DE69500303T2

DE69500303T2 - Methode zur sequenzierung kurzer oligonukleotide

Info

Publication number: DE69500303T2
Application number: DE69500303T
Authority: DE
Inventors: Alexei Belenky; Aharon Cohen; Christopher Ott
Original assignee: Hybridon Inc
Current assignee: Aceragen Inc
Priority date: 1994-01-26
Filing date: 1995-01-24
Publication date: 1997-10-30
Anticipated expiration: 2015-01-25
Also published as: CA2180722A1; JPH09508282A; EP0741799B1; ATE153078T1; WO1995020680A1; EP0741799A1; DE69500303D1; AU1734695A; US5525470A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Charakterisierung von Oligonucleotiden und insbesondere auf Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz von Oligonucleotiden und Oligonucleotid-Analoga.
Die Nucleotidsequenzbestimmung ist ein wichtiger Schritt für die Analyse eines kurzen Stranges eines unbekannten Oligonucleotids oder Oligonucleotid-Analogons und, um die spezifische Sequenz von Oligonucleotiden zu bestätigen, die als Antisense-Arzneintittel verwendet werden. Gegenwärtig verwenden die meisten Sequenzierungsprotokolle den chemischen Abbau-Ansatz von Maxam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1977, 74, 560) oder die Kettenterminationsreaktion von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (135A) 1977, 74, 5463). In diesen Verfahren werden vier getrennte Realttionen durchgeführt, die die Reaktion an Adenosin-, Cytosin-, Guanosin- oder Thymidinresten terminieren, um Fragmente zu erzeugen, die sich in der Länge nur durch ein einzelnes Nucleotid unterscheiden.
Diese Sequenzierungsprodukte werden im allgemeinen aufgelöst durch Elektrophorese auf denaturierenden Polyacrylamidgelen (PAGE). Hochleistungs-Kapillarelektrophorese (HPCE) ist ebenfalls verwendet worden, um Oligonucleotid-Sequenzierungsprodukte zu trennen (Cohen et al., 1988, J. Chromatogr. 458, 323; Cohen et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 9660; Gutttnan et al., 1990, Anal. Chem. 62, 137; Cohen et al., 1990, J. Chromatogr. 516, 49; Cohen et al., Anal. Chem. (in Druck)) und kann leicht mit der Massenspektrometrie gekoppelt werden (Smith et al., 1988, Anal. Chem. 60, 1948; Lee et al., 1988, 3. Chromatogr. 457, 313). Jedoch ist traditionell das Verfahren, um das Produkt sichtbar zu machen, die Autoradiographie, bei der ³²P oder ³&sup5;S in den Oligonucleotidstrang eingegliedert wird.
Kürzlich ist eine Seqenzierung mit Laser-induzierter Fluoreszenz (LIF) als ein Nachweismit tel verwendet worden in einer Variante der Verfahren, die sich auf Sanger et al. beziehen. In dem Grundverfahren werden vier einzigartige Fluoreszenzmarkierungen entweder an den Primer (Smith et al., 1986, Nature 321, 674) oder an jeden der Terminationsdidesoxynucleotide (Prober et al., 1987, Science 238, 336) angeheftet. In anderen, von Sanger et al. abgeleiteten Verfahren sind Einzel-Farbstoff-basierende Codierungen von Basen mit vier verschiedenen Peakhöhen (Tabor et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 8322-8326; Ausorge et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18, 3419-3420; Pentoney et al., 1992, Electrophoresis 13, 461-474; Huang et al., 1992, Anal. Chem. 64, 2149-2154) genauso wie Einzel-Farbstoff-basierende Codierungen von Basen durch Peakhöhen-Verhältnisse plus eine Base, codiert durch eine Lücke (Ausorge et al., 1990, Nucleic Acid. Res. 18, 3419-3420; Pentoney et al., 1992, Electrophoresis 13, 461-474) und Zwei-Farbstoff-binäre Codierungen von drei Basen mit einer Base, codiert durch eine Lücke oder durch zwei optische Kanäle, (Carson et al., Anal. Chem. (in Druck)) verwendet worden.
Unglücklicherweise sind viele Oligonucleotide und Oligonucleotid-Analoga, wie die, die nützlich sind für den Antisense-chemotherapeutischen Ansatz, zu kurz, um durch konventionelle Sequenzierungsveffahren sequenziert zu werden. Zum Beispiel geht die Basensequenz am 3'-Ende verloren, wenn das Sanger et al.-Verfahren verwendet wird, um eine kurze einzelsträngige DNA (z.B. 15 bis 17 Basen) zu sequenzieren. Der Verlust der Information ist abhängig von der Größe des Primers und beträgt nonnalerweise 15 bis 17 Basen, d.h. die Sequenzinformation wird nur direkt nach dem Primer bereitgestellt.
Nichtsdestotrotz sind die korrekten Sequenzen notwendig ftir die Wirksamkeit und Qualitätskontroliverfahren, um sicherzustellen, daß die synthetischen Oligonucleotide die gewüuschte Nucleotidsequenz haben. Gegenwärtig wird oft unterstellt, daß die Sequenzen von diesen Oligonucleotiden korrekt sind, basierend auf der Schritt-für-Schritt-Synthese, da keine einfachen Verfahren zur Sequenzanalyse verfügbar sind.
Die enzymatische Sequenzierung von kurzen DNA-Analoga ist beschrieben worden (Nordhoft et al., 1992, Rapid Comm. Mass. Spectrom. 6, 771; Wu et al., 1993, Rapid Comm. Mass. Spectrom. 7, 142 und Rile et al., 1993, Rapid Comm. Mass. Spectrom. 7, 195). Dieses Verfahren verwendet Exonudeasen bei Phosphodiester -gebundener DNA als ein Substrat und MALDI-MS zum Nachweis. Die gegenwärtigen Protokolle sind relativ langsam, da Aliquots alle 15 Minuten genommen werden und direkt durch MALDI-MS analysiert werden (Tabor et al., 1990, 3. Biol. Chem. 265, 8322-8326). Darqber hinaus ist der Exonuclease-Abbau sehr problematisch und manchmal unmöglich, wenn DNA-Analoga unter diesen Bedingungen sequenziert werden.
Eine zusätzliche Stufe der Komplexität ist das Vorhandensein von Modifikationen in Oligonucleotiden, einschließlich von Nicht-Phosphodiesterbindungen, wie Phosphorothioaten oder Alkylphosphonaten. Vorhergehende Verfahren zur Analyse dieser Oligonucleotid-Analoga waren für die kommerzielle Anwendung sehr mühsam. Zum Beispiel beschreibt Agrawal et al. (3. Chromatogr., 1990, 509, 396-399) die Analyse von Oligonucleotid-Phosphorothioaten, umfassend die Umwandlung von Phosphorothioatbindungen in Phosphodiester, gefolgt durch den Abbau mit Schlangengift-Phosphodiesterase, der Phosphatasebehandlung und der Analyse der Basenzusammensetzung auf einer Umkehrphasen-HPLC.
Daher bestand ein Bedarfflir einfachere und zuverlässigere Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von kurzen Oligonucleotiden und Oligonucleotid-Analoga von ihrer ersten bis zu ihrer letzten Base.
Die vorliegende Erfmdung stellt ein leistungsfähiges und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz von kurzen Oligonucleotiden und Oligonucleotid-Analoga bereit. Im allgemeinen sind konventionelle Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenzen schwierig zu verwenden für viele Oligonucleotide und synthetische Oligonucleotide, da diese Moleküle zu kurz sind, um als ein wirksames Template zu dienen. Das erfmdungsgemäße Verfahren überwindet dieses Problem durch Bereitstellung eines Oligonucleotids mit einer Sequenzierungslänge, das das zu sequenzierende Ziel-Oligonucleotid einschließt, das lang genug ist, um als wirksames Template zu dienen.
Ziel-Oligonucleotide, die fähig zur Sequenzierung durch das erfindungsgemäße Verfahren sind, sind zusammengesetzt aus: Ribonueleotiden, Desoxyribonucleotiden, Analoga von Ribonucleotiden, Analoga von Desoxyribonucleotiden und Kombinationen hiervon. Somit sind in einigen Ausfillirungsformen die Ziel-Oligonueleotide synthetische oder modifizierte Oligonucleotide oder Oligonucleotid-Analoga.
Wie hier verwendet schließt der Begriff "Oligonucleotid" Polymere von zwei oder mehr Ribonucleotiden und/oder Desoxyribonucleotid-Monomeren, kovalent gebunden durch mindestens eine 5'-3'-Internucleotidbindung ein.
Die Begriffe "modifiziertes Oligonucleotid" und "Oligonucleotid-Analoga", wie hier verwendet, umfassen ein Molekül von Ribonucleotiden oder Desoxyribonucleotiden, das kovalent gebunden ist über mindestens eine synthetische Bindung. Eine "synthetische Internucleotidbindung" ist eine andere Bindung, als eine Phosphodiesterbindung zwischen dem 5'-Ende eines Nucleotids und dem 3'-Ende eines anderen Nucleotids, bei der der 5'-Internucleotid- Phosphat ersetzt worden ist durch eine Anzahl von chemischen Gruppen. Repräsentative synthetische Bindungen schließen ein Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Alkylphosphonothioate, Phosphoramidate, Phosphatester, Carbamate, Carbonate, Phosphattriester, Acetamidate und Carboxymethylester.
Der Begriff "Oligonucleotid-Analogon" umfaßt ebenfalls Oligonucleotide mit einer modifizierten Base und/oder Zucker. Zum Beispiel ist ein 3'-5'-substituiertes Oligonucleotid ein modifiziertes Oligonucleotid mit einem Zucker, der an seiner 3'- und 5'-Position an eine andere chemische Gruppe als eine Hydroxylgruppe (an seiner 3'-Position) und anders als eine Phosphatgruppe (an seiner 5'-Position) gebunden ist. Ein modifiziertes Oligonucleotid kann ebenfalls eine Schutzgruppe haben. Ebenfalls umfaßt durch diese Begriffe sind nicht-oxidierte Oligonucleotide oder Oligomere mit einer Substitution in einem Nicht-Brücken-Sauerstoffatom pro Nucleotid in dem Molekül.
Oligonucleotid-Analoga können ebenfalls sein synthetische Oligonucleotide, die Polymere umfassen von 3'-5'-gebundenen Ribonucleosiden, 2'-modifizierten Ribonucleosiden und/oder Desoxyribonucleosiden mit nur so vielen Nucleosiden, wie gewöhnlich chemisch synthetisiert werden (d.h. bis zu etwa 80-100). Ebenfalls umfaßt sind solche Oligonucleotide mit Basen- oder Zuckermodifikationen genauso wie solche mit Nuclease-Resistenz-verleihenden umfangreichen Substitutionen an ihrem 3'- und/oder 5'-Ende(n), multiplen Ribonucleosiden und/oder Desoxyribonucleosiden, gebunden jiber eine Internucleotidbindung, die nicht in nativer DNA gefimden wird, d.h. Bindungen, anders als Phosphodiesterbindungen oder mit modifizierten Basen und/oder Zuckern in verschiedenen anderen strukturellen Modifikationen, die in vivo nicht gefimden werden ohne menschliche Einwirkung.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein einzeisträngiges Ligationsprodukt hergestellt, das einschließt ein zu sequenzierendes Ziel-Oligonucleotid und ein Hilfs-Oligonucleotid mit jeweils einem 3'- und 5'-Ende. Das Hilfs-Ollgonucleotid hat eine Nucleotidsequenz, die komplementär ist zu der Sequenz des zu verwendenden Primers. In einem Aspekt der Erfindung schließt das Hilfs-Oligonucleotid eine Signalsequenz von mindestens vier aufeinanderfolgenden Nucleotiden an seinem 5'-Ende ein, das mit dem 3'-Ende des Ziel-Oligonucleotids in dem Ligationsprodukt gebunden wird. In einigen Ausführungsformen hat das Hilfs-Oligonucleotid mindestens 8 Nucleotide.
Die Erfindung stellt mehrere bevorzugte Verfahren zur Herstellung der einzelsträngigen Ligationsprodukte bereit, abhängig teilweise von dem Grad, zu dem die Sequenz des Ziel- Oligonucleotids bekannt ist. Wenn mindestens drei Nucleotide und vorzugsweise sechs bekannt sind, wird ein Brücken-Oligonucleotid hergestellt, das komplementär ist zu diesen bekannten Nucleotiden an seinem 5'-Ende und das ferner einschließt eine Nucleotidsequenz, die komplementär ist zu den ersten mindestens vier 5'-Nucleotiden des Hilfsnucleotids. Diese Brücke wird verwendet, um das 3'-Ende des Ziel-Oligonucleotids und das 5'-Ende des Hilfsnucleotids zu annealen unter Bildung eines doppelsträngigen Konstruktes. Das Ziel-Oligonucleotid kann dann mit dem Hilfsoligonucleotid über eine Ligase ligiert werden.
Eine Brücke wird ebenfalls verwendet in einer anderen Ausflihrungsform, bei der die Sequenz des Ziel-Oligonucleotids vollständig unbeknnnt ist. In diesem Veffahren wird ein Satz von 16 Brücken-Oligonucleotiden hergestellt Jedes Brücken-Oligonucleotid ist teilweise identisch in etwa sechs Nucleotiden an seinem 3'-Ende, die komplementär sind zu sechs Nucleotiden am 5'-Ende des Hilfs-Oligonucleotids. Das Brücken-Oligonucleotid unterscheidet sich dadurch, daß es an seinem 5'-Ende eine einzigartige Dinucleotidsequenz hat (d.h. eine von 16 möglichen Kombinationen der vier Nucleotide, eines von diesen ist komplementär zu den letzten zwei unbekannten 3'-Nucleotiden des Ziel-Oligonucleotids). Das eine Brücken-Oligonucleotid, das zu den Hilfs- und Ziel-Oligonucleotiden annealt wird, stellt die gleiche Funktion bereit, wie vorstehend für die "Brücken"-Ausführungsform beschrieben.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren zur Herstellung des Ligationsprodukts einschließlich eines Ziel-Oligonucleotids mit einer vollständig unbekannten Sequenz wie folgt: ein Hilfs-Oligonucleotid wird hergestellt, das wie die vorstehend beschriebenen zusammengesetzt ist aus einer 3'-Sequenz, die komplementär ist zu der Sequenz des zu verwendenden Primers. Diese Sequenz ist an ihrem 5'-Ende gebunden an eine Signalsequenz von mindestens vier aufeinanderfolgenden Nucleotiden. Das 3'-Nucleotid des Hilfs-Oligonucleotids ist in einigen Fällen (wenn RNA-Ligase verwendet wird) geschützt.
Das 5'-Ende dieses Hilfs-Oligonucleotids wird direkt an das 3'-Ende des Zielmoleküls ligiert. In bevorzugten Aspekten der Erfindung wird die Ligation durchgeführt mit einer "blunt end" Ligase, wie der T&sub4;-RNA-Ligase.
In jedem Fall wird ein Primer zu diesem Ligationsprodukt annealt, der eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär ist zu einem Teil des Hilfs-Oligonucleotids. In einigen Aspekten der Erfindung umfaßt der Primer eine Nucleotidsequenz, die komplementär zu mindestens vier, aber vorzugsweise mindestens acht Nucleotiden des Hilfs-Oligonucleotidteils des Ligationsprodukts ist. Dieser Primer hat ebenfalls eine Markierung, die kovalent an diesen gebunden ist. Vorzugsweise ist diese Markierung eine Fluoreszenz-, Chemilumineszenz- oder Radioaktiv-Markierung. Besonders bevorzugt ist eine Markierung, die eine Fluoreszenz-Markierung ist, die im UV- oder sichtbaren Bereich anregbar ist und deren Fluoreszenz im sichtbaren Bereich liegt.
Danach wird der Primer verlängert mit kettenverlängernden Nucleosidtriphosphaten und kettenabbrechenden Nucleosidtriphosphaten in Gegenwart einer Polymerase, um eine Viel zahl von Primer-Verlängerungsprodukten zu erzeugen, die sich in der Länge unterscheiden. Diese Produkte werden dann auf der Basis ihrer relativen Mobilitäten, von der die Nucleotidsequenz des Ziel-Oligonucleotids abgeleitet werden kann, getrennt. In bevorzugten Ausfüh rungsformen der Erfindung wird die Trennung durch Plattengel- oder Hochleistungskapillargel-Elektrophorese erreicht. Abhängig von der verwendeten Primermarkierung werden die Laser-induzierte Fluoreszenz, die UV-Absorption oder die Strahlung bestimmt, um die relativen Mobilitäten der Priiner-Verlängerungsprodukte zu bestimmen.
Die vorstehenden und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung, die verschiedenen Eigenschaften hiervon genauso wie die Erfindung selbst werden durch die folgende Beschreibung zusammen mit den Zeichnungen näher erläutert.
FIG. 1A ist eine schematische Darstellung von einer Ausführungsform der Erfindung, bei der ein einzelsträngiges Ligationsprodukt hergestellt wird von einem Ziel-Oligonucleotid, dessen Sequenz teilweise bekannt ist.
FIG. 1B ist eine schematische Darstellung von einer anderen Ausführungsform der Erfindung, bei der ein einzelsträngiges Ligationsprodukt hergestellt wird mit Hilfe eines Brücken-Oligonucleotids von einem Ziel-Oligonucleotid, dessen Sequenz unbekannt ist.
FIG. 1C ist eine schematische Darstellung von einer anderen Ausführungsform der Erfindung, bei der ein einzelsträngiges Ligationsprodukt hergestellt wird ohne Hilfe eines Brücken-Oligonucleotids von einem Ziel-Oligonucleotid, dessen Sequenz unbekannt ist.
FIG. 2A ist ein UV-Elektropherogramm eines Reaktionsgemisches, enthaltend ATP, ein 12mer Brücken-Oligonucleotid, ein 25mer Ziel-Oligonucleotid, dessen Sequenz teilweise bekannt ist und eines 3 imer Hilfs-Oligonucleotids.
FIG. 2B ist ein UV-Elektropherogramm des Reaktionsgemisches, beschrieben in FIG. 2A nach der Ligation mit T&sub4;-DNA-Ligase und zeigt die Species aus FIG. 2A genauso wie ein 57mer Ligationsprodukt.
FIG. 3A ist ein UV-Elektropherogramm der HPCE-Trennung der Komponenten eines T&sub4;-RNA-Ligationsreaktionsgemisches, einschließlich ATP, Ziel-Oligonucleotids und eines 31mer Hilfs-Oligonucleotids mit einer ungeschützten 3'-Hydroxylgruppe.
FIG. 3B ist ein UV-Elektropherogramm der HPCE-Trennung der Komponenten eines T&sub4;-RNA-Ligasereaktionsgemisches wie in FIG. 3A, mit der Ausnahme, daß ein 3lmer Hilfs- Oligonucleotid mit einem 3'-Amino-geschützten Ende verwendet wird und resultiert in einem 57mer Ligationsprodukt.
FIG. 4A ist ein LIF-Elektropherogramm der HPCE-Trennung der Primer-yerlänge rungsprodukte, hergestellt von und komplementär zu dem 57mer Ligationsprodukt unter Verwendung der ddA-terminierenden Sequenzierungsreaktion und Trennung wie in FIG. 2B.
FIG. 4B ist ein LIF-Elektropherogramm der HPCE-Trennung der Primer-Verlängerungsprodukte, hergestellt von und komplementär zu dem 57mer Ligationsprodukt unter Verwendung der ddG-terminierenden Sequenzierungsreaktion.
FIG. 4C ist ein LIF-Elektropherogramm der HPCE-Trennung der Primer-Verlängerungsprodukte, hergestellt von und komplementär zu dem 57mer Ligationsprodukt unter Verwendung der ddT-terminierenden Sequenzierungsreaktion.
FIG. 4D ist ein LIF-Elektropherogramm der HPCE-Trennung der Primer-Verlängerungsprodukte, hergestellt von und komplementär zu dem 57mer T&sub4;-DNA-Ligase-Ligations produkt unter Verwendung der ddC-terminierenden Sequenzierungsreaktion.
FIG. 5A ist eine Computer-Überlagerung der LIF-Elektropherogramme der FIG. 4A-4C unter Verwendung der Zwei-Punkt-Größen-Neu-Ausrichtung (two point re-size- aligninent).
FIG. 5B ist eine Computer-Überlagerung der LIF-Elektropherogramme der FIG. 4A-4D unter Verwendung der Zwei-Punkt-Größen-Neu-Ausrichtung.
FIG. 6 ist ein Plot der relativen Fragmentwanderung gegen die Basenzalil von den Daten, dargestellt in den FIG. 5A und 5B, die eine lineare Beziehung mit R²=0,999 zeigen.
Die Patent- und wissenschaftliche Literatur, auf die Bezug genommen wird, bildet das Fachwissen des Fachmanns. Das US-Patent und die bewilligten Anmeldungen, die hier genannt sind, werden eingeschlossen.
Die Erfindung stellt ein Sequenzierungsverfahren bereit, das die Sequenz eines Ziel-Oligonucleotids von seinem ersten 5'-Nucleotid zu seinem letzten 3'-Nucleotid trotz der Kürze seiner Länge oder der Tatsache, daß es ein Oligonucleotid-Analogon mit Nicht-Phosphodiester- Internucleotidbindungen und/oder Modifikationen ist, bestimmt. Tatsächlich kann jedes Ziel- Oligonucleotid prinzipiell sequenziert werden.
Zum Beispiel kann das zu sequenzierende Ziel-Oligonucleotid eine Länge von etwa 4 bis etwa 100 Nucleotiden haben, wobei Oligonucleotide mit etwa 8 bis etwa 50 Nucleotiden am gebräuchlichsten sind. Dartiber hinaus kann das Ziel-Oligonucleotid jeden Typ von Internucleotidbindungen oder jede Kombination von verschiedenen Typen von Internucleotidbindungen haben, solange das Ziel-Oligonucleotid zu dem Hilfs-Oligonucleotid ligiert werden kann und durch eine Polymerase verlängert werden kann. Zum Beispiel kann ein Ziel-Oligonucleotid mehr als eine Nicht-Phosphodiesterbindung haben und es können sogar alle Bindungen Nicht-Phosphodiesterbindungen sein. Die Nicht-Phosphodiesterbindungen, die in dem Zieloligonucleotid vorhanden sind, können einschließen Phosphorothioat-, Alkylphosphonat-, Phosphoramidat-, Alkylphosphonothioat-, Phosphodithioat- und Sulfon-, Sulfat-, Keto-, Phosphatester-, Brücken-Phosphorthioat- und Brücken-Phosphoramidat-Bindungen, die alle bekannt sind (siehe Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90, 543-584 für einen Übersichtartikel über die Synthese und Charakteristiken von Phosphodiester- und Nicht-Phosphodiester-gebundenen Antisense-Oligonucleotide).
Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert das Herstellen eines "Hilfs-Oligonucleotids", das verwendet wird zur Ligation an das 3'-Ende des zu sequenzierenden Ziel-Oligonucleotids, wobei ein einzelsträngiges Ligationsprodukt gebildet wird. Das Hilfs-Oligonucleotid ist ein einzelsträngiges RNA, DNA oder RNA/DNA-enthaltendes Molekül mit einer bekannten Sequenz, die komplementär ist zu einem Primer. Das Hiffs-Oligonucleotid kann ebenfalls an seinem 5'-Ende einschließen eine Region von mindestens vier ausgewahlten, aufeinanderfolgenden Nucleotiden, die als ein Marker oder eine "Signalsequenz" dienen.
Dieses Hilfs-Oligonucleotid wird zu dem Zielmolekül ligiert, um ein einzeisträngiges Ligationsprodukt zu bilden, in dem die Base #1 des zu sequenzierenden Ziel-Oligonucleotids lokalisiert ist direkt nach der Hilfs-DNA.
Die Erfindung stellt mehrere Protokolle zur Herstellung des Ligationsproduktes bereit, die abhängig sind von dem Grad, in dem die Sequenz des Ziel-Oligonucleotids bekannt ist. Wenn mindestens die letzten drei und vorzugsweise die letzten sechs Nucleotide des 3'-Endes des Ziels bekannt sind, kann ein Brücken-Oligonucleotid konstruiert werden, das das Ziel-Oligonucleotid unterstützt und die Ligationsreaktion fördert. Die Brücke schließt Ribonucleotide und/oder Desoxyribonucleotide, gebunden über eine Phosphodiester- und andere als Phos phodiester-Internucleotidbindungen ein. Dieses Molekül ist komplementär zu diesen mindestens sechs Nucleotiden und schließt ferner eine Sequenz ein, die komplementär ist zu den ersten mindestens vier 5'-Nucleotiden des Hilfsnucleotids. Das Brücken-Oligonucleotid wird an das Ziel-Oligonucleotid und das Hilfs-Oligonucleotid annealt, so daß die ersten zwei 3'- Nucleotide des Brücken-Oligonucleotids annealt werden an die letzten zwei 3'-Nucleotide des Ziel-Oligonucleotids und mindestens die nächsten sechs Nucleotide des Brücken-Oligonucleotids bis zu seinem 5'-Ende annealt werden zu den ersten sechs 5'-Nucleotiden des Hilfs-Oligonucleotids unter Bildung eines teilweise doppeisträngigen Konstruts. Danach wird das 3'-Ende des Ziel-Oligonucleotids ligiert zu der Signalsequenz an dem 5'-Ende des Hilfs-Oligonucleotids mit einem Template-abhängigen Enzin, wie der T4-DNA-Ligase oder Taq-DNA-Ligase. Nach Denaturierung wird ein einzeisträngiges Ligationsprodukt erhalten.
Ein Beispiel dieses Ligationsprotokolis ist schematisch in FIG. 1A gezeigt, wobei mindestens 3 Basen des Ziel-Oligonucleotids bekannt sind. In dieser Figur sind die unbekannten Basen veranschaulicht durch "?". Ein 12mer Brücken-Oligonucleotid (SEQ ID NO:2) ist hergestellt, um die Ligation des Hilfs-Oligonucleotids zu dem Zielmolekül zu fördern. Diese Brücke besteht aus zwei Regionen von sechs Basen, wobei eine Region komplementär ist zu den letzten sechs Basen des Hilfs-Oligonucleotids (SEQ ID NO:3) an dessen 5'-Ende und die andere Region komplementär ist zu den vorherbestimmten ersten sechs Basen des Ziel- Oligonucleotids an seinem 3'-Ende, das bekannt ist. FIG. 2A und 2B zeigen die Trennung der verschiedenen Arten der Oligonucleotide (Ziel-, Hiifs- und Brücken-Oligonucleotid) durch Kapillarelektrophorese, gefolgt von UV-Nachweis vor bzw. nach der Ligation mit T4-DNA- Ligase. Die Reihenfolge der Wanderung der nachgewiesenen Peaks in FIG. 2A ist (1) das schnell wandernde 12mer Brücken-Oligonucleotid (SEQ ID NO :2), (2) das zu sequenzierende Ziel-Oligonucleotid und (3) das Hilfs-Oligonucleotid. Wenn T4-DNA-Ligase und ATP zu dem Reaktionsgemisch hinzugefligt werden, wird nach 30 Minuten Inkubation bei 37ºC ein 57mer Ligationsprodukt beobachtet FIG. 2B).
Wenn die ganze Sequenz des Ziel-Oligonucleotids unbekannt ist, werden zwei Verfahren zur Herstellung des Ligationsprodukts verwendet. Eines benötigt, wie das vorstehende Verfahren ebenfalls die Unterstützung eines Brückennucleotids. In diesem Verfahren wird ein Satz von 16 Brücken-Oligonucleotiden hergestellt, die alle an ihrem 5'-Ende identisch sind, da sie eine Sequenz einschließen, die komplementär ist zu den gleichen vier, aber vorzugsweise sechs bis acht oder mehr Nucleotiden des verwendeten Hilfs-Oligonucleotids. Zusätzlich enthalten die Brücken-Oligonucleotide an ihren 3'-Enden 1 von 16 möglichen Dinucleotiden: AA, AC, AG, AT, CA, CC, CG, CT, GA, GC, GG, GT, TA, TC, TG, TT. Eines dieser Dinucleotide ist komplementär zu den Nucleotiden des Ziel-Oligonucleotids, die am nächsten am 3'-Ende gelegen sind. Wenn dieser Satz von 16 Brücken-Oligonucleotiden gemischt wird mit dem Ziel-Oligonucleotid unbekannter Sequenz und mit dem vorstehend beschriebenen Hilfs- Oligonucleotid unter Bedingungen, die das Annealing fördern, wird das eine Brücken-Oligonucleotid mit einem Dinucleotid, komplementär zu den letzten zwei 3'-Nucleotiden des Zielmoleklils, hybridisieren zu diesen, genauso wie zu dem Hilfs-Oligonucleotid. Dieses Verfah ren ist schematisch in FIG. 1B gezeigt, wobei die 16 Brücken-Oligonucleotide die Sequenzen SEQ ID NOS:6-21 haben und jede unbekannte Base in dem Ziel-Oligonucleotid mit "?"dargestellt ist.
Alternativ kann eine "blunt end"-Ligase wie die T4-RNA-Ligase verwendet werden, die nicht das Vorhandensein eines doppelsträngigen Konstruktes für die Verknüpfüng zweier Nucleotide benötigt. In diesem Fall wird ein Hilfs-Oligonucleotid hergestellt, das zusammengesetzt ist aus einer 3'-Sequenz, die komplementär ist zu einer Sequenz eines zu verwendenden Priers, gebunden an eine 5'-Signalsequenz von niindestens vier aufeinanderfolgenden Nucleotiden. Das 3'-Ende dieses Hilfs-Oligonucleotids ist geschützt mit z.B. einem Didesoxynucleotid (ddA, ddC, ddG, ddT oder einer Aminogruppe. Das 5'-Ende des Hilfs-Oligonucleotids wird dann an das 3'-Ende des Ziel-Oligonucleotids unter Bildung eines einzelsträngigen Ligationsprodukts ligiert.
Ein Beispiel für dieses Ligationsprotokoll ist schematisch in FIG. 1C gezeigt. 1&sub4;-RNA- Ligase wird verwendet, um ein Ziel-Oligonucleotid unbekannter Sequenz an ein 3 imer Hilfs- Oligonucleotid (SEQ m NO:3) ohne die Gegenwart eines Brücken-Oligonucleotids in dem Reaktionsgemisch zu ligieren. Das UV-Elektropherogramm, gezeigt in den FIG. 3A und 3B, zeigt die Synthese des 57mer Ligationsprodukts. Wenn ein Hilfs-Oligonucleotid mit einem ungeschützten 3'-Ende verwendet wird, zwingt das Enzym den Ligationsprozeß zur Ririgbildung fortzufahren und mehrere Ring-Produkte wurden erhalten (FIG. 3A). Dieses nicht gewünschte Phänomen kann verhindert werden einfach durch Verwendung eines Hilfs- Oligonucleotids mit einer schützenden Didesoxy- oder einer Amino-Gruppe an seinem 3'- Ende, wie in FIG. 3B gezeigt, wo nur ein Ligationszyklus erhalten wird. Wie im T4-RNA- Ligase-Fall werden das ATP-25mer-Analogon, das Hilfs-3 imer und das 57mer Ligationsprodukt beobachtet.
Wenn das einzelsträngige Ligationsprodukt, das das Zielmolekül enthält, gebildet ist, wird ein Primer an das Ligationsprodukt annealt, von dem aus Stränge, komplementär zu dem Zielmolekül, durch eine Polymerase verlängert werden können (d.h. Primer-Verlängerungs produkte). Das Priiner-Oligonucleotid kann jedes der konventionellen Typen von RNA- und/oder DNA-enthaltenden Oligonucleotiden sein, die bekannt sind und gewöhnlich zur DNA- oder RNA-Sequenzierung oder für Primer-Verlängerungsreaktionen verwendet werden. Das Primer-Oligonucleotid hat eine Sequenz, die komplementär ist zu einem 3'-Teil der Hilfs-Oligonucleotidregion des Ligationsprodukts, die die Signalregion nicht beinhaltet.
Mindestens ein Molekül einer Markierung wie einer Lumineszenz-, Radioaktiv- oder Fluoreszenz-Markierung ist an den Primer gebunden. Wenn es eine Fluoreszenz-Markierung ist, ist sie im UV- oder sichtbaren Wellenlängenbereich anregbar und die Fluoreszenz liegt im sichtbaren Bereich. Solche Markierungen schließen ein Fluorescein oder die N-Succinimidester oder andere Derivate hiervon, wie "JOE" (Applied Biosystems, Foster City, CA), "FITC" (Applied Biosystems, Foster City, CA) und "FAM" (Applied Biosystems, Foster City, CA) und Rhodamin oder Derivate hiervon wie Tetramethylrhodamin ("TAMARA") (Applied Biosystems, Foster City, CA) und "Texas Red" oder "ROX" (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Smith, 1985, Nucl. Acid. Res. 13,2399-2412). Diese Markierungen können kovalent an den Priiner gebunden werden, z.B. unter Verwendung der chemischen DNA- oder RNA-Synthese, wie beschrieben bei Smith (Am. Biolab., 1989, Mai, 11-20) oder durch andere Verfahren, die nicht mit der Fähigkeit des Priiners, an das Zielmolekül zu hybridisieren oder an das Hilfs-Oligonucleotid zu ligieren, interferieren. Ein Beispiel für dieses Verfah ren schließt ein die kovalente Bindung einer Aminogruppe an den Farbstoff und nachfolgender Bindung des 5'-Endes der Aminogruppe des Oligonucleotids (Smith, 1985, Nucl. Acid. Res. 13, 2399-2412). Alternativ kann das Fragment durch Didesoxynucleotide fluoreszenzmarkiert werden.
Das Annealing der Brücken-, Hilfs- und Ziel-Oligonucleotide und des Priiners und Ligationsprodukts wird durchgefllrt unter Bedingungen, die besonders geeignet sind für die Hybridisierung einer einzeisträngigen Spezies zu einem komplementären, einzelsträngigen Oligonucleotid. Diese Bedingungen schließen ein das In-Kontakt-Bringen in Ligationspuffer (600 mM Tris-HCl, pH 7,6, 66 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 660 µM ATP) bei einer Temperatur von etwa 4ºC bis 90ºC, aber vorzugsweise bei Raumtemperatur (d.h. 19ºC bis 25ºC).
Nach dem Annealing des Primers zu dem Ligationsprodukt kann die Primer-Verlängerungsreaktion in Gegenwart einer Polymerase durchgeflihrt werden. Viele Polymerasen sind bekannt und können im Prinzip alle verwendet werden. Gewöhnlich wird eine DNA-Polyinerase, wie die Taq-DNA-Polymerase oder T4-DNA-Polymerase verwendet. Wenn das bekannte Sanger et al. (supra)-Sequenzierungsverfahren verwendet wird, werden Nucleotide und Didesoxynucleotide verwendet, um die Primer-Verlängerungen zu synthetisieren.
Schließlich werden die Didesoxy-terminierten Verlängerungsprodukte entsprechend irgendeinem bekannten Yerfahren, das diese Moleküle aufgrund der Größe trennt, getrennt. Solche Protokolle schließen ein Polyacrylamid-Plattengelelektrophorese oder Hochleistungs-Kapillargelelektrophorese. Abhängig von der verwendeten Markierung des Priiners wird Laserinduzierte Fluoreszenz, Uv-Absorption oder Strahlung gemessen, um die relative Mobilität der Primer-Verlängerungsprodukte zu bestimmen.
Zum Beispiel wird ein Hilfs-Oligonucleotid hergestellt aus 17 Basen an seinem 3'-Ende, die komplementär sind zu der Sequenz des M13mp18 (-21)-Primers. Danach folgt eine Signalregion von 10 T-Basen. Danach wird die Base #1 des Ziel-Oligonucleotids, das zu sequenzieren ist, direkt 5' zu dem Hilfs-Oligonucleotid lokalisiert.
Bei der Entwicklung eines automatischen einzelsträngigen Oligonucleotid-Sequencers für Routine-Antisense-Analysen wurde eine Arbeitsstrategie entwickelt, um die enzymatische Sequenzierung von emzelsträngigen Oligonucleotid-Analoga zu untersuchen, die die vorstehend beschriebenen Ligationsprodukte einschließen. Die folgende Strategie wurde verwendet, um eine Expression der elektrophoretischen Wanderung der Sequenzierungs-Fragmente zu entwickeln, die ein wesentliches Element der automatischen Datenverarbeitung ist.
Über einen engen Bereich der Molekulargröße kann eine lineare Beziehung zwischen relativer Wanderungszeit (T') und Basenzahl festgestellt werden unter Verwendung zweier interner Standards, was einer Zwei-Punkt-Kalibrierung gleichkommt. Diese zwei Punkte sind der l7mer Primer und das SBmer Fragment, das eine Base länger ist als das Ligationsprodukt aufgrund der Endonuclease-Aktivität der Sequenase 2.0. Diese lineare Beziehung läßt sich wie folgt beschreiben:
T' = Tp - Tpr/Tfin-Tpr
wobei "Tp" die Wanderungszeit des Sequenzierungsfragments ist; "Tpr" ist die Wanderungszeit des Primers und "Tfin" ist die Wanderungszeit des letzten Peaks. Diese Beziehung ist linear für T', das nur Fragmentgrößen-abhängig ist.
Um die Gültigkeit dieses Ausdrucks zu Überprufen, wurde der Ausdruck unter der folgenden experimentellen Bedingung getestet. Ein 57mer Ligationsprodukt (SEQ ID NO:4) (z.B. ein 25mer Ziel-Oligonucleotid-Analogon (SEQ ID NO: 1) und ein 32mer Hilfs-Oligonucleotid (SEQ ID NO:3)) wurden der enzymatischen Kettenterminationsreaktion unabhängig mit vier verschiedenen Basen unterzogen (d.h. A, G, C, T. Jedes der vier Reaktionsgemische wurde an verschiedenen Tagen. und auf verschiedenen Gelsäulen aufgetrennt. LIF-Elektropherogramme der Trennung der vier Sets der Primer-Verlängerungsprodukte sind in den FIG. 4A- 4D gezeigt. Die Verlängerungsprodukte wurden durch HPCE getrennt unter Verwendung eines Gels, enthaltend 12% T-Acrylamid, 6,5 M Hamstoff und 40% (Gewicht:Gewicht) Formamid. Diese Figuren stellen die Zwei-Punkt-Alignments des Computers dar für T-, G-, A- und C-Reaktionen. Der erste Punkt ist der l7mer Primer und der zweite Punkt ist das 57mer Fragment, das als letztes wandert. T' wurde individuell für jedes der nachgewiesenen Fragmente zwischen 17 und 57 Basen kalkuliert. Fragment 33 korrespondiert zu dem 2smer Ziel-Oligonucleotid. Die erhaltenen Werte wurden dann neu angeordnet von niedrig zu hoch, gemäß dem Vorkommen.in den vier Läufen für die vier einzelnen Basen in den FIG. 4A-4D. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt, die ein Computerausdruck der relativen Wanderung ist, die erhalten wurde unter Verwendung der Zwei-Punkt-Größen-Neu-Alignments für die Daten, die in den FIG. 4A-4D erhalten wurden. TABELLE 1
Wie vorstehend aufgezeigt wird die Sequenz des Ziel-Oligonucleotids in der ganz rechten Spalte der Tabelle 1 von dem 3'- zu dem 5'-Ende bestimmt. Dieses Sequenzierungsformat ist das Ergebnis der Computer-Soflware, die fähig ist, das Sequenzierungssystem zu automatisieren und die Datenverarbeitung durchzuführen.
Wenn diese Software mit einer käuflichen Software gekoppelt wird (z.B. Turbochrome III, P.E. Nelson, Cupertino, CA), werden Daten erhalten, die manipuliert werden können, so daß das abschließende Elektropherogramm der Sequenzierung geblottet werden kann, wie in den FIG. 5A und 5B gezeigt. Die Ergebnisse sind zusammengefaßt in FIG. 6, die die lineare Beziehung zwischen Fragnientwanderung und Basenzahl zeigt.
Somit ist ein mathematischer Ausdruck gefünden worden und erfolgreich verwendet worden für eine automatische einzelsträngige Oligonucleotidsequenzbestimmung. Die Stärke dieses Ausdrucks ist, daß "T'" sich nur auf die Fragmentlänge, ausgedrückt als Basenzalil, bezieht. Dartiberhinaus ist dieser Ausdruck unabhängig von den experimentellen Bedingungen, wenn alle Sequenzierungsfragmente getrennt werden. Die Trennung ist kein Problem, da Gelkapillare die Sequenzierungsfragmente mit hoher Wirksamkeit und Auflösung trennen können (Cohen et al., 1988, J. Chromatogr. 458, 323; Swerdlow et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18, 1415-1419; Pentoney et al., 1992, Electrophoresis 13, 461-74; Cohen et al., 1993, TRAC 12, 195-202).
Die folgenden Beispiele beschreiben die bevorzugten Ausführungsformen der Herstellung und Durchführung der vorliegenden Erfindung, aber sind nicht einschränkend zu verstehen, da alternative Verfahren verwendet werden können, um ähnliche Ergebnisse zu erhalten.

BEISPIELE

1. Herstellung von Ziel-, Hilfs-, Brücken- und Primer-Oligonucleotiden
Phosphodiester-gebundene Ziel-, Hilfs- und Primer-Oligonucleotide wurden synthetisiert durch das Phosphoramidit-Verfahren (siehe Mcbride et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24, 245) unter Verwendung eines Oligo 100 automatischen DNA-Synthesizers (Beckman, Fullerton, CA). Ziel-, Hilfs- und Primer-Oligonucleotid-Analoga wurden synthetisiert unter Verwendung von bekannten Verfahren (Uhimaim et al., Analyt. Chem., 1990, 90, 543-583), und danach entsalzt, lyophylisiert und in Pulfer rekonstituiert für das Sequenzierungs-Protokoll oder in sterilem Wasser für HPCE (Lyphomed Deerfield, IL).
Ein Hilfs-Oligonucleotid wird hergestellt mit 17 Basen an seinem 3'-Ende, die komplementär sind zu der Sequenz des M13mp18 (-21) Primers. Danach folgt eine Signalregion von 10 T- Basen. Danach wird die Base #1 direkt 5' des Hilfs-Oligonucleotids positioniert.
Ein 12mer Brücken-Oligonucleotid wird hergestellt, das besteht aus zwei Regionen von sechs Basen, wobei eine Region komplementär ist zu den letzten sechs Basen des 5'-Endes des Hilfs-Oligonucleotids und die anderen komplementär sind zu einer zuvor bestimmten Sequenz der ersten sechs Basen des Ziel-Oligonucleotids an seinem 3'-Ende.
Der Primer wird markiert durch kovalente Bindung einer Markierung an seinem 5'-Ende. Dieses wird durchgeführt durch das Phosphoramidit-Verfahren unter Verwendung eines automatischen Oligonucleotid-Synthesizers.
Alternativ wird der Primer markiert durch kovalente Bindung einer Fluoreszenz-Markierung, wie eines derivatisierten Fluoresceins ("FAM") an seinem 5'-Ende unter Verwendung der chemischen DNA- oder RNA-Synthese, wie beschrieben bei Smith, Am. Biolab., 1989, Mai, 11-20.
2. Herstellung des Ligationsprodukts, einschließlich eines Oligonucleotids mit einer bekannten Sequenz
Etwa 6 µg des Ziel-Oligonucleotids werden gemischt mit 3 µg der 5'-phosphorylierten Hilfs- DNA, 4 µg des Brücken-Oligonucleotids und 5 µl 10x Ligationspuffer (USB 70087). Das Endvolumen beträgt etwa 15 µl. Dieses Gemisch wird bei 37ºC für 15 Minuten inkubiert und danach in einem Eisbad bei 4ºC für 20 Minuten gekiihlt. 1 µl T4-DNA-Ligase (USB 70005, 300 Einheiten/µl) werden danach zu dem Gemisch gegeben und bei 37ºC für 1 Stunde gehalten. Die Ligase wird inaktiviert bei 70ºC für 5 Minuten.
3. Herstellung eines Ligationsprodultts, einschließlich eines Oligonucleotids mit einer unbekannten Sequenz

A. Nicht-Brücken-Verfahren

Dieses Protokoll basiert auf dem Verfahren von Tessioer (Analyt. Biochem., 1986, 158, 171- 178). 3 µl 5x Ligationspuffer (50 mM MgCl&sub2;, 5 mM Co (NH&sub3;)6Cl&sub3;, 250 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mg/ml Rinderserumalbumin (USB 10848)) werden mit 6 µl Ziel-Oligonucleotid, 1 µg Hilfs-DNA, 5 µl 50% Polyethylenglykol (USB 19959) und 2 µl T4-RNA-Ligase (USB 21245, 20.000 µn/ml) gemischt. Das Endvolumen beträgt etwa 15 µl. Die Hilfs-DNA wird am 5'-Ende phosphoryliert und Amino-gebunden am 3'-Ende, um die Bildung von Neben- Ligationsreaktionsprodukten zu elitninieren, einschließlich des Hilfs-Oligonucleotids und des Primers. Dieses Gemisch wird bei 25ºC über Nacht inkubiert.

B. Brücken-Verfahren

Ein Satz von 16 Brücken-Oligonucleotiden wird durch das Phosphoramidit-Verfahren unter Verwendung eines Beckman Oligo 100t (Fullerton, CA) synthetisiert.
Danach werden etwa 6 µg des Ziel-Oligonucleotids mit 3 µg der 5'-phosphorylierten Hilfs- DNA, 4x 16=32 µg Brücken-Oligonucleotid und 5 µl 10x Ligationspuffer (USB 70087) gemischt. Das Endvolumen beträgt etwa 15 µl. Dieses Gemisch wird für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert und danach in einem Wasserbad bei 4ºC für 20 Minuten gek(ihlt. 1 µl T4- DNA-Ligase (USB 70005), 300 Einheiten/µl) werden danach zu dem Gemisch hinzugegeben und bei 37ºC ftir 1 Stunde gehalten. Die Ligase wird bei 70ºC für 5 Minuten inaktiviert.

4. Primer-Annealing

3 µl (0,1 pM/µl) des einzeisträngigen Ligationsprodukts wurden mit 8 µl (0,4 pM/µl) Primer (ABI 401131 - 21M13 Primer) und 4 µl 5x Sequenzierungspuffer (USB 70702) gemischt. Das Gemisch wurde auf 65ºC für 10 Minuten erhitzt und langsam auf Raumtemperatur für 30 Minuten abgekühlt, um das Annealing zu ermöglichen.
5. Sequenzierung der Primer-Verlängerungsprodukte durch das Kettenterminations-Verfahren
Die Primer-Verlängerung/Termination wird folgendermaßen durchgeführt: 15 µl Annealing- Gemisch werden mit 5 µl Mangan-Puffer (USB 72600), 2 µl 0,1 M Dithiothreitol (USB 70726), 2 µl Sequenase-Version 2.0 (13513 70775) und 1 µl Fluorophosphat (13513 70950) in Gegenwart entweder von vier verschiedenen Gemischen, enthaltend 4 µl NTP (jeweils 2 15 mM), 2 µl 0,5 mM ddATP oder ddCTP oder ddTTP oder ddGTP oder einem einzelnen Gemisch, enthaltend ein spezifisches Verhältnis der Didesoxynucleotide ddATP, ddCTP, ddTTP und ddGTP (8:4:2:1), wie bei Tabor und Richardson (J. Biol. Chem., 1990, 265, 8322-8323) beschrieben, gemischt. Das Gemisch wird bei 37ºC für 15 Minuten inkubiert und danach zweimal mit 70% EtOH präzipitiert.

6. Trennung der Primer-Verlängerungsprodukte durch HPCE

Gel-gefüllte Kapillaren wurden folgendermaßen hergestellt. Kapillarröhrchen aus Fusedsilica (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) mit einem inneren Durchmesser von 65 µm, einem äußeren Durchmesser von 375 µm, einer effektiven Länge von 10-15 cm und einer Gesamtlänge von 30-60 cm wurden mit Methylacryloxypropyl-trimethoxysilan (Petrach Systems, Bristol, PA, USA) behandelt und danach gefüllt mit einer entgasten Lösung von 14% T-polymerisiertem Acrylamid, 7 M Harnstoff in wäßriger Lösung oder Formamid (TBE Puffer: 0,1 M bis 0,3 M Tris-Borat, 2-6 mM EDTA, pH 8,3,7 M Hamstoff). Die Polymerisierung wurde erreicht durch Hinzufligen von Ammoniumpersulfat-Lösung und N,N,N',N',- Tetramethylethylendiamin (TEMED). Dieses Protokoll basiert auf dem Verfahren von Smith et al., Nature, 1986, 321, 674. Der Lauf-Puffer war 0,2 M TBE und es wurden 400 V/cm angelegt.
Das Kapillar-Elektrophoresegerät mit UV- und Laser-induziertem Fluoreszenznachweis für die Trennung der Oligonucleotid-Sequenzierungsfragmente ist das gleiche wie beschrieben bei Smith et al., Nature, 1986, 321, 674). Kurz zusammengefaßt wird ein 30 kV, 500 µA Gleichstrom-Hoch-Volt-Stromversorgungsgerät (Modell ER/DM; Glassman, Whitehouse Station, NJ, USA) verwendet, um das Potential über die Kapillare zu erzeugen. Der UV- Nachweis der Phosphorothioate und anderer Analoga bei 270 nm wurde durchgeführt mit einem Spektralphotometer (Spectra 110, Spectra-Physics, San Jose, CA).. Für den Laserinduzierten Fluoreszenznachweis wurde ein Argoninlaser (Modell 543 10085, Omnichrom, Chino, CA, USA) verwendet. Die Daten wurden aufgenommen und gespeichert auf einem Acerpower 486133 Computer (Acer American Corp., San Jose, CA, USA) durch einen Analog-Digital-Converter (Modell 970, Nelson Analytical, Cupertino, CA, USA).

Claims

1. Ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines Zieloligonukleotids umfassend die Schritte:

(a) Herstellung eines einzelsträngigen-Ligationsproduktes umfassend:

(i) ein zu sequenzierendes Zieloligonukleotid mit einem 3'- und 5'-Ende und

(ii) ein Hilfsoligonukleotid mit einem 3'-Ende und einem 5'-Ende und einer Nukleotidsequenz komplementär zu der Sequenz des zu verwendenden Primers;

(b) Annealing eines Primers zu dem Teil der Hilfsoligonukleotids des Ligationsproduktes, wobei der Primer eine Nukleotidsequenz hat, die komplementär zu einem Teil des Hilfsoligonukleotids ist und eine kovalent gebundene Markierung hat;

(c) Verlängerung des Primers mit kettenverlängernden Nukleosidtriphosphaten und kettenabbrechenden Nukleosidtriphosphaten in der Gegenwart einer Polymerase um eine Vielzahl von Primer-Verlängerungsprodukten zu erzeugen;

(d) Trennung der Primer-Verlängerungsprodukte aufgrund ihrer Basenlänge und

(e) Bestimmung der Nukleotidsequenz des Zieloligonukleotids aufgrund der Beweglichkeiten der Primer-Verlängerungsprodukte erhalten während der Trennung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zieloligonukleotid Nukleotide einschließt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ribonukleotiden, Desoxyribonukleotiden, Analoga von Ribonukleotiden, Analoga von Desoxyribonukleotiden und Kombinationen hiervon.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zieloligonukleotid Internukleotidbindungen umfaßt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphodiester, Phosphorothioat, Alkylphosphonothioat, Phosphorodithioat, Phosphoramidat, Phosphatester, Phosphattriester, Carbamat, Carbonat, Azetamidat, Carboxymethylester und Kombinationen hiervon.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt die Herstellung eines Hilfsoligonukleotids, das Nukleotide einschließt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ribonukleotiden, Desoxyribonukleotiden, Analoga von Ribonukleotiden, Analoga von Desoxyribonukleotiden und Kombinationen hiervon.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt das Herstellen eines Hilfsoligonukleotids zusammengesetzt aus mindestens 8 aufeinanderfolgenden Nukleotiden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt das Herstellen eines Hilfsoligonukleotids ferner umfassend eine Signalsequenz von mindestens vier aufeinanderfolgenden Nukleotiden an ihrem 5'-Ende verbunden mit dem 3'-Ende des Zieloligonukleotids.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt das Herstellen eines Hilfsoligonukleotids mit einer Signalsequenz zusammengesetzt aus 4 bis 20 Nukleotiden.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt:

(i) Herstellung eines Hilfsoligonukleotids zusammengesetzt aus einer 3'-Sequenz komplementär zu der Sequenz eines zu verwendenden Primers gebunden an einer 5'-Signalsequenz von mindestens vier aufeinanderfolgenden Nukleotiden, wobei die Nukleotide an dem 3 '-Ende geschützt sind und

(ii)Ligieren des 5'-Endes des Hilfsoligonukleotids an das 3'-Ende des Zieloligonukleotids, wodurch ein Einzelstrang-Ligationsprodukt gebildet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt das Herstellen eines Hilfsoligonukleotids, das ein Didesoxy- oder ein Aminogruppen-geschütztes 3 '-Ende einschließt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt die Ligation des Hilfsoligonukleotids an das Zieloligonukleotid mit einer Bluntendligase.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt die Ligation des Hilfsoligonukleotids an das Zieloligonukleotid mit einer T4 RNA-Ligase.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt:

(i) Herstellung eines Hilfsoligonukleotids zusammengesetzt aus einer Sequenz komplementär zu der Sequenz eines zu verwendenden Primers und

(ii) Herstellung eines Satzes von sechzehn Brückenoligonukleotiden, wobei jedes Brückenoligonukleotid ein 3'-Ende und ein 5'-Ende hat und jedes die gleichen sechs Nukleotide an seinem 5'-Ende einschließt, die komplementär zu sechs Nukleotiden an dem 5'-Ende des Hilfsoligonukleotids sind und zwei Nukleotide an seinem 3'-Ende eine von sechzehn verschiedenen möglichen Sequenzen aufweisen, wobei eines komplementär ist zu den letzten zwei 3'-Nukleotiden des Zieloligonukleotids;

(iii) Annealing der Hilfs- und Zieloligonukleotide an das Brückenoligonukleotid mit den zwei 3'-Nukleotiden komplementär zu den letzten zwei 3'-Nukleotiden des Zielmoleküls, so daß die ersten zwei 3'-Nukleotide des Brückenoligonukleotids zu den letzten zwei 3'-Nukleotiden des Zieloligonukleotids hybridisieren und die nächsten sechs Nukleotide des Brückenoligonukleotids an seinem 5'-Ende zu den ersten sechs 5'-Nukleotiden des Hilfsoligonukleotids hybridisieren und

(iv) Ligieren des 3'-Endes des Zieloligonukleotids an die Signalsequenz am 5'-Ende des Hilfsoligonukleotids, wobei ein Ligationsprodukt gebildet wird.

13. Verfaliren nach Anspruch 12, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt Herstellung eines Brückenoligonukleotids, das Nukleotide einschließt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ribonukleotiden, Desoxyribonukleotiden, Analoga von Ribonukleotiden, Analoga von Desoxyribonukleotiden und Kombinationen hiervon.

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt das Herstellen eines Brückenoligonukleotids umfassend Internukleotidbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphodiester, Phosphorodithioat, Alkylphosphonothioat, Phosphorodithioat, Phosphoramidat, Phosphatester, Phosphattriester, Carbamat, Carbonat, Azetamidat, Carboxymethylester und Kombinationen hiervon.

15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt das Herstellen eines Bröckenoligonukleotids umfassend ein Dinukleotid, das an seinem 3'-Ende ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC und GG.

16. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Herstellungsschritt (a) umfaßt die Ligation des Hilfsoligonukleotids an das Zieloligonukleotid mit T4 DNA-Ligase oder Taq DNA-Ligase.

17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Annealingschritt (b) umfaßt das Annealing eines Primers komplementär an das Ligationsprodukt, wobei der Primer umfaßt eine Nukleotidsequenz komplementär zu mindestens vier Nukleotiden des Hilfsoligonukleotidteils der Ligationsprodukte.

18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Annealingschritt (b) umfaßt das Annealing eines Primers an das Ligationsprodukt, wobei der Primer Nukleotide einschließt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ribonukleotiden, Desoxyribonukleotiden, Analoga von Ribonukleotiden, Analoga von Desoxyribonukleotiden und Kombinationen hiervon.

19. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Annealingschritt (b) umfaßt das Annealing eines Primers an das Ligationsprodukt, wobei der Primer Internukleosidbindungen einschließt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphodiester, Phosphorothioat, Alkylphosphonothioat, Phosphorodithioat, Phosphoramidat, Phosphatester, Phosphattriester, Carbamat, Carbonat, Azetamidat, Carboxymethylester und Kombinationen hiervon.

20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Annealingschritt (b) umfaßt das Annealing eines Primers an das Ligationsprodukt, wobei der Primer eine Markierung hat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Fluoreszenz-, Chemilumineszenz- oder Radioaktiv-Markierung.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Annealingschritt (b) umfaßt das Annealing eines Primers mit einer Fluoreszenzmarkierung, die im UV- oder sichtbaren Bereich anregbar ist und dessen Fluoreszenz im sichtbaren Bereich liegt.

22. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verlängerungsschritt (c) umfaßt die Verlängerung des Primers mit einer Polymerase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus T4 DNA-Polymerase und Taq DNA-Polymerase.

23. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verlängerungsschritt (c) umfaßt die Verlängerung des Primers mit keffenabbrechenden Nukleotidtriphosphaten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Didesoxyadenin, Didesoxyguanidin, Didesoxythymidin und Didesoxycytosin.

24. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Trennungsschritt (d) umfaßt das Trennen der Primer-Verlängerungsprodukte durch Plattengel- oder Hochleistungskapillargelelektrophorese.

25. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bestimmungsschritt (e) umfaßt die Verwendung von laserinduzierter Fluoreszenz, UV-Absorption oder radioaktivem Nachweis, um die relativen Beweglichkeiten der Primer-Verlängerungsprodukte zu messen.