DE69301570T2 - Verfahren für die sequenzierung von synthetischen oligonukleotiden, welche internukleotid-bindungen enthalten, die nicht vom phosphodiester-typ sind - Google Patents

Verfahren für die sequenzierung von synthetischen oligonukleotiden, welche internukleotid-bindungen enthalten, die nicht vom phosphodiester-typ sind

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Description

  • Die Erfindung betrifft synthetische Oligonucleotide, die für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich sind, einschließlich der Verwendung als chemotherapeutische Antisense-Agenzien. Insbesondere betrifft die Erfindung die Bestimmung der Nucleotidsequenz von Oligonucleotiden mit Nicht- Phospodiesterinternucleotidbindungen an einer oder mehreren Positionen in diesen Oligonucleotiden.
  • Synthetische Oligonucleotide sind für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich. Die Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden zur Hemmung spezifischer Genfunktionen ist gegenwartig interessant. Zu diesem Zweck nützliche Oligonucleotide sind gewöhnlich zu einem kodierenden oder "Sinn"-Strang der RNA komplementär und werden deshalb als Antisense-Oligonucleotide bezeichnet. Antisense-Oligonucleotide, die eine Vielzahl von Genfunktionen hemmen, sind bekannt.
  • Zamecnik und Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75:280-284 haben als erste über die Hemmung der Replikation eines Virus, nämlich des Rous- Sarkom-Virus, in Zellkultur berichtet.
  • Die Hemmung in Zellkultur von HTLV-III (jetzige Bezeichnung HIV-1), das mit AIDS assoziiert ist, zeigten Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83:4143-4146.
  • Synthetische Antisense-Oligonucleotide mit einer oder mehreren Nicht- Phosphodiesterinternucleotidbindungen sind von besonderem Interesse. Solche Oligonucleotide sind aufgrund ihrer relativen Widerstandsfähigkeit gegenüber nucleolytischem Abbau, verglichen mit Oligonucleotiden ausschließlich mit internucleotidischen Phosphodiesterbindungen, für chemotherapeutische Antisense- Behandlungen interessant. Viele solcher modifizierten internucleotidischen Bindungen sind beschrieben.
  • Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:7079-7083 zeigten in Zellkultur Hemmung von HIV-1 mit ansteigender Effizienz mittels Phosphoramidat- und Phosphorthioat-Oligonucleotiden.
  • Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:7448-7451 zeigten in Zellkultur Hemmung von HIV-1 mit ansteigender Effizienz mittels Methylphosphonat-Oligonucleotiden.
  • Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:7790-7794 zeigten nucleotidsequenzspezifische Hemmung von HIV-1 sowohl in früh infizierten als auch chronisch infizierten Zellkulturen mittels Phosphorthioat-Oligonucleotiden.
  • Leiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3430-3434 zeigten Hemmung der Influenza-Virus-Replikation in Zellkultur mittels Phosphorthioat- Oligonucleotiden.
  • Oligonucleotide für die sche Antisense-Chemotherapie sind so kurz, daß sie nach üblichen Sequenzierverfahren nicht sequenziert werden können. Korrekte Sequenzen sind jedoch für die Effizienz und Qualitätskontrollen zur Überprüfung der gewünschten Nucleotidsequenz der synthetischen Oligonucleotide notwendig. Zur Zeit wird oft angenommen, basierend auf der Schritt-für-Schritt-Synthese, daß die Sequenz solcher Oligonucleotide korrekt ist, da kein zweckmäßiges Verfahren zu ihrer Sequenzanalyse zur Verfügung steht. Das trifft insbesondere auf Oligonucleotide mit Nicht-Phosphodiesterinternucleotidbindungen zu.
  • Frühere Verfahren zur Analyse von Oligonucleotiden waren für kommerzielle Anwendungen zu aufwendig. Agrawal et al., J. Chromatography, 1990, 509:396-399 beschrieben eine Analyse von Phosphorthioat-Oligonucleotiden, die die Umwandlung von Phosphorthioat- in Phosphodiester-Bindungen, gefolgt von einem Abbau mit Schlangengift-Phosphodiesterase, Phosphatasebehandlung und Analyse der Basenzusammensetzung mittels einer Umkehrphasen-HPLC einschloß.
  • Es besteht ein Bedarf zur einfacheren und zuverlässigeren Bestimmung der Nucleotidsequenz von synthetischen Oligonucleotiden, insbesondere für solche Oligonucleotide, die keine Phosphodiesterinternucleotidbindungen besitzen.
  • Die Erfindung stellt zum ersten Mal ein effizientes und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung der Nucleiotidsequenz synthetischer Oligonucleotide bereit. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz für Oligonucleotide bereit, die eine oder mehrere Nicht- Phosphodiesterinternucleotidbindungen an ihrem 3'-Ende tragen.
  • Im Verfahren der Erfindung werden vier Oligonucleotide benutzt. Das erste Oligonucleotid ist das zu sequenzierende Probenoligonucleotid. Das zweite Oligonucleotid ist ein sogenanntes Helferoligonucleotid ("helper"), das an das 3'-Ende des Probenoligonucleotids ligiert wird, um eine für eine Sequenzierung ausreichende Länge des Oligonucleotids zu erhalten (bekannt als Oligonucleotid mit einer sequenzierbaren Länge; engl. "sequencing-length" oligonucleotide). Ein drittes Oligonucleotid ist ein sogenanntes molekulares Heftoligonucleotid ("molecular tack") mit einer Sequenz, die sowohl zum 3'-Ende des Probenoligonucleotids als auch zum 5'-Ende des Helferoligonucleotids komplementär ist.
  • Diese drei Olidonucleotide werden miteinander hybridisert, so daß das molekulare Heftoligonucleotid das 3'-Ende des Probenoligonucleotids mit dem 5'- Ende des Helferoligonucleotids zusammenhält. Das Probenoligonucleotid und das Helferoligonucleotid werden sodann zu einem Oligonucleotid mit sequenzierbarer Länge miteinander ligiert. Ein viertes Oligonucleotid, das ein markiertes Primeroligonucleotid mit einer zu einem Bereich des Helferoligonucleotids komplementären Sequenz ist, wird sodann mit dem Oligonucleotid mit sequenzierbarer Länge hybridisiert. Die Sequenzierung wird mittels zum Beispiel des Sanger-Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens oder der chemischen Maxam-Gilbert- DNA-Sequenzierung durchgeführt.
    • Beschreibung der Figuren
  • In Figur 1 ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Sequenzierung synthetischer Oligonucleotide zusammengefaßt.
  • Figur 2 zeigt das erfindungsgemäße Ergebnis der Sequenzierung eines Phosphorthioat-Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz 5'- CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT-3'.
  • Figur 3 zeigt das erfindungsgemäße Ergebnis der Sequenzierung eines Phosphorthioat-Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz 5'- CAGAGCAAAATCATCAGAAGA-3'.
  • Als ersten Aspekt stellt die Erfindung ein effizientes und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz synthetischer Oligonucleotide bereit.
  • Im allgemeinen sind die üblichen Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz für synthetische Oligonucleotide schlecht zu gebrauchen, da solche Oligonucleotide für eine effiziente Matrize zu kurz sind. Das Verfahren der Erfindung löst dieses Problem durch Herstellen eines Oligonucleotids mit einer sequenzierbaren Länge, daß das zu sequenzierende Probenoligonucleotid enthält und als effiziente Matrize eine ausreichende Länge hat.
  • Als zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein effizientes und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz synthetischer Oligonucleotide mit einer oder mehreren Nicht-Phospodiesterinternucleotidbindungen am 3'-Ende des Oligonucleotids bereit. Oligonucleotide mit Phosphodiester-Bindungen am 3'-Ende des Oligonucleotids können mittels terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase verlängert werden, um zur Sequenzierung ein Molekül mit ausreichender Länge zu erhalten. Die terminale Desoxynucleotidyl-Transferase ist jedoch sehr spezifisch in ihrer Anforderung an eine Phosphodiester-Bindung zwischen den Nucleotiden am 3'- Ende des zu verlängernden Oligonucleotids. Folglich sind synthetische Oligonucleotide mit einer oder mehreren Nicht-Phosphodiester-Bindungen zwischen den Nucleotiden am 3'-Ende schlechte Substrate der terminalen Desoxynucleotidyl- Transferase. Das Verfahren der Erfindung löst dieses Problem mittels einer Ligasereaktion, bei der ein Probenoligonucleotid mit einem Helferoligonucleotid verbunden wird. Dadurch erhält man ein Oligonucleotid mit einer sequenzierbaren Länge, das eine geeignete Matrize zur Sequenzierung nach üblichen Verfahren wie nach Sanger oder Maxam-Gilbert bereitstellt. Ligasen sind weniger spezifisch in ihren Anforderungen an die terminalen Bindungen zwischen den Nucleotiden als die terminale Desoxynucleotidyl-Transferase und können deshalb zum Verbinden von Oligonucleotiden mit Nicht-Phosphodiesterinternucleotidbindungen benutzt werden.
  • Entsprechend den beiden Aspekten der vorliegenden Erfindung, umfaßt das Verfahren der Erfindung die folgenden Schritte. Man hybridisert drei Oligonucleotide miteinander: ein Probenologonucleotid, dessen Nucleotidsequenz bestimmt werden soll, ein Helferoligonucleotid zur Verlängerung und ein molekulares Heftoligonucleotid, um das Proben- und das Helferoligonucleotid zusammenzuhalten. Zweitens werden das Proben- und das Helferoligonucleotid zu einem Oligonucleotid mit sequenzierbarer Länge ligiert. Jede der verfügbaren bekannten Ligasen kann zur Ausführung dieses Ligationsschrittes benutzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird T4-DNA-Ligase benutzt. Drittens hybridisiert man ein markiertes Primeroligonucleotid mit dem Bereich des Helferoligonucleotids des im zweiten Schritt erhaltenen Oligonucleotids mit sequenzierbarer Länge. Viertens wird der Primer durch eine Polymerase verlängert. Etliche Polymerasen sind bekannt. Jedes dieser Enzyme ist im Prinzip geeignet. Vorzugsweise wird eine DNA- Polymerase benutzt, insbesondere die Taq-DNA-Polymerase. In diesem Schritt zur Primerverlängerung werden auch Didesoxynucleotide eingesetzt, falls die Sequenzbestimmung nach Sanger durchgeführt wird. Bei der Sequenzierung nach Maxam-Gilbert ist die Verwendung von Didesoxynucleotiden nicht erforderlich. In diesem Fall ist ein zusätzlicher chemischer Spaltschritt erforderlich, der beim Sanger- Verfahren nicht angewandt werden muß. Sowohl das Sanger- als auch das Maxam- Gilbert-Verfahren sind bekannt und werden hier nicht weiter beschrieben. Schließlich werden die chemisch gespaltenen oder nach dem Didesoxyverfahren erhaltenen Oligonucleotidsequenzen nach üblichen Verfahren größenfraktioniert, z.B. durch Chromatographie oder Elektrophorese. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Moleküle elektrophoretisch in einem Sequenzgel aufgetrennt. Das Bandenmuster der fraktionierten Sequenzen wird dann nach üblichen Verfahren interpretiert, um die Nucleotidsequenz des Probenoligonucleotids zu bestimmen.
  • Mit dem Verfahren der Erfindung kann im Prinzip jedes Probenoligonucleotid sequenziert werden. Vorzugsweise bestehen die Probenoligonucleotide, die mit dem Verfahren der Erfindung untersucht werden, aus etwa vier bis etwa 100 Nucleotiden. Insbesondere bestehen die Probenoligonucleotide aus etwa acht bis etwa 50 Nucleotiden. Prinzipiell können die Probenoligonucleotide jede Art von Internucleotid-Bindungen oder auch jede Kombination der verschiedenen Arten von Internucleotid-Bindungen enthalten, solange das Probenoligonucleotid an das Helferoligonucleotid ligiert und das Primeroligonucleotid von Polymerasen verlängert werden kann. Für jedes Probenoligonucleotid können diese Parameter ohne weiteres empirisch bestimmt werden. Dazu werden einfach eine Testligation und ein Primer-Verlängerungstest unter den nachstehenden Bedingungen des experimentellen Teils dieser Beschreibung durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Probenoligonucleotide mindestens eine Internucleotid-Bindung am 3'- Ende, die keine Phosphodiester-Bindung ist. Solche Probenoligonucleotide können mehr als eine Nicht-Phosphodiesterbindung besitzen, es können sogar alle Bindungen zwischen den Nucleotiden vom Nicht-Phosphodiester-Typ sein. Die im Probenoligonucleotid vorhandenen Nicht-Phosphodiester-Bindungen schließen wenigstens Phosphorthioat-, Alkylphosphonat-, Phosphoramidat-, Alkylphosphonothioat-, Phosphordithioat-, und Sulfon-, Sulfat-, Keto-, Phosphatester--, verbrückte Phosphorthioat- und verbrückte Phosphoramidat-Bindungen ein. All diese Bindungen sind bekannt. Probenoligonucleotide mit Phosphorthioat-Bindungen zwischen den Nucleotiden sind besonders bevorzugt.
  • Im Verfahren der Erfindung ligiert man ein Helferoligonucleotid mit einem Probenoligonucleotid über den Phosphatrest am 5'-Ende des Helferoligonucleotids oder am 3'-Ende des Probenoligonucleotids. Man erhält ein Oligonucleotid mit sequenzierbaren Länge, die ausreicht, um als Matrize für Sequenzreaktionen zu dienen. Die Helferoligonucleotide können, abhängig von der Länge des Probenoligonucleotids, in der Länge variieren, da der wichtige Paramenter die Gesamtlänge des Oligonucleotids mit sequenzierbarer Länge ist. Somit können für längere Probenoligonucleotide kürzere Helferoligonucleotide eingesetzt werden und umgekehrt. Vorzugsweise Oligonucleotid mit sequenzierbarer Länge etwa acht bis etwa 50 Nucleotide. Somit wird das Helferoligonucleotid in der Länge variieren, sodaß ein Oligonucleotid mit sequenzierbaren Länge im geeigneten Größenbereich für jedes gegebene Probenoligonucleotid vorliegt. Das Helferoligonucleotid kann jede Nucleotidsequenz und jede Art von Internucleotid-Bindungen oder auch eine Mischung der verschiedenen Internucleotid-Bindungen enthalten, solange das Helferoligonucleotid an das Probenoligonucleotid ligiert und als Matrize zur Verlängerung des Primeroligonucleotids von Polymerasen akzeptiert werden kann. Für jedes einzusetzende Helferoligonucleotid können diese Parameter sofort ohne weiteres empirisch bestimmt werden. Dazu werden einfach Testligationen und Primerverlängerungstests mit den nachfolgenden Bedingungen des experimentellen Abschnitts dieser Beschreibung durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Helferoligonucleotid ein Phosphodiester-Oligonucleotid.
  • Im Verfahren der Erfindung werden das Proben- und das Helferoligonucleotid zur Ligation von einem dritten Oligonucleotid zusammengehalten, welches als molekulares Heftoligonucleotid bezeichnet wird. Das molekulare Heftoligonucleotid hält das Proben- und das Helferoligonucleotid durch hybridisieren an das 3'-Ende des Probenoligonucleotids und an das 5'-Ende des Helferoligonucleotids zusammen. Deshalb muß das molekulare Heftoligonucleotid eine Nucleotidsequenz umfassen, dessen 5'-Bereich komplementär zum 5'-Bereich des Helferoligonucleotids ist und einen daran anschließenden 3'-Bereich, der komplementär zum 3'-Bereich des Probenoligonucleotids ist. Das molekulare Heftoligonucleotid kann jede Länge haben, so lange wie seine zum Helfer- und Probenoligonucleotid komplementären Bereiche eine ausreichende Länge besitzen, um sowohl mit dem Helfer- als auch mit dem Probenoligonucleotid hybridisieren zu können. Vorzugsweise hat das molekulare Heftoligonucleotid eine Länge von etwa acht bis etwa 50 Nucleotiden mit einem 5'-Bereich von mindestens vier Nucleotiden, der komplementär zum 5'-Bereich des Helferoligonucleotids ist, und einem daran anschließenden 3'-Bereich mit mindestens vier Nucleotiden, der komplementär zum 3'-Bereich des Probenoligonucleotids ist. Insbesondere hat das molekulare Heftoligonucleotid eine Länge von etwa acht bis etwa 20 Nucleotiden.
  • Das im Verfahren der Erfindung eingesetzte vierte Oligonucleotid ist ein Primeroligonucleotid zur Verlängerung durch die Polymerase. Dieses Primeroligonucleotid kann jedes übliche bekannte Oligonucleotiden sein, das für DNA-Sequenzierung oder Primerverlängerungsreaktionen benutzt wird. Die Sequenz des Primeroligonucleotids ist komplementär zu einem Bereich oder zum gesamten Helferoligonucleotid. Vorzugsweise ist das 3'-Ende des Primeroligonucleotids komplementär zu einem Bereich des Helferoligonucleotids, der etwa zehn bis etwa 15 Nucleotide vom 3'-Ende des vom Probenoligonucleotids stammenden Bereichs des Oligonucleotids mit sequenzierbarer Länge entfernt ist.
  • Die Beispiele erläutern bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens der Erfindung. Sie sind nicht einschränkend aufzufassen. Sofern nicht anderes angegeben, werden die in den nachstehenden Beispielen aufgeführten Materialien und Bedingungen benutzt.
  • [γ³²P]-ATP (3000 Ci/mmol) wurde von NEN DuPont bezogen. T4- Polynucleotidyl-Kinase, T4-DNA-Ligase, Taq-DNA-Polymerase und Didesoxynucleosid-Triphosphate wurden von Promega bezogen. Desoxyoligonucleotide und Phosphorthioat-Oligonucleotide wurden mittels eines DNA-Syntheseautomaten (Millipore, Model 8700) nach der Phosphoramidit-Methode hergestellt. Die Schutzgruppenentfernung der Oligonucleotide wurde mit konzentrierter Ammoniaklösung bei 55ºC für acht Stunden durchgeführt. Die Reinigung wurde mittels Gelelektrophorese in 20% Polyacrylamidgelen (7 M Harnstoff) durchgeführt.
    • Beispiel 1 Ligation des Proben- und Helferoligonucleotids
  • Das Helferoligonucleotid (5'- CTCCATTTTTTTTTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT-3', 35-mer) wurde mittels T4-Polynucleotidyl-Kinase unter den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen, jedoch mit unmarkiertem ATP, am 5'-Ende phosphoryliert (kinasiert). Ein drittes, zwölf Nucleotid langes molekulares Heftoligonucleotid, wurde so synthetisiert, daß die 5'- Sequenz ATGGAG lautete und die 3'-Sequenz mit dem 3'Ende des Probenoligonucleotids komplementär war. 100 pmol des 5'-phosphorylierten Helferoligonucleotids wurden mit 200 pmol des Proben- und molekularen Heftoligonucleotids vermischt und zu einer Lösung (Endvolumen 18 µl) mit 2 µl 10x Ligasepuffer (300 mM Tris, pH 7,8, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT und 10 mM ATP) gegeben. Die Reaktionslösung wurde bei 37ºC für 15 Minuten inkubiert und danach in einem Eisbad abgekühlt. 2 µl T4-DNA-Ligase (3000 Einheiten/ml) wurden zur Reaktionslösung zugesetzt, bei 4ºC über Nacht inkubiert und anschließend bei 70ºC für 5 Minuten inaktiviert. Über 90% Ligationsausbeute wurden erzielt. Die Reaktionslösung wurde dann ohne weitere Reinigung als Matrize zur Sequenzierung eingesetzt.
    • Beispiel 2 Markierung des 5'-Endes des Primeroligonucleotids
  • 200 pmol T7-Primer (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') wurden mit 300 pmol [γ-³²P]-ATP (20 µCi) und 15 Einheiten T4-Polynucleotidyl-Kinase in einer Reaktionslösung (Endvolumen 15 µl) von 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; und 5 mM DTT vermischt. Die Reaktionslösung wurde bei 37ºC für 40 Minuten inkubiert und die Kinase anschließend durch 5 minütige Inkubierung bei 70ºC inaktiviert. Der am 5'-Ende markierte Primer wurde durch Gelelektrophorese in einem 20% denaturierendem Polyacrylamidgel gereinigt. Sodann wurde der Primer aus dem Gel ausgeschnitten und mit 0,5 M Ammoniumacetat über Nacht bei Raumtemperatur eluiert und mit vier Volumen Ethanol ausgefällt.
    • Beispiel 3 Durchführung der Sequenzreaktion
  • 5 pmol der Matrize aus der Ligationsreaktion (Beispiel 1) wurden mit 15 pmol des ³²P-5'-markierten Primers in einer Lösung (Endvolumen 25 µl) von 50 mM Tris, pH 9,0 und 10 mM MgCl&sub2; gemischt. Die Lösung wurde bei 37ºC für 10 Minuten inkubiert, anschließend wurden 1,5 µl Taq-DNA-Polymerase (2500 Einheiten/ml) zugesetzt und auf vier Reaktionsgefäße (je 6 µl) verteilt, die mit G, A, T und C bezeichnet waren. Zu den entsprechenden Reaktionsgefäßen gab man 1 µl des entsprechenden d/ddNTP-Gemischs (siehe Tabelle 1), die Reaktionslösung wurde bei 70ºC für 15 Minuten inkubiert, anschließend mit 1 µl der Chase-Lösung (je 25 mM dGTP, dATP, dCTP und dTTP) und weitere 15 Minuten bei 70ºC inkubiert. Zum Abbruch der Reaktion wurden 4 µl einer Stopplösung (10 mM NaOH, 85% Formamid, 0,05 % Bromphenolblau und 0,05 % Xylencyanol) zugesetzt, bei 70ºC für 5 Minuten erhitzt und die Reaktion anschließend auf ein Sequenzgel aufgetragen.
    • Beispiel 4 Sequenzgelelektrophorese
  • Ein 8% Polyacrylamidgel (7 M Harnstoff, 50 mM Tris-Borat, pH 8,3 und 2,5 mM EDTA) mit 40 cm Länge, 30 cm Breite und 0,75 mm Dicke wurde mit dem Produkt aus Beispiel 3 geladen. Der Laufpuffer bestand aus 50 mM Tris-Borat, pH 8,3 mit 2,5 mM EDTA. Die Proben wurden auf das Gel aufgetragen und die Elektrophorese bei 600 V, 50 mA durchgeführt bis der Bromphenol-Blaumarker etwa 5 cm vom unteren Rand des Geis entfernt war. Das Gel wurde getrocknet und eine Autoradiographie durchgeführt.
  • Die Ergebnisse fur zwei verschiedene Phosphorthioat-Oligonukloetide sind in Figur 2 und 3 widergegeben. Sie zeigen, daß das Verfahren der Erfindung mit Oligonucleotiden mit Nicht-Phosphorinternucleotidbindungen, hier Phosphorthioat- Bindungen, gut arbeitet. Das Verfahren war in den beiden unterschiedlichen Sequenzen erfolgreich, was zeigt, daß der Erfolg unabhängig von der Basenzusammensetzung des Probenoligonucleotids ist. Die einzige Einschränkung des Verfahrens scheint zu sein, daß man das letzte Nucleotid am 5-Ende nicht bestimmen kann. Somit muß dieses Nucleotid mit Verfahren zur terminalen Analyse bestimmt werden. Tabelle 1 Zur Sequenzierung benutzte d/ddNTP-Zusammensetzungen Komponente Mix SEQUENZPROTOKOLL ALLGEMEINE ANGABEN: ANMELDER: Agrawal, Sudhir Tang, Jin-Yan TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren für die Sequenzierung von synthetischen Oligonucleotiden, welche Internucleotid-Bindungen enthalten, die nicht vom Phosphodiester-Typ sind ANZAHL DER SEQUENZEN: 5 KORRESPONDENZADRESSE: ADRESSE: Allegretti & Witcoff, Ltd. STRASSE: 75 State Street, Suite 2300 ORT: Boston BUNDESLAND: Massachusetts LAND: USA POSTLEITZAHL: 02109 COMPUTERLESBARE FASSSUNG: DATENTRÄGER: Diskette COMPUTER: IBM PC-kompatibel BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS SOFTWARE: PATENTIN Ausgabe #1.0, Version #1.25 ANGABEN ZUM PATENTANWALT: NAME: Keown, Wayne A. REGISTRIERUNGSNUMMER: 33,923 REFERENZNUMMER: 92,620 TELEKOMMUNIKATION: TELEFON: 617/345-9100 TELEFAX: 617/345-9111 ANGABEN ZU SEQ ID-NO: 1: SEQUENZCHARAKTERISTIKA: LÄNGE: 25 Basenpaare ART: Nucleinsäure STRANGFORM : Einzelstrang TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) HYPOTHETISCH: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NO: 1: CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25 ANGABEN ZU SEQ ID-NO: 2: SEQUENZCHARAKTERISTIKA: LÄNGE: 12 Basenpaare ART: Nucleinsäure STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) HYPOTHETISCH: NEIN ANTI-SENSE: JA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NO: 2: ATGGAGAGAA GG 12 ANGABEN ZU SEQ ID-NO: 3: SEQUENZCHARAKTERISTIKA: LÄNGE: 35 Basenpaare ART: Nucleinsäure STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) HYPOTHETISCH: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NO: 3: CTCCATTTTT TTTTCCCTAT AGTGAGTCGT ATTAT 35 ANGABEN ZU SEQ ID-NO: 4: SEQUENZCHARAKTERISTIKA: LÄNGE: 20 Basenpaare ART: Nucleinsäure STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) HYPOTHETISCH: NEIN ANTI-SENSE: JA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NO: 4: ATAATACGAC TCACTATAGG 20 ANGABEN ZU SEQ ID-NO: 5: SEQUENZCHARAKTERISTIKA: LÄNGE: 21 Basenpaare ART: Nucleinsäure STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) HYPOTHETISCH: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NO: 5: CAGAGCAAAA TCATCAGAAG A 21

Claims (6)

1. Ein Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz eines Probenoligonucleotids, umfassend die Schritte:
a) Annealing des Probenoligonucleotids und eines Helferoligonucleotids mit jeweils einem 5'- und 3'-Ende mit einem molekularen Heftoligonucleotid (tack oligonucleotide) mit einer 5'-Region, komplementär zu dem 5'-Ende des Helferoligonucleotids und einer benachbarten 3'-Region, komplementär zu dem 3'-Ende des Probenoligonucleotids,
b) Ligieren des Helferoligonucleotids an das Probenoligonucleotid unter Bildung eines Oligonucleotids einer sequenzierbaren Länge,
c) Annealing eines markierten Primer-Oligonucleotids an den Helferoligonucleotidteil des Oligonucleotids einer sequenzierbaren Länge, wobei das Primer- Oligonucleotid eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär zu einem Teil des Helferoligonucleotids ist,
d) Verlängerung des Primer-Oligonucleotids mit einer Polymerase in Gegenwart von Kettenverlängerungs- und Kettenterminations-Nucleosidtriphosphaten,
e) Fraktionierung der verlängerten Primer nach Standardverfahren und
f) Bestimmung der Nucleotidsequenz des Probenoligonucleotids von den fraktionierten verlängerten Primern.
2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Probenoligonucleotid eine oder mehrere Nicht-Phosphodiesterinternucleotidbindungen an einem 3'-Ende hat.
3. Verfahren nach Anspruch 2, in dem die Nicht-Phosphodiesterinternucleotidbindung eine Phosphorothioatbindung ist.
4. Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz eines Probenoligonucleotids, umfassend die Schritte:
a) Annealing des Probenoligonucleotids und eines Helferoligonucleotids mit jeweils einem 5'- und 3'-Ende mit einem molekularen Heftoligonucleotid mit einer 5'- Region, komplementär zu dem 5'-Ende des Helferoligonucleotids und einer benachbarten 3'-Region komplementär zu dem 3'-Ende des Probenoligonucleotids,
b) Ligieren des Helferoligonucleotids an das Probenoligonucleotid unter Bildung eines Oligonucleotids einer sequenzierbaren Länge,
c) Annealing eines markierten Primer-Oligonucleotids an den Helferoligonucleotidteil des Oligonucleotids einer sequenzierbaren Länge, wobei das Primer- Oligonucleotid eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär zu einem Teil des Helferoligonucleotids ist,
d) Verlängerung des Primer-Oligonucleotids mit einer Polymerase unter Bildung eines Primer-Verlängerungsprodukts,
e) Spaltung des Primer-Verlängerungsprodukts mit geeigneten Sequenzierungsreagentien nach Maxam und Gilbert unter Bildung gespaltener Primer-Verlängerungsprodukte,
f) Fraktionierung der gespaltenen Primer-Verlängerungsprodukte gemäß Standardverfahren und
g) Bestimmung der Nucleotidsequenz des Probenoligonucleotids von den fraktionierten gespaltenen Primer-Verlängerungsprodukten.
5. Verfahren nach Anspruch 4, in dem das Probenoligonucleotid eine oder mehrere Nicht-Phosphodiesterinternucleotidbindungen an einem 3'-Ende hat.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, in dem die Nicht-Phosphodiesterinternucleotidbindung eine Phosphorothioatbindung ist.
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