Bedingungen (1) bis (2), nicht aber die Bedingung (3) erfüllt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es bei Durchführung des Annealings von Primern an Matrizen in einer PCR bei Temperaturen höher als TmMAX + 6°C (64°C + 6°C = 70°C) des Primers möglich ist, falsche Peaks zu reduzieren, und dass es bei Durchführung des Annealings insbesondere im Temperaturbereich TmMAX + 6°C (64°C + 6°C = 70°C) bis TmMAX + 9°C (64°C + 9°C = 73°C) möglich ist, falsche Peaks unter hinreichender Beibehaltung der Nachweisempfindlichkeit für echte Peaks zu reduzieren, woraus sich eine weitere Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit beim HiCEP-Verfahren ergibt.
Beispiel 3
Ein Primersatz, bestehend aus den nachstehend gezeigten Primern X und Y, wurde verwendet, um ein Genexpressionsprofil für Mausembryo-Fibroblasten (MEF) nach ähnlichen Schritten wie in Beispiel 1 zu erstellen, mit der Ausnahme, dass die Temperatur für das Annealing der Primer an die Matrizen zu 70°C bis 76°C geändert wurde (in Inkrementen von 1°C).

MspI-Primer als Primer X (20 Basen): 5'-ACATGACACTCGGTTCGGCG-3' (SEQ ID NO 11);
MseI-Primer als Primer Y (20 Basen): 5'-ATACTGCGGGCGTCCTAATA-3' (SEQ ID NO 12).

Da gemäß der vorstehend beschriebenen Berechnungsformel (1) die Tm des MspI-Primers 64°C war und die Tm des MseI-Primers 60°C, wurde die Primer-TmMAX auf 64°C festgesetzt. Somit entspricht die in Beispiel 3 angewandte Annealing-Temperatur von 70°C bis 76°C einer TmMAX + 6°C bis TmMAX + 12°C des Primers.
Vergleichsbeispiel 2
Die gleichen Primer wie in Beispiel 3 wurden verwendet, um ein Genexpressionsprofil für die Mausembryo-Fibroblasten (MEF) nach ähnlichen Schritten wie in Beispiel 3 zu erstellen, mit der Ausnahme, dass die Temperatur für das Annealing der Primer an die Matrizen zu 65°C (TmMAX + 1°C) bis 69°C (TmMAX + 5°C) geändert wurde (in Inkrementen von 1°C).
Testbeispiel 2
Anhand von sieben Peaks, die willkürlich aus den erhaltenen Genexpressionsprofilen ausgesucht sind, wird die Beziehung zwischen Annealing-Temperatur und Fluoreszenzintensität der Peaks in der gleichen Weise wie in 3A erläutert (3B).
Die sieben Peaks wurden grob in 2 Gruppen eingeteilt, d.h., Gruppe 1 und Gruppe 2. In der Gruppe 1 behielten die Peaks hohe Fluoreszenzintensität (hohe Nachweisempfindlichkeit) selbst bei Annealing-Temperaturen von 70°C oder höher bei (Legenden in der Figur: ∎, ⦁
und ♦), und in Gruppe 2 nahm die Fluoreszenzintensität der Peaks bei einer Annealing-Temperatur von 70°C bis unter die Nachweisgrenze ab (eine Fluoreszenzintensität von 50 oder weniger) (Legenden in der Figur: ☐, O und Δ).
Die Echtheit eines jeden Peaks wurde in ähnlicher Weise wie in Testbeispiel 1 abgeschätzt. Im Ergebnis wurde gefunden, dass der Peak von Gruppe 1 ein echter Peak ist, der von dem amplifizierten PCR-Produkt stammt, das allen Bedingungen (1) bis (3) in dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Abschätzung der Echtheit eines Peaks genügt, und dass der Peak von Gruppe 2 ein falscher Peak ist, der von dem amplifizierten PCR-Produkt stammt, das die Bedingungen (1) bis (2), nicht aber die Bedingung (3) erfüllt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es bei Durchführung des Annealings von Primern an Matrizen in einer PCR bei Temperaturen höher als TmMAX + 6°C (64°C + 6°C = 70°C) des Primers möglich ist, falsche Peaks zu reduzieren, und dass es bei Durchführung des Annealings insbesondere im Temperaturbereich TmMAX + 6°C (64°C + 6°C = 70°C) bis TmMAX + 9°C (64°C + 9°C = 73°C) möglich ist, falsche Peaks unter hinreichender Beibehaltung der Nachweisempfindlichkeit für echte Peaks zu reduzieren, woraus sich eine weitere Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit beim HiCEP-Verfahren ergibt.
Beispiel 4
Ein Primersatz, bestehend aus den nachstehend gezeigten Primern X und Y, wurde verwendet, um ein Genexpressionsprofil für Mausembryo-Fibroblasten (MEF) nach ähnlichen Schritten wie in Beispiel 1 zu erstellen, mit der Ausnahme, dass die Temperatur für das Annealing der Primer an die Matrizen zu 70°C bis 76°C geändert wurde (in Inkrementen von 1°C).

MspI-Primer als Primer X (20 Basen): 5'-ACATGACACTCGGTTCGGTG-3' (SEQ ID NO 13);
MseI-Primer als Primer Y (20 Basen): 5'-ATACTGCGGGCGTCCTAACC-3' (SEQ ID NO 14).

Da gemäß der vorstehend beschriebenen Berechnungsformel (1) die Tm des MspI-Primers 62°C war und die Tm des MseI-Primers 64°C, wurde die Primer-TmMAX auf 64°C festgesetzt. Somit entspricht die in Beispiel 4 angewandte Annealing-Temperatur von 70°C bis 76°C einer TmMAX + 6°C bis TmMAX + 12°C des Primers.
Vergleichsbeispiel 3
Die gleichen Primer wie in Beispiel 4 wurden verwendet, um ein Genexpressionsprofil für die Mausembryo-Fibroblasten (MEF) nach ähnlichen Schritten wie in Beispiel 4 zu erstellen, mit der Ausnahme, dass die Temperatur für das Annealing der Primer an die Matrizen zu 67°C (TmMAX + 3°C) bis 69°C (TmMAX + 5°C) geändert wurde (in Inkrementen von 1°C).
Testbeispiel 3
Anhand von fünf Peaks, die willkürlich aus den erhaltenen Genexpressionsprofilen ausgesucht sind, wird die Beziehung zwischen Annealing-Temperatur und Fluoreszenzintensität der Peaks in der gleichen Weise wie in 3A erläutert (3C).
Die fünf Peaks wurden grob in 2 Gruppen eingeteilt, d.h., Gruppe 1 und Gruppe 2. In der Gruppe 1 behielten die Peaks hohe Fluoreszenzintensität (hohe Nachweisempfindlichkeit) selbst bei Annealing-Temperaturen von 70°C oder höher bei (Legenden in der Figur: ∎ und ⦁), und in Gruppe 2 nahm die Fluoreszenzintensität der Peaks bei einer Annealing-Temperatur von 70°C bis unter die Nachweisgrenze ab (eine Fluoreszenzintensität von 50 oder weniger) (Legenden in der Figur: O, Δ und ⎕).
Die Echtheit eines jeden Peaks wurde in ähnlicher Weise wie in Testbeispiel 1 abgeschätzt. Im Ergebnis wurde gefunden, dass der Peak von Gruppe 1 ein echter Peak ist, der von dem amplifizierten PCR-Produkt stammt, das allen Bedingungen (1) bis (3) in dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Abschätzung der Echtheit eines Peaks genügt, und dass der Peak von Gruppe 2 ein falscher Peak ist, der von dem amplifizierten PCR-Produkt stammt, das die Bedingungen (1) bis (2), nicht aber die Bedingung (3) erfüllt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es bei Durchführung des Annealings von Primern an Matrizen in einer PCR bei Temperaturen höher als TmMAX + 6°C (64°C + 6°C = 70°C) des Primers möglich ist, falsche Peaks zu reduzieren, und dass es bei Durchführung des Annealings insbesondere im Temperaturbereich TmMAX + 6°C (64°C + 6°C = 70°C) bis TmMAX + 9°C (64°C + 9°C = 73°C) möglich ist, falsche Peaks unter hinreichender Beibehaltung der Nachweisempfindlichkeit für echte Peaks zu reduzieren, woraus sich eine weitere Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit beim HiCEP-Verfahren ergibt.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß vorliegender Erfindung lässt sich das Auftreten falscher Peaks verringern, die von fehlerhaftem Annealing von Primern beim Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils herrühren. Somit wird die Empfindlichkeit des Nachweises exprimierter Gene verbessert, wodurch es möglich wird, ein Genexpressionsprofil sehr genau zu erstellen.
Die Größe eines Peaks, der in dem gemäß vorliegender Erfindung erstellten Genexpressionsprofil erscheint, ist Ausdruck der Expressionsstärke eines in einer Zelle von Interesse exprimierten Gens. Somit kann die Frequenz der Genexpression durch Beobachten der Änderungen der Größe des Peaks analysiert werden. Beispielsweise ist es möglich, Vergleiche zwischen einer normalen Zelle und einer abnormen Zelle, Vergleiche zwischen einer normalen Zelle und einer Krebszelle, Vergleiche zwischen verschiedenen Zellen und Vergleiche zwischen Zellen anzustellen, die unter verschiedenen Bedingungen behandelt wurden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils, umfassend: (a) Synthetisieren einer einzelsträngigen cDNA unter Verwendung einer Poly(A)-RNA als Matrize, wobei eine einzelsträngige cDNA synthetisiert wird, die eine Markierungssubstanz an der Seite des 5'-Endes bezogen auf die einzelsträngige cDNA trägt; (b) Synthetisieren einer doppelsträngigen cDNA unter Verwendung der in Schritt (a) synthetisierten einzelsträngigen cDNA als Matrize, wobei eine doppelsträngige cDNA erhalten wird, die eine Markierungssubstanz an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA trägt; (c) Spalten der in Schritt (b) erhaltenen doppelsträngigen cDNA mit einem ersten Restriktionsenzym X; (d) Gewinnen eines Fragments, das die Markierungssubstanz trägt, aus den in Schritt (c) erhaltenen Fragmenten durch Verwendung einer Substanz, die hohe Affinität zur Markierungssubstanz aufweist; (e) Ligieren eines Adaptors X, der eine zur Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz und eine zur Sequenz eines Primers X komplementäre Sequenz enthält, an die Spaltungsstelle des wie in Schritt (d) gewonnenen Fragments, das durch das erste Restriktionsenzym X erzeugt wurde, um ein Fragment zu erhalten, das mit dem Adaptor X an der Seite des 5'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert ist; (f) Spalten des in Schritt (e) gewonnenen Fragments mit einem zweiten Restriktionsenzym Y, das den Adaptor X nicht spaltet; (g) Abtrennen eines Fragments, das die Markierungssubstanz trägt, von den in Schritt (f) erhaltenen Fragmenten durch Verwendung einer Substanz, die hohe Affinität zur Markierungssubstanz aufweist, um ein Fragment zu gewinnen, das die durch das zweite Restriktionsenzym Y erzeugte Spaltungsstelle an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA enthält; (h) Ligieren eines Adaptors Y, der eine zur Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz und eine zur Sequenz eines Primers Y komplementäre Sequenz enthält, an die Spaltungsstelle des wie in Schritt (g) gewonnenen Fragments, das durch das zweite Restriktionsenzym Y erzeugt wurde, um ein Fragment einer doppelsträngigen Sequenz zu erhalten, das mit dem Adaptor Y an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert ist; (i) Durchführen einer PCR mit dem Fragment der in Schritt (h) erhaltenen doppelsträngigen Sequenz als Matrize unter Verwendung eines Primersatzes, bestehend aus einem Primer X, der eine zur Sequenz des Adaptors X komplementäre Sequenz enthält, die eine Sequenz aus 2 Basen N₁N₂ (N₁ und N₂ können gleiche oder verschiedene Basen sein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) an der Seite des 3'-Endes bezogen auf den Primer X aufweist, und einem Primer Y, der eine zur Sequenz des Adaptors Y komplementäre Sequenz enthält, die eine Sequenz aus 2 Basen N₃N₄ (N₃ und N₄ können gleiche oder verschiedene Basen sein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) an der Seite des 3'-Endes bezogen auf den Primer Y aufweist; und (j) Durchführen einer Elektrophorese mit dem erhaltenen PCR-Produkt und Erfassen der Wanderungsstrecke und der Peaks zur Erstellung eines Genexpressionsprofils, wobei in Schritt (i) das Annealing von Primer X und Primer Y an den Adaptor X bzw. den Adaptor Y im Temperaturbereich TmMAX + 6°C bis TmMAX + 14°C des Primers durchgeführt wird.
Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils nach Anspruch 1, wobei in Schritt (i) das Annealing von Primer X und Primer Y an den Adaptor X bzw. den Adaptor Y im Temperaturbereich TmMAX + 6°C bis TmMAX + 9°C durchgeführt wird.
Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils nach Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt (i) 256 verschiedene Primersätze, die aus 16 verschiedenen Primern X und 16 verschiedenen Primern Y in Kombination bestehen, als Primersatz verwendet werden.
Verfahren zur Erstellung eines Genexpressionsprofils nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in Schritt (i) der Primer X 5'-ACATGACACTCGGTTCGGN₁N₂-3' ist, worin N₁N₂ CC, CT, CG, CA, TC, TT, TA, TG, AC, AA, AG, AT, GT, GC, GA oder GG ist; und der Primer Y 5'-ATACTGCGGGCGTCCTAAN₃N₄-3' ist, worin N₃N₄ CC, CT, CG, CA, TC, TT, TA, TG, AC, AA, AG, AT, GT, GC, GA oder GG ist.
Verfahren zum Analysieren der Frequenz einer Genexpression, umfassend: (a) Synthetisieren einer einzelsträngigen cDNA unter Verwendung einer Poly(A)-RNA als Matrize, wobei eine einzelsträngige cDNA synthetisiert wird, die eine Markierungssubstanz an der Seite des 5'-Endes bezogen auf die einzelsträngige cDNA trägt; (b) Synthetisieren einer doppelsträngigen cDNA unter Verwendung der in Schritt (a) synthetisierten einzelsträngigen cDNA als Matrize, wobei eine doppelsträngige cDNA erhalten wird, die eine Markierungssub stanz an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA trägt; (c) Spalten der in Schritt (b) erhaltenen doppelsträngigen cDNA mit einem ersten Restriktionsenzym X; (d) Gewinnen eines Fragments, das die Markierungssubstanz trägt, aus den in Schritt (c) erhaltenen Fragmenten durch Verwendung einer Substanz, die hohe Affinität zur Markierungssubstanz aufweist; (e) Ligieren eines Adaptors X, der eine zur Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz und eine zur Sequenz eines Primers X komplementäre Sequenz enthält, an die Spaltungsstelle des durch das erste Restriktionsenzym X erzeugten und in Schritt (d) gewonnenen Fragments, um ein Fragment zu erhalten, das mit dem Adaptor X an der Seite des 5'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert ist; (f) Spalten des in Schritt (e) gewonnenen Fragments mit einem zweiten Restriktionsenzym Y, das den Adaptor X nicht spaltet; (g) Abtrennen eines Fragments, das die Markierungssubstanz trägt, von den in Schritt (f) erhaltenen Fragmenten durch Verwendung einer Substanz, die hohe Affinität zur Markierungssubstanz aufweist, um ein Fragment zu gewinnen, das die durch das zweite Restriktionsenzym Y erzeugte Spaltungsstelle an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA enthält; (h) Ligieren eines Adaptors Y, der eine zur Sequenz der Spaltungsstelle komplementäre Sequenz und eine zur Sequenz eines Primers Y komplementäre Sequenz enthält, an die Spaltungsstelle des wie in Schritt (g) gewonnenen Fragments, das durch das zweite Restriktionsenzym Y erzeugt wurde, um ein Fragment einer doppelsträngigen Sequenz zu erhalten, das mit dem Adaptor Y an der Seite des 3'-Endes bezogen auf die doppelsträngige cDNA ligiert ist; (i) Durchführen einer PCR mit dem Fragment der in Schritt (h) erhaltenen doppelsträngigen Sequenz als Matrize unter Verwendung eines Primersatzes, bestehend aus einem Primer X, der eine zur Sequenz des Adaptors X komplementäre Sequenz enthält, die eine Sequenz aus 2 Basen N₁N₂ (N₁ und N₂ können gleiche oder verschiedene Basen sein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) an der Seite des 3'-Endes bezogen auf den Primer X aufweist, und einem Primer Y, der eine zur Sequenz des Adaptors Y komplementäre Sequenz enthält, die eine Sequenz aus 2 Basen N₃N₄ (N₃ und N₄ können gleiche oder verschiedene Basen sein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) an der Seite des 3'-Endes bezogen auf den Primer Y aufweist; (j) Durchführen einer Elektrophorese mit dem erhaltenen PCR-Produkt und Erfassen der Wanderungsstrecke und der Peaks zur Erstellung eines Genexpressionsprofils; und (k) Analysieren der Änderungen der Frequenz der Genexpression einer Zelle von Interesse durch Vergleichen zweier in den Schritten (a) bis (i) erhaltener Genexpressionsprofile, wobei in Schritt (i) das Annealing von Primer X und Primer Y an den Adaptor X bzw. den Adaptor Y im Temperaturbereich TmMAX + 6°C bis TmMAX + 14°C des Primers durchgeführt wird.