DE69636895T2

DE69636895T2 - Die Verwendung der 3'-wesentlichen Bearbeitungswirksamkeit von DNS-Polymerase

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Publication number: DE69636895T2
Application number: DE69636895T
Authority: DE
Inventors: Bruno Cambridge Canard; Dr. Gregor Sagner
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-06-01
Filing date: 1996-05-29
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2016-05-30
Also published as: DE69636895D1; ES2281076T3; ATE353973T1; EP0745686A1; JP3013156B2; US6001566A; JPH08322600A

Description

Die Erfindung richtet sich auf die Verwendung von DNA-Polymerasen mit 3'-intrinsischer Editieraktivität (3'-IEA) in Gegenwart oder Abwesenheit eines Deaktivierungsmittels zur Abspaltung einer Schutzgruppe von der 3'-Position von Oligo- oder Polyribo- oder Desoxyribonukleotiden. Dabei betrifft die Verwendung insbesondere ein verbessertes, nicht auf einem Gel beruhendes Sequenzierverfahren.
Die moderne molekulare Genetik bringt zur Zeit wichtige Fortschritte hinsichtlich des Verständnisses komplexer biologischer Vorgänge und Krankheitsbilder wie beispielsweise Krebs oder Erbkrankheiten. Ermöglicht wurde dies hauptsächlich durch die Entwicklung von Nukleotidsequenziertechniken in den späten 70er Jahren (Sanger, 1977, Maxam und Gilbert, 1977). Diese klassischen Verfahren werden immer noch in den meisten Laboratorien in der ganzen Welt in ihrer ursprünglichen Form verwendet. Trotz ihrer breiten Akzeptanz als Verfahren der Wahl konnte das Didesoxyverfahren nach Sanger bislang noch nicht vollständig automatisiert werden, und zwar in der Hauptsache wegen des Gelelektrophoreseschritts. Dementsprechend wurde dieser Batch-Schritt im Hinblick auf die Geschwindigkeit sowie die Anzahl bearbeiteter Proben verbessert, doch wird derzeit versucht, nach einem alternativen Verfahren zu suchen, mit dem diese offensichtlichen Beschränkungen umgangen werden könnten. Diese Bemühungen blieben bislang ziemlich ergebnislos, und neu auftauchende Konzepte und Projekte, wie beispielsweise die Sequenzierung durch Hybridisierung (Strezoska et al., 1991) oder die Rastertunnelmikroskopie (Driscoll et al., 1990), sind erst kürzlich erschienen.
Vor dem Hintergrund solcher Überlegungen wurde von mehreren Arbeitsgruppen ein neuer Ansatz vorgeschlagen, der die enzymatische Leistung des Didesoxyverfahrens nach Sanger nutzen würde, ohne dabei jedoch ein komplexes Gemisch von Produkten zu erzeugen, die anschließend durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert werden (Tsien 1991, Gibbs et al. 1993, Canard und Sarfati, 1993). Dieser neue Ansatz beruht auf einer Ein-Basen-Addition in einem zur zu bestimmenden Nukleotidsequenz komplementären wachsenden DNA-Strang. Dabei wird jede hinzugefügte Base schrittweise identifiziert und die unbekannte Sequenz in Echtzeit während eines vollautomatisierbaren Schemas abgeleitet. Zur Kontrolle der Addition einer, und tatsächlich nur einer Base durch eine DNA-Polymerase müssen spezielle Nukleotid-5'-triphosphate der vier Basen ATGC so konstruiert werden, daß sie noch gute DNA-Polymerase-Substrate darstellen, voneinander leicht unterschieden werden können und entweder als Kettenterminatoren oder nach ihrem Einbau als neuer 3'-Primer für die Addition der nächsten zu identifizierenden Base fungieren können.
Der chemische Schutz des 3'-Hydroxyl derartiger Substrate würde ihnen diese gewünschten Eigenschaften verleihen, so lange nach dem Einbau eines davon ihr 3'-blockiertes Hydroxyl zur Wiederherstellung eines funktionellen 3'-Endes entschützt werden könnte. Auf diese Weise fungiert der 3'-Schutz als ein Tag für jede der vier Basen ATGC, wobei dessen Identifizierung die Identifizierung der der DNA-Matrize entsprechenden Nukleobase unter Verwendung von Standardregeln der Basenpaarung bedeutet und somit einen sehr leichten Weg zur Bestimmung einer Nukleotidsequenz liefert, sobald dieser Vorgang auf wirksame Weise im Kreis geführt werden kann. Viele 3'-modifizierte 2'-Desoxynukleotid-5'-triphosphate wurden synthetisiert, wobei gezeigt werden konnte, daß sie Substrate für DNA-Polymerasen darstellen (Kornberg, 1980, Tabor und Richardson, 1989, Kraevsky, 1987, Canard & Sarfati, 1994a), so daß damit wenig Zweifel über die Durchführbarkeit der Einbaureaktion innerhalb eines vernünftigen Zeitraums bestehen. In gleicher Weise wird gegenwärtig der fluorimetrische Nachweis von Nukleotiden oder verlängerten DNAs mit fluoreszenzmarkierten Basen in Standardvorschriften für halbautomatische Sequenziergeräte verwendet (Venter et al., 1992) ebenso wie an in einer durch 3'-Exonuklease gesteuerten Reaktion freigesetzten einzelnen Fluoreszenzmolekülen vorgesehen (Davis et al., 1991). Damit können Probleme beim Einbau und Nachweis bereits auf der Ebene der Entwicklung und Automatisierung angegangen werden.
Dies ist bei der Entschützung ganz eindeutig nicht der Fall, die damit nach wie vor den Schlüsselschritt darstellt. Die 3'-Position muß so geschützt werden, daß sie unter den Standard-Einbaubedingungen vollkommen stabil ist, um die Bildung unerwünschter kleinster Konzentrationen an ungeschütztem Nukleosid-5'-Triphosphat zu vermeiden, jedoch leicht unter anderen, mit der chemischen und Duplex-Stabilität der DNA verträglichen milden Bedingungen leicht entschützt wird. Von Gibbs et al., 1994 wurde ein derartiges Tymidinnukleotidsubstrat mit einem 3'-Spacer-Arm konstruiert, der lichtempfindlich ist und somit bei UV-Bestrahlung ein 3'-Hydroxylende wiederherstellt. Allerdings muß dabei eine hochentwickelte und schwierige Chemie auf die drei restlichen Basen AGC angewandt werden, und es wird nur eine geringe Flexibilität bei der Konstruktion des Spacer-Arms und somit des entsprechenden Tag zugelassen, wobei über die Verwendung anderer DNA-Polymerasen als BST-DNA-Polymerase I (Gibbs et al., 1994) keine Daten vorliegen.
Von Canard und Sarfati (1993) wurden neue 3'-modifizierte 2'-Desoxynukleotide konstruiert, die indirekt und unmittelbar unter neutralen Bedingungen bei Raumtemperatur entschützt werden. Von diesen Autoren wurden ebenso Daten über die enzymatische Entschützung unter Verwendung esteraseähnlicher Enzyme, die zur Hydrolyse von 3'-Estern fähig sind, allerdings bei reduzierter Geschwindigkeit, präsentiert (Canard und Sarfati, 1994a). Die enzymatische Entschützung weist alle erforderlichen Eigenschaften für eine vollständige Integration in einem solchen Sequenzierverfahren auf, mit der Ausnahme, daß sie kinetisch attraktiv sein muß; das heißt, die Entschützung sollte idealerweise innerhalb von Sekunden ablaufen.
Während der Suche nach idealen Einbaubedingungen stellte sich heraus, daß die meisten DNA-Polymerasen zur Entschützung des 3'-blockierten Endes der terminierten DNA verwendet werden könnten, womit die mühselige Suche nach einem geeigneten 3'-Deblockierungsenzym oder -verfahren umgangen wird (Canard und Sarfati, 1994a, b). Allerdings wird diese allgemeine Eigenschaft von DNA-Polymerasen in nicht auf einem Gel beruhenden Sequenzierschemata, wie bei Tsien, 1991 beschrieben, oder dergleichen vollkommen hinfällig.
Eine derartige, nicht auf einem Gel beruhende Sequenzierung, bei der mittels einer DNA-Polymerase ein komplementärer Strang stufenweise hergestellt wird und anschließend keine zeitaufwendigen Gelelektrophoresen benötigt werden, weist gegenüber den klassischen Verfahren, beispielsweise von Sanger, wesentliche Vorteile auf ( WO 91/06678 , WO 93/05183 , DE 4141 178 , US 5,302,509 , FR 93 03 538 ). Ein 3'-modifiziertes Nukleotid (DNA-Kettenterminatoren) wird als ein DNA-Polymerase-Substrat präsentiert. Allerdings muß in einem zweiten Schritt die Gruppe, die am 3'-Ende des DNA-Strangs eingeführt wurde (3'-Tag), entfernt werden. Diesbezüglich werden üblicherweise chemische, fotochemische und enzymatische Verfahren angewandt.
Das zu lösende Hauptproblem gemäß der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Überwindung der oben erwähnten Nachteile.
Dieses Problem wird durch die vorliegende Erfindung gelöst und betrifft die Verwendung einer DNA-Polymerase mit 3'-intrinsischer Editieraktivität (3'-IEA) als Werkzeug bei mehreren molekularbiologischen Techniken, insbesondere bei nicht auf einem Gel beruhenden Sequenziertechniken. Die 3'-IEA gestattet die Verwendung von 3'-modifizierten DNA-Polymerase-Substraten, bei denen es sich nicht um DNA-Kettenterminatoren handelt. Da das 3'-Tag von der DNA-Polymerase während der Addition des nächsten Nukleotids abgespalten wird, handelt es sich bei dem ersten 3'-modifizierten Nukleotid um einen falschen Kettenterminator, dessen 3'-Position zu einem funktionellen 3'-Ende, das als Primer für das nächste Nukleotid fungieren kann, umgewandelt wurde. Die Schlüsseltatsache, die die Grundlage für die vorliegende Erfindung bildet, besteht darin, daß das 3'-Tag von der DNA-Polymerase selbst gleichzeitig mit der Addition des nächsten korrekten Nukleotids freigesetzt wird. Somit ist das freigesetzte 3'-Tag ein Anzeichen dafür, welches Nukleotid inseriert wurde, jedoch auch dafür, welches nächste Nukleotid die Freisetzung des Tag provoziert hat. Die Tatsache, daß die DNA-Polymerase in der Lage ist, ein 3'-Tag bei Insertion eines mit einem 3'-Tag versehenen Nukleotids nach Addition eines gegebenen klassischen Nukleotids freizusetzen, liefert somit Informationen über zwei aufeinanderfolgende Nukleobasen auf einem unbekannten DNA-Strang. Dies läßt sich zur Abspaltung eines für ein inseriertes Nukleotid spezifischen 3'-Tag in einem nicht auf einem Gel beruhenden Sequenzierschema, wie es von Tsien, 1991, Gibbs et al., 1991, Canard und Sarfati, 1993 beschrieben ist, verwenden. In diesem Fall ist die 3'-IEA der Schlüssel zu einer effizienten Durchführung des Entschützungsschritts und anschließender Identifizierung der inserierten Base. Interessanterweise ist ebenso festzustellen, daß die Polymerisierung eines Gemischs aus drei der vier klassischen Nukleotide und dem vierten, mit einem 3'-Tag versehenen Nukleotid an einer mit einem Primer versehenen DNA in Gegenwart einer DNA-Polymerase mit 3'-IEA normal abläuft, das 3'-Tag jedoch in das Medium freigesetzt wird, sobald das Nukleotid, welches es trägt, in die DNA eingebaut wird. Somit ist das Vorhandensein des freien Tag im Medium ein Zeichen dafür, daß die Polymerisierung stattgefunden hat. Dies ist von besonderem Interesse zur schnellen Überprüfung, ob die Polymerisierung in einem gegebenen Reaktionsansatz (wie z.B. PCR) stattgefunden hat. Vorzugsweise wird das Tag leicht in seiner freien Form im Vergleich mit seiner 3'-gebundenen Form identifiziert.
Typische DNA-Polymerase-Substrate gemäß der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I):
wobei X für eine bifunktionelle Verknüpfungsgruppe, Y für einen eine aktivierte Gruppe bereitstellenden Rest und der Rest B für ein Purin, Pyrimidin, Deazapurin, Deazapyrimidin oder deren Analoge steht, vorzugsweise Verbindungen, wobei X für einen Sauerstoff, Schwefel oder eine -NH-Gruppe und Y für eine -C(O)R-, -CH₂-R-, -C(S)NH-R- oder -C(O)NH-R-Gruppe steht, wobei R für ein Hapten, einen Farbstoff oder ein Chromophor, wie z.B. ein Fluoreszenzchromophor, oder eine verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe, die aus wenigstens einem Atom besteht, steht.
Insbesondere fungieren 3'-veresterte 2'-Desoxynukleotid-5'-triphosphate als Substrate für mehrere DNA-Polymerasen in einem einfachen Test mit stehendem Start unter Verwendung des zugehörigen Nukleotids allein. Wurde jedoch ein Gemisch der vier 3'-veresterten Desoxynukleotide verwendet, so wurde mehr als ein Additionsprodukt bei dem großen Fragment der E.coli-DNA-Polymerase I und der T7-DNA-Polymerase beobachtet. Dies war nicht der Fall für die Taq-DNA-Polymerase oder mehrere andere thermophile Enzyme, was vermuten läßt, daß das "Readthrough" [etwa: Überlesen] nicht an einer sehr kleinen Konzentration 3'- ungeschützter Desoxynukleotide lag. Optimale Einbauniveaus unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase werden überraschenderweise bei Temperatur zwischen 37°C und 45°C, weit unterhalb der bekannten optimalen Temperatur von 72°C für die Taq-DNA-Polymeraseaktivität, erzielt. Allerdings gab es keinen Unterschied im Produktmuster bei Verwendung eines klonierten gegenüber eines nativen thermophilen Enzyms, was eine mögliche Kontamination des klonierten Produkts durch E. coli-DNA-Polymerasen ausschließt. Die Abspaltung des 3'-Esters war ebenso durchgehend unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit einer 3'-nach-5'-Exonukleaseaktivität, die häufig mit DNA-Polymerasemolekülen assoziiert ist, wie beispielhaft durch die Verwendung gentechnisch konstruierter T7-DNA-Polymerase (Sequinase), der eine solche Proofreading-Aktivität fehlt, dargestellt wurde. Wurden 3'-veresterte Nukleotide mit T7-DNA-Polymerase in Abwesenheit von DNA vorinkubiert, das Enzym anschließend hitzeinaktiviert und der Ansatz mit einer DNA-Matrize/einem DNA-Primer sowie Taq-DNA-Polymerase inkubiert, so wurde wie zuvor ein einziges Additionsprodukt beobachtet, was darauf hindeutet, daß die 3'-Ester vor dem Einbau nicht hydrolysiert wurden.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe zur Verwendung von DNA-Polymerasen mit 3'-IEA betrifft die Menge an in Medium freigesetzten freien Tag, die zur Menge seiner Träger-Nukleobase, wie in den wachsenden DNA-Strang inseriert wurde, stöchiometrisch ist. Dies ist von besonderem Interesse bei der Bestimmung der Anzahl von Wiederholungen einer gegebenen Base, eines gegebenen Dinukleotids, eines gegebenen Trinukleotids oder einer beliebigen gegebenen wiederholten Sequenz, die nur drei der vier Basen ATGC enthält. In einem derartigen Test ist dann die Menge an freigesetztem Tag im Medium, wenn die Polymerisierung über einen Abschnitt eines Wiederholungsmotivs erfolgt, direkt proportional zur Anzahl der Wiederholung des besagten Motivs. Dies ist von besonderer Wichtigkeit, wenn die Anzahl an Wiederholungen in einer DNA-Sequenz mit dem Ausbruch oder der vollen Expression einer Erbkrankheit, wie beispielsweise dem Fragile-X-Syndrom (Fu et al., 1991), oder anderer Krankheiten, an denen ähnliche molekulare Defekte beteiligt sind, korreliert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß mit ihr eine Position in modifizierten Nukleotiden (oder Nukleotidanalogen) identifiziert wird, die chemisch ohne Änderung der Einbaueigenschaften dieser Substrate modifiziert werden kann. Somit läßt sich diese 3'-Position zur chemischen Anwendung von Substituenten verwenden, womit dem Nukleotidanalog andere Eigenschaften als dem 3'-Hydroxynukleotid-Ausgangsanalog vermittelt werden. Es ist dann möglich, physikalische Eigenschaften von Nukleotidanalogen zu erhöhter Hydrophobizität, Hydrophilizität, Polarität oder dergleichen zu ändern, ohne dabei ihre Einbaueigenschaften durch die Polymerase zu ändern. Dies ist von besonderer Wichtigkeit bei der antiviralen Chemie, bei der die 5'-Triphosphatform eines Nukleotidanalogs einen potenten Inhibitor der viral codierten reversen Transkriptase in vitro darstellen kann, jedoch in vivo unwirksam ist, da das geladene 5'-Mono-, -Di- oder -Triphosphat die Zuführung in das Innere der lebenden Zelle aufgrund seiner Unfähigkeit, die apolare cytoplasmatische Membran zu durchqueren, verhindert. Durch einen lipophilen Ester in der 3'-Position werden die hydrophoben Eigenschaften eines solchen 5'-Monophosphat-Nukleotidanalogs stark verändert, was einen leichten Eintritt in das Innere der Zelle gestattet, womit die Notwendigkeit für eine spezifische 5'-Kinasereaktion am Nukleotidanalog umgangen wird. Dies ist von großer klinischer Relevanz, da Virusstämme durch den Verlust ihres Kinasegens resistent gegenüber Arzneistoffen werden können. In einer eher allgemeinen Weise gestattet die Anbindung eines Substituenten, der lipophile Eigenschaften aufweist, in der 3'-Position eines Nukleotids den Abgleich einer hydrophilen oder polaren Eigenschaft, die von einem 5'-Mono-, -Di- oder -Triphosphat eingebracht wurde. Sobald sich dieses 3'-lipophile Nukleotid-5'-mono-, -di- oder -triphosphat in der Zelle befindet, läßt es sich – falls erforderlich – durch celluläre Kinasen in die 5'-Triphosphatform umwandeln und in DNA einbauen. Falls das 3'-lipophile Nukleotid eine modifizierte Base trägt, und zwar wegen der 3'-IEA, so wird dieses modifizierte Nukleotid in die DNA der Zelle zusammen mit seiner modifizierten Base eingebaut, wodurch der frühere 3'-lipophile Substituent in freier Form, das heißt, nicht kovalent an die DNA gebunden, vorliegt und zwar Dank der 3'-IEA. Ebenso ist dem Fachmann ersichtlich, daß sich dies zur Zuführung einer Verbindung, die sich allein nicht leicht in die Zelle einführen ließe, genutzt werden kann.
Im folgenden wird veranschaulicht, wie die 3'-IEA kontrolliert wird, bzw. andererseits, wie die 3'-IEA, wie oben beschrieben, vorteilhaft genutzt wird.
In 3, Tafel a) wird gezeigt, wie eine DNA-Polymerase (5 Einheiten) sowie vier mit einem 3'-Tag versehene Nukleotid-5'-triphosphate (1 mM) in einem nicht auf einem Gel beruhenden Sequenzierschema verwendet werden, um das Nukleotid eines unbekannten DNA-Strangs (2 Picomol), der an einem festen Träger (Dynabead M-280, DYNAL) mobilisiert ist, zu bestimmen. Dabei wird deutlich, daß die DNA-Polymerase unter diesen Reaktionsbedingungen frei von 3'-IEA sein muß, da ansonsten die mit dem 3'-Tag versehenen dNTPs als falsche Kettenterminatoren fungieren und eine korrekte und spezifische Insertion eines einzigen Nukleotids unmöglich machen würden. 4a) zeigt, daß Taq-Polymerase in der Lage ist, was in 3 dargestellt ist durchzuführen, doch nur, wenn darauf geachtet wird, die klassischen Reaktionsbedingungen der Taq-Polymerase (72°C, pH 8,3, 1–5 mM Mg²⁺) zu ändern, um ihre 3'-IEA vollständig zu hemmen (30°–45°C, pH 7,5, 1 mM Mn²⁺, 5 mM Citrat, jeweils 1 mM mit 3'-Tag versehene Nukleotide).
3, Tafel b) zeigt, wie sich dieses Sequenzierschema auf eine sehr große Anzahl von auf einem festen Träger, wie beispielsweise dem von Fodor, 1994 beschriebenen, immobilisierter DNA-Proben angepaßt werden kann, sowie die von einem Bildanalysesystem (CCD-Kamera) aufgezeichneten Einbauergebnisse. Es werden dieselben experimentellen Bedingungen wie in 3a) verwendet, mit der Ausnahme, daß der die immobilisierten DNAs tragende Chip in ein Reaktionsgemisch, das lediglich ein mit einem 3'-Tag versehenes Nukleotid zu einem gegebenen Zeitpunkt zusammen mit der DNA-Polymerase ohne 3'-IEA in einem geeigneten Puffer enthält, eingetaucht wird, in Waschpuffer gespült wird, mittels einer LCD-Kamera analysiert wird, die Koordinaten der DNA-Proben mit dem eingebauten, mit 3'-Tag versehenen Nukleotid aufgezeichnet werden und der Vorgang wiederum für die drei verbliebenen, mit 3'-Tag versehenen Nukleotide wiederholt wird. Nach Einbau der vier mit 3'-Tag versehenen Nukleotide sind alle DNA-Proben mit dem Tag markiert. Alle Tags werden dann mit einer Entschützungslösung abgespalten, und der Vorgang wird wiederholt, um zu bestimmen, welche zweite Phase jeweils von der jeweiligen DNA-Probe eingebaut werden kann. Wiederum ist ersichtlich, daß eine 3'-IEA-Aktivität zeigende DNA-Polymerase die DNA-Stränge, wie in 1a) gezeigt, komplett auffüllen würde, was das Verfahren hinfällig macht.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben:
Beispiel 1. Die Verwendung der 3'-IEA als Marker für Nukleotideinbau in DNA
Die Bestimmung des Erfolgs einer Einbaureaktion (z.B. einer PCR) wird zur Zeit über die Analyse der Reaktionsprodukte mittels Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese erreicht. Dieser Schritt ist zwar einfach, kann jedoch äußerst mühselig und einer Automatisierung schlecht zugänglich sein, falls eine große Anzahl von PCR-Produkten gleichzeitig analysiert wird. Somit würde es sich als sehr sinnvoll erweisen, in der Lage zu sein, den Einbau von dNTPs optisch zu überprüfen oder zumindest die Gelelektrophorese durch Verwendung eines automatisierbaren Einbautests zu umgehen. Die Verwendung von mit 3'-Tag versehenen dNTPs in Verbindung mit klassischen dNTPs und einer 3'-IEA zeigenden DNA-Polymerase gestattet in effizienter Weise die Entscheidung darüber, ob Nukleotide während einer Polymerisierungsreaktion eingebaut wurden oder nicht. Das Verfahren ist in 4) dargestellt, wobei eine geringe Konzentration eines mit 3'-Tag versehenen dNTP in einer PCR zusammen mit einem klassischen PCR-Mix (dNTPs, Primer, DNA-Matritze und Puffer) mit einbezogen ist.
Da das mit 3'-Tag versehene dNTP willkürlich anstelle seines normalen 3'-OH-dNTP-Gegenstücks vor seinem zugehörigen Watson-Crick-Partner inseriert wird und das Tag anschließend, wenn die Addition des nächsten Nukleotids erfolgt, abgespalten wird, ist das Vorhandensein eines nicht gekoppelten Tag im Überstand ein Zeichen dafür, daß die Polymerisierung stattgefunden hat, wobei die Konzentration des Tag im Überstand direkt mit der Anzahl inserierter, mit 3'-Tag versehener Nukleotide in Verbindung steht. 4b) zeigt einen Weg zum Testen der Konzentration des doppelsträngigen Produkts nach Beendigung der PCR. Ein Gemisch von drei dNTP und einem mit 3'-Tag versehenen dNTP wird zu der PCR gegeben und lediglich ein PCR-Cyclus durchgeführt, wobei auf die optimale Aktivitätstemperatur der zugegebenen DNA-Polymerase geachtet wird. Wiederum steht die Konzentration des doppelsträngigen DNA-Produkts in Verbindung mit der Konzentration des freien 3'-Tag im Überstand. Anschließend kann man diejenige PCR ausfällen, in denen ein Einbau stattgefunden hat und nur diese für eine Analyse der korrekten Produktmenge unter Verwendung von Gelelektrophorese einsetzen.
Ebenso ist ersichtlich, daß sich dieses Verfahren zur Bestimmung einer DNA-Konzentration in einer unbekannten DNA-Probe verwenden läßt. Tatsächlich ist im Fall von 4b ersichtlich, daß die Menge an freigesetztem Tag proportional zur Menge an Matrizen-DNA ist und daß eine entsprechende Kalibrierung mit Standards, deren Konzentration bekannt ist, die Bestimmung der DNA-Konzentration der besagten unbekannten Probe durch direktes Testen des freien Tag im Überstand gestattet. Wie zuvor erwähnt wird das Tag leicht in seiner freien Form im Vergleich zu seiner 3'-gekoppelten Form identifiziert. Zu diesem Zweck eignen sich als Fluorophore am besten solche mit einer großen Stokes'schen Verschiebung, und zwar so, daß die ihrer freien Form entsprechende maximale Emissionswellenlänge so wenig wie möglich mit der maximalen Emissionswellenlänge ihrer gekoppelten Form überlappt. Diese Eigenschaft läßt sich vorteilhaft einsetzen, um ein Fluoreszenzsignal nur dann zu erhalten, wenn ein freies Tag im Überstand nach Expression der 3'-IEA vorliegt.
Beispiel 2. Zählen der Anzahl an Trinukleotidwiederholungen in einer gegebenen DNA-Sequenz unter Verwendung eines einzelnen Röhrchens und einer Einzelreaktion: der Fall von CGG-Wiederholungen und Fragile-X-Syndrom
Bei Fragile-X-Syndrom handelt es sich um die häufigste vererbte Geistesschwäche (Übersichtsartikel von Oostra et al., 1993). Die molekulare Grundlage für diese Krankheit besteht in einer sogenannten "dynamischen Mutation" am FMR1-Locus unter Beteiligung einer schnellen Expansion einer (CGG)n-Triplett-Wiederholung, deren Zahl n eng mit normalen, Träger- oder krankhaften Phänotypen korreliert (Fu et al., 1991). Normale Phänotypen weisen polymorphe (CGG)-Wiederholungen im Bereich von 6 bis 23 Einheiten auf, während weibliche Träger zwischen 43 und 200 Einheiten aufweisen. Betroffene Individuen weisen mehr als 200 Einheiten der CGG-Wiederholung auf. Somit ist ersichtlich, daß ein genaues Zählen der Anzahl an CGG-Wiederholungen sowohl auf der diagnostischen als auch der prädiktiven Ebene klinisch relevant ist, wobei diese Zahl mit klassischen cytogenetischen Verfahren oder der DNA-Analyse mittels PCR und anschließender Gelelektrophorese nur grob abgeschätzt werden kann. Die Verwendung der 3'-IEA kann den Gelelektrophoreseschritt in vorteilhafter Weise ersetzen und eine genaue Zahl der Wiederholungen in einem sehr einfachen Test angeben. Dabei werden den Triplett-Wiederholungsbereich flankierende Primer (5) zur Herstellung eines PCR-Produkts verwendet, das an einen festen Träger mittels Standardverfahren, wie beispielsweise dem Biotin-Streptavidin-System und magnetischen Kügelchen (Dynal, Norwegen) immobilisiert werden kann. Eine einzelsträngige DNA-Sequenziermatrize wird durch Schmelzen des Duplex mit NaOH, wie vom Hersteller empfohlen, hergestellt, und ein Primer wird unmittelbar stromaufwärts des (CGG)n-Bereichs positioniert. Anschließend wird die mit dem Primer versehene DNA mit einem Gemisch mit einer 3'-IEA zeigenden DNA-Polymerase, 200 μM dGTP, 50 μM dATP und 50 μM ddTTP sowie 400 μM mit 3'-Tag versehenem dCTP unter für sowohl die Polymerisierung als auch die 3'-IEA-Aktivitäten optimalen pH-, Temperatur- und Zeitbedingungen inkubiert. Das 2'-3'-Didesoxynukleotid wird lediglich außerhalb des CGG-Bereichs eingebaut und stoppt die Reaktion mittels DNA-Kettentermination, wenn es auf seine zugehörige Base trifft. Innerhalb des CGG-Bereichs wird dGTP vor seiner zugehörigen dC-Base eingebaut und mit 3'-Tag versehenes dCTP wird ebenso im CGG-Bereich eingebaut, wobei sein 3'-Tag während der Expression der 3'-IEA abgespalten wird. Nach Beendigung der Verlängerungsreaktion wird der Überstand auf das Vorhandensein des freien Tag entweder direkt oder nach einem kurzen Reinigungsverfahren, das auf die Trennung des freien Tag vom nicht eingebauten mit 3'-Tag versehenen dCTP abzielt, wie z.B. HPLC oder eine schnelle Ionenaustauschchromatographie, mit der Triphosphatverbindungen, jedoch nicht das freie Tag abgetrennt werden kann, analysiert. Das gleiche Experiment wird mit einer Kontroll-DNA gefahren, in der der CGG-Bereich durch DNA-Sequenzierung vollständig charakterisiert wurde, wobei ein Vergleich der freien Tag-Konzentration zwischen den beiden Proben die genaue Bestimmung des Werts für die CGG-Wiederholungszahl n gestattet, und zwar unter Berücksichtigung der Anzahl amplifizierter Allele, da der FMR1-Bereich auf dem X-Chromosom lokalisiert ist.
Es ist ersichtlich, daß sich diese Technik auf jede andere DNA-Sequenz, die eine Mono-, Di-, Trinukleotid-Wiederholung trägt, oder längere Sequenzen mit lediglich 3 der vier klassischen Basen A, T, G und C, wie beispielsweise den wiederholten Telomersequenzen (TTAGGG)n, bei denen n eine biologische Signifikanz aufweist, anwenden läßt. Die Zusammensetzung des Gemischs aus ddNTP, dNTP und mit 3'-Tag versehenem dNTP wird leicht an den zu untersuchenden Fall zur zweckmäßigen Bestimmung der Zahl n von Wiederholungen einer gegebenen kurzen Sequenz angepaßt.
Beispiel 3. Bestimmung der Nukleotidsequenz einer unbekannten DNA-Probe unter Verwendung eines durch die 3'-IEA der DNA-Polymerase vermittelten Tag-Ersatzschemas
Für Primer:Matrize wird der gleiche experimentelle Aufbau wie in 5 verwendet, doch besteht das Ziel des Experiments darin, die unbekannte DNA-Nukleotidsequenz der Matrize zu bestimmen. Die mit einem Primer versehenen DNA wird dabei nacheinander mit nur einem mit 3'-Tag versehenen dNTP zu einem bestimmten Zeitpunkt inkubiert, wobei der Einbau sowohl in situ (z.B. durch fluorimetrischen Nachweis, falls es sich um ein fluoreszierendes Tag handelt) als auch im Überstand überprüft wird. Dabei wird in der Tat, wenn die DNA-Polymerase ihre 3'-IEA zeigt, das angebundene Tag am 3'-Ende in den Überstand freigesetzt, während die DNA durch ein neuankommendes Nukleotid, das ein 3'-Tag aufweist, terminiert wird, womit die Fluoreszenz am 3'-Ende der DNA-Kette und im Überstand als freies Tag bestimmt werden muß. Im Grunde genommen wird ein mit 3'-Tag versehenes dNTP zu einem bestimmten Zeitpunkt auf der mit dem Primer versehenen DNA inkubiert. In 6 ist die folgende Reihenfolge gegeben: A, T, C, G, jeweils ein 3'-Tag tragend. Somit wird mit 3'-Tag versehenes dATP zuerst zugegeben, wobei die Fluoreszenz in situ und im Überstand überprüft wird. Beide verbleiben negativ, da ein A in der Matrize unmittelbar neben dem Primer angetroffen wird. Anschließend wird mit 3'-Tag versehenes dTTP verwendet, wobei durch fluorimetrischen Nachweis lediglich in situ dessen Einbau festgestellt wird. Ein positives Fluoreszenzsignal in situ zeigt lediglich an, daß keine 3'-IEA exprimiert wurde und daß somit lediglich ein T eingebaut wurde. Nachdem irgendein positives Signal (in situ oder im Überstand) festgestellt wurde, wird die Reihenfolge der mit 3'-Tag versehenen Nukleotide A, T, C und G wiederverwendet und somit der Ansatz mit mit 3'-Tag versehenem dATP als Sonde versetzt, wobei sich in unserem Beispiel ein positives Ergebnis ergibt, da es sich bei der nächsten Base um T handelt. Eine Fluoreszenz wird sowohl in situ als auch im Überstand nachgewiesen, was auf eine Expression der 3'-IEA hindeutet. In diesem Fall ist es wichtig, zu wissen, wie viele As in einer Reihe inseriert wurden. Dies läßt sich leicht dadurch erreichen, indem zu dem Überstand ein interner fluorimetrischer Standard, das heißt eine bekannte Menge an freiem Tag zugegeben wird, um genau abzuschätzen, wie viele Tags pro Matrize durch die 3'-IEA freigesetzt wurden, in diesem Fall nur eines.
Dies wird für die nächste eingebaute Base veranschaulicht, wobei vier mit 3'-Tag versehene dCTP in einer Reihe zugegeben werden, was zur Freisetzung von vier freien Tags pro Matrize führt. Diese werden durch Zugabe eines internen Standards im Überstand getestet und anschließend fluorimetrisch quantifiziert. Obwohl das Verfahren leicht von Hand durchgeführt werden kann, ist ersichtlich, daß ein mit einem Rechner gekoppeltes Fluoreszenznachweissystem eine Roboter-Arbeitsstation steuern kann, die die Sequenzdaten in Echtzeit editiert ebenso wie ableitet, welche Base gemäß dem Vorhandensein oder der Abwesenheit des Tags am 3'-Ende der DNA bzw. als freies Tag im Überstand hinzugefügt wird. Diese geordneten und logischen Schritte werden für jede Base der Matrize wiederholt, bis eine vollständige DNA-Sequenz bestimmt ist.
Literatur

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Figurbeschreibungen
1 Strukturen mehrerer 3'-modifizierter 2'-Desoxinukleotid-5'-triphosphat-Substrate. Diese Verbindungen wurden von Canard und Sarfati, Gene 148 (1994), 1–16 synthetisiert und sind als Substrate für mehrere DNA-Polymerasen geeignet.
2 Endmarkierte Primerverlängerung und Geltest unter Verwendung von 3'-ant-dNTPs und DNA-Polymerasen. 3'-ant-dNTPs waren wie in Gene 148 (1994), 1–16 von Canard und Sarfati beschrieben. a, 3'-veresterte dNTPs (400 μM) wurden mit Primer/Matrize und Sequinase 0, 1, 2, 3, 4, 5 min (Spuren 0, 1, 2, 3, 4, 5) inkubiert. b, die gleichen Primer/Matrize und 3'-veresterten Nukleotide (2 mM) wurden mit Taq-DNA-Polymerase 0, 5, 10, 15 min (Spuren 0, 6, 7, 8) verwendet. P: Primer (21-mer). Die Proben wurden über ein 15% denaturierendes Polyacralamidgel gefahren, das autoradiographiert wurde.
3 Tafel a) zeigt, wie eine DNA-Polymerase (5 Einheiten) sowie vier mit 3'-Tag versehene Nukleotid-5'-triphosphate (1 mM) in einem nicht auf einem Gel beruhenden Sequenzierschema zur Bestimmung des Nukleotids eines unbekannten DNA-Strangs (2 Picomol), der auf einem festen Träger (Dynabead M-280, Dynal) immobilisiert ist, verwendet werden.
Tafel b) zeigt, wie sich dieses Sequenzierschema auf eine sehr große Anzahl an auf einem festen Träger (S. Fodor, Science 264 (1994), 1400) immobilisierter DNA-Proben anpassen läßt sowie die mit einem Bildanalysesystem (CCD-Kamera) aufgezeichneten Einbauergebnisse.
4 Tafel a) zeigt, daß Taq-Polymerase in der Lage ist, was in 3 dargestellt ist durchzuführen, jedoch unter klassischen Reaktionsbedingungen (72°C, pH 8,3, 1–5 mM Mg²⁺), um 3'-IEA der Taq-Polymerase vollständig zu hemmen (30°–40°C, pH 7,5, 1 mM Mn²⁺, 5 mM Citrat, jeweils 1 mM mit 3'-Tag versehener Nukleotide).
Tafel b) veranschaulicht einen Weg zum Testen der Konzentration des doppelsträngigen Produkts nach Beendigung der PCR. Ein Gemisch aus drei dNTPs und einem mit 3'-Tag versehenen dNTP wird zu der PCR gegeben und lediglich ein PCR-Cyclus bei der für die optimale Aktivität der DNA-Polymerase entsprechenden Temperatur durchgeführt.
5 Den Triplet-Wiederholungsbereich flankierende Primer werden zur Herstellung eines PCR-Produkts verwendet, das unter Verwendung von Standardverfahren, wie beispielsweise dem Biotin-Streptavidin-System und magnetischen Kügelchen (z.B. von Dynal) auf einem festen Träger immobilisiert werden kann.
6 Bestimmung der Nukleotidsequenz einer unbekannten DNA-Probe unter Verwendung eines von der 3'-IEA der DNA-Polymerase vermittelten Tag-Ersatzschemas. Die mit dem Primer versehene DNA wird nacheinander mit lediglich einem mit 3'-Tag versehenen dNTP zu einem bestimmten Zeitpunkt inkubiert, wobei der Einbau sowohl in situ (z.B. durch fluorimetrischen Nachweis, falls es sich um ein fluoreszierendes Tag handelt) als auch im Überstand überprüft wird (siehe Beispiel 3).

Claims

Verfahren zur Abspaltung der Gruppe Y von einem Oligo- oder Polyribo- oder -desoxyribonukleotid der Formel (I):
wobei X für eine bifunktionelle Verknüpfungsgruppe und Y für einen eine aktivierte Gruppe bereitstellenden Rest und B für ein Purin, Pyrimidin, Deazapurin oder deren Analoge steht, in Gegenwart einer DNA-Polymerase, eines Ribo- oder eines Desoxyribonukleotid-5'-triphosphats oder eines Derivats davon sowie einer Matrize und eines Deaktivierungsmittels, wodurch die Gruppe Y durch die DNA-Polymerase während der Addition des nächsten Nukleotids abgespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei X für Sauerstoff, Schwefel, -NH und Y für
steht, wobei R für ein Hapten, einen Chromophor oder eine gegebenenfalls verzweigte Alkylgruppe mit einem oder mehreren Atomen steht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R für einen Fluoreszenzchromophor steht und die Alkylgruppe aus 1 bis 20 Atomen besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, wobei es sich bei der Polymerase um eine matrizenabhängige DNA-Polymerase handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei eine Polymerase ohne signifikante 3'-5'-Exonukleaseaktivität verwendet wird und es sich bei der Matrize um eine Desoxynukleotidsequenz handelt, die ein Hybrid mit der Oligonukleotidverbindung der Formel (I) bilden kann.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, wobei eine gentechnisch oder chemisch hergestellte 3'-5'-exominus-T7-Polymerase, Taq-Polymerase bzw. reverse Transkriptase des HIV verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ribo- oder ein Desoxyribonukleotid-5'-triphosphat oder ein Derivat davon zum Nukleotid im Matrizenstrang hinter dem 3'-Ende der Oligonukleotidverbindung der Formel (I) komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Matrize und ein Deaktivierungsmittel vorhanden sind und es sich bei dem Deaktivierungsmittel um ein physikalisches, chemisches oder enzymatisches Mittel handelt, durch das die Spaltung der X-Y-Verknüpfung in signifikanter Weise gehemmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1–8, wobei eine DNA-Polymerase mit 3'-intrinsischer Editieraktivität verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1–9, bei dem man ein oder mehrere Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) oder ein Derivat davon in DNA einbaut und gegebenenfalls die Konzentration oder Sequenz der DNA bestimmt, wobei neben einer DNA-Polymerase mit 3'-intrinsischer Editieraktivität entsprechende Primer, eine DNA-Matrize und ein geeigneter Puffer verwendet werden.
Verfahren nach Ansprüchen 1–9 zur Verwendung in einem nicht auf einem Gel beruhenden Nukleotidsequenzierverfahren.
Verfahren nach Ansprüchen 1–9 zur Verwendung beim Zählen der Anzahl an Nukleotidwiederholungen in einer gegebenen DNA-Sequenz.