DE69422467T2

DE69422467T2 - Fraktioniermethode für Nukleotidfragmente

Info

Publication number: DE69422467T2
Application number: DE69422467T
Authority: DE
Inventors: Hideki Kambara; Kazunori Okano; Chihiro Uematsu
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1993-10-26
Filing date: 1994-10-21
Publication date: 2000-08-24
Anticipated expiration: 2014-10-22
Also published as: CN1106459A; EP0649852A1; JPH07116000A; DE69422467D1; EP0649852B1; JP3419850B2; US5817464A; CN1077140C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fraktionierungsverfahren für Nukleotidfragmente (DNA oder RNA) und ein entsprechendes DNA-Sequenzbestimmungsverfahren.
Wenn DNAs unterschiedlicher Längen im Zustand einer Mischung, beispielsweise im Zustand enzymgespaltener Produkte einer langen DNA, vorliegen, ist es nicht möglich, ihre DNA- Sequenzen sofort zu bestimmen. Es sind zwei herkömmliche Verfahren zum Analysieren solcher DNA-Sequenzen bekannt. Das erste Verfahren beinhaltet das Separieren einzelner DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese und das Unterziehen der getrennten einzelnen Fragmente einer DNA-Sequenzbestimmung. Das zweite Verfahren beinhaltet das Einfügen dieser DNAs in einen geeigneten Vektor (Klonen), das Einbringen des Vektors in E. coli, das dann auf einem Agarmedium kultiviert wird, das Rekultivieren von E. coli in jeder erzeugten Kolonie und das Entnehmen von DNA aus dem vervielfachten Bakterium zur DNA-Sequenzbestimmung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Zur Gelelektrophorese, die zur DNA-Trennung verwendet werden soll, kann Agarosegel oder Polyacrylamidgel verwendet werden. Durch Gelelektrophorese können einzelne DNA-Basen mit einer Länge von 400b oder weniger unterschieden werden, und es kann weiterhin DNA mit einer Länge von 300b oder weniger getrennt und fraktioniert werden. Wenn die Länge jedoch anwächst, kann die Trennfähigkeit des Gels sinken. Daher ist das erste herkömmliche Verfahren problematisch, weil einzelne DNA-Fragmente nicht immer mit identischen Fraktionierungsergebnissen getrennt werden können.
Alternativ ist das über ein Klonen ablaufende zweite herkömmliche Verfahren auch problematisch, weil für das Verfahren umfangreiche Arbeiten erforderlich sind, weil ein DNA- Fragment mit einer erheblich geringeren Länge nicht geklont werden kann und weil eine enorme Anzahl von Klonen zur DNA- Sequenzbestimmung erforderlich sein kann, falls alle allen Fragmenten entsprechenden Klone getrennt werden sollten, um die Analyse aller Fragmente sicherzustellen.
Es ist ein DNA-Fraktionierungsverfahren bekannt, welches eine Hybridisierung verwendet und welches das Immobilisieren von DNA-Sonden verschiedener DNA-Sequenzen auf einer festen Oberfläche und das Hybridisieren von Ziel-DNA-Fragmenten mit den Sonden, wodurch die Fragmente getrennt und fraktioniert werden, beinhaltet. Es ist in diesem Fall jedoch erforderlich, daß die Sequenzen der Ziel-DNA-Fragmente bekannt sind, um die Sonden auf einer festen Oberfläche herzustellen, so daß das Verfahren nicht auf DNA-Fragmente mit unbekannten Sequenzen anwendbar ist.
Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme und sieht ein Verfahren zum leichten Trennen von DNA-Fragmenten, ein Analyseverfahren für eine DNA-Sequenz und dergleichen vor.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente, welches das Behandeln einer Mischung von DNA-Fragmenten, bei denen ein Terminus mit einem Oligonucleotid einer bekannten Sequenz mit einem Sondenchip oder einem Satz von Sondenchips, die eine feste Oberfläche aufweisen, an der verschiedene DNA-Sonden immobilisiert werden, verbunden wird, wobei die DNA-Sonden einen Sequenzauswählteil eines Oligonucleotids mit einer Länge, bei der das Oligonucleotid nicht ausschließlich stabil hybridisiert werden kann, also eines Oligonucleotids mit einer bis sechs Basen, am 3'-Terminus angrenzend an die bekannte Oligonucleotidsequenz, die zum Terminusteil der obenerwähnten DNA- Fragmente komplementär ist, aufweisen, und das Fraktionieren der gemischten DNA-Fragmente durch den Hybridisierungsprozeß und/oder die DNA-Komplementärstrangverlängerungsreaktion beinhaltet. Eine stabile Hybridisierung tritt in der speziellen DNA-Sequenz auf, während der Sequenzauswählteil zum Erkennen des Auftretens der DNA-Komplementärstrangverlängerung verwendet wird. Wenn die DNA-Komplementärstrangverlängerung bei einer vollkommen mit einem DNA-Fragment hybridisierten Oligonucleotidsonde auftritt, steigt die Hybridisierungskraft an, die zum Trennen des DNA-Fragments von anderen DNA- Fragmenten verwendet werden kann, die nicht vollkommen mit Oligonucleotidsonden hybridisiert sind. Daher tritt die DNA- Strangverlängerung nicht auf. Durch das oben beschriebene Fraktionierungsverfahren können fraktionierte DNA-Fragmente getrennt und gesammelt werden, falls dies erforderlich ist.
Ein solcher Sondenchip ist beispielsweise ein schmaler Stab, ein Draht, ein Folienstreifen, ein Band oder dergleichen, an denen DNA-Sonden immobilisiert sind, oder eine feste Oberfläche mit Abschnitten, an denen unterschiedliche Typen von DNA-Sonden einzeln immobilisiert sind.
Durch das Verfahren wird ein einziger Sondenchip oder werden mehrere Sondenchips, die DNA-Sonden aufweisen, gleichzeitig in eine DNA-Fragmente enthaltende Lösung eingebracht, damit die DNA-Komplementärstrangverlängerungsreaktion doppelsträngige DNA(s) erzeugt, die dann einzeln oder zusammen mit mehreren Typen fraktioniert wird (werden).
Nach dem Verfahren wird wenigstens eine Wiederholung eines Zyklus des Prozesses der DNA-Komplementärstrangverlängerungsreaktion und eines Prozesses, der das Erhöhen der Temperatur einer Mischung der erhaltenen Produkte der Komplementärstrangverlängerungsreaktion zum Trennen der nicht verlängerten DNA-Sonde von der DNA-Fragmentprobe enthält, während die verlängerte DNA-Sonde mit der DNA-Probe hybridisiert bleibt, vorgenommen.
Wenn beim obenerwähnten Verfahren die DNA-Komplementärstrangverlängerungsreaktion unter Verwendung von Sondenchips, bei denen DNA-Sonden einzeln an verschiedenen festen Oberflächen oder an verschiedenen Abschnitten einer festen Oberfläche immobilisiert sind, ausgeführt wird, kann die Anzahl der DNA-Fragmente zusammen mit einem freien Oligonucleotidoligomer (Primer) durch wiederholtes Erhöhen und dann Senken der Reaktionstemperatur auf einer festen Oberfläche vergrößert und getrennt werden, wobei es sich um eine Art einer PCR (Polymerasekettenreaktion) mit einer festen Oberfläche handelt. Hierbei enthält die auf der festen Oberfläche immobilisierte DNA-Sonde eine gemeinsame Sequenz und einen Sequenzauswählteil am 3'-Terminus, wenngleich der freie Primer nur eine gemeinsame Sequenz enthält.
Die durch das Fraktionierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen DNA-Fragmente werden so wie sie sind oder nach einzelner Trennung und Isolation zur DNA- Sequenzbestimmung verwendet.
Das DNA-Sequenzbestimmungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf die DNA-Sequenzbestimmung von DNA- Fragmenten nach der Fraktionierung, wie oben beschrieben wurde, oder von DNA-Fragmenten nach der Trennung oder Isolation ohne eine einzelne Fraktionierung angewendet werden. Durch Anbringen eines bekannten DNA-Oligomers an dem Terminus eines DNA-Fragments wird das DNA-Fragment zu einer mit einer DNA-Sonde hybridisierbaren Form modifiziert. Ein am 3'-Terminus der DNA-Sonde angebrachter Sequenzauswählteil von mehreren Basen wird zum Auswählen eines Ziel-DNA-Fragments angeordnet, und die DNA-Sonde ist daher eine zum Auswählen dienende Sonde. Für die Sequenz mehrerer Basen am 3'-Terminus sollten alle Kombinationen mehrerer Basen hergestellt werden. DNA-Sonden, die jeweils einen Sequenzauswählteil, der aus einer Sequenz dieser Kombination und einer bekannten Sequenz, die zu einem speziellen DNA-Fragment komplementär ist, zusammengesetzt ist, aufweisen, werden einzeln an den Spitzen verschiedener schmaler Stäbe angebracht. Wenn die an den 3'-Terminus von einer dieser DNA-Sonden angrenzende Sequenz vollständig paßt, wird die DNA-Komplementärstrangverlängerung mit der sich ergebenden Stabilitätserhöhung zur Hybridisierung ausgeführt, so daß nicht passende Sequenzen um den Terminus herum durch Erhöhen der Temperatur von dieser Sequenz unterschieden werden können.
Weil die Sequenz der Sonde, die an die mehreren Basen am 3'-Terminus zum Auswählen eines DNA-Fragments angrenzt, allen an schmalen Stäbe angebrachten Sonden gemeinsam ist, hybridisieren alle DNA-Fragmente mit DNA-Sonden. Eine große Anzahl sogenannter nicht passender Paare (ein Paar aus einem DNA- Fragment und einer DNA-Sonde), die nicht am 3'-Terminus aneinander angebracht sind, sind jedoch in einem Stadium vorhanden, in dem DNA-Fragmente und DNA-Sonden unter Bildung von Hybridomeren gemischt sind. Die DNA-Komplementärstrangverlängerung geschieht nur für die vollständig passenden Paare. Demgemäß wird ein mit einer Sonde ohne Komplementärstrangverlängerung hybridisiertes DNA-Fragment dehybridisiert und dann mit einer anderen Sonde rehybridisiert, während ein mit einer durch eine Komplementärstrangverlängerungsreaktion verlängerten Sonde hybridisiertes DNA-Fragment unverändert bleibt. Durch Wiederholen dieses Vorgangs kann die Anzahl der Paare (also der Paare aus einem DNA-Fragment und der DNA- Sonde), deren Sequenz zur Sequenz um den 3'-Terminus der DNA- Sonde, die einer DNA-Komplementärstrangverlängerung unterzogen wurde, paßt, erhöht werden. Auf diese Weise werden Paare mit vollständiger Hybridisierung getrennt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können DNA-Fragmente unbekannter DNA-Sequenzen auf der Grundlage der Differenz ihrer Terminussequenzen getrennt werden. Die getrennten DNA- Fragmente werden fraktioniert und zur Sequenzbestimmung durch PCR vermehrt. Demgemäß kann die DNA-Analyse ohne einen herkömmlichen Klonprozeß ausgeführt werden, der viel Arbeit und mehr Zeit erfordert. Die vorliegende Erfindung ist auch auf verschiedene andere Gebiete anwendbar, weil alle DNA-Bibliotheken auf der Grundlage ihrer Terminussequenzen getrennt und isoliert werden können.
Die vorliegende Erfindung kann folgendermaßen zusammengefaßt werden. Durch Herstellen eines Sondenchips oder von Sondenchips, die jede DNA-Sonde einzeln auf einer festen Oberfläche immobilisieren, deren Sequenz einen bestimmten Teil mit einer bekannten Sequenz, einen Teil einer Restriktionsenzymerkennungssequenz (die kombinierte Sequenz ist der erste Sequenzteil) und einen Sequenzauswählteil aus 1-6 Basen am 3'-Terminus (am zweiten Sequenzteil) angrenzend an den Teil mit einer bekannten Sequenz aufweist, durch Einbringen des Teils mit einer bekannten Sequenz in die Fragmenttermini einer DNA-Fragmentmischung von einer Restriktionsenzymsegmentierung und durch Kontaktieren der Sonde oder der Sonden mit den DNA-Fragmenten der Mischung zum Hybridisieren mit der DNA-Fragmentmischung, wodurch Komplementärstränge verlängert werden, werden einzelne DNA-Fragmente durch den Unterschied der Hybridisierungsstabilität getrennt. Die DNA-Fragmente werden unverändert oder nach dem Isolieren und Vermehren zur Sequenzbestimmung verwendet. DNA-Fragmente mit unbekannten DNA-Sequenzen können auf der Grundlage des Unterschieds der Sequenz um die Termini herum getrennt werden, wodurch der Klonprozeß drastisch verkürzt werden kann.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht der DNA-Extraktion gemäß der vorliegenden Erfindung,
Fig. 2 ist eine schematische Ansicht der in einem Bündel angeordneten schmalen Stäbe zur DNA-Extraktion gemäß der vorliegenden Erfindung,
Fig. 3 ist eine Ansicht zur Veranschaulichung des Verfahrens zum Analysieren von zwei Basen am DNA-Fragmentterminus,
Fig. 4 ist eine schematische Ansicht des Detektors für die Analyse der zwei Basen am DNA-Fragmentterminus,
Fig. 5 ist eine Ansicht zur Veranschaulichung eines weiteren Verfahrens zum Analysieren von zwei Basen am DNA- Fragmentterminus, und
die Fig. 6A bis 6E sind Ansichten zur Veranschaulichung eines Beispiels vdn DNA-Sequenzbestimmungsergebnissen bei Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen erklärt. Der technische Bereich der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Das Prinzip der vorliegenden Erfindung wird mit Bezug auf die Fig. 1 und 2 anhand eines einfachen Beispiels erklärt. Durch Ligieren wird zuerst ein DNA-Oligomer 2 mit einer bekannten Sequenz an den Terminus des durch Restriktionsenzymsegmentierung erzeugten doppelsträngigen DNA-Fragments 1 ligiert. Hierbei ist der Teil des ligierten Oligomers und der Erkennungssequenz des Enzyms der Teil mit einer bekannten Sequenz. Andernfalls wird Poly A mit End-Transferase an den Terminus der einsträngigen DNA angefügt, um die bekannte Sequenz in dem Terminus herbeizuführen. In Fig. 1 wird nun durch Veranschaulichen eines Beispiels eines Probenfragments 3 mit dem in den Terminus des doppelsträngigen DNA- Fragments 1 eingefügten Oligomers 2 mit einer bekannten Sequenz eine Erklärung gegeben.
Eine DNA-Sonde 12 wird an der Spitze eines schmalen Röhrchens oder eines schmalen Stabs 11 angebracht. Die am schmalen Röhrchen oder schmalen Stab 11 angebrachte DNA-Sonde 12 besteht aus einem Sequenzauswählteil 14 aus mehreren Basen am 3'-Terminus und einem Teil 13 mit einer bekannten Sequenz. Hierbei werden DNA-Sonden 12, die jeweils den Sequenzauswählteil 14 mit einer jeweils anderen Sequenz aufweisen, einzeln am schmalen Röhrchen oder an den schmalen Stäben 11 angebracht, und der Sequenzauswählteil 14 wird, wie beim Beispiel in Fig. 1 dargestellt ist, aus zwei Basen zusammengesetzt, während der Teil 13 mit einer bekannten Sequenz aus fünfzehn Basen zusammengesetzt wird (ein Kreis stellt nicht eine Base dar). Die Basenlänge der bekannten Sequenz und der selektiven Sequenz ist lang genug, tun eine stabile Hybridisierung mit DNA-Fragmenten herzustellen. Der schmale Stab 11 wird in eine Probenlösung eingetaucht, die das Probenfragment 3 enthält, das denaturiert und dann reassoziiert wird. Die erhaltenen Ziel-DNA-Fragmente 41, 42 werden zur DNA-Komplementärstrangverlängerung mit der DNA-Sonde 12 hybridisiert. Während dieser Reaktion kann die hybridisierte DNA-Sonde 12 ohne eine Fehlanpassung an ihrem 3'-Terminus DNAs 51, 52 durch Komplementärstrangverlängerung erzeugen. Ansonsten kann die Komplementärstrangverlängerung bei DNA-Sonden, die an ihrem Terminus eine Fehlanpassung aufweisen, nicht fortgesetzt werden, weil das nicht passende DNA-Fragment 41 ein hybridisiertes DNA-Fragment 61 erzeugen kann.
Um das nicht passende DNA-Fragment 61 von der Sonde zu dehybridisieren, wird die Temperatur der Probenlösung auf 70 bis 85ºC erhöht. Nachfolgend wird die Temperatur gesenkt, um die Ziel-DNA-Fragmente 41, 42 zur Komplementärstrangverlängerung mit der DNA-Sonde zu hybridisieren. Nach dem Wiederholen dieses Vorgangs wird die Lösung auf einer höheren Temperatur gehalten, und der schmale Stab 11 wird bei einer höheren Temperatur herausgezogen, um die mit den verlängerten Sonden hybridisierten Fragmente zu sammeln, während das nicht passende DNA-Fragment in der Lösung bleibt. Daraufhin wird die Spitze jedes schmalen Stabs in eine andere mit einer Pufferlösung gefüllte Flasche übertragen, und es wird dann die Temperatur des Stabs erhöht, um das DNA-Fragment von der Sonde an der Spitze zu dehybridisieren. Durch Bündeln einer Vielzahl schmaler Stäbe (A, B, C, ---) aus Fig. 1, wie in Fig. 2 dargestellt ist, um einen Satz schmaler Stäbe 101 zu bilden (A, B, C, ---, I, J), kann der oben beschriebene Reaktionsprozeß gleichzeitig ablaufen. Die Spitze jedes schmalen Stabs wird in eine Pufferlösung eingetaucht, und die DNA-Fragmente, die jeweils eine DNA-Sequenz mit einem passenden 3'-Terminus aufweisen, wobei die DNA-Sonde am schmalen Stab immobilisiert ist, werden durch Erhöhen der Temperatur fraktioniert. Die DNA-Sequenz wird unter Verwendung der fraktionierten DNA-Fragmente bestimmt.

(Beispiel 1)

Hind-III-Aufschlußprodukte von λ-Phagen-DNA wurden als Proben verwendet. Fragmente von einer Restriktionsenzymsegmentierung werden durch eine Ligationsreaktion an ein fluoreszenzmarkiertes DNA-Oligomer (durch Sulphorhodamin 101) ligiert. Alternativ wird eine Oberfläche eines Glasstabs (mit einem Durchmesser von 0,2 mm an der Spitze) bei einer Länge von der Spitze bis 5 mm darunter behandelt, um DNA-Sonden mit einem Aminorest am 5'-Terminus anzubringen und dadurch eine große Anzahl von Glasstäben herzustellen, die jeweils an ihrer Spitze mit der DNA-Sonde immobilisiert sind.
Zum linmobilisieren wird eine Silanisierungsreaktion verwendet, um verschiedene aktivierte Reste auf die Glasoberfläche aufzubringen. Die Glasoberfläche wird beispielsweise mit einer verdünnten wäßrigen Essigsäurelösung von 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan behandelt und dann bei 90 bis 105ºC ausgeheizt, um die Epoxidgruppe auf der Glasoberfläche zu bilden. Daraufhin erzeugt die Reaktion mit einer 5'-Amino- DNA-Sonde bei einem pH-Wert von 9 einen Glasstab, der die DNA-Sonde an seiner Oberfläche aufweist. Ein weiteres Verfahren beinhaltet das Aufbringen eines Aminorests auf die Glasoberfläche unter Verwendung von 3-Aminopropyltrimethoxysilan, 3-(2-Aminoethylaminopropyl)trimethoxysilan und dergleichen und das Behandeln der Oberfläche mit Succinanhydrid, wodurch die Carboxylgruppe in den Aminorest eingebracht wird. Nachfolgend erzeugt die Reaktion mit einer 5'-Amino-DNA-Sonde bei Anwesenheit von wasserlöslichem Carbodiimid einen die DNA- Sonde aufweisenden Glasstab.
Die DNA-Sequenz der DNA-Sonde besteht aus wenigstens einem Teil mit einer gemeinsamen Sequenz, die eine komplementäre Sequenz (welche der Sequenz am 5'-Terminus gleicht) zur Sequenz am 3'-Terminus des zum Ligieren mit den DNA-Fragmenten verwendeten fluoreszenzmarkierten Oligomers ist, einem Teil einer Enzymerkennungssequenz und einem Sequenzauswählteil einer geeigneten Sequenz von zwei Basen am 3'-Terminus. Die Selektivität erreicht ihren höchsten Wert, wenn der Terminussequenzauswählteil aus einer bis zwei Basen besteht. Die Anzahl der Kombinationen von Termini mit zwei Basen ist 16, so daß 16 Typen schmaler Stäbe, die einzeln 16 DNA-Sonden aufweisen, herzustellen sind. Der 3'-Terminussequenzauswählteil kann aus drei bis vier Basen bestehen, und es sollten bei drei Basen 64 Typen solcher schmaler Stäbe hergestellt werden. Für vier Basen sollten 256 Typen solcher Stäbe hergestellt werden. Wenn die Länge eines Terminussequenzauswählteils größer ist, kann manchmal selbst dann eine Komplementärstrangverlängerung auftreten, wenn die Basenübereinstimmung zwischen der Sonden-DNA und der Proben-DNA ungenügend ist. Um diese bei nicht passenden Paaren auftretende Verlängerung zu verhindern, sollte das Terminushybridisierungspotential erheblich verringert werden, um eine Bildung stabiler Hybridomere zwischen nicht passenden Paaren an einem Terminus zu verhindern. Wenn mehrere Basen im Teil mit einer gemeinsamen Sequenz und insbesondere Basen, die an einen Sequenzauswählteil am 3'-Terminus angrenzen, in Inosin umgewandelt oder in eine nicht passende Sequenz modifiziert werden, hängt die Stabilität der Hybridisierung um den Terminus herum in hohem Maße vom Passen des Sequenzauswählteils ab und kann demgemäß so eingestellt werden, daß die Komplementärstrangverlängerung selbst dann nicht ausreichend fortschreitet, wenn auch nur eine einzige Base im Sequenzauswählteil nicht paßt. Die Länge des Sequenzauswählteils kann vorzugsweise 6-mer oder weniger sein, wodurch allein kein stabiles hybridisiertes Produkt gebildet wird, und sie beträgt bevorzugt 1-mer bis 3-mer, weil eine Komplementärstrangverlängerung stark durch den Grad der Basenanpassung am 3'-Terminus des 1-mers bis 3-mers beeinflußt wird.
Daraufhin wird ein Teil der durch Ligieren hergestellten fluoreszenzmarkierten Fragmente fraktioniert und durch Gelelektrophorese analysiert, um ein Gelelektrophoresemuster der Fragmente zu erzeugen. Wenn die Anzahl der Fragmente, in denen die Elekttophoresemuster auftreten, bei einer einsträngigen Form größer als 10 ist, ist die Anzahl der in einem Bruchteil auftretenden DNA-Arten zu groß, um ohne Trennung analysiert zu werden. Daher werden die DNA-Fragmente getrennt und wiederum durch Gelelektrophorese fraktioniert. Schließlich sollte die Anzahl der in einem Bruchteil enthaltenen Fragmente in einer einsträngigen Form 10 betragen oder geringer sein. Dies liegt daran, daß die Anzahl der nachfolgend für eine DNA-Trennung zu verwendenden DNA-Sondentypen 16 sein sollte, so daß das Einfangen von mehr als zwei DNA-Fragmentarten durch eine einzige Sondenart verhindert werden sollte.
Beim Hind-III-Aufschlußprodukt von λ-Phagen ist die Anzahl der Fragmente 14, die Fragmente wurden jedoch versuchsweise zur Sequenzbestimmung ohne ein Trennen verwendet. Durch Auflösen der DNA-Fragmente in einer Pufferlösung werden 16 schmale Stäbe, die jeweils mit 16 einzelnen Typen von DNA- Sonden immobilisiert sind, zur Hybridisierung in die Lösung eingetaucht. Um das Hybridisieren zu fördern, kann doppelsträngige DNA thermisch denaturiert werden, oder ihr 3'-Terminus kann durch Exonucleaseaufschluß beim 5'-Terminus des Doppelstrangs zu einer einsträngigen Form modifiziert werden. Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP) als Substrate für eine Komplementärstrangverlängerung werden zusammen mit DNA-Polymerase hinzugefügt, um die Komplementärstrangverlängerung zu fördern. Weil die Komplementärstrangverlängerung für die DNA- Sonde mit einem 3'-Terminus in vollständig angepaßter Hybridisierung mit einem DNA-Fragment abläuft, ist die Bindungsstärke der DNA-Sonde an das DNA-Fragment erhöht. Andererseits tritt die Komplementärstrangverlängerung unter der Bedingung einer teilweise nicht passenden Hybridisierung bei einer DNA- Sonde nicht auf, so daß die Bindungsstärke gering ist.
Aus einem statistischen Grund können nur 1/16 der DNA-Fragmente mit der Sonde hybridisieren, ohne daß eine Fehlanpassung durch den Hybridisierungsvorgang auftritt, bei dem einmal 16 schmale Stäbe in die Lösung eingetaucht werden und gleichzeitig 16 Typen von DNA-Sondenchips in eine Lösung eingetaucht werden, die DNA-Fragmente enthält. Nach dem Been den der Komplementärstrangverlängerung wird eine thermische Denaturierung durch Erhöhen der Temperatur auf bis zu 70 bis 80ºC ausgeführt, um das Dehybridisieren von DNA-Fragmenten von einer Sonde zu fördern. Daraufhin wird die Temperatur abgesenkt, um DNA-Fragmente zur Komplementärstrangverlängerung wieder mit einer anderen nicht verlängerten Sonde zu hybridisieren. Durch Wiederholen dieses Vorgangs kann die Anzahl vollkommen passender DNA-Paare erhöht werden. Falls der Zyklus öfter wiederholt wird als die Anzahl der DNA- Sondentypen, kann ein Ziel-DNA-Fragment fast vollständig mit einer passenden DNA-Sonde eingefangen werden, die darin isoliert wird. Eine kleinere Anzahl der gleichzeitig zu hybridisierenden DNA-Sondentypen verringert die Anzahl des Wiederholens dieses für eine ausreichende Isolation erforderlichen Vorgangs. Demgemäß werden praktische Mittel veranschaulicht, wie die Verwendung eines Einzel-DNA-Sondenchips, die Verwendung einer Gruppe von vier bis fünf Sondenchips, die Verwendung eines DNA-Sondenchips, der nur die erforderliche 2- Basen-Sequenz angrenzend an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil der DNA-Fragmente aufweist, und dergleichen.
Um die an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil der DNA-Fragmente angrenzende 2-Basen-Sequenz zu identifizieren, wird nach dem in Fig. 3 dargestellten Vorgang ein Glasstab 11 verwendet, der mit einer DNA-Sonde immobilisiert ist, die A, C, G und T als die erste an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil angrenzende Base aufweist. Ein Bündel 110 aus 16 schmalen Stäben, wobei jede Gruppe von vier Stäben einen Satz von A-, C-, G- und T-Termini aufweist, wird zum Hybridisieren gleichzeitig mit einer Probenmischungslösung zur Reaktion gebracht. Nach der Hybridisierreaktion werden die Glasstäbe in Wasser gewaschen, um die nicht hybridisierte Probe abzuwaschen, und das Bündel 110 wird dann in vier Sondengruppen eingeteilt, wobei jede Sondengruppe einen Satz von A-, C-, G- und T-Termini aufweist. Wie in Fig. 3 dargestellt ist, wird folglich hybridisierte DNA 111 auf den Glasstäben eingefangen. Daraufhin wird durch Hinzufügen von fluoreszenzmarkiertem Terminator. 112 (Didesoxynukleotidtriphosphat; ddNTP*) ddNTP* durch eine DNA- Polymerasereaktion angrenzend an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil der DNA-Sonde als ein zweites Nukleotid eingebracht (das Symbol "*" stellt eine Fluoreszenzmarkierung dar).
Durch das in Fig. 4 dargestellte Verfahren wird die Sequenzinformation bis zur zweiten Base, die an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil der erforderlichen DNA- Sonden angrenzt, durch Messen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Fluoreszenz an der Oberfläche der Glasstäbe gewonnen. Das in Fig. 4 dargestellte Verfahren beinhaltet das Aufweiten des Laserstrahls von der Laserquelle 121 durch einen Strahlaufweiter 122, das Kollimieren des Laserstrahls durch eine Linse 124 und das Einführen des Laserstrahls durch einen Photokoppler 127. Der auf den Glasstab 11 abgebildete Laserstrahl erreicht den oberen Teil des Glases. Es wird Fluoreszenz emittiert, falls ein Fluorophor durch die oben angegebene Reaktion an die DNA-Sonde auf der Glasoberfläche bindet. Die Fluoreszenz breitet sich nacheinander durch den Glasstab 11 und den Photokoppler 127 aus. Daraufhin wird ihre Richtung durch einen dichroitischen Spiegel 123 geändert. Der durch ein Filter 125 hindurchtretende Strahl wird durch die Linse 124 in einen Photodetektor 126 eingeleitet. Durch Erfassen der Fluoreszenz von jedem Glasstab und durch Analysieren der Daten der erfaßten Signale mit einem Computer können die Terminusbasensequenz und ein Fluoreszenz emittierender Terminator identifiziert werden. Mit anderen Worten kann die Terminussequenz von DNA-Fragmenten bis zur zweiten Base durch Prüfen des Typs einer ersten Base, die an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil angrenzt, und des Typs des in die zweite Base eingeführten fluoreszenzmarkierten Terminators identifiziert werden.
Falls Fluorophore unterschiedlicher Wellenlängen für vier Typen von fluoreskenzmarkierten Terminatoren, also Didesoxyadenosintriphosphat ddATP*, Didesoxycysteintriphos phat ddCTP*, Didesoxyguanosintriphosphat ddGTP* und Didesoxytimintriphosphat ddTTP*, verwendet werden, ist die Reaktion eines Satzes von vier schmalen Stäben anstelle von vier Stäben ausreichend. In diesem Fall kann der Basentyp bis zur an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil angrenzenden zweiten Base auf der Grundlage der Differenz der Fluoreszenzwellenlänge identifiziert werden.
Für ein weiteres Verfahren zum Identifizieren der an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil der DNA-Fragmente angrenzenden 2-Basen-Sequenz werden DNA-Sonden mit A, C, G und T als die an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil angrenzenden Basen hergestellt. Die Länge jeder DNA- Sonde sollte so modifiziert werden, wie die der in Fig. 5 dargestellten DNA-Sonden 200, 201, 202 und 203, so daß sie durch Größentrennung durch Elektrophorese einzeln identifiziert werden können. Nach dem Herstellen einer die Proben-DNA 204 und die erwähnten Primer 200, 201, 202 und 203 zur Komplementärstrangverlängerung enthaltenden Lösung wird die Lösung in vier Teile eingeteilt, um eine zweite Basenart zu prüfen. Zu den einzelnen eingeteilten Lösungen werden der fluoreszenzmarkierte Terminator 112 hinzugefügt, und es werden DNA-Polymerasereaktionen ausgeführt. Auf diese Weise verbindet sich der fluoreszenzmarkierte Terminator 205 mit dem Teil der zweiten Base, der an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil der DNA-Sonde angrenzt. Die Reaktionsprodukte werden durch Elektrophorese analysiert, um die Terminusbasenart der Reaktionsprodukte zu bestimmen. Anhand des Elektropherogramms kann die Sequenzinformation des zur an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil angrenzenden zweiten Base erhalten werden. Bei einer Elektrophoresevorrichtung, die bei der Elektrophoreseanalyse zu verwenden ist, wie in Fig. 5 dargestellt ist, bestrahlt ein Laserstrahl 210 von einer Laserquelle 206 ein Elektrophoresegel 209 fast senkrecht zur Wanderungsrichtung der DNA-Fragmente, um eine DNA-Bande der Sonde 220 mit einem durch induzierte Fluores zenz markierten Terminator zu erfassen. Die Fluoreszenz von DNA-Banden wird mit einem Photodetektor 207 erfaßt.
Die Fig. 3 bis 5 zeigen zum Vereinfachen der Erklärung des Prinzips einen Fall, in dem die Proben-DNA ein Einzelstrang ist. Wie im vorliegenden Beispiel gezeigt wird, kann die Information bis zur an den eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil angrenzenden zweiten Base selbst für eine Mischung erhalten werden, die mehrere DNAs enthält. Es wurde bei diesem Beispiel herausgefunden, daß acht Sondentypen vollkommen mit DNA-Fragmenten übereinstimmten.
Es wird ein weiteres Beispiel gezeigt, in dem durch Hind-III-Aufschluß von λ-Phagen-DNA hergestellte DNA-Fragmente unter Verwendung eines mit DNA-Sonden immobilisierten schmalen Stabs (Sondenchips) zur DNA-Sequenzbestimmung getrennt wurden. Es wurden durch Aufschließen von λ-Phagen- DNA mit Hind III vierzehn Typen von DNA-Fragmenten hergestellt. Wie in Fig. 3 - 3 dargestellt ist, ist das Oligomer 2 mit einer bekannten Sequenz in den Terminus der erzeugten DNA-Fragmente eingebracht. Wie in Fig. 1 dargestellt ist, sind die DNA-Sonde 12, die aus dem Teil 13 mit einer bekannten Sequenz besteht, welcher zum in den DNA-Fragment-Terminus und einen Teil der Hind-III-Erkennungssequenz eingebrachten Oligomer komplementär ist, und ein Sequenzauswählteil 14, der angrenzend an den 3'-Terminus des eine bekannte Sequenz aufweisenden Teils 13 zwei geeignete Basen aufweist, auf dem Trennstab immobilisiert. Weil die Anzahl der Kombinationen der geeigneten zwei Basen an dem Sequenzauswählteil 16 ist, sind 16 Typen von DNA-Sonden zum Trennen der DNA-Fragmente erforderlich. Demgemäß ist die Anzahl der Typen schmaler Stäbe 16. Nach dem erwähnten Immobilisierungsverfahren werden mit der DNA-Sonde immobilisierte schmale Stäbe hergestellt. In eine Lösung, die 14 Typen von mit dem Oligomer einer bekannten Sequenz eingebrachten DNA-Fragmenten enthält, wird ein Bündel von Sondenchips eingetaucht, das durch Bündeln einzelner schmaler Stäbe hergestellt wird, die mit den 16 Typen von DNA-Fragmenten immobilisiert sind, die wie oben beschrieben hergestellt wurden. Nach dem thermischen Denaturieren der DNA-Fragmente in der Lösung reagieren die auf den schmalen Stäben immobilisierten DNA-Sonden unter Hybridisierungsbedingungen mit den DNA-Fragmenten. Die Komplementärstrangverlängerung läuft kontinuierlich an den komplementär passenden Paaren ab. Weiterhin werden 30 Zyklen dieser Denaturierung und Hybridisierung, gefolgt von einer Komplementärstrangverlängerung, wiederholt. DNA-Fragmente mit unvollständig hybridisierten 3'-Termini sowie nicht reaktive Substanzen an den schmalen Stäben werden in wässriger Lösung bei 70 bis 80ºC abgewaschen. Durch das oben beschriebene Verfahren können vollständig hybridisierte DNA-Fragmente fraktioniert werden. Unter Verwendung einer Vorrichtung in der Art der in Fig. 4 dargestellten können die schmalen Stäbe, auf denen die DNA-Fragmente vollständig hybridisiert sind, isoliert werden. Durch Erwärmen der schmalen Stäbe mit den hybridisierten DNA- Fragmenten auf 96ºC werden die hybridisierten DNA-Fragmente von den Stäben freigegeben und fraktioniert. Die Sequenzen der fraktionierten DNA-Fragmente werden durch das Didesoxyterminatorverfahren unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Primers bestimmt. Beispielsweise ist in Fig. 6 ein Teil der Sequenzbestimmungsergebnisse der DNA-Fragmente, die von den eine DNA-Sonde immobilisierenden schmalen Stäben isoliert sind, dargestellt, wobei ein Sequenzauswählteil am 3'- Terminus GC ist. Zur Sequenzbestimmung durch das Didesoxyterminatorverfahren wird als Primer ein DNA-Oligomer verwendet, wobei ein Sequenzauswählteil beim 3'-Terminus GC ist und wobei die DNA-Sonde auf dem schmalen Stab immobilisiert ist. Die Sequenzbestimmungs-Reaktionsprodukte, bei denen vier Typen von Terminatoren (ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP) verwendet werden, werden durch unterschiedliche Elektrophoresemigrationswege zur Fluoreszenzbestimmung unterschieden. In den Fig. 6A, 6B, 6C und 6D ist ein Elektropherogramm der unter Verwendung der vier Typen von Terminatoren ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP hergestellten Reaktionsprodukte bei der Sequenzbestimmung dargestellt. Diese Elektropherogramm sätze sind gleichzeitig in Fig. 6E dargestellt. In den Fig. 6A bis 6D werden die unterschiedlichen Basen entsprechenden DNA-Banden bei unterschiedlichen Migrationszeiträumen beobachtet. Die Positionen der Peaks überlappen nicht, was darauf hinweist, daß es in der Probenlösung nur eine zu analysierende Art von DNA-Fragmenten gibt. Falls die Isolation der DNA-Fragmente von einer Mischung unzureichend ist und es in einer Probe mehrere DNA-Fragmente gibt, sollten an den gleichen Positionen mehrere Peaks beobachtet werden (maximal vier von A, C, G und T abgeleitete Peaks). Wenn sich die Positionen der Peaks nicht überlappen, wie in den Fig. 6A bis 6D dargestellt ist, beweist dies, daß die Isolation und Fraktionierung der DNA-Fragmente gemäß der vorliegenden Erfindung zufriedenstellend ist. Die Basenarten und damit die Sequenz sind in den Figuren dargestellt. Wie oben beschrieben wurde, wird die Sequenz so erhalten, wie bei der Sequenz Nr. 1 dargestellt ist, die einer Teilsequenz der λ-Phagen-DNA entspricht. Wie hier gezeigt wird, ist das Fraktionierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Sequenzbestimmung mehrerer DNA-Fragmente direkt aus dem gemischten Zustand ohne einen Klonvorgang vorteilhaft.
Beim oben angegebenen Beispiel werden die auf Sondenchips eingefangenen DNA-Fragmente zur Analyse verwendet, es können jedoch auch die auf einer festen Oberfläche verlängerten DNA-Sonden zur Analyse verwendet werden. Wenn sich ein Komplementärstrang in voller Länge unter Verwendung einer an der Spitze eines schmalen Stabs als ein Primer zur Komplementärstrangverlängerung immobilisierten DNA-Sonde erstreckt, sollte der eine gemeinsame Sequenz aufweisende Teil am 3'-Terminus der verlängerten Sonde erscheinen (das Oligomer verbindet sich durch Ligieren mit beiden Enden des doppelsträngigen DNA-Fragments), so daß die Analyse unter Verwendung eines Primers mit einer bekannten Sequenz am 3'- Terminus des verlängerten Strangs begonnen werden kann. Weiterhin wird die DNA vor dem Separieren mit einem anderen Restriktionsenzym getrennt, wenn ein eingefangener DNA-Strang lang ist, um die DNA in kleinere Fragmente aufzuschließen, die dann wiederholt dem obenerwähnten Verfahren unterzogen werden.
Beim oben beschriebenen Beispiel wird die Wahrscheinlichkeit des Verlängerns von Komplementärsträngen durch Wiederholen des Hybridisierens, gefolgt von einer DNA-Strangverlängerung und einer Dehybridisierung von DNA-Sonden in DNA- Fragmente erhöht. Wenn ein freier Primer mit dem eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teil zur Lösung hinzugefügt wird, läuft eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion) gleichzeitig ab, wodurch die Anzahl der DNA-Fragmentkopien während des Trennens erhöht wird. Es ist für die Zwecke dieser Anmeldung im Hinblick auf die Wirksamkeit vorzuziehen, daß die mit den beiden Termini der DNA-Fragmente verbundenen eine gemeinsame Sequenz aufweisenden Teile voneinander verschieden sind, so daß eine immobilisierte Sonde und ein freier Primer jeweils unterschiedliche Teile mit einer gemeinsamen Sequenz aufweisen, wobei jeder Teil eine andere Sequenz aufweist.
Die PCR-Verstärkung unter Verwendung von DNA-Sonden, die entsprechend ihren Sequenzen zusammen mit einem freien Primer auf einem festen Träger getrennt immobilisiert sind, stellt ein neue s Mittel zum Trennen und Aktivieren einer Mischung dar. Die mit einer immobilisierten Sonde, aus der sich ein Komplementärstrang erstreckt, hybridisierte DNA ist im wesentlichen um den Teil herum angeordnet, der die Sonde immobilisiert, die verlängert worden ist, um den Komplementärstrang bei einer höheren Temperatur von etwa 95ºC zu erzeugen, welche dazu dient, einen Doppelstrang thermisch in Einzelstränge zu dissoziieren. Alternativ ist das Paar aus der DNA und der DNA-Sonde ohne eine Komplementärstrangverlängerung weniger stabil, und es wird leicht während des Temperaturerhöhungsprozesses zu Einzelsträngen dehybridisiert. Dieses Paar bildet während des Temperaturverringerungsprozesses langsamer Doppelstränge. Daher wird die Wahrscheinlichkeit, daß die DNA mit einer anderen DNA-Sonde hybridisiert, hoch, nachdem die einsträngige DNA in einen anderen Teil diffundiert ist, der von der Position fern ist, an der die erste Hybridisierung auftritt, und die Wahrscheinlichkeit, daß die DNA die DNA-Sonde für ein stabiles Hybridisieren erreicht, ist erhöht, während der Prozeß wiederholt wird. Wenn die einsträngige DNA alternativ einen Doppelstrang mit einer komplementär hybridisierbaren DNA-Sonde bildet, wird die Komplementärstrangverlängerung zum Erhöhen der Stabilität eingeleitet, und während des Temperaturerhöhungsprozesses geschieht die Dissoziation des Doppelstrang später, während das Hybridisieren während des Temperaturverringerungsprozesses schneller geschieht. Daher tritt keine starke Migration von DNA durch Diffusion auf. Durch vorab geschehendes Festlegen der Reassoziierungstemperatur als der geringeren Temperatur auf eine höhere Temperatur kann dieses Phänomen leichter hervorgerufen werden. Durch Wiederholen dieses Vorgangs kann das Aussieben und Multiplizieren von DNA-Strängen in einzelne Bruchteile vorgenommen werden.
Beim obenerwähnten Beispiel werden verschiedene DNA- Sonden nach dem Immobilisieren an festen Oberflächen, wie einzeln trennbaren schmalen Stäben, verwendet, das Material ist jedoch nicht auf die hier verwendeten Glasstäbe beschränkt. Weiterhin kann die Oberfläche von Plattenmaterialien in der Art einer Glasplatte fraktioniert werden, um einzelne DNA-Sonden zum Fraktionieren zu immobilisieren.

Beispiel 2

Das Beispiel 2 ist ein Beispiel der Verwendung der fraktionierten DNA-Fragmente als Matrize zur DNA-Sequenzbestimmung. Wie beim Beispiel 1 werden die DNA-Fragmente gruppiert und zur Komplementärstrangverlängerung an der Spitze von Bandstreifen gehalten. Am 3'-Terminus des verlängerten Komplementärstrangs befindet sich die gleiche gemeinsame Sequenz wie beim zuvor durch Ligieren angebrachten Oligomer. Durch Erhöhen der Temperatur wird der Doppelstrang thermisch in Einzelstränge dissoziiert, und es werden dann alle Streifen in ein Gefäß übertragen, das eine Reaktionslösung zur DNA-Sequenzbestimmung enthält. Als ein Primer wird eine Sequenz verwendet, die zur gemeinsamen Sequenz am 3'- Terminus komplementär ist. Es ist zweckmäßig, den Terminator ddNTP (Didesoxynukleotidtriphosphat) zu verwenden, der abhängig vom Basentyp mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert ist. Wenn ein fluoreszenzmarkierter Primer verwendet wird, sollten vier DNA-verlängerte Stränge, die an den Bandstreifen immobilisiert sind, hergestellt werden, um eine Fragmentfamilie mit unterschiedlichen Basentypen zur Sequenzbestimmung zu erzeugen. Nach Beendigung der Sequenzbestimmungsreaktion werden Fragmente verschiedener Längen, die unter Verwendung der DNA-Polymerasereaktion mit einem gemeinsamen Primer gewonnen wurden, am 3'-Terminus der verlängerten DNA gehalten, deren 5'-Terminus am Oberteil des Bands immobilisiert ist. Durch Anordnen der Bandstreifen auf der Oberseite einer Gelplatte und durch Erwärmen des Bands zum Freigeben der durch die Sequenzbestimmungsreaktion erzeugten Fragmente zur Gelelektrophorese, um die Fragmentlänge herauszufinden, wird die Sequenz bestimmt. Die Bandstreifen werden abhängig vom Sondentyp an unterschiedlichen Positionen angeordnet, und die davon dissoziierten DNA-Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt.
Sequenztabelle
Sequenznummer: 1
Sequenzlänge: 34
Sequenztyp: Nucleinsäure
Kettenanzahl: Doppelstrang
Sequenztyp: Bakteriophagen-DNA-Fragment
Sequenz: TTCAAACATT AATTTTTTAT GATAAACAAT TCCA

Claims

1. Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente, welches die folgenden Schritte umfaßt:

1) das Herstellen eines Sondenchips oder eines Satzes von Sondenchips, die unabhängig voneinander eine DNA-Sonde immobilisieren; ·

ii) das Ligieren eines Oligomers mit einer bekannten Sequenz an den 3'-Terminus von verdauten DNA-Fragmenten, die durch Restriktionsenzymverdau gebildet wurden;

iii) das Einbringen des Sondenchips oder des Satzes der Sondenchips in eine Lösung, die die in Stufe ii)

hergestellten, an das Oligomer ligierten verdauten DNA- Fragmente enthält, um die verdauten DNA-Fragmente, die an das Oligomer ligiert sind, mit der DNA-Sonde zu hybridisieren, und Verlängern der erhaltenen hybridisierten DNA-Sonde durch Komplementärstrangverlängerungsreaktion in der Lösung; und

iv) das Erhöhen der Temperatur der Lösung, die aus der Komplementärstrangverlängerungsreaktion in Stufe iii) erhalten wird, und Entfernen der DNA-Fragmente, die mit der DNA- Sonde hybridisiert sind, die durch die Komplementärstrangverlängerungsreaktion nicht verlängert wurde, während die verlängerte DNA-Sonde an den verdauten DNA-Fragmenten, die an das Oligomer ligiert sind, hybridisiert bleibt;

wobei die DNA-Sonde einen gemeinsamen Sequenzteil und einen Sequenzauswählteil hat, der neben dem gemeinsamen Sequenzteil am 3'-Terminus liegt, der gemeinsame Sequenzteil zu der Sequenz des Oligomers, das an den 3'-Terminus der verdauten DNA-Fragmente ligiert ist, und eines Enzymerkennungssequenzteils komplementär ist, und der Sequenzauswählteil aus einer bis sechs Basen besteht und jede mögliche Kombination der einen bis sechs Basen ist; und

wobei Stufe iii) und Stufe iv) mindestens einmal wiederholt werden, wodurch die DNA-Fragmente getrennt oder fraktioniert werden.

2. Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente gemäß Anspruch 1, wobei der Sondenchip beliebig unter einem schmalen Stab, einem Draht, einer Folie und einem Band ausgewählt ist.

3. Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Probenchip auf einer festen Oberfläche mehrere Bereiche hat, und jede Kombination der einen bis sechs Basen in dem Sequenzauswählteil der DNA- Sonden auf jeden Bereich immobilisiert wird.

4. Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Probenchip oder die Probenchips gleichzeitig in die DNA-Fragmente enthaltende Lösung gegeben wird/werden, und die erzeugten Doppelstrang-DNAs nach jedem einzelnen Typ oder gemeinsam nach mehreren Typen fraktioniert werden.

5. Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Probenchip auf einer festen Oberfläche mehrere Bereiche hat, und jede Kombination der einen bis sechs Basen in dem Sequenzäuswählteil der DNA- Sonden auf jeden Bereich immobilisiert wird, oder die individuellen DNA-Proben auf verschiedene feste Oberflächen immobilisiert werden, und wobei ein freies Oligomer für die Komplementärstrangverlängerungsreaktion in Stufe iii) verwendet wird, und die Komplementärstrangverlängerungsreaktion durch Erhöhen oder Senken der Temperatur vorangetrieben wird, wodurch die DNA ausgewählt wird.

6. Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente gemäß Anspruch 5, wobei der Probenchip mehrere Bereiche auf einer festen Oberfläche hat, und jede Kombination der einen bis sechs Basen in dem Sequenzauswählteil der DNA-Sonden auf je den Bereich immobilisiert wird, und der gemeinsame Sequenzteil den DNA-Sonden gemeinsam ist.

7. Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein freies Oligomer mit einer Sequenz, die mit dem gemeinsamen Sequenzteil identisch ist, zu der Lösung in Stufe iii) gegeben wird, und eine Polymerasekettenreaktion gleichzeitig fortschreitet, wobei die Kopienzahl der verdauten DNA-Fragmente, die an das Oligomer ligiert sind, durch Erhöhen und Senken der Temperatur der Lösung zum Bewirken der Polymerasekettenreaktion erhöht wird.

8. Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Oligomer mit einem Fluorophor markiert ist.

9. Fraktionierungsverfahren für DNA-Fragmente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, welches die zusätzliche Stufe des Bestimmens der DNA-Sequenzen der DNA-Fragmente, die gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 erzeugt wurden, wie sie sind oder nach Abtrennung und Isolierung umfaßt.