WO2002024944A2 - Verfahren zum nachweis mindestens einer nukleinsäuresequenz - Google Patents

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WO2002024944A2
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Jürgen SCHÜLEIN
Hans Kosak
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November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of at least one nucleic acid sequence and a kit for carrying out the method according to the invention.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the duplicated sequences can then be detected by means of hybridization with a binding sequence specific for the nucleic acid sequence to be detected. It is disadvantageous in this method that a specific binding sequence is required for each nucleic acid sequence to be detected. Furthermore, it is disadvantageous that specific hybridization conditions must be maintained for each hybridization with this binding sequence.
  • the primer has a region in which the synthesis of a counter strand by a blocking agent for a polymerase is prevented.
  • the area has a fluorophore and a quencher, which are located in the immediate vicinity due to base pairings. A fluorescence signal cannot be generated.
  • the region has a sequence which is complementary to a product resulting from the extension of the primer during the PCR. After denaturation of the product, base pairing of the section with the complementary region in the product occurs under suitable conditions.
  • the quencher causes the quencher to be separates so that a fluorescence signal can arise.
  • the fluorescence signal serves as evidence of the presence of a DNA sequence specific for the primer.
  • the method has the disadvantage that a primer specific for each nucleic acid sequence to be detected has to be synthesized with a specific complementary section. Due to the various functional units, the primer is relatively long and therefore difficult to manufacture.
  • nucleotides in a PCR which do not occur in the nucleic acid sequence to be reproduced.
  • a nucleotide can be deoxy uridine.
  • an undesirable product can be treated with uracil DNA glycosylase.
  • Uracil DNA glycolyase cleaves the gycosidic bond between the base uracil and the sugar deoxy-ribose of a deoxy-uridine residue built into a DNA molecule.
  • the undesired product can no longer serve as a template in a further replication reaction.
  • Another nucleotide that can be used is bromodeoxy uridine. DNA containing bromo-deoxy-uridine can be degraded by treatment with light under suitable conditions.
  • No. 5,744,311 discloses a amplification process for nucleic acids based on strand displacement.
  • a primer is hybridized with the 3 'end of a single-stranded nucleic acid to be amplified and extended by means of a DNA polymerase.
  • Deoxy nucleoside triphosphates are used for the extension, some of which are derivatized.
  • Suitable derivatized deoxy nucleoside triphosphates are, for example, ⁇ -thio-deoxy nucleoside triphosphates.
  • a strand of the resulting double-stranded DNA with derivatized deoxy nucleotide residues is len recognized by a restriction endonuclease and cut. Starting from the cut, the DNA polymerase extends the 3 'end of the cut DNA strand. The other part of the cut DNA strand is displaced by the double-stranded DNA. The displaced DNA strand is multiplied by repeating the process.
  • WO 97/31256 it is known to detect target sequences in nucleic acids by means of a ligase reaction and an addressable matrix having immobilized binding sequences.
  • an oligonucleotide probe is used which has a target sequence-specific and a binding sequence-specific portion.
  • a second oligonucleotide probe which has a labeling substance, is used, which can bind to the target sequence to be detected in the immediate vicinity of the first oligonucleotide probe. If the target sequence is present, the first and second oligonucleotide probes bind to the target sequence. They are covalently connected to each other by a ligase.
  • Probes are brought into contact with the immobilized binding sequences so that hybridization takes place.
  • the presence of the target sequence is detected by detecting the labeling substance at the hybridization site.
  • the disadvantage of the method is that it often gives false positive results.
  • US 5,525,494 describes a method for amplifying a target nucleotide sequence, a first primer being used.
  • the first primer has a binding section that is essentially complementary to the target nucleotide sequence.
  • An extension section is tied to this.
  • the extension section is designed so that a synthesis of a complementary extension section is suppressed.
  • the extension section formed at the 5 'end remains single-stranded.
  • the products formed in the polymerase chain reaction (PCR) can thus be bound to suitable oligonucleotides immobilized on a solid phase.
  • the detection sensitivity of the known method is not particularly high.
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a universal method and a kit for the parallel detection of nucleic acid sequences are to be specified.
  • a method for the parallel detection of nucleic acids using a section-wise single-stranded nucleic acid reaction is provided with the following steps:
  • a) Providing compounds each formed from a first primer specific for the nucleic acids to be detected and an identification sequence specific to the first primers, the identification sequence being selected from a group of identification sequences which, given predetermined uniform hybridization conditions, do not crosshy among one another and not with the first primers - bridize, and wherein in the connection a means is provided that the single-strandedness of a section of the lit. c product formed, b) bringing the nucleic acids into contact with the compounds and with second primers specific for the nucleic acids to be detected, the second primers being selected from a group of second primers which do not cross-hybridize with the identification sequences under predetermined uniform hybridization conditions,
  • binding sequences are selected from a group of binding sequences which do not cross-hybridize with incompletely complementary single-stranded sections of the specific products under given uniform hybridization conditions, and
  • a primer is understood to be an oligonucleotide that can be extended by a polymerase.
  • the primers can consist of DNA.
  • First and second primers specific for the nucleic acid sequence to be detected are primers which hybridize specifically under suitable hybridization conditions with the nucleic acid sequence to be detected or with a complementary complementary strand.
  • An identification sequence specific for the first primer is an identification sequence which is clearly assigned to the first DNA primer. The agent can be contained within the identification sequence, within the first primer or between the first primer and the identification sequence.
  • a specific product is understood to mean a product which is specific for the nucleic acid sequence to be detected. Such a product is in step lit. c formed especially under stringent conditions.
  • step lit. e the specific hybridization of the identification sequence or of the single-stranded section with the binding sequence takes place under suitable stringent conditions. These conditions depend on the identification sequences or the binding sequences.
  • the advantage of the method is that the specific product formed can hybridize directly with the immobilized binding sequence without being previously denatured. This prevents the single strands forming the double-stranded section of the specific product from interfering with the hybridization with the binding sequences, for example through cross-hybridization. It is also advantageous in the method that single-stranded regions hybridize with the binding sequences when the products are hybridized. Egg- Hybridization between single-stranded sections is considerably faster and more efficient compared to hybridization between denatured double-stranded sections. It is furthermore advantageous that the carrier with a set of immobilized binding sequences can be used for the detection of different nucleic acid sequences. Predefined identical identification sequences can be linked to different first primers in different detection methods.
  • Identical binding sequences can then be used for the detection of different nucleic acid sequences.
  • the method according to the invention can be used universally for the detection of nucleic acids. Because of the proposed selection of primer identification and binding sequences, any number of nucleic acids can be detected in a parallel method. This property is also called multiplexing.
  • the proposed selection of the first and second primers has the effect that the formation of primer dimers is reduced.
  • Primer dimers would be used in step lit. e lead to false positive results and the amount of specific products formed in step lit.
  • Reduce c Since it is excluded according to a further provision of the invention that the first primers hybridize with the identification sequences, it is prevented that the amount of the first primers required for the formation of the specific product is reduced. It also prevents the amount of single-stranded sections required to form the specific product from being reduced.
  • the multiplexing ability requires specific properties of the second primer used, the identification sequences and the binding sequences.
  • the second primer should consist of A group of second primers can be selected, which specifically bind to their complementary sequences on the nucleic acids to be detected under a hybridization condition that applies to all primers. Furthermore, the second primers are selected so that under the hybridization conditions according to lit. c no cross-hybridization with one another and no hybridization of the primers with the identification sequences takes place. It is also advisable to select the second primer so that under the conditions of step lit. e Cross hybridization of the second primer with the binding sequences is excluded. This is particularly useful if in step lit. d free primers are not separated.
  • the selection of the identification sequences has the advantage that the amount of the lit. c products formed increases and at the same time the amount of non-specific products is reduced.
  • the single-stranded sections of the products can be selected from a group of single-stranded sections, which at least under the conditions of step lit. e do not hybridize with each other. Hybridization would be disadvantageous in this case because the concentration of those for the binding of the single-stranded sections to the binding sequences would be reduced.
  • the binding sequences are expediently selected from a group of binding sequences which, at least under the conditions of step lit. hybridize specifically with the complementary, single-stranded sections of the products. They do not hybridize to non-complementary single-stranded sections of the products. A hybridization of the binary Ending sequences with incompletely complementary binding sequences of the products would lead to false positive results or at least a lower detection sensitivity of the nucleic acids to be detected.
  • the first primers can also be selected from a group of first primers which do not cross-hybridize under given uniform hybridization conditions.
  • the compounds can contain an agent which, during the reaction, alters a synthesis of a counter strand complementary to the identification sequence.
  • the compounds can contain an agent which, during the reaction, enables the identification sequence or its complementary counter-strand to be degraded.
  • the agent can e.g. a uracil, a thionucleotide and / or a ribonucleotide.
  • the degradation reaction can be carried out using uracil DNA glycosylase, exonuclease, RNAseH, under the action of light or by means of a restriction endonuclease which cleaves the identification sequence or its counter strand, in particular BsrI, BstNI, BsmAI, BsII, BsoBI or BstOI.
  • a degradation reaction is understood to mean a reaction which modifies the identification sequence or its counter strand. It separates the identification sequence or the counter strand from the respectively unmodified complex mental strand.
  • the degradation reaction can be a single bond in the identification sequence or the counter-cleavage reaction. Such a reaction can lead to fragmentation of the identification sequence or the opposite strand.
  • the hybrid of the identification sequence and the counter strand is thus destabilized thermodynamically so that it is the latest among those for step lit. e required stringent conditions dissociated.
  • the identification sequence can be complementary in the terminal areas. It can have a refolding, preferably having 4 to 10 base pairs. This increases the stringency of the hybridization in step lit. e.
  • the reaction is carried out with the formation of conditions which counteract primer dimers. This helps prevent false positive results.
  • the conditions are chosen so that the first and second primers do not hybridize with one another in the reaction producing the product.
  • the primers can be formed from a group of primers in which the melting point of the cross hybrids is at least 10 ° C. below the lowest melting point of a specific hybrid of a primer with the nucleic acid to be detected. Furthermore, the primers can be selected from a group of primers in which cross hybrids of primers and identification sequences are at least 10 ° C. below the lowest melting point of a specific hybrid of a primer. The aforementioned are advantageously located
  • the reaction can be a primer extension reaction, preferably a polymerase chain reaction (PCR) or a strand displacement reaction.
  • PCR polymerase chain reaction
  • hot-start conditions are selected as conditions in the primer extension reaction. This counteracts the formation of primer dimers and other non-specific products.
  • the nucleic acid sequence to be detected can be a DNA or an RNA. If it is an RNA, the connection can additionally be brought into contact with a reverse transcriptase and in step lit. c in addition, reverse transcription is carried out. In step lit. b in addition, a third primer, which is specific for the nucleic acid sequence to be detected, on which step lit. c nucleotides are added using the reverse transcriptase.
  • an optically or electrically detectable marking can be built into the product during the reaction.
  • the second primer can have a preferably 5 'terminal labeling group, or it can be lit.
  • c labeled nucleotides are inserted into the product by polymerization. Suitable markings are e.g. fluorescent nucleotides, biotin, hapten or redox markers.
  • the melting point of the double-stranded section of the product is expediently greater than the hybridization temperature. rature of a hybrid formed from the single-stranded section of the product with the binding sequence.
  • the binding sequence can be complementary in the terminal areas. It can have a refolding, preferably having 4 to 10 base pairs. This increases the stringency of the hybridization of the binding sequences with the single-stranded regions of the products.
  • the products are separated from non-extended connections.
  • the separation can be done using glass / silica particles or a filter.
  • identification sequences in particular are removed. This significantly increases the sensitivity of the method to detection.
  • the identification sequences can be destroyed in a targeted manner after the formation of the specific products. This is possible, for example, when using uracil in the identification sequences and when treating with uracil glycolysis when using ribonucleotides in the identification sequences.
  • Such treatment is expediently carried out in an alkaline environment. In this case the environment is then neutralized again in order to ensure renaturation to the double strand of the product before contact with the binding sequences.
  • a kit for carrying out the method according to the invention, comprising
  • the kit can also contain activated identification sequences which are suitable for coupling to 5 'modified primers.
  • the identification sequence can be selected from a group of identification sequences which do not cross-hybridize under given uniform hybridization conditions.
  • the end of an identification sequence can have a maleiimide or succiimide group. These groups enable simple coupling of the identification sequence to a primer modified with a thiol or amine group.
  • the advantage of such a kit is that a user of the method can use the same set of immobilized binding sequences and identification sequences for each of his specific nucleic acids to be detected. Because of the further advantageous refinements of the kit, reference is made to the preceding explanations.
  • the features mentioned there can also be features and / or components of the kit.
  • FIG. 1 a, b a schematic representation of the duplication of a nucleic acid sequence to be detected by means of a PCR
  • FIG. 2 a - c a schematic representation of binding sequences immobilized on a support and their hybridization with (FIG. 2 b) and without
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the multiplication of an RNA by means of a reverse transcriptase and a DNA polymerase in one
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a duplication of a nucleic acid sequence to be detected by means of a PCR and a subsequent degradation reaction.
  • FIG. 1 a shows a compound 14 composed of a first primer 10 and an identification sequence 12.
  • the primer 10 binds to the nucleic acid sequence 16 to be detected.
  • the second primer 18 has a labeling substance 20. It binds to the opposite strand of the nucleic acid sequence 16 to be detected. the result of a PCR is shown, which has been carried out with the compound 14 shown in FIG. 1 a, the second primer 18 and the nucleic acid sequence 16 to be detected.
  • the identification sequence 12 contains means which prevent the region of the identification sequence 12 from becoming double-stranded. Products with a double-stranded section and the single-stranded identification sequence were created.
  • Fig. 2a shows a carrier 22. This can e.g. act as a membrane. Binding sequences 26 are bound to the carrier 22 via linkers 24. 2b shows the situation after the binding sequences 26 shown in FIG. 2a have been brought into contact with the single-stranded sections of the products. The hybridization can be detected on the carrier 22 by the marking substance. 2c shows, by comparison, a situation in which non-elongated connections have not been removed prior to contacting the product with the binding sequences 26. The simultaneous presence of product and free compounds can lead to competition for the specific binding sequences on the carrier 22. Because of the greater mobility, size, charge density, and number of free compounds compared to the product, binding of the free compound is the preferred reaction with the binding sequences 26.
  • FIG. 3 schematically shows a method in which the nucleic acid sequence 16 to be detected is an RNA. First, the second one containing the marking substance 20 binds
  • Primer 18 to the RNA It is extended using a reverse transcriptase. This creates a double-stranded DNA-RNA hybrid. After denaturing the DNA-RNA hybrid the first primer 10 binds to the DNA strand. A PCR is carried out to reproduce the DNA strand.
  • the 4 shows a compound 14 consisting of a primer 10 and an identification sequence 12.
  • the identification sequence 12 has nucleotides 13 which can be cleaved by a degradation reaction.
  • a PCR reaction with this compound, a nucleic acid sequence 16 to be detected and a second primer 18 leads to completely double-stranded PCR products.
  • the identification sequences contained therein are removed by a degradation reaction. The result is double-stranded products with a single-stranded counter strand of the identification sequence.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens enthaltend: a) an einem Träger immobilisierte Bindungssequenzen und b) Verbindungen, jeweils gebildet aus einem für die nachzuweisenden Nukleinsäuren spezifischen ersten Primern und einer für den ersten Primer spezifischen Identifizierungssequenz, wobei die Identifizierungssequenz aus einer Gruppe von Identifizierungssequenzen ausgewählt ist, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen nicht kreuzhybridisieren.

Description

Verfahren zum Nachweis mindestens einer Nu leinsäuresequenz
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis mindestens einer Nukleinsäuresequenz und einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Zum Nachweis einer Nukleinsäuresequenz ist es allgemein bekannt, die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz mittels spezifischer DNA-Primer in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu vervielfältigen. Die vervielfältigten Sequenzen können dann mittels einer Hybridisierung mit einer für die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz spezifischen Bindungssequenz nachgewiesen werden. Bei diesem Verfahren ist es nachteilig, daß für jede nachzuweisende Nukleinsäuresequenz eine spezifi- sehe Bindungssequenz erforderlich ist. Weiterhin ist es von Nachteil, daß für jede Hybridisierung mit dieser Bindungssequenz spezifische Hybridisierungsbedingungen eingehalten werden müssen.
Aus Whitcombe, D. et al . , Nature Biotechnology 17 (1999) Seiten 804 bis 807 ist es bekannt, eine PCR mit einem speziellen Primer durchzuführen. Der Primer weist einen Bereich auf, in dem die Synthese eines Gegenstrangs durch ein Blockiermittel für eine Polymerase verhindert wird. Der Bereich weist ein Fluorophor und einen Quencher auf, welche sich durch Basenpaarungen in unmittelbarer Nachbarschaft befinden. Ein Fluoreszenz-Signal kann nicht erzeugt werden. Der Bereich weist in einem nicht basengepaarten Abschnitt eine Sequenz auf, die komplementär zu einem durch die Verlängerung des Primers bei der PCR entstehenden Produkt ist. Nach einer Denaturierung des Produkts, kommt es unter geeigneten Bedingungen zu einer Basenpaarung des Abschnitts mit dem komplementären Bereich in dem Produkt. Dadurch wird der Quencher von dem Fluorophor ge- trennt, so daß ein Fluoreszenz-Signal entstehen kann. Das Fluoreszenz-Signals dient als Nachweis für das Vorhandensein einer für den Primer spezifischen DNA-Sequenz. Bei dem Verfahren ist es nachteilig, daß ein für jede nachzuweisende Nu- kleinsäuresequenz spezifischer Primer mit einem spezifischen komplementären Abschnitt synthetisiert werden muß. Durch die verschiedenen funktioneilen Einheiten ist der Primer verhältnismäßig lang und damit aufwendig herzustellen.
Aus der EP 0 401 037 ist es bekannt bei einer PCR Nukleotide einzusetzen, die in der zu vervielfältigenden Nukleinsäuresequenz nicht vorkommen. Ein solches Nukleotid kann Desoxy- Uridin sein. Nach einer Vervielfältigungsreaktion kann ein unerwünschtes Produkt mit Uracil-DNA-Glycosylase behandelt werden. Uracil-DNA-Glycolyase spaltet die gycosidische Bindung zwischen der Base Uracil und dem Zucker Desoxy-Ribose eines in einem DNA-Molekül eingebauten Desoxy-Uridin-Rests . Dadurch kann das unerwünschte Produkt bei einer weiteren Vervielfältigungsreaktion nicht mehr als Matrize dienen. Ein weiteres einsetzbares Nukleotid ist Bromdesoxy-Uridin. Brom- desoxy-Uridin enthaltende DNA kann durch Behandlung mit Licht unter geeigneten Bedingungen abgebaut werden.
Aus der US 5,744,311 ist ein auf einer Strangverdrängung ba- sierendes Vervielfältigungsverfahren für Nukleinsäuren bekannt. Dabei wird ein Primer mit dem 3 ' -Ende einer zu vervielfältigenden einzelsträngigen Nukleinsäure hybridisiert und mittels einer DNA-Polymerase verlängert. Zum Verlängern werden Desoxy-Nukleosidtriphosphate verwendeten, die zum Teil derivatisiert sind. Geeignete derivatisierte Desoxy-Nukleosidtriphosphate sind z.B. α-Thio-Desoxy-Nukleosidtriphospha- te . Ein Strang der entstandenen doppelsträngigen DNA mit derivatisierte Desoxy-Nukleotid-Resten wird an bestimmten Stel- len von einer Restriktionsendonuklease erkannt und geschnitten. Ausgehend von dem Schnitt verlängert die DNA-Polymerase das 3 ' -Ende des geschnittenen DNA-Strangs. Der andere Teil des geschnittenen DNA-Strangs wird von der doppelsträngigen DNA verdrängt. Durch Wiederholen des Verfahrens wird der verdrängte DNA-Strang vervielfältigt.
Aus der WO 97/31256 ist es bekannt, Zielsequenzen in Nukleinsäuren mittels einer Ligase-Reaktion und einer immobilisierte Bindungssequenzen aufweisenden adressierbaren Matrix nachzuweisen. Dabei wird für jede nachzuweisende Zielsequenz eine Oligonukleotid-Sonde verwendet, die einen Zielsequenz-spezifischen und einen Bindungssequenz-spezifischen Anteil aufweist. Ferner wird eine eine Markierungssubstanz aufweisende zweite Oligonukleotid-Sonde eingesetzt, die an der nachzuweisenden Zielsequenz in unmittelbarer Nachbarschaft zu der ersten Oligonukleotid-Sonde binden kann. Beim Vorhandensein der Zielsequenz binden die erste und die zweite Oligonukleotid- Sonde an der Zielsequenz. Sie werden durch eine Ligase kova- lent miteinander verbunden. Die verbundenen Oligonukleotid-
Sonden werden mit den immobilisierten Bindungssequenzen in Kontakt gebracht, so daß eine Hybridisierung stattfindet. Das Vorhandensein der Zielsequenz wird durch das Detektieren der Markierungssubstanz am Ort der Hybridisierung nachgewiesen. Der Nachteil des Verfahrens besteht darin, daß es häufig falsch-positive Ergebnisse liefert.
Die U.S. 5,525,494 beschreibt ein Verfahren zur Amplifizie- rung einer Ziel-Nukleotidsequenz, wobei ein erster Primer verwendet wird. Der erste Primer weist einen Bindungsabschnitt auf, der im wesentlichen komplementär zur Ziel-Nukleotidsequenz ist. Daran ist ein Verlängerungsabschnitt gebunden. Der Verlängerungsabschnitt ist so ausgebildet, daß eine Synthese eines dazu komplementären Verlängerungsabschnitts unterdrückt wird. Der am 5 ' -Ende gebildete Verlängerungsabschnitt bleibt einzelsträngig. Damit können die bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) gebildeten Produkte an ge- eigneten an einer festen Phase immobilisierten Oligonukleoti- den gebunden werden. - Die Nachweisempfindlichkeit des bekannten Verfahrens ist nicht besonders hoch.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Insbesondere sollen ein universelles Verfahren und ein Kit zum parallelen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen angegeben werden.
Die Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 33 gelöst . Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 - 32 und 34 - 43.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum parallelen Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung einer abschnitts- weise einzelsträngige Nukleinsäuren erzeugenden Reaktion vorgesehen mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen von Verbindungen jeweils gebildet aus einem für die nachzuweisenden Nukleinsäuren spezifischen ersten Primer und einer für die ersten Primer spezifischen Identifizierungssequenz, wobei die Identifizierungssequenz aus einer Gruppe von Identifizierungssequenzen ausgewählt ist, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen nicht untereinander und nicht mit den ersten Primern kreuzhy- bridisieren, und wobei in der Verbindung ein Mittel vorgesehen ist, daß die Einzelsträngigkeit eines Abschnitts des in lit. c gebildeten Produkts bewirkt, b) Inkontaktbringen der Nukleinsäuren mit den Verbindungen und mit für die nachzuweisenden Nukleinsäuren spezifischen zweiten Primern, wobei die zweiten Primer aus einer Gruppe von zweiten Primern ausgewählt sind, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen mit den Identifizierungssequenzen nicht kreuzhybridisieren,
c) Durchführen der Reaktion, wobei die Verbindungen und die zweiten Primer durch eine Polymerase verlängert werden und Hybride bilden derart, daß spezifische Produkte bestehend aus einem doppelsträngigen Abschnitt und einem einzelsträngigen Abschnitt hergestellt werden, wobei der einzelsträngige Abschnitt entweder die Identifizierungssequenz oder die komplementäre Identifizierungssequenz ist,
d) Trennen der spezifischen Produkte von nicht verlängerten Verbindunge ,
e) Inkontaktbringen der spezifischen Produkte mit an einem Träger immobilisierten Bindungssequenzen, welche komplementär zu den einzelsträngigen Abschnitten der Produkte sind, so daß die Bindungssequenzen mit den einzelsträngigen Abschnitten der Produkte spezifisch hybridisieren, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die doppelsträngigen Abschnitte der spe- zifischen Produkte erhalten bleiben, und wobei die Bindungssequenzen aus einer Gruppe von Bindungssequenzen ausgewählt sind, welche mit nicht vollständig komplementären einzelsträngigen Abschnitten der spezifischen Produkte bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen nicht kreuzhy- bridisieren, und
f) Nachweis der Hybridisierung der spezifischen Produkte mit den Bindungssequenzen. Unter einem Primer wird ein durch eine Polymerase verlängerbares Oligonukleotid verstanden. Die Primer können aus DNA bestehen. Für die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz spezifische erste und zweite Primer sind Primer, welche unter geeig- neten Hybridisierungsbedingungen spezifisch mit der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz oder einem dazu komplementären Gegenstrang hybridisieren. Eine für den ersten Primer spezifische Identifizierungssequenz ist eine Identifizierungssequenz, die eindeutig dem ersten DNA-Primer zugeordnet ist. Das Mittel kann innerhalb der Identifizierungssequenz, innerhalb des ersten Primers oder zwischen dem ersten Primer und der Identifizierungssequenz enthalten sein.
Unter einem spezifischen Produkt wird ein Produkt verstanden, welches spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz ist. Ein solches Produkt wird beim Schritt lit. c insbesondere unter stringenten Bedingungen gebildet .
Beim Schritt lit. e erfolgt das spezifische Hybridisieren der Identifizierungssequenz bzw. des einzelsträngigen Abschnitts mit der Bindungssequenz unter geeigneten stringenten Bedingungen. Diese Bedingungen sind abhängig von den Identifizierungssequenzen bzw. den BindungsSequenzen.
Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß das gebildete spezifische Produkt direkt mit der immobilisierten Bindungssequenz hybridisieren kann, ohne zuvor denaturiert zu sein. Dadurch wird verhindert, daß die den doppelsträngigen Abschnitt des spezifischen Produkts bildenden Einzelstränge die Hybridisierung mit den Bindungssequenzen, z.B. durch Kreuzhy- bridisierung, stören. Weiterhin ist es bei dem Verfahren vorteilhaft, daß bei der Hybridisierung der Produkte mit den Bindungssequenzen einzelsträngige Bereiche hybridisieren. Ei- ne Hybridisierung zwischen einzelsträngigen Abschnitten ist erheblich schneller und effizienter im Vergleich zu einer Hybridisierung zwischen denaturierten doppelsträngigen Abschnitten. Weiterhin ist es vorteilhaft, daß die Träger mit einem Satz von immobilisierten Bindungssequenzen zum Nachweis verschiedener Nukleinsäuresequenzen verwendet werden kann. Vorgegebene identische Identifizierungssequenzen können in verschiedenen Nachweisverfahren mit unterschiedlichen ersten Primern verbunden sein. Identische Bindungssequenzen können dann für den Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist universell zum Nachweis von Nukleinsäuren einsetzbar. Wegen der vorgeschlagenen Auswahl von Primer-Identifizierungs- und Bindungssequenzen, können beliebig viele Nukleinsäuren in einem parallelen Verfahren nachgewiesen werden. Diese Eigenschaft wird auch als Multiplexfähigkeit bezeichnet.
Die vorgeschlagene Auswahl der ersten und zweiten Primer bewirkt, daß die Bildung von Primerdimeren reduziert wird. Pri- merdimere würden beim Schritt lit. e zu falsch-positiven Ergebnissen führen und die Menge der gebildeten spezifischen Produkte beim Schritt lit. c reduzieren.- Indem nach weiterer Maßgabe der Erfindung ausgeschlossen ist, daß die ersten Primer mit den Identifizierungssequenzen hybridisieren, wird verhindert, daß die Menge der zur Bildung des spezifischen Produkte benötigten ersten Primer verringert wird. Außerdem wird verhindert, daß die Menge der zur Bildung des spezifischen Produkts benötigten einzelsträngigen Abschnitte verringert wird.
Die Multiplexfähigkeit erfordert spezifische Eigenschaften der verwendeten zweiten Primer, der Identifizierungssequenzen und der BindungsSequenzen. Die zweiten Primer sollten aus ei- ner Gruppe von zweiten Primern ausgewählt sein, welche unter einer für alle Primer geltenden Hybridisierungsbedingung spezifisch jeweils an ihre komplementären Sequenzen an den nachzuweisenden Nukleinsäuren binden. Ferner sind die zweiten Primer so ausgewählt, daß unter dem Hybridisierungsbedingungen gemäß lit. c keine Kreuzhybridisierung untereinander und keine Hybridisierung der Primer mit den Identifizierungssequenzen stattfindet. Außerdem ist es zweckmäßig, die zweiten Primer so auszuwählen, daß unter den Bedingungen des Schritts lit. e eine Kreuzhybridisierung der zweiten Primer mit den Bindungssequenzen ausgeschlossen ist . Das ist insbesondere dann zweckmäßig, wenn im Schritt lit. d freie Primer nicht abgetrennt werden.
Die Auswahl der Identifizierungssequenzen hat den Vorteil, daß die Menge der im Schritt lit. c gebildeten Produkte erhöht und gleichzeitig die Menge an unspezifischen Produkten verringert wird.
Die einzelsträngigen Abschnitte der Produkte können aus einer Gruppe von einzelsträngigen Abschnitten ausgewählt sein, die zumindest unter den Bedingungen des Schritts lit. e nicht untereinander hybridisieren. Eine Hybridisierung wäre in diesem Fall nachteilig, weil die Konzentration der für die Bindung der einzelsträngigen Abschnitte an die Bindungssequenzen reduziert würde .
Die Bindungssequenzen sind zweckmäßigerweise aus einer Gruppe von Bindungssequenzen ausgewählt, die zumindest unter den Be- dingungen des Schritts lit. e spezifisch mit den komplementären, einzelsträngigen Abschnitten der Produkte hybridisieren. Sie hybridisieren nicht mit nicht-komplementären einzelsträngigen Abschnitten der Produkte. Eine Hybridisierung der Bin- dungsSequenzen mit nicht vollständig komplementären Bindungssequenzen der Produkte würde zu falsch-positiven Resultaten oder zumindest einer geringeren Nachweisempfindlichkeit der nachzuweisenden Nukleinsäuren führen.
Auch die ersten Primer können aus einer Gruppe von ersten Primern ausgewählt sein, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen nicht kreuzhybridisieren.
Die Verbindungen können nach einer vorteilhaften Ausgestaltung ein Mittel enthalten, welches bei der Reaktion eine Synthese eines zur Identifizierungssequenz komplementären Gegenstrangs verändert . Bei dem Mittel kann es sich um PNA (=Peptid-Nucleic-Acid) , einen PEG (=Polyethylenglycol-Lin- ker, eine Peptid- oder Disulfid-Bindung handeln.
Die Verbindungen können nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ein Mittel enthalten, welches bei der Reaktion eine Abbaureaktion der Identifizierungssequenz oder ihres komplementären Gegenstrangs ermöglicht. Das Mittel kann z.B. ein Uracil, ein Thionukleotid und/oder ein Ribonukleotid sein.
Die Abbaureaktion kann mittels Uracil-DNA-Glycosylase, Exonu- klease, RNAseH, unter Lichteinwirkung oder mittels einer die Identifizierungssequenz oder deren Gegenstrang spaltenden Restriktionsendonuklease, insbesondere BsrI, BstNI, BsmAI , BsII, BsoBI oder BstOI durchgeführt werden.
Unter einer Abbaureaktion wird eine die Identifizierungssequenz oder deren Gegenstrang modifizierende Reaktion verstanden. Sie bewirkt eine Trennung der Identifizierungssequenz oder des Gegenstrangs vom jeweils nicht modifizierten komple- mentären Strang. Die Abbaureaktion kann eine nur einzelne Bindungen in der Identifizierungssequenz oder dem Gegenstrang spaltende Reaktion sein. Eine solche Reaktion kann zu einer Fragmentierung der Identifizierungssequenz oder des Gegen- Strangs führen. Das Hybrid aus der Identifizierungssequenz und dem Gegenstrang wird dadurch thermodynamisch so destabilisiert, daß es spätestes unter den für Schritt lit. e erforderlichen stringenten Bedingungen dissoziiert.
Die Identifizierungssequenz kann in den terminalen Bereichen komplementär ausgebildet sein. Sie kann eine, vorzugsweise 4 bis 10 Basenpaare aufweisende, Rückfaltung besitzen. Das erhöht die Stringenz der Hybridisierung in Schritt lit. e.
Nach einem vorteilhaften Ausgestaltungsmerkmal wird die Reaktion unter der Bildung von Primerdimeren entgegenwirkenden Bedingungen durchgeführt . Das trägt zur Verhinderung von falsch-positiven Ergebnissen bei. Die Bedingungen sind dabei so gewählt, daß bei der das Produkt erzeugenden Reaktion die ersten und zweiten Primer nicht miteinander hybridisieren.
Zur Verhinderung einer solchen Kreuzhybridisierung der Primer können die Primer aus einer Gruppe von Primern ausgebildet sein, bei denen die Schmelzpunkte der Kreuzhybride mindestens 10° C unterhalb des geringsten Schmelzpunkts eines spezifi- sehen Hybrids eines Primers mit der nachzuweisenden Nuklein- säure liegt. Weiterhin können die Primer aus einer Gruppe von Primern auswählt sein, bei der Kreuzhybride aus Primern und Identifizierungssequenzen mindestens 10° C unterhalb des geringsten Schmelzpunkts eines spezifischen Hybrids eines Pri- mers liegt. Vorteilhafterweise liegen die vorgenannten
Schmelzpunkte aller verwendeten Primer innerhalb eines Temperaturbereichs von 5° C. Es ist zweckmäßig, daß alle Primer eine im wesentlichen gleich Länge und einen im wesentlichen gleichen GC-Gehalt aufweisen.
Bei der Reaktion kann es sich um eine Primerverlängerungsre- aktion, vorzugsweise eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder eine Strang-Displacement-Reaktion, handeln. Zweckmäßigerweise werden bei der Primerverlängerungsreaktion als Bedingungen hot-start-Bedingungen gewählt. Das wirkt der Bildung von Primerdimeren und anderen unspezifischen Produkten entgegen.
Bei der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz kann es sich um eine DNA oder auch eine RNA handeln. Sofern es sich um eine RNA handelt, kann die Verbindung zusätzlich mit einer rever- sen Transkriptase in Kontakt gebracht werden und beim Schritt lit. c zusätzlich eine reverse Transkription durchgeführt werden. Dabei kann beim Schritt lit. b zusätzlich ein dritter, für die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz spezifischer Primer zugesetzt werden, an welchem beim Schritt lit. c mit- tels der reversen Transkriptase Nukleotide angefügt werden.
Nach einer weiteren Ausgestaltung kann bei der Reaktion eine optisch oder elektrisch nachweisbare Markierung in das Produkt eingebaut werden. Z.B. kann der zweite Primer über eine bevorzugt 5 ' -terminale Markierungsgruppe verfügen, oder es können während des Schritts lit. c markierte Nukleotide in das Produkt durch Polymerisation eingefügt werden. Als Markierung eignen sich z.B. fluoreszierende Nukleotide, Biotin, Hapten oder auch Redoxmarker.
Zweckmäßigerweise ist der Schmelzpunkt des doppelsträngigen Abschnitts des Produkts größer als die Hybridisierungstempe- ratur eines aus dem einzelsträngigen Abschnitt des Produkts mit der Bindungssequenz gebildeten Hybrids.
Die Bindungssequenz kann in den terminalen Bereichen komple- mentär ausgebildet sein. Sie kann eine, vorzugsweise 4 bis 10 Basenpaare aufweisende, Rückfaltung besitzen. Das erhöht die Stringenz der Hybridisierung der Bindungssequenzen mit den einzelsträngigen Bereichen der Produkte.
Beim Schritt lit. d werden die Produkte von nicht verlängerten Verbindungen getrennt. Die Trennung kann mittels Glas/Silika-Partikeln oder einem Filter erfolgen. Durch die Abtrennung der nicht verlängerten Verbindungen, werden insbesondere Identifizierungssequenzen entfernt. Dadurch wird die Nachweisempfindlichkeit des Verfahrens wird erheblich gesteigert. Zum Abtrennen der Identifizierungssequenzen nicht verlängerten Verbindungen können die Identifizierungssequenzen nach der Bildung der spezifischen Produkte gezielt zerstört werden. Das ist beispielsweise bei der Verwendung von Uracil in den Identifizierungssequenzen und der Behandlung mit Ura- cilglycolyse bei der Verwendung von Ribonukleotiden in den Identifizierungssequenzen möglich. Eine solche Behandlung erfolgt zweckmäßigerweise im alkalischen Milieu. In diesem Fall wird das Milieu anschließend wieder neutralisiert, um eine Renaturierung zum Doppelsträng des Produkts vor dem Kontakt mit dem Bindungssequenzen zu gewährleisten. Es ist aber auch möglich, nicht in das Produkt umgewandelte Identifizierungssequenzen gemeinsam mit den freien Primern von den Produkten zu trennen. Dazu können z.B. herkömmliche Primer-Removal-Kits hergenommen werden. Die Produkte können in Schritt lit. d außerdem von zweiten Primern und Spaltprodukten getrennt werden. Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, enthaltend:
a) an einem Träger immobilisierte Bindungssequenzen und
b) Verbindungen, jeweils gebildet aus einem für die nachzuweisenden Nukleinsäuren spezifischen ersten Primer und einer für den ersten Primer spezifischen Identifizierungssequenz, wobei die Identifizierungssequenz aus einer Gruppe von Identifizierungssequenzen ausgewählt ist, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen nicht kreuzhybridisieren.
Wegen der vorteilhaften Ausgestaltungen des Kits wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen. Die dort erwähnten Merkmale können sinngemäß auch Merkmale und/oder Bestandteile des Kits sein.
Der Kit kann des weiteren aktivierte Identifizierungssequenzen enthalten, die zur Kopplung an 5 'modifizierte Primer geeignet sind. Die Identifizierungssequenz können aus einer Gruppe von Identifizierungssequenzen ausgewählt sein, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen nicht kreuzhybridisieren. Das Ende einer Identifizierungssequenz kann über eine Maleiimid- oder Succiimidgruppe verfügen. Diese Gruppen ermöglichen eine einfache Kopplung der Identifizierungssequenz an einen mit einer Thiol- oder Amin- gruppe modifizierten Primer. Der Vorteil eines solchen Kits besteht darin, daß ein Anwender des Verfahrens den gleichen Satz an immobilisierten Bindungssequenzen und Identifizierungssequenzen für jeweils seine spezifischen nachzuweisenden Nukleinsäuren nutzen kann. Wegen der weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen des Kits wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen. Die dort erwähnten Merkmale können sinngemäß auch Merkmale und/oder Bestandteile des Kits sein.
Nachfolgend werden Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung beschrieben. Hierin zeigen:
Fig. 1 a, b eine schematische Darstellung der Vervielfäl- tigung einer nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz mittels einer PCR,
Fig. 2 a - c eine schematische Darstellung von auf einem Träger immobilisierten Bindungssequenzen und deren Hybridisierung mit (Fig. 2 b) und ohne
(Fig. 2 c) die Entfernung freier Verbindungen,
Fig. 3 eine schematische Darstellung der Vervielfältigung einer RNA mittels einer Reversen Tran- skriptase und einer DNA-Polymerase in einem
Flußdiagramm und
Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Vervielfältigung einer nachzuweisenden Nukleinsäure- sequenz mittels einer PCR und einer anschließenden Abbaureaktion.
In Fig. 1 a ist eine aus einem ersten Primer 10 und einer Identifizierungssequenz 12 zusammengesetzte Verbindung 14 dargestellt. Der Primer 10 bindet an die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz 16. Der zweite Primer 18 weist eine Markierungssubstanz 20 auf. Er bindet an den Gegenstrang der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz 16. In Fig. lb ist Schema- tisch das Ergebnis einer PCR gezeigt, die mit der in Fig. 1 a dargestellten Verbindung 14, dem zweiten Primer 18 und der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz 16 durchgeführt worden ist. Die Identifizierungssequenz 12 enthält Mittel, die es verhindern, daß der Bereich der Identifizierungssequenz 12 doppelsträngig wird. Es sind Produkte mit einem doppelsträn- gigen Abschnitt und der einzelsträngigen Identifizierungssequenz entstanden.
Fig. 2 a zeigt einen Träger 22. Dabei kann es sich z.B. um eine Membran handeln. An dem Träger 22 sind über Linker 24 Bindungssequenzen 26 gebunden. In Fig. 2b ist die Situation nach dem Inkontaktbringen der in Fig. 2a dargestellten Bindungssequenzen 26 mit den einzelsträngigen Abschnitten der Produkte gezeigt . Durch die Markierungssubstanz ist die Hybridisierung auf dem Träger 22 nachweisbar. Fig. 2c zeigt im Vergleich dazu eine Situation, bei der nicht verlängerte Verbindungen vor dem Inkontaktbringen des Produkts mit dem Bindungssequenzen 26 nicht entfernt worden sind. Durch das gleichzeitige Vorhandensein von Produkt- und freien Verbindungen kann es zu einer Kompetition um die spezifischen Bindungssequenzen auf dem Träger 22 kommen. Wegen der größeren Beweglichkeit, der geringeren Größe, der geringeren Ladungsdichte und der größeren Anzahl der freien Verbindungen im Vergleich zu dem Produkt ist die Bindung der freien Verbindung die bevorzugte Reaktion mit den Bindungssequenzen 26.
Fig. 3 zeigt schematisch ein Verfahren, bei den die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz 16 eine RNA ist. Dabei bindet zunächst der die Markierungssubstanz 20 enthaltende zweite
Primer 18 an die RNA. Er wird mittels einer Reversen Transkriptase verlängert. Dabei entsteht ein doppelsträngiges DNA-RNA-Hybrid. Nach einer Denaturierung des DNA-RNA-Hybrids bindet der erste Primer 10 an den DNA-Strang. Zur Vervielfältigung des DNA-Strangs wird eine PCR durchgeführt.
Fig. 4 zeigt eine aus einem Primer 10 und einer Identifizie- rungssequenz 12 bestehende Verbindung 14. Die Identifizierungssequenz 12 weist Nukleotide 13 auf, die durch eine Abbaureaktion spaltbar sind. Eine PCR-Reaktion mit dieser Verbindung, einer nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz 16 und einem zweiten Primer 18 führt zu vollständig doppelsträngigen PCR-Produkten. Die darin enthaltenen Identifizierungssequenzen werden durch eine Abbaureaktion entfernt. Es entstehen doppelsträngige Produkte mit einem einzelsträngigen Gegenstrang der Identifizierungssequenz.
Bezugszeichenliste
10 erster Primer
12 Identifizierungssequenz 13 modifizierbares Nukleotid
14 Verbindung
16 Nukleinsäuresequenz
18 zweiter Primer
20 Markierungssubstanz 22 Träger
24 Linker
26 Bindungssequenz

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum parallelen Nachweis von Nukleinsäuren (16) unter Verwendung einer abschnittsweise einzelsträngige Nu- kleinsäuren erzeugenden Reaktion mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen von Verbindungen (14) jeweils gebildet aus einem für die nachzuweisenden Nukleinsäuren (16) spezifischen ersten Primer (10) und einer für die ersten Primer (10) spe- zifischen Identifizierungssequenz (12), wobei die Identifizierungssequenz (12) aus einer Gruppe von Identifizierungssequenzen ausgewählt ist, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen nicht untereinander und nicht mit den ersten Primern kreuzhybridisieren, und wobei in der Ver- bindung ein Mittel vorgesehen ist, daß die Einzelsträngigkeit eines Abschnitts des in lit. c gebildeten Produkts bewirkt,
b) Inkontaktbringen der Nukleinsäuren (16) mit den Verbindungen (14) und mit für die nachzuweisenden Nukleinsäuren (16) spezifischen zweiten Primern (18) , wobei die zweiten
Primer aus einer Gruppe von zweiten Primern ausgewählt sind, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen mit den Identifizierungssequenzen nicht kreuzhybridisieren,
c) Durchführen der Reaktion, wobei die Verbindungen (14) und die zweiten Primer (18) durch eine Polymerase verlängert werden und Hybride bilden derart, daß spezifische Produkte bestehend aus einem doppelsträngigen Abschnitt und einem ein- zelsträngigen Abschnitt (XX) hergestellt werden, wobei der einzelsträngige Abschnitt (XX) entweder die Identifizierungssequenz (12) oder die komplementäre Identifizierungssequenz ist, d) Trennen der spezifischen Produkte von nicht verlängerten Verbindungen,
e) Inkontaktbringen der spezifischen Produkte mit an einem Träger (22) immobilisierten Bindungssequenzen (26) , welche komplementär zu den einzelsträngigen Abschnitten (XX) der Produkte sind, so daß die Bindungssequenzen (26) mit den einzelsträngigen Abschnitten (XX) der Produkte spezifisch hybridisieren, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die dop- pelstrangigen Abschnitte der spezifischen Produkte erhalten bleiben, und wobei die Bindungssequenzen (26) aus einer Gruppe von BindungsSequenzen ausgewählt sind, welche mit nicht vollständig komplementären einzelsträngigen Abschnitten (XX) der spezifischen Produkte bei vorgegebenen einheitlichen Hy- bridisierungsbedingungen nicht kreuzhybridisieren, und
f) Nachweis der Hybridisierung der spezifischen Produkte mit den Bindungssequenzen (26) .
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten Primer (10) aus einer Gruppe von ersten Primern ausgewählt sind, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen nicht kreuzhybridisieren.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Identifizierungssequenzen zwischen 5 und 30 Basen lang sind.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei alle Identifizierungssequenzen den gleichen GC-Gehalt besitzen.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die alle Identifizierungssequenzen die gleiche Länge besitzen.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schmelzpunkte aller Identifizierungssequenzen weniger als 5°C auseinander liegen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der höchste Schmelzpunkt eines Hybrids zweier Identifizierungssequenzen mindestens 5°C unterhalb des niedrigsten Schmelzpunktes eines Hybrids einer Identifizierungssequenz mit ihrer komplementären Sequenz ist .
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungssequenzen zwischen 5 und 30 Basen lang sind.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Bindungssequenzen den gleichen GC-Gehalt besitzen.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungssequenzen die gleiche Länge besitzen.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schmelzpunkte aller Bindungssequenzen weniger als 5°C auseinander liegen.'
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der höchste Schmelzpunkt eines Hybrids einer Bindungssequenz mit einer nicht vollständig komplementären Identifizierungssequenz mindestens 5°C unterhalb des niedrigsten Schmelzpunktes eines Hybrids aus einer Bindungssequenz und einer vollständig komplementären Identifizierungssequenz ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindungen (14) ein Mittel enthalten, welches bei der Reaktion eine Synthese eines zur Identifizierungssequenz (12) komplementären Gegenstrangs verhindert .
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mittel eine PNA, ein PEG-Linker, eine Peptid- oder Disul- fid-Bindung ist .
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung (14) mindestens ein Nukleotid enthält oder bei der Reaktion mindestens ein Nukleotid in die Verbindung (14) eingebaut wird, welches eine Abbaureaktion der Identifizierungssequenz (12) oder eines zur Identifizierungssequenz (12) gebildeten komplementären Gegenstrangs ermöglicht.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mittel Uracil, ein Thionukleotid und/oder ein Ribonukleo- tid ist.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Abbaureaktion mittels Uracil-DNA-Glycosylase, RNaseH, Exonuklease, unter Lichteinwirkung oder mittels einer die Identifizierungssequenz (12) oder deren Gegenstrang spalten- den Restriktionsendonuklease, insbesondere BsrI , BstNI, Bs AI, BsII, BsoBI oder BstOI, durchgeführt wird.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Identifizierungssequenz (12) in den terminalen Bereichen komplementär ausgebildet.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Identifizierungssequenz (12) eine, vorzugsweise 4 bis 10 Basenpaare aufweisende, Rückfaltung besitzt.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktion unter der Bildung von Primerdimeren entgegenwirkenden Bedingungen durchgeführt wird.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktion eine Primerverlangerungsreaktion, vorzugsweise eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder eine Strang-Dis- placement-Reaktion, ist.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei der Primerverlangerungsreaktion als Bedingungen hot- start-Bedingungen gewählt werden.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktion eine reverse Transkriptase-Reaktion umfaßt.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei der Reaktion eine optisch oder elektrisch nachweisbare Markierung in das Produkt eingebaut wird.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierung ein Fluorogen, Hapten, Biotin oder eine Redox- Gruppe enthält .
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei der Reaktion zweite Primer (18) verwendet werden, welche die Markierung enthalten.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Träger (22) eine Membran, ein Chip oder ein identifizierbares Partikel verwendet wird.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schmelzpunkt des doppelsträngigen Abschnitts des Produkts höher ist als die Hybridisierungstemperatur eines aus dem einzelsträngigen Abschnitt (XX) des Produkts mit der Bindungssequenz (26) gebildeten Hybrids.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungssequenz (26) in den terminalen Bereichen komplementär ausgebildet.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungssequenz eine, vorzugsweise 4 bis 10 Basenpaare aufweisende, Rückfaltung besitzt.
31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt lit. d die Produkte von zweiten Primern und/oder
Spaltprodukten getrennt werden.
32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Trennung mittels Glas/Silika-Partikeln oder einem Filter erfolgt.
33. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthaltend:
a) an einem Träger (22) immobilisierte Bindungssequenzen (26)
und b) Verbindungen (14) , jeweils gebildet aus einem für die nachzuweisenden Nukleinsäuren (16) spezifischen ersten Primern (10) und einer für den ersten Primer (10) spezifischen Identifizierungssequenz (12) , wobei die Identifizierungsse- quenz (12) aus einer Gruppe von Identifizierungssequenzen ausgewählt ist, welche bei vorgegebenen einheitlichen Hybridisierungsbedingungen nicht kreuz-hybridisieren.
34. Kit nach Anspruch 33, wobei in der Verbindung (14) ein Mittel vorgesehen ist, welches bei der Reaktion eine Synthese eines Gegenstrangs zur Identifizierungssequenz (12) verhindert .
35. Kit nach einem der Ansprüche 33 oder 34, wobei die Bin- dungssequenz (26) an einer definierten Stelle des Trägers
(22) immobilisiert ist oder der Träger (22) ein identi izierbarer Träger (22) ist.
36. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei der Träger (22) aus Glas oder Kunststoff besteht und/oder in Form eines identifizierbaren Partikels, einer Membran oder eines Chips vorliegt .
37. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 36, wobei das Mittel aus mindestens einen Nukleotidanalogon, RNA, PNA oder einer
Unterbrechung der Abfolge der die Nukleotide in der Verbindung (14) verbindenden Phosphodiesterbindungen, insbesondere durch einen Polyethylenglycol-Linker, eine Peptidbindung oder eine Disulfidbindung, besteht.
38. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 37, wobei eine Poly- merase und ggf . eine reverse Transkriptase enthalten ist/sind.
39. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 38, wobei ein, insbesondere eine Markierungssubstanz (20) aufweisender, zweiter Primer (18) enthalten ist.
40. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 39, wobei mit einer Markierungssubstanz (20) versehene Nukleotide enthalten sind.
41. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 40, wobei ein dop- pelstrangspezifischer Interkalator, insbesondere SYBR Green, enthalten ist.
42. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 41 enthaltend ferner einen Primer-Removal-Kit und/oder Glas/Silika-Partikeln und/oder einen Filter.
43. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 42 enthaltend aktivierte Identifizierungssequenzen, die zur Kopplung an 5 λmodifizierte Primer geeignet sind.
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