DE10246824A1

DE10246824A1 - Hybridisierungsproben reduzierter Komplexität

Info

Publication number: DE10246824A1
Application number: DE2002146824
Authority: DE
Inventors: Achim Dr. Fischer
Original assignee: Axaron Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2002-10-08
Filing date: 2002-10-08
Publication date: 2004-04-22
Also published as: AU2003273960A1; WO2004033721A3; WO2004033721A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays mit einer komplexitätsreduzierten Version des Nukleinsäure-Gemisches, wobei das zu analysierende Nukleinsäure-Gemisch mindestens mit einer Bcgl-ähnlichen Restriktionsendonuklease geschnitten, markiert und gegebenenfalls isoliert wird. DOLLAR A Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Hybridisierungsprobe, umfassend ein markiertes Nukleinsäurefragment-Gemisch mit im wesentlichen identisch langen Fragmenten und mit verbesserter Hybridisierungsspezifität, welche nach dem oben genannten Verfahren erhältlich ist. DOLLAR A Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines markierten Nukleinsäurefragment-Gemisches mit im wesentlichen identisch langen Fragmenten, welches nach dem oben genannten Verfahren erhältlich ist zur Hybridisierung mit immobilisierten Nukleinsäuren, insbesondere mit DNA-Arrays.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays mit einer komplexitätsreduzierten Version des Nukleinsäure-Gemisches, wobei das zu analysierende Nukleinsäure-Gemisch mindestens mit einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease geschnitten, markiert und gegebenenfalls isoliert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Hybridisierungsprobe (engl.: „sample") umfassend ein markiertes Nukleinsäurefragment-Gemisch mit im wesentlichen identisch langen Fragmenten und mit verbesserter Hybridisierungsspezifität, welche nach dem oben genannten Verfahren erhältlich ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines markierten Nukleinsäurefragment-Gemisches mit im wesentlichen identisch langen Fragmenten, welches nach dem oben genannten Verfahren erhältlich ist zur Hybridisierung mit immobilisierten Nukleinsäuren, insbesondere mit DNA-Arrays.
Hybridisierungen von DNA-Microarrays werden derzeitig zumeist mit komplexen Nukleinsäure-Gemischen als Hybridisierungsproben durchgeführt, vorzugsweise mit Gemischen aus den vollständigen cDNAs einer definierten Herkunft, insbesondere mit Gemischen der vollständigen cDNAs aus einem bestimmten Organ, Gewebe oder aus einem bestimmten Organismus. Wie beispielsweise in Science 1995 Oct 20;270(5235):467–70 und in Nat Biotechnol 1996 Dec;14(13):1675–80) beschrieben wurde, weisen solche Hybridisierungen von DNA-Arrays mit Hybridisierungsproben, bestehend aus den vollständigen cDNAs einer definierten Herkunft oftmals eine zu geringe Hybridisierungsspezifität und Empfindlichkeit auf, um eine zuverlässige Expressionsanalyse von cDNA-Gemischen definierter Herkunft zu liefern.
Die Hauptursache der limitierten Hybridisierungsspezifität der derzeitig eingesetzten Hybridisierungsproben, die meist ein Gemisch aus allen vollständigen cDNAs aus einem bestimmen Organismus, Gewebe oder Organ umfassen, ist ihre oftmals enorme Komplexität. Die Komplexität der eingesetzten Hybridisierungsproben wird in der Regel als das Produkt aus Länge der einzelnen Nukleinsäuremoleküle und der Anzahl verschiedener Nukleinsäuremolekülsorten im Gemisch erfaßt. Sind in einer Probe beispielsweise 15.000 verschiedene cDNA-Moleküle einer Durchschnittslänge von 2,5 kb vorhanden, so beträgt die Komplexität der Probe 2.500 × 15.000 = 3,7 × 10⁷. Hiervon trägt nur ein kleiner Teil zum Erhalt der gewünschten spezifischen Hybridisierungsereignisse bei, nämlich diejenigen Teilsequenzen, zu welchen an der Oberfläche des DNA-Arrays immobilisierte Nukleinsäuremoleküle mit komplementärer Sequenz (die sog. Hybridisierungssonden, engl.: „probes") existieren. Alle übrigen Teilsequenzen sollten durch ihre Tendenz zur „Kreuzhybridisierung", also der „unspezifischen" Hybridisierung mit nicht perfekt komplementären oberflächengebundenen Hybridisierungssonden, zur Entstehung von Hintergrundsignalen führen. Dies gilt insbesondere für sog. Oligonukleotid-Arrays, welche immobilisierte Oligonukleotide einer Länge von meist 20– 100 by tragen, denn hier ist das Verhältnis von „gewünschten" Sequenzbereichen (zu welchen komplementäre, immobilisierte Nukleinsäuremoleküle auf dem DNA-Array existieren) zu „unerwünschten" Sequenzbereichen (zu welchen keine komplementären, immobilisierten Nukleinsäuremoleküle als „Gegenstück" auf dem DNA-Array vorliegen) besonders ungünstig. Andererseits ist bei sogenannten „cDNA-Arrays", also Arrays, bei denen die Hybridisierungssonden durch längere, meist deutlich über 100 by lange Nukleinsäuremoleküle, wie insbesondere durch PCR-Produkte, gebildet werden, die Länge der gebildeten Hybride größer als für die maximal erreichbare Hybridisierungsspezifität erforderlich, so daß in diesem Fall eine überflüssig hohe Komplexität auf Seite der Hybridisierungssonden vorliegt, welche ebenfalls zu erhöhtem Hintergrund durch Kreuzhybridisierung führt.
Für die Hybridisierung von DNA-Arrays erscheint es somit zur Reduktion der Kreuzhybridisierung und damit zur Verbesserung der Hybridisierungsspezifität sinnvoll, die Komplexität der als Hybridisierungsproben eingesetzten komplexen cDNA-Gemische zu reduzieren. Bei einer solchen Reduktion der Komplexität der eingesetzten Hybridisierungsprobe sollte somit Idealerweise nur die Nukleinsäure-Sequenzmenge pro cDNA, nicht aber die Zahl der im Nukleinsäure-Gemisch vertretenen cDNAs erniedrigt werden. Weiterhin ist anzustreben, daß die Komplexität der immobilisierten Hybridisierungssonden im wesentlichen der Komplexität der Hybridisierungsprobe entspricht.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Komplexitätserniedrigung von Nukleinsäuremolekül-Gemischen bekannt.
Lisitsyn et al. (Science 1993 Feb 12;259 (5097): 946–51) beschreiben ein Verfahren, das „Representational Difference Analysis" (RDA) genannt wird. RDA beruht auf der Erzeugung von sogenannten „Repräsentationen" des ursprünglichen Nukleinsäure-Gemisches durch Restriktionsdau mit nicht häufig schneidenden Restriktionsendonukleasen, gefolgt von einer Amplifikation der kleineren hierbei erzeugten Fragmente. Längere Fragmente (beispielsweise über 1 kb) werden unter den gewählten Bedingungen nicht effizient amplifiziert, so daß das Amplifikationsprodukt im wesentlichen aus einer Mischung kürzerer Fragmente besteht. Nachteil dieses Verfahrens ist das Fehlen eines eindeutigen Selektionskriteriums derjenigen Nukleinsäuremoleküle, welche in einer Repräsentation vorhanden sein oder fehlen sollen, da zwischen gut amplifizierbaren, kurzen und schlecht amplifizierbaren, langen Nukleinsäurefragmenten ein Kontinuum besteht. Das Fehlen eines solchen eindeutigen Kriteriums wirkt sich nachteilig auf die Reproduzierbarkeit des Verfahrens aus. Da bei PCR-basierten Amplifikationsverfahren cDNA-Fragmente mit bis zu 1 kb Länge noch mit großer Effizienz entstehen können, ist außerdem der Umfang der erwünschten Komplexitätserniedrigung pro cDNA eher gering, der Umfang der unerwünschten Komplexitätserniedrigung bezüglich der Anzahl der repräsentierten cDNAs jedoch eher groß, wodurch viele verschiedene Parallelexperimente notwendig werden.
Ein weiteres Verfahren, die sogenannte „Differential Display"-Technik (DD), wird von Liang und Pardee (Science 1992 Aug 14;257(5072):967–71) beschrieben. DD beruht auf der Verwendung von kurzen Primern mit zufälliger Sequenz („arbitrary primers") zur Amplifikation von cDNA-Fragmenten aus einer cDNA-Präparation. Abhängig von Primersequenzen und Amplifikationsbedingungen (vor allem abhängig von der Elongationszeit, sowie von der annealing-Temperatur) werden Fragmentmischungen definierter Zusammensetzung erhalten. Nachteile von DD sind jedoch schlechte Reproduzierbarkeit, Überlappung der einzelnen Fragmentpools, Unterrepräsentation schwach exprimierter Transkripte sowie die schlechte Vorhersagbarkeit der erhaltenen Ergebnisse.
Ein anderes Verfahren zur Komplexitätsreduktion wird in EP 0 650 528 beschrieben. Hier werden Nukleinsäuremolekül-Populationen mit Typ IIS-Restriktionsendonukleasen behandelt, welche überhängende Enden mit unbekannter Sequenz erzeugen. Anschließend wird das überhängende Strangende mit einer Vielzahl an Adaptoren, welche ebenfalls mit unterschiedliche überhängende Enden besitzen, ligiert. Auf diese Weise wird die Einteilung der erzeugten Fragmente in verschiedene Subpopulationen und damit eine Reduktion der Komplexität der verschiedenen Subpopulationen gegenüber der ursprünglichen Population vorgenommen.
Ein ähnliches Verfahren wird in der US-A 6,361,947 zur Komplexitätsreduktion genomischer DNA offenbart. Nachteile dieses Verfahrens und des Verfahrens nach EP 0 650 528 sind aber die eingeschränkte Reproduzierbarkeit der Verfahren aufgrund von sogenannten „Fehlligationen". Solche Fehlligationen äußern sich in der Verknüpfung von nicht perfekt komplementären überhängenden Enden. Fehlligationen sind zu einem bestimmten Prozentsatz bei allen bekannten DNA-Ligasen zu beobachten und limitieren entscheidend die Reproduzierbarkeit des Verfahrens.
In US-A 6,352,829 wird ein Verfahren zur Komplexitätsreduktion beschrieben, welche auf der Erzeugung von Nukleinsäuremolekül-Subpopulationen mittels genspezifischer Primer beruht. Spezieller Nachteil dieses Verfahrens ist, daß hierbei nur eine wenig komplexe Subpopulation bekannter und ausgewählter Nukleinsäuremoleküle und nicht die Gesamtheit der Nukleinsäuremoleküle im cDNA-Gemisch untersucht werden kann.
Auch bei diesem Verfahren zur Reduzierung der Komplexität ist der Umfang der erwünschten Komplexitätserniedrigung pro cDNA (Sequenzumfang pro cDNA) eher gering, der Umfang der unerwünschten Komplexitätserniedrigung bezüglich der Anzahl der repräsentierten cDNAs in der Subpopulation jedoch eher groß, wodurch viele verschiedene Parallelexperimente notwendig werden.
Die geringe Komplexitätserniedrigung pro cDNA führt dazu, daß bei der Array-Hybridisierung mit der nach dem obigen Verfahren hergestellten Hybridisierungsprobe viele Nukleinsäuremoleküle in voller oder in nahezu voller Länge teilnehmen. Dies wiederum bedeutet, daß bei der Hybridisierung selbst auch Molekülabschnitte zugegen sind, welche nicht zur spezifischen Hybridisierung beitragen, sondern lediglich ein Hintergrundsignal durch Kreuzhybridisierung erzeugen können.
Alle vorstehend genannten Verfahren zur Komplexitätserniedrigung von Nukleinsäure-Gemischen haben, sofern sie für die Komplexitätsreduktion von Hybrisierungsproben eingesetzt werden, mindestens einen der nachfolgenden Nachteile:

– Da bei den meisten Verfahren zur Komplexitätserniedrigung einer Hybridisierungsprobe – vor allem bei den auf PCR-Amplifikationen basierenden Verfahren – noch relativ große cDNA-Fragmente generiert werden, ist der Umfang der erwünschten Komplexitätserniedrigung pro cDNA bei diesen Verfahren eher gering. Dadurch sind noch relativ viele Nukleotidsequenzen bei der Hybridisierung zugegen, die nicht zu einer spezifischen Hybridisierung, sondern lediglich zur unspezifischen Kreuzhybridisierung beitragen.
– Bei den meisten Verfahren ist der Umfang der unerwünschten Komplexitätserniedrigung bezüglich der Anzahl der in der Hybridisierungsprobe repräsentierten cDNAs eher groß. Dadurch werden viele verschiedene zeit- und kostenaufwendige parallele Hybridisierungen notwendig, um alle in der Hybridisierungsprobe vertretenen cDNAs abzudecken.
– Bei den meisten Verfahren zur Komplexitätserniedrigung – vor allem bei den auf PCR-Amplifikationen basierenden Verfahren – ist die Reproduzierbarkeit gering.
– Da bei den meisten Verfahren zur Komplexitätserniedrigung noch relativ große Nukleinsäure-Fragmente generiert werden, erlauben es diese Verfahren nicht, die Existenz bzw. die Expressionsniveaus alternativer Spleiß-Varianten zu detektieren oder zu analysieren.

Neben der in der Regel zu großen Komplexität der für Array-Hybridisierungen nach dem Stand der Technik als Hybridisierungsproben eingesetzten Nukleinsäure-Gemische gibt es weitere Ursachen, die zu einer unzureichenden Hybridisierungsspezifität bei der Hybridisierung mit komplexen Hybridisierungsproben führen können. So unterscheiden sich beispielsweise die einzelnen Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäure-Fragmente, aus denen die komplexe Hybridisierungsprobe besteht, in der Regel in ihrer Länge.
Längere Nukleinsäurefragmente unterscheiden sich von kürzeren Nukleinsäurefragmenten in ihren optimalen Hybridisierungs- und Waschbedingungen, wie insbesondere

– in der optimalen Hybridisierungs- und Waschtemperatur,
– in der optimalen Zusammensetzung der Hybridisierungs- und Waschlösungen,
– sowie in den optimalen Hybridisierungs- und Waschzeiten.

Die Hybridisierung von DNA-Arrays mit komplexen Hybridisierungsproben, d.h. zumeist mit einem Gemisch aus unterschiedlich langen DNAs bzw. DNA-Fragmenten, wird daher grundsätzlich unter solchen Hybridisierungs- und Waschbedingungen durchgeführt, die für die mittlere Größe der DNAs oder der DNA-Fragmente optimal sind. Dies kann zur Folge haben, daß besonders kleine oder besonders große Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Fragmente unter diesen „mittleren Hybridisierungsbedingungen" nicht mit ausreichender Spezifität hybridisieren und daher im Ergebnis unter- oder überrepräsentiert sein können.
Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung dieses Nukleinsäure-Gemisches mit einem DNA-Array bereitzustellen, bei dem ein Verfahrensschritt zur Reduktion der Komplexität des als Hybridisierungsprobe eingesetzten Nukleinsäure-Gemisches vorgesehen ist, welcher die vorstehend beschriebenen Nachteile der bereits bekannten Verfahren zur Komplexitätsreduktion von Nukleinsäure-Gemischen überwindet.
Insbesondere war es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung dieses Nukleinsäure-Gemisches mit einem DNA-Array bereitzustellen, bei dem

– die Komplexität der vom Nukleinsäure-Gemisch bereitgestellten Sequenzmengen pro Nukleinsäuresorte (z.B. pro cDNA) stark reduziert wird,
– die Komplexität der vom Nukleinsäure-Gemisch bereitgestellten unterschiedlichen Nukleinsäuresorten (z.B. unterschiedliche cDNAs) möglichst nicht reduziert wird,
– eine gute Reproduzierbarkeit des Verfahrens gegeben ist,
– die Fragmentlängen aller unterschiedlichen Nukleinsäuren des Nukleinsäure-Gemisches (z.B. aller cDNAs im Gemisch) mindestens weitgehend identisch sind, und
– die Fragmentlängen so kurz sind, daß in der Regel auch alternative Spleiß-Varianten bei der Analyse unterschieden werden können.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays, der immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt, mit einem markierten, komplexitätsreduzierten Nukleinsäure-Gemisch als Hybridisierungsprobe, mit den folgenden Verfahrensschritten:

(1a) Schneiden des Nukleinsäure-Gemisches mit einer oder mehreren BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten,
(2a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten aus (1a),
(3a) Markierung der Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches aus (1a) oder (2a),
(4a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus markierten und identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten aus Schritt (3a),
(5a) Hybridisierung eines DNA-Arrays mit dem Gemisch aus Schritt (3a) oder (4a) als Hybridisierungsprobe,
(6a) Auswertung der Hybridisierung.

Das vorstehend beschriebene Verfahren dient der Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches mit Hilfe eines DNA-Arrays. Bevorzugte Analysen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können, betreffen die Expressionsanalyse von Nukleinsäure-Gemischen einer definierten Herkunft, die Identifizierung von kurzen Nukleinsäure-tags in einem Nukleinsäure-Gemisch, sowie besonders bevorzugt vergleichende Expressions- und/oder Sequenz-Analysen von mehreren Nukleinsäure-Gemischen unterschiedlicher Herkunft. Hierbei dient das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere der vergleichenden Expressions- und/oder Sequenz-Analyse von verschiedenen Gemischen aus cDNA, genomischer DNA oder RNA, welche jeweils aus unterschiedlichen oder auf unterschiedliche Weise behandelten Organismen, Geweben oder Organen gewonnen wurden.
In Verfahrensschritt (1a) wird das zu analysierende Nukleinsäure-Gemisch zunächst mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease geschnitten, wobei ein Gemisch aus Nukleinsäure-Fragmenten generiert wird. Die einzelnen Nukleinsäure-Fragmente sind hierbei – sofern sie aus dem Verdau mit dem gleichen BcgI-ähnlichen Restriktionsenzym stammen – meist identisch lang. Beim Verdau des Nukleinsäure-Gemisches mit mehr als einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease können die Fragmente, die aus den unterschiedlichen Restriktionen hervorgehen, unterschiedlich lang sein. Weiterhin können unterschiedlich lange Fragmente auch dadurch entstehen, daß das Nukleinsäure-Gemisch mit einer auf nicht eindeutige Weise schneidenden BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease verdaut wird. Ein Beispiel für eine solche auf nicht eindeutige Weise schneidende BcgI-ähnliche Restriktionsendonuklease ist Hin4I, welche entweder in einer Entfernung von 13 oder von 14 Nukleotiden von seiner Erkennungsstelle einen Strangbruch katalysieren kann, so daß hierbei Fragmente mit sehr geringen Längendifferenzen entstehen können.
Bei Durchführung eines Restriktionsverdaus des Nukleinsäure-Gemisches mit den oben genannten nicht eindeutig schneidenden BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen bzw. mit Kombinationen von BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen entstehen jedoch in der Regel Fragmente, deren Länge lediglich in geringem Ausmaß differiert. Solche Fragment-Gemische werden daher im folgenden als Nukleinsäure-Fragment-Gemische mit einer „im wesentlichen identischen Fragmentlänge" bezeichnet.
Die Längenunterschiede zwischen den kürzesten und den längsten Fragmenten, die durch einen Restriktionsverdau mit BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen erzeugt wurden, betragen in der Regel nicht mehr als 25%, vorzugsweise nicht mehr als 10%, insbesondere nicht mehr als 5%. Hierbei sind mit Fragmenten selbstverständlich nicht solche Fragmente gemeint, welche sich zwischen zwei Schnittstellen für die eingesetzte(n) BcgI-ähnliche(n) Restriktionsendonuklease(n) befanden, sondern diejenigen Fragmente, welche ihrerseits eine Erkennungsstelle für die BcgI-ähnliche Restriktionsendonuklease aufweisen, mittels derer sie erzeugt wurden.
In jedem Fall sind die Längendifferenzen verschiedener mittels einer oder mehrerer BcgI-ähnlicher Restriktionsendonuklease(n) erzeugter Fragmente so gering, daß die gleichen Hybridisierungsbedingungen für alle erzeugten Fragmente zur Anwendung kommen können, ohne daß unspezifische Hybridisierung einzelner Fragmente störend in Erscheinung tritt.
Unter BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen werden solche Restriktionsendonukleasen verstanden, die einen als Substrat dienenden DNA-Doppelstrang an zwei Stellen, beispielsweise beidseitig ihrer Erkennungssequenz, schneiden. Hierfür müssen im Gegensatz zu konventionellen Restriktionsendonukleasen vom Typ II oder IIs, welche einen als Substrat dienenden Doppelstrang an einer Stelle schneiden und hierfür zwei Einzelstrangbrüche katalysieren, vier Einzelstrangbrüche katalysiert werden, so daß ein kurzes Doppelstrang-Fragment definierter Länge (i.d.R. zwischen 20 und 30 bp) freigesetzt wird (Nucleic Acids Res 1996 Sep 15;24(18):3590–2; Gene 1998 Jun 15;213(1-2):17–22; einige Beispiele siehe Tabelle 1). Wird demnach ein komplexes Gemisch aus verschiedenen Nukleinsäuren, wie beispielsweise die gesamte cDNA aus einem definierten Organ, Gewebe oder Organismus, mit einer solchen BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease geschnitten, so erhält man meist exakt gleich lange Fragmente für alle unterschiedlichen cDNAs, d.h. man erhält Nukleinsäure-tags, die jeweils einem kurzen, zur Identifikation der cDNA ausreichenden Sequenzabschnitt entsprechen.
Zu einem analogen Ergebnis gelangt man jedoch auch mit bestimmten Kombinationen („Doppeldaus") von Typ IIs-Restriktionsendonukleasen oder auch einer Typ IIs-Restriktionsendonuklease und einer Typ II-Restriktionsendonuklease, wobei ein solcher Doppeldau mit beiden Enzymen gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden kann. Beispielsweise kann durch Inkubation von DNA mit den Typ IIs-Restriktionsendonukleasen MnlI (Schneidecharakteristik CCTC(7/6)) und BseRI (Schneidecharakteristik GAGGAG(10/8) bzw., in umgekehrter Orientierung gelesen, (8/10)CTCCTC) ebenfalls ein kurzes Doppelstrang-Fragment (Länge: 22bp zuzügl. einzelsträngiger Überhänge) freigesetzt werden.
Unter Typ IIs-Restriktionsendonukleasen werden solche Restriktionsendonukleasen verstanden, die ihr Substrat in einem definierten Abstand (bei derzeit bekannten TypIIs-Enzymen bis zu 20 bp) von der Erkennungsstelle entfernt schneiden.
Ähnlich kann die Restriktionsendonuklease AlwI (Schneidecharakteristik GGATC(4/5) bzw., in umgekehrter Orientierung gelesen, (5/4)GATCC) beim Vorliegen der Teilsequenz GGATCC (einer „kombinierten Erkennungsstelle") ein Doppelstrang-Fragment der Länge 12 by freisetzen, dessen einbasige einzelsträngige Enden sich so auffüllen lassen, daß ein 14 bp-Fragment erhalten wird.
Es ist ebenso möglich, daß eines der beiden Enzyme innerhalb der Erkennungsstelle des anderen Enzyms schneidet, oder beide Enzyme auf der gleichen Seite ihrer kombinierten Erkennungsstelle schneiden. In diesem Fall muß der Doppeldau so durchgeführt werden, daß zunächst das von der kombinierten Erkennungsstelle weiter entfernt schneidende Enzym und danach das andere Enzym zur Anwendung kommt, da anderenfalls mit der Schneidecharakteristik des zweiten Enzyms kein Schnitt mehr erfolgen könnte. So kann man etwa mit einer Kombination der Restriktionsendonukleasen BsgI (Schneidecharakteristik GTGCAG(16/14)) und BtsI (Schneidecharakteristik GCAGTG(2/0)) die Sequenz GTGCAGTG erkennen und 12 by lange Doppelstrang-Fragmente erzeugen oder mit einer Kombination der Restriktionsendonukleasen BpmI (Schneidecharakteristik CTGGAG(16/14)) und BsrI (Schneidecharakteristik ACTGG(1/-1)) die Sequenz ACTGGAG erkennen und 13 by lange Doppelstrang-Fragmente generieren.
Dementsprechend umfaßt der Begriff der „BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen" im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens ausdrücklich auch solche Enzyme oder Enzymkombinationen, welche beim Vorliegen einer geeigneten, ggf. aus zwei Erkennungstellen kombinierten Erkennungsstelle die Erzeugung von Fragmenten definierter, weitgehend einheitlicher Länge ermöglichen (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1 zeigt BcgI-ähnliche Restriktionsendonukleasen, die beidseitig ihrer Erkennungssequenz schneiden oder auch Kombinationen von Typ IIs- bzw. Typ II-Restriktionsendonukleasen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls zu den BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen gezählt werden. All diesen BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen ist gemeinsam, daß sie identisch lange oder im wesentlichen identisch lange Fragmente aus einzelnen Nukleinsäure-Molekülen wie auch aus komplexen Nukleinsäure-Gemischen herausschneiden.
Tabelle 1: Beispiele für BcgI-ähnliche Restriktionsendonukleasen
Die Vorteile der ungewöhnlichen Fragmentierungscharakteristika der BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen liegen im Hinblick auf das erfindungsgemäße Verfahren darin, daß durch die BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen

– erstens sehr kurze Fragmente mit meist nicht mehr als 40 Nukleotiden Länge erzeugt werden, wodurch die Komplexität der vom Nukleinsäure-Gemisch bereitgestellten Sequenzmengen pro Nukleinsäuresorte (z.B. pro cDNA) stark reduziert wird, und
– zweitens Fragmente mit identischer Länge erzeugt werden, die alle die gleichen oder hinreichend ähnliche optimale Hybridisierungsbedingungen (Hybridisierungs-Temperatur, -Dauer, Zusammensetzung der Hybridisierungslösung, Waschbedingungen) besitzen, um gemeinsam zur Hybridisierung eingesetzt zu werden, ohne daß unspezifische Hybridisierungsereignisse störend in Erscheinung treten.

Durch den Restriktionsverdau des Nukleinsäure-Gemisches mit einer oder mehreren BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen sinkt die Komplexität des Nukleinsäure-Gemisches um einen Faktor von 10 bis 1000, vorzugsweise um einem Faktor von 50 bis 200, insbesondere um einen Faktor von ca. 100, so daß bei der Hybridisierung eines DNA-Arrays mit der erfindungsgemäß komplexitätsreduzierten Nukleinsäurefragment-Mischung als Hybridisierungsprobe ein deutlich geringerer Hintergrund durch Kreuzhybridisierung entsteht.
Außerdem basiert die Komplexitätsreduktion des hier eingesetzten Verfahrens nicht auf dem Einsatz von PCR, sondern lediglich auf definierten Restriktionsschritten, so daß sich das Verfahren durch eine gute Reproduzierbarkeit auszeichnet. Sofern in dem erfindungsgemäßen Verfahren nach einem der genannten Verfahrensschritte dennoch ein weiterer PCR-Amplifikationsschritt durchgeführt werden würde, was im Rahmen des Verfahrens ausdrücklich möglich ist, so würde dieser Amplifikationsschritt aufgrund der im wesentlichen identischen Fragmentlängen im Gemisch unter Bedingungen erfolgen, unter denen keine Beeinträchtigung der Reproduzierbarkeit des Verfahrens auftritt.
Weiterhin kann durch die Restriktion des Nukleinsäure-Gemisches durch mehr als eine BcgI-ähnliche Restriktionsendonuklease gewährleistet werden, daß annähernd alle im ursprünglichen Nukleinsäure-Gemisch vertretenen Nukleinsäuresorten (bzw. alle cDNAs im Gemisch) auch in dem komplexitätsreduzierten Fragmentgemisch, das aus der Restriktion mit einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease hervorgeht, repräsentiert sind. Somit sollte die „unerwünschte Komplexitätserniedrigung", d.h. die Komplexitätserniedrigung bezüglich der Anzahl der in der Hybridisierungsprobe repräsentierten cDNAs, eher gering sein. Somit werden keine zahlreichen, kosten- und zeitaufwendigen Parallelhybridisierungen notwendig.
Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das Nukleinsäure-Gemisch in Verfahrensschritt (1a) mit mehreren BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen gleichzeitig oder nacheinander geschnitten.
In Verfahrensschritt (2a) werden die aus dem Restriktionssverdau des Nukleinsäure-Gemisches mit einer oder mehreren BcgI-ähnilichen Restriktionsendonukleasen hervorgehenden Nukleinsäurefragmente gegebenenfalls isoliert.
Eine solche Isolation bzw. Reinigung der identisch langen Fragmente kann über alle dem Fachmann geläufigen Standardverfahren der Molekularbiologie zur Isolation und/oder Größenselektion von Nukleinsäurefragmenten erfolgen. Insbesondere ist es möglich, die aus dem Verdau mit BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen hervorgegangenen Nukleinsäure-Fragmente durch Gelelektrophorese oder Chromatographie-Verfahren oder auch durch größenselektive Fällungs-Methoden zu isolieren.
Im Verfahrensschritt (3a) wird das Fragmentgemisch aus (1a) bzw. das gegebenenfalls gereinigte Fragmentgemisch aus (2a) mit Hilfe von Standardverfahren als Hybridisierungsprobe markiert.
Die Markierung kann durch alle Markierungsverfahren erfolgen, die dem Fachmann nach dem Stand der Technik bekannt sind.
Vorzugsweise kann die Markierung durch kovalente Verknüpfung bzw. Ligation mit markierten Linkermolekülen vorgenommen werden.
Werden Linker verwendet, ist auch eine vorherige Amplifikation der Nukleinsäure-Fragmente (Nukleinsäure-tags) – insbesondere durch PCR – möglich. Gegebenenfalls kann die Markierung gleichzeitig mit der Amplifikation stattfinden. Hier könnten die Linker als Bindungsstellen für Oligonukleotid-Primer dienen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Linker eingesetzt, welche einen RNA-Polymerase-Promotor aufweisen. Daraufhin folgt dann eine in vitro-Transkription, zu der bevorzugt markierte Ribonukleotide eingesetzt werden.
Weiterhin bevorzugt ist die Markierung des Fragmentgemisches aus (1a) bzw. des gegebenenfalls gereinigten Fragmentgemisches aus (2a)

– durch den Einbau von Nukleotiden, welche radioaktive Isotope umfassen, wie insbesondere ³²P oder ³⁵S, oder
– durch die kovalente Verknüpfung mit Fluoreszenzfarbstoffen, wie insbesondere Cy3, Cy5 etc.

Im Verfahrensschritt (4a) kann das in Schritt (3a) markierte Gemisch aus im wesentlichen gleich langen Nukleinsäure-Fragmenten, welches als Hybridisierungsprobe eingesetzt werden soll, gegebenenfalls nochmals isoliert bzw gereinigt. Diese Reinigung kann durch alle dem Fachmann bekannten Isolations- bzw. Reinigungsverfahren erfolgen, insbesondere auch durch die unter Schritt (2a) genannten Techniken.
In Verfahrensschritt (5a) wird ein DNA-Array mit dem markierten Gemisch aus im wesentlichen identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten, welches als komplexe Hybridisierungsprobe eingesetzt wird, hybridisiert.
Unter einem DNA-Array wird im Rahmen der Erfindung eine beliebige Oberfläche verstanden, an der eine Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäurefragmenten, sogenannte Hybridisierungssonden, immobilisiert worden sind. Bei der Oberfläche handelt es sich oft um eine planare Oberfläche eines Trägers aus Glas, Kunststoff, Metall, Silizium oder anderen Werkstoffen. Allerdings kann die Oberfläche auch auf beliebig andere Weise geformt oder strukturiert sein; auch ist es nicht erforderlich, daß sich alle Hybridisierungssonden auf dem selben Träger befinden. Vielmehr sind Array-Anordnungen denkbar, bei denen sich die Hybridisierungssonden auf den Oberflächen kleiner Partikel, beispielsweise sog. beads, befinden. Man spricht in solchen Fällen oft von Suspensions-Arrays. Bei den immobilisierten Hybridisierungssonden handelt es sich meist um DNA- oder RNA-Stränge, wobei artifizielle Nukleinsäuren wie beispielsweise PNA (peptidic nucleic acids) oder auf beliebige Weise modifizierte Nukleinsäuren ebenfalls zum Einsatz kommen könnten. Es ist möglich, Hybridisierungssonden durch PCR-Amplifikation ausgewählter Bereiche von mRNA- bzw. cDNA-Molekülen zu erzeugen oder aus cDNA-Banken stammende Klone als Hybridisierungssonden einzusetzen.
Um eine möglichst hohe Sensitivität zu erzielen, ist es bevorzugt, daß die Hybridisierungssonden vor Einsatz des Arrays zur Hybridisierung in einzelsträngiger Form vorliegen. Sind die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle zunächst doppelsträngig, so kann einer der beiden Stränge durch Denaturierung abgeschmolzen und fortgewaschen werden. In diesem Fall ist insbesondere einer der beiden Stränge mit einer immobilisierbaren Gruppe ausgestattet, welche der Gegenstrang nicht aufweist, so daß gezielt einer der beiden Stränge entfernt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die eingesetzten Hybridisierungssonden, welche die auf der Array-Oberfläche immobilisierten Nukleinsäuren bezeichnen, nicht oder nicht wesentlich länger als die in der Hybridisierungsprobe enthaltenen markierten Nukleinsäurefragmente. Dies trägt neben der Komplexitätsreduktion der Hybridisierungsprobe weiter zur Unterdrückung von Hintergrundsignal durch Kreuzhybridisierung bei.
Es ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens weiterhin bevorzugt, die Hybridisierungssonden durch Behandlung geeigneter Nukleinsäuremischungen, beispielsweise einer cDNA-Mischung, mit geeigneten BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen, gefolgt von einer Klonierung und einer geordneten Ablage, d.h. einer lokal geordneten Immobilisierung der gewonnenen Klone auf der Oberfläche in Form eines DNA-Arrays zu erzeugen.
Vorzugsweise wird daher bei dem Verfahren ein DNA-Array eingesetzt, der solche immobilisierten Nukleinsäuren umfaßt, die ebenfalls mit den gleichen BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen geschnitten sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden als Hybridisierungssonden, d.h. als immobilisierte Nukleinsäuren auf der Array-Oberfläche, Oligonukleotide, insbesondere synthetisch hergestellte Oligonukleotide, eingesetzt. Diese Oligonukleotide werden vorzugsweise derart entworfen, daß sie im wesentlichen die Nukleotidsequenzen aller in einer Hybridisierungsprobe vorhandenen oder alle nachzuweisenden Nukleinsäure-tags „abdecken", d.h. komplementär zu einem der beiden tag-Stränge sind. In der Regel zeichnen sich solche Oligonukleotide aus durch

(1) eine immobilisierbare Gruppe,
(2) gegebenenfalls durch einen geeigneten Distanzhalter („spacer"), sowie
(3) einen Sequenzbereich, welcher komplementär zu einem Strang eines Nukleinsäure-tags ist, der in einer relevanten Hybridisierungsprobe erwartet wird oder möglicherweise vorhandenen ist.

Bevorzugt ist daher der Einsatz eines DNA-Arrays, welcher Oligonukleotide als immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt. Vorzugsweise umfaßt zumindest ein Anteil dieser Oligonukleotide identische Nukleotidsequenzen wie mindestens ein Teil der in Schritt (1a) durch Schneiden mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease generierten Nukleinsäure-Fragmente.
Weiterhin sind solche Oligonukleotide, die auf einem Array in geordneter Weise immobilisiert sind, in der Regel 20 bis 100 Nukleotide, vorzugsweise 25 bis 40 Nukleotide lang.
In Verfahrensschritt (6a) wird die Hybridisierung vorzugsweise mit Hilfe geeigneter Computerprogramme ausgewertet.
Die Verfahrensschritte (5a) und (6a) werden im einzelnen nach solchen Methoden durchgeführt, die dem Fachmann bekannt sind, und die im Detail in Science 1995 Oct 20;270(5235):467–70 und in Nat Biotechnol 1996 Dec;14(13):1675–80) beschrieben sind.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die zur Hybridisierung genutzte Nukleinsäure-tag-Länge nachträglich ariligierte Adaptersequenzen ganz oder teilweise umfassen. Damit auf diese Weise die Hybridisierungsspezifität der einzelnen Nukleinsäure-Fragmente nicht verringert wird, werden in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Vielzahl von Adaptern mit degenerierten Überhängen an die jeweils komplementären Überhänge der einzelnen Nukleinsäure-tags ligiert. Hierfür müßten beispielsweise für einen zweibasigen degenerierten Überhang der Nukleinsäure-Fragmente 16, d.h. 4² Linker mit sequenzverschiedenen, zweibasigen Überhängen eingesetzt werden. Da durch die Sequenz des tag-Überhangs vorherbestimmt ist, welcher der Adapter befestigt werden wird, kann das zu diesem Nukleinsäure-tag gehörige Oligonukleotid auf dem DNA-Array in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ebenfalls um die entsprechende Sequenz (nämlich das reverse Komplement des entsprechenden Adapterstrangs) verlängert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Verfahrensschritt (5a) zur Hybridisierung eines DNA-Arrays lediglich einer der beiden Stränge des Nukleinsäurefragment-Gemisches aus Schritt (3a) oder (4a) eingesetzt.
Der Einsatz nur eines Stranges des Nukleinsäurefragment-Gemisches hat einen zusätzlichen Sensitivitätsgewinn des Hybridisierungsschrittes (5a) zur Folge , da dadurch eine erneute Re-Hybridisierung („Reannealing") des (+)-Stranges und des (–)-Stranges in der Hybridisierungslösung vermieden wird. Diese erneute Re-Hybridisierung steht sonst in Kompetition zur Hybridisierung der Fragmente des Gemisches mit den immobilisierten Nukleinsäuren des Arrays und vermindert somit die Sensitivität des Analyseverfahrens.
Die Isolation nur jeweils eines Stranges des als Hybridisierungsprobe eingesetzten Nukleinsäurefragment-Gemisches kann in der Regel durch alle dem Fachmann bekannten Verfahren erreicht werden, die die Generation solcher Nukleinsäure-tags, bzw. solcher Nukleinsäure-Fragmente beinhalten, bei denen die (+)- Stränge und die (–)-Stränge enzymatisch, chemisch oder physikalisch voneinander unterscheidbar sind.
Eine enzymatische Unterscheidbarkeit zwischen (+)- Strang und (–)-Strang kann insbesondere über die folgenden Verfahrensschritte erreicht werden:

(1b) Restriktionsverdau eines Hybrids aus messenger-RNA (mRNA) und Erststrang-cDNA mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease,
(2b) Ligation eines Adapters, der einen Promotor für eine RNA-Polymerase, beispielsweise für die T7 RNA-Polymerase, umfaßt,
(3b) enzymatischer Abbau des RNA-Strangs und
(4b) in-vitro-Transkription in Anwesenheit markierter Nukleotide.

Anstelle eines enzymatischen Abbaus des RNA-Strangs ist auch ein chemischer Abbau, insbesondere eine Hydrolyse, denkbar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden daher die Verfahrensschritte (1a) bis (4a) durch die Verfahrensschritte (1b) bis (4b) ersetzt, um die Herstellung einer einzelsträngigen, markierten Hybridisierungsprobe, die eine komplexitätsreduzierte Version des zu analysierenden Nukleinsäure-Gemisches umfaßt, zu ermöglichen. Anschließend erfolgt dann die Hybridisierung der so erzeugten Hybridisierungsprobe mit einem DNA-Array, sowie die Auswertung dieser Hybridisierung nach den Verfahrensschritten (5a) und (6a).
Eine alternative Möglichkeit, eine Unterscheidbarkeit von (+)- und (–)-Strang zu erzielen, besteht darin, daß während der Synthese von doppelsträngiger cDNA zur Erststrang-Synthese eine andere Mischung von Nukleotidbausteinen eingesetzt wird als zur Zweitstrangsynthese. Insbesondere können beispielsweise nur zur Zweitstrang-Synthese besondere Nukleotide oder modifizierte Nukleotide eingesetzt werden, welche demzufolge nur in den cDNA-Zweitstrang inkorporiert werden, aber während der Erststrang-Synthese nicht anwesend waren. Ein solches Verfahren würde nachfolgend eine Unterscheidung beider Stränge zulassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt daher die Isolation jeweils nur der (+)-Stränge oder nur der (–)-Stränge der einzelnen Nukleinsäure-Fragmente des Fragment-Gemisches über die folgenden Einzelschritte, welche die Verfahrensschritte (1a) bis (2a) ersetzen:

(1c) Synthese eines Gemisches aus doppelsträngiger cDNA, wobei entweder nur bei der Erststrang- oder nur bei der Zweitstrang-Synthese ein modifiziertes Nukleotidtriphosphat unter Entstehung eines doppelsträngigen cDNA-Gemisches mit unterscheidbaren Einzelsträngen inkorporiert wird,
(2c) Schneiden des doppelsträngigen cDNA-Gemisches aus (1c) mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen cDNA-Fragmenten,
(3c) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus cDNA-Fragmenten aus (2c),
(4c) spezifische Entfernung nur der Erst-Stränge oder nur der Zweit-Stränge der einzelnen cDNA-Fragmente des Gemisches aus (2c) oder (3c) unter Generierung eines Gemisches aus einzelsträngigen cDNA-Fragmenten.

Danach erfolgen die Verfahrensschritte (3a) bis (6a).
Beispiele für solche besonderen und/oder modifizierten Nukleotide sind dUTP oder mittels einer immobilisierbaren Gruppe modifizierte Nukleotide, wie etwa Biotin-dUTP.
Wird dUTP beispielsweise bei der Zweitstrangsynthese zugegeben, zeichnet sich die doppelsträngige DNA durch einen Uracil-haltigen (Zweit)-strang aus, während der andere (Erst-)Strang kein Uracil aufweist. Wird ein solcher Doppelstrang (oder ein doppelsträngiger Nukleinsäure-tag, welcher durch Restriktionsverdau mit BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen erzeugt wurde) mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) behandelt, werden die Uracil-Gruppen entfernt, so daß nur noch der Gegenstrang als Template für eine RNA- oder DNA-Polymerase dienen kann.
Die Erfindung betrifft daher weiterhin ein Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays, der immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt, mit einem markierten, komplexitätsreduzierten Nukleinsäure-Gemisch als Hybridisierungsprobe, mit den folgenden Verfahrensschritten:

(1d) Synthese eines Gemisches aus doppelsträngiger cDNA, wobei entweder nur bei der Erststrang- oder nur bei der Zweitstrang-Synthese dUTP anstelle von dTTP inkorporiert wird,
(2d) Schneiden des Gemisches aus doppelsträngiger cDNA aus (1d) mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen cDNA-Fragmenten,
(3d) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus cDNA-Fragmenten aus (2d),
(4d) kovalente Verknüpfung von Adaptor-Molekülen mit den Enden der cDNA-Fragmente des Gemisches aus (2d) oder (3d), wobei die Adaptoren mindestens eine Promotor-Sequenz für eine RNA-Polymerase enthalten unter Entstehung eines Gemisches aus doppelsträngigen cDNA-Fragmenten,
(5d) Entfernung der inkorporierten Uracil-Basen aus den doppelsträngigen cDNA-Fragmenten des Gemisches aus (4d) mittels Uracil-DNA-Glykosylase,
(6d) in-vitro-Transkription der Adaptor-flankierten Fragmente mittels einer RNA-Polymerase, deren Promotor-Sequenz in den Adaptormolekülen enthalten ist, in Gegenwart markierter Nukleotidtriphosphate unter Entstehung eines Gemisches aus markierten, einzelsträngigen cDNA-Fragmenten,
(7d) Hybridisierung eines DNA-Arrays mit dem Gemisch aus cDNA-Fragmenten aus (6d),
(8d) Auswertung der Hybridisierung.

Eine alternative Möglichkeit, eine Unterscheidbarkeit zwischen den (+)- und den (–)-Strängen der Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches zu erzielen, besteht darin, daß entweder nur während der Erststrang-cDNA-Synthese oder nur während der Zweitstrang-cDNA-Synthese ein mittels einer immobilisierbaren Gruppe modifiziertes Nukleotidtriphosphat, insbesondere Biotin-dUTP, zugegeben wird. Hierdurch entsteht doppelsträngige cDNA, die sich beispielsweise durch einen biotinylierten Zweitstrang auszeichnet, während der Erststrang nicht biotinyliert ist. Werden solche Doppelstränge (oder ein doppelsträngiger Nukleinsäure-tag, welcher durch Restriktionsverdau mit BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen erzeugt wurde) an einer Streptavidin-haltige Phase immobilisiert, läßt sich der nicht-biotinylierte Strang selektiv unter Denaturierung (Hitze-Denaturierung oder alkalische Denaturierung) ablösen und nachfolgend zur Gewinnung einer Hybridisierungsprobe einsetzen. Danach können entweder die immobilisierbaren Stränge oder die nicht immobilisierbaren Stränge des cDNA-Fragment-Gemisches als einzelsträngige Hybridisierungsprobe zur Hybridisierung mit dem Array eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays, der immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt, mit einem markierten, komplexitätsreduzierten Nukleinsäure-Gemisch als Hybridisierungsprobe, mit den folgenden Verfahrensschritten:

(1e) Synthese eines Gemisches aus doppelsträngiger cDNA, wobei entweder nur bei der Erststrang- oder nur bei der Zweitstrang-Synthese ein mittels einer immobilisierbaren Gruppe modifiziertes Nukleotidtriphosphat inkorporiert wird,
(2e) Schneiden des doppelsträngigen cDNA-Gemisches aus (1e) mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen cDNA-Fragmenten,
(3e) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus cDNA-Fragmenten aus (2e),
(4e) Trennung der immobilisierbaren Stränge des Gemisches von den nicht immobilisierbaren Strängen des Gemisches durch Immobilisierung und Denaturierung,
(5e) Markierung der immobilisierbaren Stränge aus dem Gemisch oder der nicht immobilisierbaren Stränge aus dem Gemisch,
(6e) Hybridisierung eines DNA-Arrays mit den markierten, immobilisierbaren Strängen des Gemisches aus (5e) oder mit den markierten, nicht immobilisierbaren Strängen des Gemisches aus (5e),
(7e) Auswertung der Hybridisierung.

In einer weiteren Ausführungsform des obigen Verfahrens entfällt der Markierungsschritt (5e) zugunsten einer Markierung während des Verfahrensschrittes (1e), wobei die Markierung eines oder beider cDNA-Stränge des Gemisches über die zusätzliche Inkorporation markierter Nukleotidtriphosphate während der Erst- und/oder Zweit-Strang-Synthese erfolgt.
In einer weiteren Ausführungsform des obigen Verfahrens entfällt der Markierungsschritt (5e) zugunsten einer Markierung während des Verfahrensschrittes (2e), wobei das mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease verdauten cDNA-Fragmente des cDNA-Fragment-Gemisches anschließend durch kovalente Verknüpfung mit markierten Adaptormolekülen markiert werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Hybridisierungsprobe, die ein markiertes Nukleinsäurefragment-Gemisch mit identisch langen oder im wesentlichen identisch langen Fragmenten und mit verbesserter Hybridisierungsspezifität umfaßt und die erhältlich ist durch die folgenden Verfahrensschritte:

(1a) Schneiden des Nukleinsäure-Gemisches mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten,
(2a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten aus (1a),
(3a) Markierung der Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches aus (1a) oder (2a),
(4a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus Nukleinsäure-Fragmenten aus Schritt (3a).

Einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung eines markierten Nukleinsäurefragment-Gemisches mit identisch langen oder im wesentlichen identisch langen Fragmenten dar, wobei das Nukleinsäurefragment-Gemisch erhältlich ist durch die oben benannten Verfahrensschritte (1a) bis (4a), zur Hybridisierung mit immobilisierten Nukleinsäuren.
Bei den immobilisierten Nukleinsäuren handelt es sich vorzugsweise um einen DNA-Array, stärker bevorzugt um einen DNA-Array mit weitgehend identisch langen, Oligonukleotiden mit 20 bis 100 Nukleotiden, insbesondere mit 25 bis 40 Nukleotiden Länge. Die Oligonukleotide besitzen hierbei vorzugsweise die gleichen Sequenzen wie die in Schritt (1a) durch Schneiden mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease generierten Nukleinsäure-Fragmente.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft auch einen DNA-Array, welcher eine Oberfläche und darauf immobilisierte Oligonukleotide mit einer im wesentlichen einheitlichen Länge von 20 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise von 25 bis 40 Nukleotiden, umfaßt. Die Sequenz dieser immobilisierten Oligonukleotide auf dem Array ist hierbei komplementär zu jeweils einem Strang solcher Nukleinsäure-tags, die durch Restriktionsverdau eines definierten Nukleinsäure-Gemisches mit einer oder mehreren ausgewählten BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen generiert worden sind. Erhältlich ist ein solcher DNA- bzw. Oligonukleotid-Array durch die folgenden Verfahrensschritte:

(1h) Ermittlung der aus einem Nukleinsäure-Gemisch mittels Restriktionsverdau mit einer oder mehreren BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen freisetzbaren Nukleinsäure-Fragmente,
(2h) Herstellung von solchen Oligonukleotiden mit weitgehend einheitlicher Länge und mit jeweils 20 bis 100 Nukleotiden, deren Sequenz mit den in Schritt (1h) ermittelten Nukleinsäure-Fragmenten identisch ist,
(3h) Immobilisierung der Oligonukleotide aus Schritt (2h) auf jeweils lokal definierten Regionen einer geeigneten Oberfläche.

Claims

Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays, der immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt, mit einem markierten, komplexitätsreduzierten Nukleinsäure-Gemisch als Hybridisierungsprobe, mit den folgenden Verfahrensschritten: (1a) Schneiden des Nukleinsäure-Gemisches mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten, (2a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus Nukleinsäure-Fragmenten aus (1a), (3a) Markierung des Gemisches der Nukleinsäure-Fragmente aus (1a) oder (2a), (4a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus markierten und identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten aus Schritt (3a), (5a) Hybridisierung eines DNA-Arrays mit dem Gemisch aus Schritt (3a) oder (4a) als Hybridisierungsprobe, (6a) Auswertung der Hybridisierung.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte DNA-Array solche immobilisierten Nukleinsäuren umfaßt, die ebenfalls mit den BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen aus Schritt (1a) geschnitten sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte DNA-Array Oligonukleotide als immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Anteil der Oligonukleotide identische Nukleotidsequenzen umfaßt wie mindestens ein Teil der in Schritt (1a) durch Schneiden mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease generierten Nukleinsäure-Fragmente.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt (1a) eingesetzte(n) BcgI-ähnliche(n) Restriktionsendonuklease(n) ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe AloI, Bael, BcgI, BplI, BsaXI, Bsp24I, CjeI, CjePI, FalI, HaeIV, Hin4I, PpiI, PsrI, AlwI, MnlI und BseRl gemeinsam, BpmI und BsrI gemeinsam, BsgI und BtsI gemeinsam.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt (1a) eingesetzte BcgI-ähnliche Restriktionsendonuklease eine Typ IIs-Restriktionsendonuklease, insbesondere AlwI, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt (1a) eingesetzten BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen eine Kombination aus zwei Typ IIs-Restriktionsendonukleasen oder aus einer Typ II- und einer Typ IIs-Restriktionsendonuklease, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe MnlI, BseRI, BpmI, BsrI, BsgI und BtsI, sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure-Gemisch in Schritt (1a) mit mehr als einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease geschnitten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung des Gemisches aus Schritt (3a) durch die kovalente Verknüpfung mit markierten Linker-Molekülen erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung des Gemisches aus Schritt (3a) durch Inkorporation fluoreszenzmarkierter Nukleotid-Derivate erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung des Gemisches aus Schritt (3a) durch den Einbau von radioaktiv markierten Nukleotiden in die einzelnen Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zu einem beliebigen Zeitpunkt nach dem Verfahrensschritt (1a) und vor dem Hybridisierungsschritt (5a) in einem zusätzlichen Verfahrensschritt mindestens eine Sorte von Nukleinsäure-Adaptoren an die einzelnen Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches ligiert werden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als eine Sorte von Nukleinsäure-Adaptoren an die einzelnen Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches ligiert werden, die sich mindestens in der Sequenz ihrer einzelsträngigen Überhänge voneinander unterscheiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Nukleinsäuren auf dem DNA-Array jeweils auch die Sequenzen der Nukleinsäure-Adaptoren mitumfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß zu einem beliebigen Zeitpunkt nach dem Verfahrensschritt (1a) und vor dem Hybridisierungsschritt (5a) in einem zusätzlichen Verfahrensschritt jeweils nur die (+)-Stränge oder nur die (–)-Stränge der einzelnen Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches isoliert werden und diese anschließend im Hybridisierungsschritt (5a) als einzelsträngige, markierte Hybridisierungsprobe eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolation jeweils nur der (+)-Stränge oder nur der (–)-Stränge der einzelnen Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches über die folgenden Einzelschritte erfolgt, welche die Verfahrensschritte (1a) bis (4a) ersetzen: (1b) Restriktionsverdau eines Hybrids aus messenger-RNA (mRNA) und Erststrang-cDNA mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease, (2b) Ligation eines Adapters, der einen Promotor umfaßt, (3b) Abbau des RNA-Strangs und (4b) in-vitro-Transkription in Anwesenheit markierter Nukleotide.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolation jeweils nur der (+)-Stränge oder nur der (–)-Stränge der einzelnen Nukleinsäure-Fragmente des Fragment-Gemisches über die folgenden Einzelschritte erfolgt, welche die Verfahrensschritte (1a) bis (2a) ersetzen: (1c) Synthese eines Gemisches aus doppelsträngiger cDNA, wobei entweder nur bei der Erststrang- oder nur bei der Zweitstrang-Synthese ein modifiziertes Nukleotidtriphosphat unter Entstehung eines doppelsträngigen cDNA-Gemisches mit unterscheidbaren Einzelsträngen inkorporiert wird, (2c) Schneiden des doppelsträngigen cDNA-Gemisches aus (1c) mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen cDNA-Fragmenten, (3c) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus cDNA-Fragmenten aus (2c), (4c) spezifische Entfernung nur der Erst-Stränge oder nur der Zweit-Stränge der einzelnen cDNA-Fragmente des Gemisches aus (2c) oder (3c) unter Generierung eines Gemisches aus einzelsträngigen cDNA-Fragmenten.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung des Gemisches aus Nukleotid-Fragmenten entweder in Verfahrensschritt (1c) oder (2c) erfolgt.
Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays, der immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt, mit einem markierten, komplexitätsreduzierten Nukleinsäure-Gemisch als Hybridisierungsprobe, mit den folgenden Verfahrensschritten: (1d) Synthese eines Gemisches aus doppelsträngiger cDNA, wobei entweder nur bei der Erststrang- oder nur bei der Zweitstrang-Synthese dUTP anstelle von dTTP inkorporiert wird, (2d) Schneiden des Gemisches aus doppelsträngiger cDNA aus (1d) mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen cDNA-Fragmenten, (3d) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus cDNA-Fragmenten aus (2d), (4d) kovalente Verknüpfung von Adaptor-Molekülen mit den Enden der cDNA-Fragmente des Gemisches aus (2d) oder (3d), wobei die Adaptoren mindestens eine Promotor-Sequenz für eine RNA-Polymerase enthalten unter Entstehung eines Gemisches aus doppelsträngigen cDNA-Fragmenten, (5d) Entfernung der inkorporierten Uracil-Basen aus den doppelsträngigen cDNA-Fragmenten des Gemisches aus (4d) mittels Uracil-DNA-Glykosylase, (6d) in-vitro-Transkription der Adaptor-flankierten Fragmente mittels einer RNA-Polymerase, deren Promotor-Sequenz in den Adaptormolekülen enthalten ist, in Gegenwart markierter Nukleotidtriphosphate unter Entstehung eines Gemisches aus markierten, einzelsträngigen cDNA-Fragmenten, (7d) Hybridisierung eines DNA-Arrays mit dem Gemisch aus cDNA-Fragmenten aus (6d), (8d) Auswertung der Hybridisierung.
Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays, der immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt, mit einem markierten, komplexitätsreduzierten Nukleinsäure-Gemisch als Hybridisierungsprobe, mit den folgenden Verfahrensschritten: (1e) Synthese eines Gemisches aus doppelsträngiger cDNA, wobei entweder nur bei der Erststrang- oder nur bei der Zweitstrang-Synthese ein mittels einer immobilisierbaren Gruppe modifiziertes Nukleotidtriphosphat inkorporiert wird, (2e) Schneiden des doppelsträngigen cDNA-Gemisches aus (1e) mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen cDNA-Fragmenten, (3e) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus cDNA-Fragmenten aus (2e), (4e) Trennung der immobilisierbaren Stränge des Gemisches von den nicht immobilisierbaren Strängen des Gemisches durch Immobilisierung und Denaturierung, (5e) Markierung der immobilisierbaren Stränge aus dem Gemisch oder der nicht immobilisierbaren Stränge aus dem Gemisch, (6e) Hybridisierung eines DNA-Arrays mit den markierten, immobilisierbaren Strängen des Gemisches aus (5e) oder mit den markierten, nicht immobilisierbaren Strängen des Gemisches aus (5e), (7e) Auswertung der Hybridisierung.
Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays, der immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt, mit einem markierten, komplexitätsreduzierten Nukleinsäure-Gemisch als Hybridisierungsprobe, mit den folgenden Verfahrensschritten: (1f) Synthese eines Gemisches aus doppelsträngiger cDNA, wobei entweder nur bei der Erststrang- oder nur bei der Zweitstrang-Synthese ein mittels einer immobilisierbaren Gruppe modifiziertes Nukleotidtriphosphat inkorporiert wird und wobei zusätzlich eine Markierung eines oder beider Stränge erfolgt, (2f) Schneiden des doppelsträngigen cDNA-Gemisches aus (1f) mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen cDNA-Fragmenten, (3f) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus cDNA-Fragmenten aus (2f), (4f) Trennung der immobilisierbaren Stränge des Gemisches von den nicht immobilisierbaren Strängen des Gemisches durch Immobilisierung und Denaturierung, (5f) Hybridisierung eines DNA-Arrays mit den immobilisierbaren Strängen des Gemisches aus (4f) oder mit den nicht immobilisierbaren Strängen des Gemisches aus (4f), (6f) Auswertung der Hybridisierung.
Verfahren zur Analyse eines Nukleinsäure-Gemisches durch Hybridisierung eines DNA-Arrays, der immobilisierte Nukleinsäuren umfaßt, mit einem markierten, komplexitätsreduzierten Nukleinsäure-Gemisch als Hybridisierungsprobe, mit den folgenden Verfahrensschritten: (1g) Synthese eines Gemisches aus doppelsträngiger cDNA, wobei entweder nur bei der Erststrang- oder nur bei der Zweitstrang-Synthese ein mittels einer immobilisierbaren Gruppe modifiziertes Nukleotidtriphosphat inkorporiert wird, (2g) Schneiden des doppelsträngigen cDNA-Gemisches aus (1g) mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen cDNA-Fragmenten, welche anschließend durch kovalente Verknüpfung mit markierten Adaptormolekülen markiert werden, (3g) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus markierten cDNA-Fragmenten aus (2g), (4g) Trennung der immobilisierbaren Stränge des Gemisches von den nicht immobilisierbaren Strängen des Gemisches durch Immobilisierung und Denaturierung, (5g) Hybridisierung eines DNA-Arrays mit den immobilisierbaren Strängen des Gemisches aus (4g) oder mit den nicht immobilisierbaren Strängen des Gemisches aus (4g), (6g) Auswertung der Hybridisierung.
Hybridisierungsprobe umfassend ein markiertes Nukleinsäurefragment-Gemisch mit identisch langen oder im wesentlichen identisch langen Fragmenten und mit verbesserter Hybridisierungsspezifität, welche erhältlich ist durch die folgenden Verfahrensschritte: (1a) Schneiden des Nukleinsäure-Gemisches mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten, (2a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten aus (1a), (3a) Markierung der Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches aus (1a) oder (2a), (4a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus Nukleinsäure-Fragmenten aus Schritt (3a).
Verwendung eines markierten Nukleinsäurefragment-Gemisches mit identisch langen oder im wesentlichen identisch langen Fragmenten, welches erhältlich ist durch die folgenden Verfahrensschritte: (1a) Schneiden des Nukleinsäure-Gemisches mit mindestens einer BcgI-ähnlichen Restriktionsendonuklease unter Herstellung eines Gemisches aus identisch langen oder im wesentlichen identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten, (2a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus identisch langen Nukleinsäure-Fragmenten aus (1a), (3a) Markierung der Nukleinsäure-Fragmente des Gemisches aus (1a) oder (2a), (4a) gegebenenfalls Isolation des Gemisches aus Nukleinsäure-Fragmenten aus Schritt (3a). zur Hybridisierung mit immobilisierten Nukleinsäuren.
Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den immobilisierten Nukleinsäuren um einen DNA-Array handelt.
Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem DNA-Array um einen DNA-Array aus Oligonukleotiden, die jeweils 20 bis 100 Nukleotide umfassen, handelt.
DNA-Array umfassend eine Oberfläche und darauf immobilisierte Oligonukleotide mit einer im wesentlichen einheitlichen Länge von 20 bis 100 Nukleotiden, erhältlich durch die folgenden Verfahrensschritte: (1h) Ermittlung der aus einem Nukleinsäure-Gemisch mittels Restriktionsverdau mit einer oder mehreren BcgI-ähnlichen Restriktionsendonukleasen freisetzbaren Nukleinsäure-Fragmente, (2h) synthetische Herstellung von solchen Oligonukleotiden mit weitgehend einheitlicher Länge und mit jeweils 20 bis 100 Nukleotiden, deren Sequenz mit den in Schritt (1h) ermittelten Nukleinsäure-Fragmenten identisch ist, (3h) Immobilisierung der Oligonukleotide aus Schritt (2h) auf jeweils lokal definierten Regionen einer geeigneten Oberfläche.