JPH09508282A - 短いオリゴヌクレオチドの配列決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法を開示する。この方法において、配列決定すべき標的オリゴヌクレオチドおよび補助オリゴヌクレオチドを含む一本鎖ライゲーション生成物を調製する。該補助オリゴヌクレオチドの一部に相補的で標識が共有結合したプライマーを、該ライゲーション生成物の補助オリゴヌクレオチド部分にアニールする。このプライマーをポリメラーゼの存在下、鎖伸長ヌクレオシド三リン酸および鎖停止ヌクレオシド三リン酸を用いて伸長させて複数のプライマー伸長生成物を得る。ついで、これら伸長生成物をその塩基長に基づいて分離する。ついで、その分離の間に得られたプライマー伸長生成物の移動度から標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する。

Description

【発明の詳細な説明】 短いオリゴヌクレオチドの配列決定法発明の技術分野 本発明は、オリゴヌクレオチドの特徴付けに関し、さらに詳しくは、オリゴヌ クレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体のヌクレオチド配列の決定法に関す る。発明の背景 ヌクレオチド配列の決定は、未知のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド類似体の短い鎖の分析において、およびアンチセンス薬剤として使用するオ リゴヌクレオチドの特異的な配列を確認するうえで重要なステップである。現在 、ほとんどの配列決定プロトコールは、マクサム(Ｍaxam)らの化学分解法(Ｐroc .Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)(１９７７)７４：５６０)またはサンガー(Ｓanger) らのチェインターミネーション法(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)(１９７７) ７４：５４６３)を使用している。これらの方法において、４つの別々の反応を 行い、アデノシン、シトシン、グアノシン、またはチミジン残基で終わる単一の ヌクレオチドのみで長さが異なるフラグメントを得る。 これら配列決定生成物は、一般に、変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動 (ＰＡＧＥ)により分離する。オリゴヌクレオチド配列決定生成物を分離するため 、高性能キャピラリー電気泳動(ＨＰＣＥ)も用いられており(コーエン(Ｃohen) ら(１９８８)Ｊ.Ｃhromatogr.４５８：３２３；コーエンら(１９８８)Ｐroc.Ｎa tl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)８５：９６６０；ガットマン(Ｇuttman)ら(１９９０)Ａ nal.Ｃhem.６２：１３７；コーエンら(１９９０)Ｊ.Ｃhromatogr.５１６：４９ ；コーエンら、Ａnal.Ｃhem.(印刷中))、質量分析と容易にカップリングするこ とができる(スミス(Ｓmith)ら(１９８８)Ａnal.Ｃhem.６０：１９４８；リー(Ｌ ee)ら(１９８８)Ｊ.Ｃhromatogr.４５７：３１３)。しかしながら、生成物を可 視化する方法は、伝統的に³²Ｐまたは³⁵Ｓをオリゴヌクレオチド鎖中に導入する オートラジオグラフィーであった。 最近、種々のサンガー法に関連するプロトコールにレーザー誘導蛍光(laser− induced fluorescence)(ＬＩＦ)が検出モードとして用いられている。基本的な 方法において、４つの独特の蛍光標識をプライマーか(スミスら(１９８６)Ｎatu re３２１：６７４)または停止した各ジデオキシヌクレオチド(プロバー(Ｐrober )ら(１９８７)Ｓcience ２３８：３３６)のいずれかに結合させる。他のサンガ ー法に関連するプロトコールにおいて、４つの異なるピーク高による単一染料− ベースの塩基のコーディング(single−dye−based coding of bases with four different peak heights)(テーバー(Ｔabor)ら(１９９０)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６ ５：８３２２〜８３２６；オーソージュ(Ａusorge)ら(１９９０)Ｎucleic Ａcid s Ｒes.１８：３４１９〜３４２０；ペントニー(Ｐentoney)ら(１９９２)Ｅlect rophoresis１３：４６１〜４７４；フアン(Ｈuang)ら(１９９２)Ａnal.Ｃhem.６ ４：２１４９〜２１５４)並びにピーク高の比による単一染料−ベースの塩基の コーディングに加えてギャップによりコードされた一つの塩基(オーソージュら( １９９０)Ｎucleic Ａcids Ｒes.１８：３４１９〜３４２０；ペントニーら(１ ９９２)Ｅlectrophoresis１３：４６１〜４７４)、および３つの塩基の２つの染 料による二重コーディングで一つの塩基をギャップまたは２つの光学チャネルに よりコードされるもの(カーソン(Ｃarson)ら、Ａnal.Ｃhem.(印刷中))が用いら れている。 残念ながら、アンチセンス化学療法に有用なものなどの多くのオリゴヌクレオ チドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、従来の配列決定法で配列決定するには 短すぎる。たとえば、サンガー法を用いて短い(たとえば１５〜１７塩基の長さ) 一本鎖ＤＮＡの配列を決定しようとすると、その３'端の塩基配列は失われてし まう。かかる情報の欠失はプライマーのサイズに依存し、通常１５〜１７塩基で ある。すなわち、配列情報はプライマーの直後からのみ得られるであろう。 にもかかわらず、有効性のためには正確な配列が必要であり、合成オリゴヌク レオチドが所望のヌクレオチド配列を有することを確実にするためには品質制御 手順が必要である。現在のところ、かかるオリゴヌクレオチドの配列は段階的な 合成自体に基づいて正しいと推定されている。というのは、その配列分析に利用 できる便利な方法が存在しないからである。 短いＤＮＡ類似体の酵素的な配列決定法が文献に記載されている(ノルトホフ ト(Ｎordhoft)ら(１９９２)Ｒapid Ｃomm.Ｍass.Ｓpectrom.６：７７１;ウー(Ｗ u)ら(１９９３)Ｒapid Ｃomm.Ｍass.Ｓpectrom.７：１４２；およびライル(Rile )ら(１９９３)Ｒapid Ｃomm.Ｍass.Ｓpectrom.７：１９５)。この方法は、エキ ソヌクレアーゼおよび基質としてホスホジエステル結合したＤＮＡを用いるもの であり、検出にはＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いる。現在のプロトコールは１５分毎に アリコートを取り、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより直接分析するので比較的遅い(テー バーら(１９９０)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６５：８３２２〜８３２６)。加えて、ＤＮ Ａ類似体をこれら条件下で配列決定する場合にはエキソヌクレアーゼ消化は非常 に問題があり、場合によっては不可能である。 さらに、オリゴヌクレオチド中にホスホロチオエートやアルキルホスホネート などの非ホスホジエステル結合を含む修飾が存在することによって複雑さのレベ ルが増大する。かかるオリゴヌクレオチド類似体を分析するための以前の方法は 商業的に応用するには面倒なものであった。たとえば、アグラワル(Ａgrawal)ら は(Ｊ.Ｃhromatogr.(１９９０)５０９：３９６〜３９９)、ホスホロチオエート 結合をホスホジエステルに変換した後にヘビ毒ホスホジエステラーゼで消化し、 ホスファターゼ処理し、ついで逆相ＨＰＬＣで塩基組成を分析することを含むオ リゴヌクレオチドのホスホロチオエートの分析を開示している。 それゆえ、短いオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の配列を 、まさにその最初の塩基から最後の塩基に至るまで決定するための一層簡単かつ 信頼性のある方法に対する必要性が存在する。発明の要約 本発明は、短いオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体のヌクレ オチド配列を決定するための効率的かつ信頼性のある方法を提供する。一般に、 ヌクレオチド配列を決定するための従来法は多くのオリゴヌクレオチドおよび合 成オリゴヌクレオチドに使用するのは困難である。なぜなら、かかるヌクレオチ ド分子は有効な鋳型として機能するには短すぎるからである。本発明による方法 は、有効な鋳型として機能するに充分な長さの配列決定すべき標的オリゴヌクレ オチドを含む配列決定長の(sequencing−length)オリゴヌクレオチドを提供する ことにより、この問題を解決するものである。 本発明の方法により配列決定することのできる標的オリゴヌクレオチドは、リ ボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドの類似体、デオ キシリボヌクレオチドの類似体、およびこれらの組み合わせからなる。それゆえ 、幾つかの態様において、標的オリゴヌクレオチドは合成のまたは修飾されたオ リゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である。 本明細書において「オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも一つの５'→３'イン ターヌクレオチド結合によって共有結合により連結した２またはそれ以上のリボ ヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドモノマーからなるポリマ ーを含む。 本明細書において「修飾されたオリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチ ド類似体」とは、少なくとも一つの合成結合によって共有結合により連結された リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの分子を包含する。「合成イ ンターヌクレオチド結合」とは、一つのヌクレオチドの５'端と他のヌクレオチド の３'端との間のホスホジエステル以外の結合であって、５'インターヌクレオチ ドリン酸が幾つかの数の化学基で置換されているものをいう。代表的な合成結合 としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオ エート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、 リン酸トリエステル、アセトアミデート、およびカルボキシメチルエステルが挙 げられる。 「オリゴヌクレオチド類似体」なる語はまた、修飾された塩基および／または糖 を有するオリゴヌクレオチドをも包含する。たとえば、３',５'−置換されたオ リゴヌクレオチドは、３'位および５'位の両方でヒドロキシル基以外の化学基( その３'位にて)およびリン酸基以外の化学基(その５'位にて)に結合した糖を有 する修飾されたオリゴヌクレオチドである。修飾されたオリゴヌクレオチドはま た、キャッピングされた種であってよい。これら語はまた、ヌクレオチド当たり 一つ の非架橋酸素に置換を有する酸化されていないオリゴヌクレオチトまたはオリゴ マーも包含する。 オリゴヌクレオチド類似体はまた、合成オリゴヌクレオチドをも包含する。「 合成オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成するのに都合のよい数だけの(すなわ ち、約８０〜１００までの)ヌクレオチドを有する３'→５'結合したリボヌクレ オシド、２'−修飾されたリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレ オシドのポリマーを包含する。また、３'および／または５'端にヌクレアーゼ耐 性を付与するかさばった置換基を有するか、天然のＤＮＡには認められないイン ターヌクレオチド結合、すなわちホスホジエステル結合以外の結合によって連結 された複数のリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシド、また はヒトの介入なしにはインビボで認められない他の種々の構造的修飾において修 飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドも包含される。 本発明の方法において、それぞれ３'端および５'端を有する配列決定すべき標 的オリゴヌクレオチドおよび補助(auxiliary)オリゴヌクレオチドを含む一本鎖 ライゲーション生成物を調製する。補助オリゴヌクレオチドは、使用すべきプラ イマーの配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。本発明の一つの態様におい て、補助オリゴヌクレオチドはまた、その５'端に少なくとも４つの隣接(contig uous)ヌクレオチドのシグナル(signalling)配列を有し、このものがライゲーシ ョン生成物において標的オリゴヌクレオチドの３'端に連結する。幾つかの態様 において、補助オリゴヌクレオチドは長さが少なくとも８つのヌクレオチドであ る。 本発明は、標的オリゴヌクレオチドの配列がどの程度知られているかに一部依 存して一本鎖のライゲーション生成物を調製する幾つかの好ましい方法を提供す る。少なくとも最後の３つのヌクレオチド、好ましくは６つのヌクレオチドが知 られているなら、架橋(bridge)オリゴヌクレオチドを調製する。架橋オリゴヌク レオチドは、これら知られたヌクレオチドに相補的な配列をその５'端に有し、 補助ヌクレオチドの最初の少なくとも４つの５'ヌクレオチドに相補的なヌクレ オチド配列をさらに含む。この架橋は、標的オリゴヌクレオチドの３'端と補助 ヌクレオチドの５'端とにアニールして二本鎖構築物を生成させるのに用いる。 ついで、標的オリゴヌクレオチドをリガーゼで補助オリゴヌクレオチドにライゲ ートすることができる。 架橋はまた、標的オリゴヌクレオチドの配列が全くわからない他の態様におい ても用いることができる。この方法では、１６の架橋オリゴヌクレオチドのセッ トを調製する。各架橋オリゴヌクレオチドは、その３'端が補助オリゴヌクレオ チドの５'端の６つのヌクレオチドに相補的な約６つのヌクレオチドを有する点 で一部同一である。これら架橋オリゴヌクレオチドは、その５'端に独特のジヌ クレオチド配列(すなわち、４ヌクレオチドの１６の可能な組み合わせの一つ)を 有する点で異なっており、これらのうちの一つが標的オリゴヌクレオチドの最後 の２つの未知の３'ヌクレオチドに相補的であろう。補助オリゴヌクレオチドお よび標的オリゴヌクレオチドにアニールする一つの架橋オリゴヌクレオチドが、 上記第一の架橋態様と同じように機能する。 他の好ましい態様において、配列が全く知られていない標的オリゴヌクレオチ ドを含むライゲーション生成物を調製するのに使用する方法は以下の通りである 。上記と同様に３'配列が使用すべきプライマーの配列に相補的な補助オリゴヌ クレオチドを調製する。この配列の５'端を、少なくとも４つの知られた隣接ヌ クレオチドのシグナル配列に連結させる。ある場合には(ＲＮＡリガーゼを用い る場合)補助オリゴヌクレオチドの３'ヌクレオチドを保護する。この補助オリゴ ヌクレオチドの５'端を標的分子の３'端に直接ライゲートする。本発明の好まし い態様において、ライゲーションはＴ₄ＲＮＡリガーゼなどの平滑末端リガーゼ を用いて行う。 いずれの場合も、このライゲーション生成物にプライマーをアニールさせるが 、該プライマーは該補助オリゴヌクレオチドの一部に相補的なヌクレオチド配列 を有する。本発明の幾つかの側面において、プライマーは、ライゲーション生成 物の補助オリゴヌクレオチド部分の少なくとも４つ、好ましくは少なくとも８つ のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む。このプライマーにはまた、 標識が共有結合している。この標識は、蛍光、化学ルミネセンス、または放射性 標識であるのが好ましい。最も好ましくは、この標識は、ＵＶまたは可視範囲で 励 起することができ、可視範囲で蛍光を発する蛍光標識である。 ついで、ポリメラーゼの存在下で鎖伸長ヌクレオシド三リン酸および鎖停止ヌ クレオシド三リン酸を用いてプライマーを伸長させ、長さの異なる複数のプライ マー伸長生成物を得る。ついで、これら生成物を相対的な移動度に基づいて分離 し、それから標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を得ることができる。 本発明の好ましい態様において、分離はスラブゲルまたは高性能キャピラリーゲ ル電気泳動により行う。使用したプライマー標識に依存して、レーザー誘導蛍光 、ＵＶ吸収、または放射能を測定して、プライマー伸長生成物の相対的な移動度 を決定する。図面の簡単な説明 本発明の上記および他の目的、その種々の特徴、並びに本発明それ自体は、下 記記載を添付の図面と併せて読んだときにより一層完全に理解されるであろう。 図１Ａは、本発明の一つの態様の模式図であって、配列が部分的に知られてい る標的オリゴヌクレオチドから一本鎖ライゲーション生成物を調製するものであ る。 図１Ｂは、本発明の他の態様を示す模式図であって、配列が知られていない標 的オリゴヌクレオチドから架橋オリゴヌクレオチドの助けをかりて一本鎖ライゲ ーション生成物を調製するものである。 図１Ｃは、本発明のさらに他の態様を示す模式図であって、配列が知られてい ない標的オリゴヌクレオチドから架橋オリゴヌクレオチドの助けをかりないで一 本鎖ライゲーション生成物を調製するものである。 図２Ａは、ＡＴＰ、１２ｍｅｒの架橋オリゴヌクレオチド、２５ｍｅｒの標的 オリゴヌクレオチド(配列は部分的に知られている)、および３１ｍｅｒの補助オ リゴヌクレオチドを含む反応混合物のＵＶエレクトロフェログラム(electropher ogram)である。 図２Ｂは、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼでライゲーション後の図２Ａに記載の反応混合 物のＵＶエレクトロフェログラムであり、図２Ａの化学種並びに５７ｍｅｒのラ イゲーション生成物を示す。 図３Ａは、ＡＴＰ、標的オリゴヌクレオチド、および保護されていない３'ヒ ドロキシル基を有する３１ｍｅｒの補助オリゴヌクレオチドを含むＴ₄ＲＮＡリ カーゼ反応混合物の成分のＨＰＣＥ分離のＵＶエレクトロフェログラムである。 図３Ｂは、３'アミノ保護末端を有する３１ｍｅｒの補助オリゴヌクレオチド を用い、５７ｍｅｒのライゲーション生成物が得られる他は、図３Ａと同様のＴ₄ ＲＮＡリガーゼ反応混合物の成分のＨＰＣＥ分離のＵＶエレクトロフェログラ ムである。 図４Ａは、ｄｄＡで停止するシークエンシング反応を用いて５７ｍｅｒのライ ゲーション生成物から調製し(かつ該生成物に相補的であり)、図２Ｂと同様にし て分離したプライマー伸長生成物のＨＰＣＥ分離のＬＩＦエレクトロフェログラ ムである。 図４Ｂは、ｄｄＧで停止するシークエンシング反応を用いて５７ｍｅｒのライ ゲーション生成物から調製した(かつ該生成物に相補的であり)プライマー伸長生 成物のＨＰＣＥ分離のＬＩＦエレクトロフェログラムである。 図４Ｃは、ｄｄＴで停止するシークエンシング反応を用いて５７ｍｅｒのライ ゲーション生成物から調製した(かつ該生成物に相補的であり)プライマー伸長生 成物のＨＰＣＥ分離のＬＩＦエレクトロフェログラムである。 図４Ｄは、ｄｄＣで停止するシークエンシング反応を用いて５７ｍｅｒのＴ₄ ＤＮＡリガーゼライゲーション生成物から調製した(かつ該生成物に相補的であ り)プライマー伸長生成物のＨＰＣＥ分離のＬＩＦエレクトロフェログラムであ る。 図５Ａは、２点再サイズアラインメント(re−size alignment)を用いた図４Ａ 〜４ＣのＬＩＦエレクトロフェログラムのコンピューターオーバーレイである。 図５Ｂは、２点再サイズアラインメントを用いた図４Ａ〜４ＤのＬＩＦエレク トロフェログラムのコンピューターオーバーレイである。 図６は、図５Ａおよび５Ｂに示すデータについての相対的なフラグメントの移 動度と塩基数とのプロットであり、Ｒ²＝０．９９９の一次関係を示す。好ましい態様の簡単な記載 本明細書中に引用する特許および科学文献は、当業者に利用できる知見を確立 する。本明細書中に記載する発行された米国特許および許された出願は、参照の ため引用する。 本発明は、長さの短さや非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合および ／または他の修飾を有するオリゴヌクレオチド類似体であるかもしれないという 事実にもかかわらず、全く最初の５'ヌクレオチドから全く最後の３'ヌクレオチ ドに至るまで標的オリゴヌクレオチドの配列を決定する新規な配列決定法を提供 する。事実、原則としていかなる標的オリゴヌクレオチドも配列決定することが できる。 たとえば、配列決定すべき標的オリゴヌクレオチドは長さが約４〜約１００ヌ クレオチドの範囲であってよく、長さが約８〜約５０ヌクレオチドのオリゴヌク レオチドが最も一般的である。さらに、標的オリゴヌクレオチドは、補助オリゴ ヌクレオチドにライゲートすることができ、ポリメラーゼによって伸長すること ができる限り、いかなる種類のインターヌクレオチド結合を有していてもよく、 異なる種類のインターヌクレオチド結合の組み合わせさえも有していてよい。た とえば、標的オリゴヌクレオチドは、１を越える非ホスホジエステル結合を有し ていてよく、すべて非ホスホジエステル結合であってよい。標的オリゴヌクレオ チド中に存在する非ホスホジエステル結合としては、少なくともホスホロチオエ ート、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキルホスホノチオエー ト、ホスホジチオエート、およびスルホン、サルフェート、ケト、リン酸エステ ル、で架橋したホスホロチオエートおよび架橋したホスホルアミデート(これら はすべて当該技術分野で知られている)が挙げられる(ホスホジエステルおよび非 ホスホジエステル結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成および特性に 関する概論についてはウールマン(Ｕhlmann)ら(１９９０)Ｃhem.Ｒev.９０：５ ４３〜５８４参照)。 本発明の方法には「補助オリゴヌクレオチド」の調製が必要であるが、これは配 列決定すべき標的オリゴヌクレオチドの３'端へライゲーションすることによっ て一本鎖ライゲーション生成物を生成するのに用いる。補助オリゴヌクレオチド は、プライマーに相補的な知られた配列を有する一本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡまたは ＲＮＡ／ＤＮＡを含有する分子である。補助オリゴヌクレオチドはまた、その５ '端にマーカーまたは「シグナル配列」として機能する少なくとも４つの前以て選 択した隣接ヌクレオチドの領域をも含んでいてよい。 この補助オリゴヌクレオチドを標的分子にライゲートさせて一本鎖ライゲーシ ョン生成物を生成させるが、その際、配列決定すべき標的オリゴヌクレオチドの 第１番目の塩基が補助ＤＮＡの直後にくる。 本発明は、標的オリゴヌクレオチドの配列がどの程度知られているかに依存し てライゲーション生成物を調製するための幾つかのプロトコールを提供する。標 的オリゴヌクレオチドの３'端の最後の少なくとも３つ、好ましくは６つのヌク レオチドが知られているなら、標的オリゴヌクレオチドを支持しライゲーション 反応を容易にする架橋オリゴヌクレオチドを構築することができる。架橋オリゴ ヌクレオチドは、ホスホジエステルおよびホスホジエステル以外のインターヌク レオチド結合により連結されたリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌ クレオチドを含む。この分子は、これら少なくとも６つのヌクレオチドに相補的 であり、補助ヌクレオチドの５'端の最初の少なくとも４つのヌクレオチドに相 補的な配列をさらに含む。架橋オリゴヌクレオチドを標的オリゴヌクレオチドと 補助オリゴヌクレオチドとにアニールさせ、架橋オリゴヌクレオチドの最初の２ つの３'ヌクレオチドが標的オリゴヌクレオチドの最後の２つの３'ヌクレオチド にアニールし、架橋オリゴヌクレオチドの５'端の方へ向かって少なくとも次の ６つのヌクレオチドが補助オリゴヌクレオチドの最初の６つの５'ヌクレオチド にアニールすることによって、部分的に二本鎖の構築物を生成するようにする。 ついで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼやＴａｑＤＮＡリガーゼなどの鋳型に依存した酵素 を用い、標的オリゴヌクレオチドの３'端を補助オリゴヌクレオチドの５'端のシ グナル配列にライゲートさせる。変性させると一本鎖ライゲーション生成物が得 られる。 このライゲーションプロトコールの例を図１Ａに模式的に示してあり、図中、 標的オリゴヌクレオチドの少なくとも３つの塩基がすでに知られている。この図 において、未知の塩基は「？」の記号で示してある。補助オリゴヌクレオチドの標 的分子へのライゲーションを容易にするために１２ｍｅｒの架橋(配列番号：２) を調製する。この架橋は６塩基の２つの領域、すなわち、補助オリゴヌクレオチ ド(配列番号：３)の最後の６つの塩基に相補的な５'端の一つの領域および標的 オリゴヌクレオチドの配列の知られた前以て決定した最初の６つの塩基に相補的 な３'端の他の領域、からなる。図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、Ｔ４ＤＮＡリ ガーゼでライゲーションする前およびライゲーションした後のキャピラリー電気 泳動とそれに続くＵＶ検出によるオリゴヌクレオチドの種々の種(標的、補助、 および架橋)の分離を示す。図２Ａにおいて検出ピークの移動順序は、(１)速く 移動する１２ｍｅｒの架橋(配列番号：２)；(２)配列決定すべき標的オリゴヌク レオチド；および(３)補助オリゴヌクレオチドである。Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよ びＡＴＰを反応混合物に加えると、３７℃で３０分間インキュベーションした後 に５７ｍｅｒのライゲーション生成物が観察される(図２Ｂ)。 標的オリゴヌクレオチドの全配列が知られていない場合には、ライゲーション 生成物の調製のための２つの方法を用いることができる。一つの方法は、上記と 同様に架橋オリゴヌクレオチドの支持を必要とする。この方法では１６の架橋オ リゴヌクレオチドのセットを調製するが、これらオリゴヌクレオチドは使用すベ き補助オリゴヌクレオチドの同じ４つ、好ましくは６〜８またはそれ以上のヌク レオチドに相補的な配列を含むので５'端は同一である。加えて、架橋オリゴヌ クレオチドはその３'端に１６の可能なジヌクレオチド：ＡＡ、ＡＣ、ＡＧ、Ａ Ｔ、ＣＡ、ＣＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＧ、ＧＴ、ＴＡ、ＴＣ、ＴＧ、Ｔ Ｔのうちの一つを含む。これらジヌクレオチドのうちの一つは、標的オリゴヌク レオチドの最も３'側の２つのヌクレオチドに相補的てあろう。それゆえ、この １６の架橋オリゴヌクレオチドのセットを未知の配列の標的オリゴヌクレオチド および上記補助オリゴヌクレオチドとアニールを可能とする条件下で混合すると 、該標的分子の最後の２つの３'ヌクレオチドに相補的なジヌクレオチドを有す る一つの架橋オリゴヌクレオチドが該標的分子および補助オリゴヌクレオチドに ハイ ブリダイズするであろう。この方法は図１Ｂに模式的に示してあり、図中、１６ の架橋オリゴヌクレオチドは配列番号：６〜２１を有し、標的オリゴヌクレオチ ド中の未知の各塩基は「？」の記号で示してある。 別法として、２つのヌクレオチドを連結させるのに二本鎖構造の存在を必要と しないＴ４ＲＮＡリガーゼなどの平滑末端リガーゼを用いることもできる。この 場合、少なくとも４つの隣接ヌクレオチドの５'シグナル配列に連結した、使用 すべきプライマーの配列に相補的な３'配列からなる補助オリゴヌクレオチドを 調製する。この補助オリゴヌクレオチドの３'端は、たとえば、ジデオキシヌク レオチド(ｄｄＡ、ｄｄＣ、ｄｄＧ、ｄｄＴ)またはアミノ基で保護する。ついで 、補助オリゴヌクレオチドの５'端を標的オリゴヌクレオチドの３'端にライゲー トすることによって一本鎖ライゲーション生成物を生成させる。 このライゲーションプロトコールの例を図１Ｃに模式的に示す。Ｔ₄ＲＮＡリ ガーゼを用い、反応混合物中に架橋を存在させることなく、未知の配列の標的オ リゴヌクレオチドを３１ｍｅｒの補助オリゴヌクレオチド(配列番号：３)にライ ゲートさせる。図３Ａおよび３Ｂに示すＵＶエレクトロフェログラムは、５７ｍ ｅｒのライゲーション生成物の合成を示している。３'端を保護していない補助 オリゴヌクレオチドを用いると、酵素はライゲーション過程を環形成に導き、幾 つかの環が観察される(図３Ａ)。この望ましくない現象は、図３Ｂに示すように (一つのライゲーション環しか得られていない)、単に３'端をジデオキシまたは アミノ基で保護した補助オリゴヌクレオチドを用いることにより防ぐことができ る。Ｔ４ＲＮＡリガーゼの場合のように、ＡＴＰ２５ｍｅｒ類似体、補助３１ｍ ｅｒ、および５７ｍｅｒのライゲーション生成物が観察される。 標的分子を含む一本鎖ライゲーション生成物が生成されたら、プライマーをラ イゲーション生成物にアニールさせ、これから該標的分子に相補的な鎖をポリメ ラーゼにより伸長させることができる(すなわち、プライマー伸長生成物)。この プライマーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定またはプライマ 一伸長反応に一般的に用いられよく知られた通常のタイプのＲＮＡおよび／また はＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。プライマーオリゴヌ クレオチドは、シグナル領域を含まないライゲーション生成物の補助オリゴヌク レオチト領域の３'部分に相補的な配列を有する。 ルミネセンス、放射性、または蛍光標識などの標識の少なくとも一つの分子を プライマーに結合する。標識が蛍光である場合は、ＵＶまたは可視波長範囲で励 起することができ、可視範囲で蛍光を発する。かかる標識としては、フルオレセ イン、またはそのＮ−スクシンイミドエステルまたは他の誘導体、たとえば、い わゆる「ＪＯＥ」(アプライド・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosystems)、フォ スターシティー、カリフォルニア)、「ＦＩＴＣ」(アプライド・バイオシステムズ 、フォスターシティー、カリフォルニア)および「ＦＡＭ」(アプライド・バイオシ ステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)およびローダミンまたはその 誘導体、たとえばテトラメチルローダミン(「ＴＡＭＡＲＡ」)(アプライド・バイ オシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)および「テキサスレッド( Ｔexas Ｒed)」または「ＲＯＸ」(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシテ ィー、カリフォルニア)(スミス(１９８５)Ｎucl．Ａcids Ｒes.１３：２３９９ 〜２４１２)が挙げられる。これら標識は、たとえばスミスによって記載されて いるように(Ａm.Ｂiolab.(１９８９)５月：１１〜２０)化学的ＤＮＡまたはＲＮ Ａ合成によって、またはプライマーが標的分子にハイブリダイズしたりヘルパー オリゴヌクレオチドにライゲートされたりする能力を妨害しないであろう他の方 法によって、プライマーに共有結合により結合することができる。一つのかかる 方法の例として、アミノ基を染料に共有結合により結合させ、ついで該アミノ基 をオリゴヌクレオチドの５'端に連結させることが挙げられる(スミス(１９８５) Ｎucl．Ａcid．Ｒes.１３：２３９９〜２４１２)。別法として、フラグメントを ジデオキシヌクレオチドで蛍光標識により標識することができる。 架橋オリゴヌクレオチド、補助オリゴヌクレオチドおよび標的オリゴヌクレオ チドのアニーリング、およびプライマーとライゲーション生成物とのアニーリン グは、相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドへの一本鎖種のハイブリダイゼーショ ンを最も可能とする条件下で行う。これら条件には、約４℃〜９０℃の温度、好 ましくは室温(すなわち、１９℃〜２５℃)でのライゲーション緩衝液(６００ｍ Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、６６ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＤＴＴ、６６０ μｍＡＴＰ)中での接触が含まれる。 ライゲーション生成物にプライマーをアニールさせたら、ポリメラーゼの存在 下でプライマー伸長反応を行うことができる。多くのポリメラーゼが当該技術分 野で知られており、原則としてすべて適している。通常、ＴａｑＤＮＡポリメラ ーゼやＴ４ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼが用いられるであろう 。非常によく知られているサンガーら(上掲)による配列決定法に従う場合には、 ヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドを用いてプライマー伸長物を合成す る。 最後に、ジデオキシ停止した伸長生成物を、かかる分子をサイズに基づいて分 離するためのよく知られた標準法に従って分離する。かかるプロトコールとして は、ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動または高性能キャピラリーゲル電気 泳動が挙げられる。使用したプライマー標識に依存して、レーザー誘導蛍光、Ｕ Ｖ吸収、または放射能を測定してプライマー伸長生成物の相対的な移動度を決定 する。 たとえば、Ｍ１３ｍｐ１８(−２１)プライマーの配列に相対的な３'端での１ ７塩基から補助オリゴヌクレオチドを調製する。次は１０のＴ塩基のシグナル領 域である。ついで、配列決定すべき標的オリゴヌクレオチドの第１番目の塩基が 補助オリゴヌクレオチドの５'端に直接配置される。 日常的なアンチセンス分析のための自動化一本鎖オリゴヌクレオチドシークエ ンサーを開発するに際して、上記ライゲーション生成物を含む一本鎖オリゴヌク レオチド類似体の酵素的配列決定を調べるために作業戦略を開発した。自動化デ ータ処理の本質的な要素であるシークエンシングフラグメントの電気泳動での移 動の表現を開発するため、下記戦略を用いた。 狭い範囲の分子サイズにわたり、２点の検量にどれだけの量を適用するかに２ つの内部標準を用い、相対的な移動時間(Ｔ')と塩基数との間に一次関係を確立 することができる。これら２点は、プライマー(１７ｍｅｒ)およびシークエナー ゼ２.０のエンドヌクレアーゼ活性のためにライゲーション生成物よりも１塩基 だけ長い５８ｍｅｒのフラグメントである。この一次関係は下記のように記載さ れる： (式中、「Ｔｐ」はシークエンシングフラグメントの移動時間；「Ｔｐｒ」はプライ マーの移動時間；「Ｔｆｉｎ」は最後のピークの移動時間である)。この関係はＴ' について一次であって、フラグメントのサイズにのみ依存する。 この術語を確認するため、下記実験条件下で上記式を試験した。５７ｍｅｒの ライゲーション生成物(配列番号：４)(たとえば、２５ｍｅｒの標的オリゴヌク レオチド類似体(配列番号：１)＋３２ｍｅｒの補助オリゴヌクレオチド(配列番 号：３))を４つの異なる塩基(すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ)について別々に酵素的 鎖停止反応に供した。これら４つの各反応混合物を異なる日および異なるゲルカ ラム上で別々に行った。これら４つのセットのプライマー伸長生成物の分離のＬ ＩＦエレクトロフェログラムを図４Ａ〜４Ｄに示す。１２％Ｔのアクリルアミド 、６.５Ｍの尿素、および４０％(ｗ／ｗ)のホルムアミドを含有するゲルを用い たＨＰＣＥにより伸長生成物を分離した。これら図は、Ｔ、Ｇ、ＡおよびＣ反応 についてのコンピューター２点アラインメントである。第一の点は１７ｍｅｒの プライマーであり、第二の点は５７ｍｅｒの最も遅く移動するフラグメントであ る。長さが１７塩基と５７塩基との間の検出された各フラグメントについてＴ' を別々に計算した。フラグメント３３は２５ｍｅｒの標的オリゴヌクレオチドに 対応する。ついで、図４Ａ〜４Ｄにおける４つの個々の塩基についての４つの実 験における出現に従い、得られた値を低い方から高い方に順番に再配列する。そ の結果を表１にまとめて示すが、これは図４Ａ〜４Ｄで得られたデータについて の２点再サイズアラインメントを用いて得られた相対的な移動のコンピューター 印字である。 上記に示すように、標的オリゴヌクレオチドの配列を表１の右端の欄において３ '端から５'端の方向に決定する。この配列決定フォーマットは、配列決定システ ムを自動化できデータ処理を行うことのできるコンピューターソフトウエアの結 果である。 このソフトウエアを市販のソフトウエア(たとえば、ターボクロム(Ｔurbochro me)^TMIII、ネルソン(Ｐ.Ｅ.Ｎelson)、キュパーチノ、カリフォルニア)とインタ ーフェースすると、図５Ａおよび５Ｂに示すように、配列決定の最終的なエレク トロフェログラムをプロットすることができるように得られたデータを操作する ことができる。その結果を図６に示す。図６はフラグメントの移動と塩基数との 間の一次関係を示している。 それゆえ、数学的な表現が得られ、自動化された一本鎖オリゴヌクレオチドの 配列決定に首尾よく用いることができた。この表現の強みは、「Ｔ'」が塩基数と して表されたフラグメントの長さとのみ関係することである。さらに、この表現 は、すべてのシークエンシングフラグメントが分離されるならば実験条件に依存 しない。ゲルキャピラリーは非常に高い効率および分離能でシークエンシングフ ラグメントを分離できるので、分離は問題なく行える(コーエンら(１９８８)Ｊ. Ｃhromatogr.４５８：３２３；スワードロウ(Ｓwerdlow)ら(１９９０)Ｎucl．Ａ cids Ｒes.１８：１４１５〜１４１９；ペントニーら(１９９２)Ｅlectrophores is１３：４６１〜７４；コーエンら(１９９３)ＴＲＡＣ１２：１９５〜２０２) 。 下記実施例は、本発明の好ましい製造および実施態様を示すものであるが、本 発明の範囲を限定することを意図するものではない。なぜなら他の方法を用いて も同様の結果を得ることができるからである。 実施例 １．標的オリゴヌクレオチド、補助オリゴヌクレオチド、架橋オリゴヌクレオチ ド、およびプライマーオリゴヌクレオチドの調製 ホスホジエステル結合した標的オリゴヌクレオチド、補助オリゴヌクレオチド およびプライマーオリゴヌクレオチドの合成は、オリゴ(Ｏligo)１００^TM自動Ｄ ＮＡ合成機(ベックマン(Ｂeckman)、フラートン、カリフォルニア)を用い、ホス ホルアミダイト法(マックブライド(ＭcＢride)ら(１９８３)Ｔetrahedron Ｌett .２４：２４５参照)により行った。標的オリゴヌクレオチド類似体、補助オリゴ ヌクレオチド類似体およびプライマーオリゴヌクレオチド類似体の合成は、公知 の方法(ウールマンら、Ａnalyt.Ｃhem.(１９９０)９０：５４３〜５８３)により 行い、ついで脱塩し、凍結乾燥し、配列決定プロトコールのためには緩衝液中で 、ＨＰＣＥ(リホメド・ディアフィールド(Ｌyphomed Ｄeerfield)、イリノイ)の ためには滅菌水中で再構築した。 補助オリゴヌクレオチドの調製は、Ｍ１３ｍｐ１８(−２１)プライマーの配列 に相補的な３'端の１７塩基から行う。次は１０のＴ塩基のシグナル領域である 。ついで、配列決定すべき標的オリゴヌクレオチドの第１番目の塩基が該補助オ リゴヌクレオチドの５'の直後にくる。 ６塩基の２つの領域、すなわち、補助オリゴヌクレオチドの最後の６つの塩基 に相補的な５'端の一つの領域および標的オリゴヌクレオチドの配列の前以て決 定した最初の６つの塩基に相補的な３'端の他の領域、からなる１２ｍｅｒの架 橋を調製する。 このプライマーの５'端に標識を共有結合させることにより標識する。このこ とは、自動化オリゴヌクレオチド合成機を用い、ホスホルアミダイト化学により 行う。 別法として、スミスによって記載されているように(Ａm.Ｂiolab.(１９８９) ５月：１１〜２０)、化学的ＤＮＡまたはＲＮＡ合成を用いることにより５'端に 誘導体化フルオレセイン(「ＦＡＭ」)などの蛍光標識を共有結合させることにより プライマーを標識する。 ２．知られた配列を有するオリゴヌクレオチドを含むライゲーション生成物の調 製 約６μｇの標的オリゴヌクレオチドを、３μｇの５'−リン酸化した補助ＤＮ Ａ、４μｇの架橋オリゴヌクレオチド、および５μｌの１０×ライゲーション緩 衝液(ＵＳＢ７００８７)と混合する。最終容量は約１５μｌである。この混合物 を３７℃で１５分間インキュベートし、ついで氷浴中で４℃にて２０分間冷却す る。 ついて、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ(ＵＳＢ７０００５、３００単位／μｌ) を混合物に加え、３７℃に１時間保持する。リガーゼを７０℃で５分間不活化す る。 ３．未知の配列を有するオリゴヌクレオチドを含むライゲーション生成物の調製 Ａ．架橋法 このプロトコールはテシアー(Ｔessioer)の方法(Ａnalyt.Ｂiochem.(１９８６ )１５８：１７１〜１７８)に基づく。３μｌの５×ライゲーション緩衝液(５０ ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ Ｃｏ(ＮＨ₃)６Ｃｌ₃、２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ８、５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン(ＵＳＢ１０８４８))を６μｇの標 的オリゴヌクレオチド、１μｇの補助ＤＮＡ、５μｌの５０％ポリエチレングリ コール(ＵＳＢ１９９５９)、および２μｌのＴ４−ＲＮＡリガーゼ(ＵＳＢ２１ ２４５、２０，０００μｎ／ｍｌ)と混合する。最終容量は約１５μｌである。 補助ＤＮＡを５'端でリン酸化し、補助オリゴヌクレオチドとプライマーを含む ライゲーション反応副生成物の生成を排除するために３'端からアミノ結合する 。この混合物を２５℃にて一夜インキュベートする。 Ｂ．架橋法 ベックマンオリゴ１００^TM(フラートン、カリフォルニア)を用い、１６の架橋 オリゴヌクレオチドのセットをホスホルアミダイト化合により合成する。 ついで、約６μｇの標的オリゴヌクレオチドを、３μｇの５'−リン酸化した 補助ＤＮＡ、４×１６＝３２μｇの架橋オリゴヌクレオチド、および５μｌの１ ０×ライゲーション緩衝液(ＵＳＢ７００８７)と混合する。最終容量は約１５μ ｌである。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、ついで氷浴中、４ ℃で２０分間冷却する。ついで、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ(ＵＳＢ７００ ０５、３００単位／μｌ)を混合物に加え、３７℃で１時間保持する。リガーゼ を７０℃で５分間不活化する。 ４．プライマーのアニーリング 一本鎖のライゲーション生成物(３μｌ、０.１ｐＭ／μｌ)を８μｌ、０.４ｐ Ｍ／μｌのプライマー(ＡＢＩ４０１１３１−２１Ｍ１３プライマー)および４μ ｌの５× シークエンシング緩衝液(ＵＳＢ７０７０２)と混合した。この混合物を６５℃で １０分間加熱し、３０分間かけてゆっくりと室温まで冷却してアニールさせる。 ５．チェインターミネーション法によるプライマー伸長生成物の配列決定 プライマーの伸長／停止を以下のようにして行う：テーバーおよびリチャード ソン(Ｒichardson)によって記載されているように(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.(１９９０) ２６５：８３２２〜８３２８)、１５μｌのアニール混合物を、４μｌのｄＮＴ Ｐ(各２ｍＭ)、２μｌの０.５ｍＭｄｄＡＴＰまたはｄｄＣＴＰまたはｄｄＴＮ ＰまたはｄｄＧＴＰを含有する４つの異なる混合物か、または特定の比のジデオ キシヌクレオチドｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＮＰ、およびｄｄＧＴＰ(８ ：４：２：１)を含有する単一の混合物のいずれかの存在下、５μｌのマンガン 緩衝液(ＵＳＢ７２６００)、２μｌの０.１Ｍジチオトレイトール(ＵＳＢ７０７ ２６)、２μｌのシークエナーゼバージョン２．０(ＵＳＢ７０７７５)、および １μｌのピロリン酸(ＵＳＢ７０９５０)と混合する。この混合物を３７℃で１５ 分間インキュベートし、７０％ＥｔＯＨで２回沈殿させる。 ６．ＨＰＣＥによるプライマー伸長生成物の分離 ゲル充填したキャピラリーを以下のようにして調製する。内径が７５μｍ、外 径が３７５μｍ、有効長が１０〜１５ｃｍ、全長が３０〜６０ｃｍの溶融シリカ キャピラリーチュービング(ポリミクロ・テクノロジーズ(Ｐolymicro Ｔechnolo gies)、フェニックス、アリゾナ、米国)を(メチルアクリルオキシプロピル)トリ メトキシシラン(ペトラック・システムズ(Ｐetrach Ｓystems)、ブリストル、ペ ンシルベニア、米国)で処理し、ついで水性またはホルムアミド媒体(ＴＢＥ緩衝 液：０.１Ｍ〜０.３Ｍのトリス−硼酸、２〜６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.３、７ Ｍ尿素)中の１４％Ｔ重合アクリルアミド、７Ｍ尿素の脱気溶液を充填した。重 合は、過硫酸アンモニウム溶液およびＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジ アミン(ＴＥＭＥＤ)を加えることにより行った。このプロトコールはスミスらの 方法(Ｎature(１９８６)３２１：６７４)に基づく。使用した緩衝液は０.２ＭＴ ＢＥであり、適用した電場は４００Ｖ／ｃｍであった。 オリゴヌクレオチドシークエンシングフラグメントの分離のためのＵＶおよび レーザー誘導蛍光検出を有するキャピラリー電気泳動装置はスミスらによって記 載されたものと同じである(Ｎature(１９８６)３２１：６７４)。簡単に説明す ると、３０ｋＶ、５００μＡ直流高電圧サプライ(モデルＥＲ／ＤＭ；グラスマ ン(Ｇlassman)、ホワイトハウスステーション、ニュージャージー、米国)を用い 、キャピラリーに電圧をかけた。ホスホロチオエートおよび他の類似体の２７０ ｎｍにおけるＵＶ検出は、分光光度計(スペクトラ(Ｓpectra)１１０、スペクト ラ−フィジックス(Ｓpectra−Ｐhysics)、サンホセ、カリフォルニア)を用いて 行った。レーザー誘導蛍光検出にはアルゴンイオンレーザー(モデル５４３ １０ ０ＢＳ、オムニクロム(Ｏmnichrom)、シーノ、カリフォルニア、米国)を用いた 。データは、アナログ→デジタルコンバーター(モデル９７０、ネルソン・アナ リティカル、キュパーチノ、カリフォルニア、米国)によりＡcerＰower４８６／ ３３コンピューター(エーサー・アメリカン(Ａcer Ａmerican Ｃorp.)、サンホ セ、カリフォルニア、米国)に獲得および貯蔵した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オット，クリストファー・エム アメリカ合衆国01068マサチューセッツ、 オーカム、スペンサー・ロード389番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(ａ)(ｉ)３'端および５'端を有する配列決定すべき標的オリコヌクレオチド 、および (ｉｉ)３'端および５'端および使用すべきプライマーに相補的なヌクレオチド配 列を有する補助オリゴヌクレオチド を含む一本鎖ライゲーション生成物を調製し、 (ｂ)該ライゲーション生成物の補助オリゴヌクレオチド部分にプライマーをアニ ールし、その際、該プライマーは該補助オリゴヌクレオチドの一部に相補的なヌ クレオチド配列を有し、かつ標識が共有結合しており、 (ｃ)該プライマーをポリメラーゼの存在下、鎖伸長ヌクレオシド三リン酸および 鎖停止ヌクレオシド三リン酸を用いて伸長させて複数のプライマー伸長生成物を 得、 (ｄ)得られたプライマー伸長生成物をその塩基長に基づいて分離し、ついで (ｅ)その分離の間に得られたプライマー伸長生成物の移動度から該標的オリゴヌ クレオチドのヌクレオチド配列を決定する 工程からなることを特徴とする、標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の 決定方法。 ２．標的オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド 、リボヌクレオチドの類似体、デオキシリボヌクレオチドの類似体、およびそれ らの組み合わせよりなる群から選ばれたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の 方法。 ３．標的オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、アル キルホスホノチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸 エステル、リン酸トリエステル、カルバメート、カーボネート、アセトアミデー ト、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ば れたインターヌクレオチド結合を含む、請求項１に記載の方法。 ４．調製工程(ａ)が、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボヌク レオチドの類似体、デオキシリボヌクレオチドの類似体、およびそれらの組み合 わせよりなる群から選ばれたヌクレオチドを含む補助オリゴヌクレオチドを調製 することを含む、請求項１に記載の方法。 ５．調製工程(ａ)が、少なくとも８つの隣接ヌクレオチドからなる補助オリゴヌ クレオチドを調製することを含む、請求項１に記載の方法。 ６．調製工程(ａ)が、その５'端に標的オリゴヌクレオチドの３'端に連結した、 少なくとも４つの隣接ヌクレオチドのシグナル配列をさらに含む補助オリゴヌク レオチドを調製することを含む、請求項１に記載の方法。 ７．調製工程(ａ)が、４〜２０のヌクレオチド長のシグナル配列を有する補助オ リゴヌクレオチドを調製することを含む、請求項６に記載の方法。 ８．調製工程(ａ)が、 (ｉ)少なくとも４つの隣接ヌクレオチドの５'シグナル配列に連結した、使用す べきプライマーの配列に相補的な３'配列からなる補助オリゴヌクレオチドを調 製し、その際、ヌクレオチドの３'端は保護されており、ついで (ｉｉ)該補助オリゴヌクレオチドの５'端を該標的オリゴヌクレオチドの３'端に ライゲートすることによって一本鎖ライゲーション生成物を生成させる ことを含む、請求項１に記載の方法。 ９．調製工程(ａ)が、ジデオキシまたはアミノ基で保護した３'端を含む補助オ リゴヌクレオチドを調製することを含む、請求項８に記載の方法。 １０．調製工程(ａ)が、平滑末端リガーゼを用いて補助オリゴヌクレオチドを標 的オリゴヌクレオチドにライゲートすることを含む、請求項８に記載の方法。 １１．調製工程(ａ)が、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて補助オリゴヌクレオチド を標的オリゴヌクレオチドにライゲートすることを含む、請求項１０に記載の方 法。 １２．調製工程(ａ)が、 (ｉ)使用すべきプライマーの配列に相補的な配列からなる補助オリゴヌクレオチ ドを調製し、 (ｉｉ)１６の架橋オリゴヌクレオチドのセットを調製し、その際、各架橋オリゴ ヌクレオチドは３'端および５'端を有し、それそれ、その５'端に補助オリゴヌ クレオチドの５'端の６つのヌクレオチドに相補的な同じ６つのヌクレオチドを 含み、その３'端に１６の可能な異なる配列の一つである２つのヌクレオチドを 含み、これら１６の可能な異なる配列のうちの一つが標的オリゴヌクレオチドの 最後の２つの３'ヌクレオチドに相補的であり、 (ｉｉｉ)架橋オリゴヌクレオチドの最初の２つの３'ヌクレオチドが標的オリゴ ヌクレオチドの最後の２つの３'ヌクレオチドにハイブリダイズし、架橋オリゴ ヌクレオチドの５'端にある次の６つのヌクレオチドが補助オリゴヌクレオチド の最初の６つの５'ヌクレオチドにハイブリダイズするように、該補助オリゴヌ クレオチドおよび標的オリゴヌクレオチドを該標的分子の最後の２つの３'ヌク レオチドに相補的な２つの３'ヌクレオチドを有する架橋オリゴヌクレオチドに アニールさせ、ついで (ｉｖ)該標的オリゴヌクレオチドの３'端を該補助オリゴヌクレオチドの５'端に あるシグナル配列にライゲートすることによってライゲーション生成物を生成さ せる ことを含む、請求項１に記載の方法。 １３．調製工程(ａ)が、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボヌ クレオチドの類似体、デオキシリボヌクレオチドの類似体、およびそれらの組み 合わせよりなる群から選ばれたヌクレオチドを含む架橋オリゴヌクレオチドを調 製することを含む、請求項１２に記載の方法。 １４．調製工程(ａ)が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、アルキルホス ホノチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル 、リン酸トリエステル、カルバメート、カーボネート、アセトアミデート、カル ボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたイン ターヌクレオチド結合を含む架橋オリゴヌクレオチドを調製することを含む、請 求項１２に記載の方法。 １５．調製工程(ａ)が、その３'端にＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、Ｔ Ｃ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣおよびＧＧよりなる群か ら選ばれたジヌクレオチドを含む架橋オリゴヌクレオチドを調製することを含む 、請 求項１２に記載の方法。 １６．調製工程(ａ)が、Ｔ４ＤＮＡリガーゼまたはＴａｑＤＮＡリガーゼを用い て補助オリゴヌクレオチドを標的オリゴヌクレオチドにライゲートすることを含 む、請求項５に記載の方法。 １７．アニール工程(ｂ)がプライマーをライゲーション生成物にアニールするこ とを含み、該プライマーが該ライゲーション生成物の補助オリゴヌクレオチド部 分の少なくとも４つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項 １に記載の方法。 １８．アニール工程(ｃ)がプライマーをライゲーション生成物にアニールするこ とを含み、該プライマーがリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボ ヌクレオチドの類似体、デオキシリボヌクレオチドの類似体、およびそれらの組 み合わせよりなる群から選ばれたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。 １９．アニール工程(ｃ)がプライマーをライゲーション生成物にアニールするこ とを含み、該プライマーがホスホジエステル、ホスホロチオエート、アルキルホ スホノチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステ ル、リン酸トリエステル、カルバメート、カーボネート、アセトアミデート、カ ルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたイ ンターヌクレオチド結合を含む、請求項１２に記載の方法。 ２０．アニール工程(ｃ)が、プライマーをライゲーション生成物にアニールする ことを含み、該プライマーが蛍光、化学ルミネセンス、または放射性標識よりな る群から選ばれた標識を有する、請求項１に記載の方法。 ２１．アニール工程(ｃ)が、ＵＶまたは可視範囲で励起することができ、可視範 囲で蛍光を発する蛍光標識を有するプライマーをアニールすることを含む、請求 項２０に記載の方法。 ２２．伸長工程(ｃ)が、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、およびＴ ａｑ ＤＮＡリガーゼよりなる群から選ばれたポリメラーゼを用いてプライマー を伸長することを含む、請求項１に記載の方法。 ２３．伸長工程(ｃ)が、ジデオキシアデニン、ジデオキシグアニジン、ジデオキ シチミジン、およびジデオキシシトシンよりなる群から選ばれた鎖停止ヌクレオ チド三リン酸を用いてプライマーを伸長することを含む、請求項１に記載の方法 。 ２４．分離工程(ｄ)が、スラブゲル電気泳動または高性能キャピラリーゲル電気 泳動によりプライマー伸長生成物を分離することを含む、請求項１に記載の方法 。 ２５．決定工程(ｅ)が、レーザー誘導蛍光、ＵＶ吸収、または放射性検出を用い てプライマー伸長生成物の相対的移動度を測定することを含む、請求項１に記載 の方法。