DE69409646T2

DE69409646T2 - Magnetische zyklusreaktionen

Info

Publication number: DE69409646T2
Application number: DE69409646T
Authority: DE
Inventors: Alec Cambridge Ma 02139 Mian
Original assignee: Gamera Bioscience Corp
Current assignee: Gamera Bioscience Corp
Priority date: 1993-06-09
Filing date: 1994-06-08
Publication date: 1998-08-06
Anticipated expiration: 2014-06-09
Also published as: WO1994029484A1; AU7106794A; CA2164706A1; ES2114692T3; JPH08511425A; KR960703174A; DE69409646D1; US5545540A; GR3026678T3; DK0702728T3; EP0702728A1; EP0702728B1; ATE165118T1; AU690124B2; CA2164706C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Amplifikation spezifischer Nucleinsäuresequenzen. Insbesondere betrifft die Erfindung Reagenzien und Verfahren zur Ausführung einer derartigen spezifischen Amplifikation und Verwendungen davon.

2. Zusammenfassung der verwandten Technik

Die Fähigkeit, spezifische DNA-sequenzen zu amplifizieren, hat Entwicklungen auf den Gebieten der Molekularbiologie, Medizin und Gerichtschemie erheblich erleichtert. Frühe Verfahren zur Amplifizierung spezifischer DNA-sequenzen, bekannt als PCR, verwendeten alternierende Zyklen einer thermischen Denaturierung doppelsträngiger DNA-Moleküle, gefolgt von Annealing von Primern an die Einzelstränge bei erniedrigter Temperatur und Extension der Primer durch eine Polymerase um erneut Doppelstränge zu erhalten. Mullis, U.S. Patent Nr. 4,683,202 (1987) offenbart ein derartiges Verfahren, bei dem zwischen den Zyklen neue Polymerase zugegeben werden muß, um die Polymerase, die durch die erhöhten Temperaturen des thermischen Denaturierungsschritts inaktiviert worden ist, zu ersetzen. Mullis et al., U.S. Patent Nr. 4,683,195 (1987), lehren die Verwendung eines derartigen Verfahrens zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit einer spezifischen Nucleinsäuresequenz in einer Probe, oder zur Unterscheidung zwischen unterschiedlichen spezifischen Nucleinsäuresequenzen in einer Probe.
Ein Mangel dieser frühen Verfahren bestand in der erheblichen Unannehmlichkeit zwischen den Zyklen Polymeraseenzym zugeben zu müssen. Diese Unannehmuchkeit wurde durch das Auffinden einer gereinigten thermostabilen DNA-Polymerase überwunden. Gelfand et al., U.S. Patent Nr. 4,889,818 (1989) offenbaren ein gereinigtes thermostabiles Polymeraseenzym aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus. Mullis et al., U.S. Patent Nr. 4,965,188 (1990) offenbaren ein Verfahren zur Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen unter Verwendung der thermostabilen Polymerase, wodurch die Erfordernis zwischen den Reaktionszyklen Polymerase zuzugeben beseitigt wird. Johnson et al., U.S. Patent Nr. 5,038,852 (1991) offenbaren eine Vorrichtung zur Automatisierung der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung des thermostabilen Polymeraseenzyms.
1. Die internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO92/05443 der Medical Research Council offenbart eine Vorrichtung zum Abtrennen eines an einem magnetischen Festphasenträger angebrachten Zielreagenzes aus einem Reagenziengemisch.
2. Die internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO92/04470 der Scientific Generics Ltd. offenbart ein Verfahren zur Denaturierung von doppelsträngiger Nucleinsäure in einer elektrochemischen Zelle durch Anlegen einer Spannung an die Nucleinsäure.
Die Verwendung eines thermostabilen Polymeraseenzyms in einer auf thermischer Denaturierung beruhenden Kettenreaktion hat die Unannehmlichkeit einer Amplifizierung von spezifischen Nucleinsäureseguenzen vermindert und hat der Methode dazu verholfen, eine breite kommerzielle Akzeptanz zu erreichen. Unglücklicherweise hat die Verwendung des thermostabilen Enzyms, die durch den thermischen Denaturierungsschritt erforderlich wird, dem Amplifizierungsverfahren schwerwiegende Einschränkungen auferlegt. Die bedeutendsten dieser Einschränkungen sind die Genauigkeit des Amplifikationsvorgangs, die Größe der Nucleinsäuresequenzen, die amplifiziert werden kann, und der zur Durchführung des Amplifikationsverfahrens erforderliche Zeitraum.
Das thermostabile Polymeraseenzym ist in der Primerextensionsreaktion viel stärker fehleranfällig als viele bekannte Polymerasen aus mesophilen Quellen. Dies kann ein erhebliches Problem darstellen, wenn das Amplifikationsverfahren präparativ zum Klonieren verwendet wird. Weiterhin ist das thermostabile Polymeraseenzym erfolgreich eingesetzt worden zur Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen von lediglich etwa 10 Kilobasen oder weniger. Schließlich polymerisiert das thermostabile Polymeraseenzym Desoxyribonucleosid-Triphosphate in einer sehr geringen Geschwindigkeit. Zusammen mit dem nicht unbeträchtlichen Zeitraum, der für die Schritte thermische Denaturierung und Annealing benötigt wird, führt diese langsame Polymerisierung zu einem Amplifikationsverfahren, das in Stunden gemessen wird.
Es besteht daher ein Bedarf für Verfahren zur Amplifikation spezifischer Nucleinsäuresequenzen, welche die Einschränkungen der auf thermischen Zyklen beruhenden Verfahren überwinden. Idealerweise sollte ein derartiges Verfahren die Anforderungen an den Zeitraum für den Amplifikationsvorgang, sowie an die Größe der Zielnucleinsäure, die amplifiziert werden kann, verringern. Am meisten bevorzugt sollte ein derartiges Verfahren mit einer Ausrüstung, die mechanisch relativ einfach ist, durchführbar sein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Amplifizierung spezifischer Nucleinsäuresequenzen bereit, das schneller ist als existierende Methoden, eine größere Genauigkeit aufweist, und wesentlich größere Ziel-Nucleinsäuren amplifizieren kann. Dieses neue Verfahren wird hierin als "Magentische Zyklusreaktion" oder "MCR" (magnetic cycle reaction) bezeichnet. Die Vorteile der MCR resultieren daraus, daß sie Elektromagnetismus verwendet um die für die Amplifikation erforderliche Strangtrennung zu bewirken. Die Verwendung von Elektromagnetismus für die Strangtrennung beseitigt die Erfordernis, das Amplifikationsverfahren unter Bedingungen, welche Polymeraseenzyme destabilisieren, durchzuführen. Infolgedessen liefert die Erfindung die Annehmlichkeit einer ununterbrochenen zyklischen Amplifikation spezifischer Nucleinsäuresequenzen ohne die Erfordernis der Verwendung eines thermostabilen Enzyms, und statt dessen können mesophile Polymeraseenzyme verwendet werden. Diese mesophilen Polymerasen katalysieren sequenzextensionen in einer Geschwindigkeit, die mindestens eineinhalb Größenordnungen schneller ist als die der bekannten thermostabilen Polymerasen. Darüber hinaus weisen die mesophilen Polymerasen eine viel größere Replikationsgenauigkeit auf als die thermostabilen Polymerasen. Zusätzlich sind die mesophilen Polymerasen bei weitem prozessiver als die thermostabilen Enzyme, wodurch die Amplifizierung von Ziel-Nucleinsäuren mit einer Länge von bis zu 100 Kilobasen oder mehr ermöglicht wird. Somit stellt die Erfindung eine spezifische Nucleinsäure-Amplifizierung bereit, welche schneller und genauer ist als existierende ununterbrochene Methoden, und welche auf viel längere Ziel- Nucleinsäuresequenzen anwendbar ist.
Die Erfindung erreicht eine elektromagnetische Trennung von Nucleinsäuresträngen durch Verwendung von Primer-Typen mit zwei unterschiedlichen Arten gebundener Teilchen. Der erste Primer- Typ wird als ein "Festphasenprimer" bezeichnet und hat den Primer physikalisch an eine Festphase oder ein unbewegliches Teilchen oder eine unbewegliche Oberfläche gebunden. Der zweite Primer-Typ wird als ein "magnetischer Primer" bezeichnet und ist ein Primer, der physikalisch an ein Teilchen gebunden ist, welches auf ein elektromagnetisches Feld anspricht. In den Anfangsschritten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden der Festphasen- und der Magnetphasenprimer in die Ziel- Nucleinsäuresequenzen in stränge eingebaut, welche als der Festphasenstrang und der magnetische Strang bezeichnet werden. Für einzelsträngige Ziel-sequenzen erfordert dieser Schritt jeweils eine Runde Polymeraseextension ausgehend vom Festphasenprimer und dem magnetischen Primer, mit einem einzigen dazwischenliegenden Denaturierungsschritt. Für doppelsträngige Ziel-Nucleinsäuresequenzen werden die gleichen anfänglichen Primerextensionsschritte mit Polymerase verwendet, aber es geht jeweils ein Denaturierungsschritt voraus. Diese Schritte führen zu einer Ziel-Nucleinsäure, die ein Ende (über das 5'-Ende des Festphasenstrangs) an eine Festphase und ein Ende (über das 5'-Ende des magnetischen Strangs) an ein magnetisches Teilchen gebunden hat. Sobald eine solche Ziel- Nucleinsäure erhalten worden ist, wird die Amplifizierung ausgeführt durch mehrere Zyklen, bei denen zunächst ein Magnetfeld angelegt wird um den Festphasenstrang und den magnetischen Strang zu trennen, danach ein Annealing von weiteren Festphasenprimern und magnetischen Primern an die getrennten Stränge ermöglicht wird, schließlich ausgehend von den annealten Primern eine herkömmliche Polymeraseextension durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren ist für eine Reihe von Zwecken geeignet. Erstens kann das Verfahren für diagnostische Zwecke verwendet werden um die Gegenwart oder Abwesenheit einer spezifischen Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe zu bestimmen. Bei dieser Verwendung liefert das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund der rascheren Trennung der Ziel-Nucleinsäurestränge und der schnelleren Polymerisationsgeschwindigkeit der mesophilen Polymerasen einen schnelleren diagnostischen Ansatz als existierende Amplifikationsverfahren. Zweitens ist das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren zur quantitativen Bestimmung der Menge einer spezifischen Ziel-Nucleinsäure in einer Probe geeignet, wiederum in einer schnelleren Weise als es mit existierenden Amplifikationsverfahren möglich ist. Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren ist auch für präparative Verwendungen geeignet, wie etwa die Erzeugung von spezifischen Ziel- Nucleinsäuresubstraten zur Klonierung, sequenzanalyse und Mutagenese. Bei dieser Verwendung ist das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren existierenden Verfahren nicht nur wegen seiner höheren Schnelligkeit vorzuziehen, sondern auch, weil die höhere Genauigkeit der mesophilen Polymerasen weniger Mutationen in dem präparativen Substrat zur Folge hat. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren zur Nucleinsäure-Kartierung verwendet werden, eine Anwendung, die unter Verwendung existierender Amplifikationsverfahren nicht möglich ist. Diese Verwendung wird ermöglicht durch die höhere Prozessivität von Nucleinsäuren mit einer Länge bis zu 100 bis 200 Kilobasen, im Vergleich zum Maximum von etwa 5-10 Kilobasen, die mit den weniger prozessiven thermostabilen Polymerasen erhältlich sind. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens sollte existierende Kartierungsmethoden, wie etwa den Ansatz über Klonierung künstlicher Hefechromosomen, ergänzen oder ersetzen.
Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens werden in den nachfolgenden Abschnitten dieser Anmeldung und in den Zeichnungen ausführlicher beschrieben.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist eine schematische Darstellung der grundlegenden Schritte der Magnetzyklusreaktion unter Verwendung einer doppelsträngigen Ziel-Nucleinsäure. Die Schritte 1 und 2 sind Denaturierungs- und Extensionsschritte. Lange durchgezogene Linien stellen die ursprünglichen Ziel-Nucleinsäurestränge dar. Kurze durchgezogene Linien stellen Primer dar. Sterne und Kreise am Ende der Primer stellen gebundene Magnetteilchen bzw. Festphasenoberflächen dar. Gepunktete Linien stellen Primerextensionsprodukte dar. Schritt 5 stellt die Trennung der Zielstränge durch einen elektromagnetischen Impuls dar und er wird gefolgt durch Annealing von weiteren magnetischen Primern und Festphasenprimern und Polymerase-vermittelte Extension der Primer.
Die Figuren 2A und 2B zeigen eine allgemeine schematische Darstellung davon, wie die elektromagnetische Trennung der Magnetteilchen-gebundenen und der Festphasen-gebundenen Zielstränge erreicht wird. Ein Elektromagnet 1 ist um ein Teströhrchen 2, in dem der Amplifikationsvorgang stattfindet, gewickelt. Das Anlegen eines elektrischen Impulses durch den Elektromagneten in einer Richtung erzeugt ein Magnetfeld in Richtung des langen Pfeils 3, gezeigt in Figur 2A. Das Anbinden eines Zielstrangs an die Festphasenoberfläche 4 verhindert eine Mobilität dieses Strangs als Reaktion auf das Magnetfeld. Im Gegensatz dazu wird der andere Zielstrang aufgrund seiner Anbindung an ein Magnetteilchen 5 durch das Magnetfeld vom ersten Zielstrang getrennt. Die Umkehr des elektrischen Impulses erzeugt ein Magnetfeld in der entgegengesetzten Richtung, wie in Figur 2B gezeigt. Das Magnetfeld in der entgegengesetzten Richtung bringt die an magnetische Teilchen gebundenen Stränge und Primer 6 in die Nähe der Festphasengebundenen Zielstränge zurück.
Figur 3 zeigt das in den in Beispiel 6 beschriebenen Experimenten verwendete Versuchsschema. Die Figur zeigt zwei repräsentative Wells vom Typ A (Well A) und B (Well B), an die jeweils mehrere einzelsträngige DNA-Moleküle mit einer Länge von 750 Nucleotiden, jeweils am 5'-Ende der DNA-Moleküle, kovalent gebunden worden sind. Die DNA-Moleküle in den Wells B sind radioaktiv markiert (angezeigt durch einen Stern), während die der Wells A nicht radioaktiv sind. Im zweiten Schritt des Versuchsprotokolls werden mehrere einzelsträngige DNA-Moleküle mit einer Länge von 500 Nucleotiden, die komplementär zum 3'- Bereich der kovalent gebundenen DNA-Moleküle mit 750 Nucleotiden sind, jeweils an die DNA-Moleküle mit 750 Nucleotiden in den Wells A und B annealt. Die DNA-Moleküle mit 500 Nucleotiden sind an ihren 5'-Enden biotinyliert und nichtkovalent an Streptavidin-beschichtete Magnetbeads gebunden. Diese DNA-Moleküle werden dann in Schritt 3 des Protokolls unter Verwendung von T7 DNA-Polymerase in der Gegenwart (Wells A) oder Abwesenheit (Wells B) radioaktiv markierter Nucleotid- Precusoren extendiert. In Schritt 4 werden die zwei DNA-Stränge bei 50ºC durch Anlegen eines äußeren Magnetfelds getrennt, und die getrennten, extendierten, an Magnetbeads gebundenen Stränge für eine elektrophoretische Analyse isoliert. Nach dieser Trennung wurden die Wells bei 90ºC eluiert und DNA für eine elektrophoretische Analyse rückgewonnen.
Figur 4 zeigt die Ergebnisse einer elektrophoretischen Analyse der gemäß Beispiel 6 erzeugten DNA-Fragmente. Das erste elektrophoretische Muster auf der linken Seite wurde erzeugt durch Elektrophorese von radioaktiv markierter Templat-DNA mit 750 Nucleotiden und ist als eine Kontrolle gezeigt. Die Positionen des Ursprungs der Elektrophoresewells und der 750 und 500 Nucleotid-DNA-Fragmente sind durch Pfeile angezeigt. Die Elektrophoresemuster der durch magnetische Strangtrennung (50ºC) und thermische Denaturierung (90ºC) gewonnenen DNA- Fragmente jeder der Wells A und B sind gezeigt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Die Erfindung betrifft die Amplifizierung spezifischer Ziel- Nucleinsäuresequenzen. Die Erfindung stellt neue Reagenzien und ein neues Verfahren zur Ausführung einer derartigen spezifischen Nucleinsäure-Amplifikation bereit.
Im ersten Aspekt stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Ausführung einer Amplifikation spezifischer Ziel- Nucleinsäuresequenzen bereit, welches schneller ist als existierende Verfahren, eine höhere Genauigkeit hat und viel größere Ziel-Nucleinsäuren amplifizieren kann. Diese Verbesserungen gegenüber existierenden Amplifikationsverfahren resultieren aus der Verwendung von Elektromagnetismus um die für die Amplifizierung erforderliche Strangtrennung zu bewirken. Dementsprechend wird dieses neue Verfahren als "Magnetische Zyklusreaktion" oder "MCR" bezeichnet.
Die grundlegenden, am MCR-Verfahren zur Amplifizierung einer einzelsträngigen Ziel-Nucleinsäuresequenz beteiligten Schritte sind wie folgt. Als erster Schritt wird ein Festphasenprimer oder ein magnetischer Primer in einen Nucleinsäurestrang, welcher komplementär zu der Ziel-Nucleinsäuresequenz ist, eingebaut. Dieser Schritt ergibt eine doppelsträngige Ziel- Nucleinsäure, welche einen Strang entweder an einen Festphasenprimer oder einen magnetischen Primer gebunden hat, bezeichnet als der Festphasenstrang bzw. der magnetische Strang. Als zweiter Schritt werden die Ziel-Nucleinsäuresequenz und ihre komplementäre Sequenz denaturiert. Als dritter Schritt wird ein magnetischer Primer oder ein Festphasenprimer, welcher auch immer nicht in den komplementären Strang eingebaut worden war, in einen Nucleinsäurestrang, der zu der Ziel-Nucleinsäuresequenz homolog, d.h. zum Festphasenstrang oder magnetischen Strang komplementär ist, eingebaut. Diese Schritte liefern eine doppelsträngige Nucleinsäuresequenz, welche einen Strang an einen Festphasenprimer gebunden hat (den Festphasenstrang) und den anderen Strang an einen magnetischen Primer gebunden hat (den magnetischen Strang). Als vierter Schritt werden die zwei Stränge durch Anlegen eines Magnetfelds, worin der Festphasenstrang immobil ist und der magnetische Strang mobil ist, voneinander getrennt. Als fünfter Schritt werden die getrennten Stränge an weitere Festphasenprimer und magnetische Primer annealen gelassen. In diesem Schritt wird der Festphasenstrang an einen magnetischen Oligonucleotidprimer, der zu seinem 3'-Ende komplementär ist, annealen gelassen und der magnetische Strang wird an einen Festphasenprimer, der zu seinem 3'-Ende komplementär ist, annealen gelassen. Als sechster Schritt werden die an den Festphasenstrang und den magnetischen Strang annealten Primer durch eine Polymerase extendiert, wobei weitere Kopien von doppelsträngigen Nucleinsäuren, die einen Strang an einen Festphasenprimer gebunden haben und einen Strang an einen magnetischen Primer gebunden haben, bereitgestellt werden. Als siebter Schritt werden die Schritte vier bis sechs so oft wie erforderlich, um eine gewünschte Menge von Nucleinsäure-Kopien zu erhalten, wiederholt.
Die grundlegenden, am MCR-Verfahren zur Amplifizierung einer doppeisträngigen Ziel-Nucleinsäuresequenz beteiligten Schritte sind die gleichen wie zur Amplifizierung einer einzelsträngigen Ziel-Nucleinsäuresequenz, mit Ausnahme der nachstehenden Modifikationen in den Anfangsschritten. Anfangs ist ein einleitender Denaturierungsschritt erforderlich um die zwei Ziel-Nucleinsäurestränge voneinander zu trennen. Danach werden die getrennten Ziel-Nucleinsäurestränge an Primer annealen gelassen, wobei ein Strang an einen Festphasenprimer und der andere Strang an einen magnetischen Primer annealt. Danach werden die Primer durch eine Polymerase extendiert. Diese einleitenden Schritte liefern zwei doppelsträngige Ziel- Nucleinsäuren, wovon eine einen Festphasenstrang und die andere einen magnetischen Strang hat. Das weitere Verfahren wird ausgeführt wie vorstehend in den Schritten zwei bis sieben zur Amplifizierung einer einzelsträngigen Ziel-Nucleinsäure beschrieben.
Bei dieser Erfindung bedeutet der Begriff "Einbauen eines Festphasenprimers oder eines magnetischen Primers in einen Nucleinsäurestrang" das Hybridisieren eines derartigen Primers an einen Nucleinsäurestrang, welcher zu dem zu synthetisierenden Strang komplementär ist, danach Extendieren des Primers mit einem Polymeraseenzym in der Gegenwart von Desoxyribose- oder Ribosenucleosidtriphosphaten.
Bei dieser Erfindung bedeutet der Begriff "magnetischer Primer" einen Oligonucleotidprimer, der kovalent an ein Teilchen, das auf ein Magnetfeld anspricht, gebunden ist. Beispiele bevorzugter Teilchen zur Verwendung in derartigen magnetischen Primern umfassen Ferritin-Moleküle und jedes andere Metallteilchen, welches groß genug ist um ein Dipolmoment zu haben, wie etwa Dynabead paramagnetische Beads (Dynel, Oslo, Norwegen). Das Teilchen sollte eine geeignete Größe aufweisen um eine maximale Kraft zu vermitteln, welche den an das Teilchen gebundenen Strang von einem an eine Festphase gebundenen, immobilen komplementären Strang trennt. Für ein gegebenes Teilchen kann die Geschwindigkeit empirisch ermittelt werden und die Maximalkraft berechnet werden nach der Stokes'schen Beziehung
FM = 6πnrv
wobei r der Teilchenradius ist, n die Viskosität des für die Amplifikation verwendeten Puffers ist und v die gemessene Geschwindigkeit des ungebundenen Teilchens durch den Puffer ist. Bei dieser Erfindung bedeutet der Begriff "Festphasenprimer" einen Oligonucleotidprimer, der an eine Festphase oder immobile Phase gebunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Festphase Glas mit gesteuerten Poren (CPG, controlled pore glass) und der Primer ist in der herkömmlichen, zur Synthese von Oligonucleotiden verwendeten Weise kovalent an die Festphase gebunden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Primer über eine Rezeptor-Ligand-wechselwirkung indirekt an die Festphase gebunden. Bei dieser Ausführungsform ist ein Rezeptor kovalent an eine Festphase gebunden, und sein Ligand ist kovalent an den Primer gebunden, oder umgekehrt. Der Primer wird somit durch die nicht-kovalente Bindung zwischen Rezeptor und Ligand an die Festphase gebunden. Da die Bindung an die Festphase sehr stark sein sollte, sollte die Affinität von Rezeptor und Ligand sehr hoch sein, wie etwa die des Avidin-Biotin Systems, welches eine Affinität von etwa 10¹&sup5;/Mol aufweist. Erfindungsgemäße Primer sind bevorzugt kovalent an das Magnetteilchen, die Festphasenoberfläche, den Rezeptor oder den Liganden gebunden. Eine derartige Bindung kann durch eine Reihe von Mitteln erfolgen, und in einer bevorzugten Ausführungsform unter Beteiligung der 5'-Hydroxylgruppe des Oligonucleotids. Die Länge der Primer ist im allgemeinen die übliche Länge für Primer, die in der gut bekannten Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt wird, und sie beträgt bevorzugt von etwa 8 bis etwa 50 Nucleotide. Bei dieser Erfindung ist ein "magnetischer Strang" ein Nucleinsäurestrang mit einem eingebauten magnetischen Primer und ein "Festphasenstrang" ist ein Nucleinsäurestrang mit einem eingebauten Festphasenprimer.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die Denaturierung von doppelsträngiger Ziel-Nucleinsäure vor dem Einbau von sowohl Festphasenprimer als auch magnetischem Primer auf eine Reihe von Arten ausgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine derartige Denaturierung thermisch erreicht werden, beispielsweise durch Aussetzen der Probe einer Temperatur von 94ºC während etwa einer bis etwa fünf Minuten, bevorzugt während etwa zwei Minuten. In einer alternativen Ausführungsform kann eine derartige Denaturierung erreicht werden durch Aussetzen der Probe einer Base, bevorzugt bei einem pH-Wert von etwa 13 bis etwa 14. Im ersten Fall wird das anschließende Annealing von Festphasenprimern oder magnetischen Primern an die getrennten Stränge erreicht durch Erniedrigen der Temperatur auf unterhalb der Tm, üblicherweise auf etwa 45ºC bis etwa 65ºC für bis zu 5 Minuten in der Gegenwart von Primer im Überschuß. Im zweiten Fall wird das Annealing ausgeführt durch Bringen der Probe auf neutralen pH, bevorzugt von etwa pH 7 bis pH 9 in der Gegenwart von Primer im Überschuß. In jedem Fall ist der molare Überschuß von Primer zu Ziel-Nucleinsäure vorzugsweise etwa 10³-fach für klonierte Ziel-Nucleinsäuren und etwa 10&sup6;-fach für genomische Ziel- Nucleinsäuren und am meisten bevorzugt bei einer Primerkonzentration von etwa 100 Pikomol pro Reaktion. In jedem Fall wird danach ein geeignetes Polymeraseenzym in der Gegenwart von Desoxyribonucleosid- oder Ribonucleosidtriphosphaten zugegeben. Geeignete Polymerasen umfassen jede RNA- oder DNA-Polymerase aus einem beliebigen eukaryontischen oder prokaryontischen Organismus oder Virus. Bevorzugte Polymerasen umfassen T7 DNA-Polymerase und die E.coli DNA-Polymerase, Holoenzym oder Klenow-Fragment. Bevorzugt sind die Nucleosidtriphosphate Desoxyribonucleosidtriphosphate und sind in einer Konzentration von etwa 100-300 uM für jedes dNTP vorhanden. Am meisten bevorzugt findet die Primerextension in einem Puffer statt, der auch etwa 5-15 mM Mg²&spplus;, 1 mM Dithiothreitol (DTT), jeweils 0,5 mM Festphasenprimer und magnetischen Primer, 0-5 mM Betain enthält, und der einen pH-Wert von etwa 7 bis 8 aufweist aufgrund der Gegenwart von etwa 10-20 mM Tris-HCl, oder HEPES Puffer bei diesem pH-Wert.
Sobald ein Festphasenprimer in einen Strang einer Ziel- Nucleinsäure eingebaut worden ist und ein magnetischer Primer in den entgegengesetzten Strang eingebaut worden ist, können alle weiteren Strangtrennungsschritte durch Anlegen eines elektromagnetischen Felds durchgeführt werden. Wie in Figur 2A gezeigt, hat die Anbindung eines Strangs an eine feste oder immobile Phase und das Wegziehen des anderen Strangs durch eine elektromagnetische Kraft das Aufbrechen der Basenpaarungs- und Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen zwischen den Strängen zur Folge, was schließlich zur Strangtrennung führt. Die an die doppelsträngige Ziel-Nucleinsäure angelegte elektromagnetische Kraft sollte ausreichend stark sein um die Basenpaarungs- und Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen zwischen den Strängen aufzubrechen, aber nicht stark genug um Wechselwirkungen kovalenter Bindungen innerhalb der individuellen Stränge aufzubrechen.
Die erforderliche Kraft um die schwächste Intrastrang-Bindung, d.h innerhalb eines Strangs in einem DNA-Molekül aufzubrechen beträgt etwa 368.000 Joule/Mol oder etwa 6 x 10&supmin;¹&sup9; Joule/Molekül. Da Arbeit (W) Kraft (F) x Entfernung (D), ist die minimale Kraft, welche erforderlich ist um eine Intrastrang-Spaltung zu verursachen, F = W/D. Für DNA beträgt die Entfernung, über welche die Kraft wirkt, 3,3 x 10&supmin;¹&sup0; Meter/Molekül (siehe Smith et al., 1992, Science 258:1122- 1126). Somit ist die minimale Kraft zur Strangspaltung
Fs = 6x10&supmin;¹&sup9; J/Molekül/3,3x10 m/Msolekül = 1x10&supmin;&sup9; Joule/Mol = 1x10&supmin;&sup9; Newton (N).
Im Gegensatz dazu beruht die Kraft, die erforderlich ist um ein DNA-Doppelstrangmolekül aufzubrechen, auf der grundlegenden Gleichung:
2f / [1-f]² C&sub0; exp (-ΔGº/RT),
wobei C&sub0; = Konzentration einzelsträngiger DNA,
f = 0,9, wenn T = T&sub9;&sub0; (90% Dissoziationstemperatur),
f = 0,5, wenn T = T&sub5;&sub0; (50% Dissoziationstemperatur = Tm),
und f = 0,1, wenn T = T&sub1;&sub0; (10% Dissoziationstemperatur).
Die Temperaturabhängigkeit von ΔG folgt der integrierten Form der Gibbs-Helmholtz Gleichung:
ΔG = -TΔS + ΔH.
Somit ist für ein 200-mer
ΔGº = 31,4 -AG + (Initiationsenergie) = 26,5 kcal/Mol
ΔSº = 0,32928 kcal/Mol
ΔHº = 148,8 kcal/Mol und
AG&sub9;&sub0; - AG&sub1;&sub0; = 31 kcal/Mol, oder etwa 2 x 10&supmin;¹&sup9; Joule/Molekül.
Somit ist
FD = 2x10&supmin;¹&sup9; Joule/Molekül/3,3x10&supmin;¹&sup0; m/Molekül = 6,1x10&supmin;¹&sup0; N.
Gemäß diesem Wert erreicht die Dissoziationskraft FD die Spaltkraft Fs nicht, bis der zu dissoziierende Duplex bzw. Doppelstrang etwa 600 Bp erreicht. Deutlich unterhalb dieses Größenbereichs wird die Dissoziierung des Doppelstrangs jedoch kooperativ, wodurch eine vollständige Dissoziation ermöglicht wird ohne Fs jemals zu erreichen.
Wie angegeben ist es günstig, die Dissoziierung bei einer Temperatur in Nähe der Tm des Doppelstrangs auszuführen. Die Dissoziierung sollte jedoch bei einer Temperatur erfolgen, bei der das für die Primerextension verwendete Polymeraseenzym nicht destabilisiert wird. Dementsprechend ist es bevorzugt, Mittel zu verwenden, welche die Tm des Doppelstrangs erniedrigen. Beispielsweise verschiebt das Zwitterion Betain bei einer Konzentration > 5M den Schmelzpunkt von Kalbsthymus- DNA von etwa 62ºC auf etwa 48ºC ohne Protein-DNA- Wechselwirkungen bei neutralem pH zu beeinflussen. Somit wird in einer bevorzugten Ausführungsform die MCR in einem Puffer ausgeführt, welcher > 1M Betain, am meisten bevorzugt von etwa 5,2M bis etwa 5,6M Betain enthält. Alternativ kann die Schmeiztemperatur durch die Gegenwart von etwa 2,4M Triethylammoniumchlorid erniedrigt werden. Es sollte bemerkt werden, daß die Verwendung derartiger Substanzen zur Erniedrigung der Schmelztemperatur im allgemeinen stärker erwünscht ist, wenn es sich entweder um lange Ziel-Nucleinsäuren oder um Ziel- Nucleinsäuren mit einem hohen G + C Gehalt handelt. Eine weitere Destabilisierung der Doppelhelix kann erreicht werden durch die Zugabe von Einzelstrang-bindenden (ssb) Proteinen, wie etwa E.coli ssb, und/oder Helicasen, wie etwa den E.coli DNA-Helicasen I, II und IV (siehe Wood and Matson, 1987, J. Biol. Chem. 262: 152-169 und 1989, J. Biol. Chein. 264: 82-97). Andere chemische Denaturierungsmittel können in begrenzten Mengen ebenfalls zugegeben werden um die Schmeiztemperatur weiter zu erniedrigen. Diese Denaturierungsmittel umfassen Niederalkyl- (1-4C) Alkohole, Harnstoff, Formamid und andere Kompetitoren um Wasserstoffbrücken. Wenn derartige chemische Denaturierungsmittel verwendet werden, muß Sorgfalt angewandt werden, um sie in Mengen einzusetzen, welche das Polymeraseenzym nicht übermäßig destabilisieren. Wenn derartige Mittel richtig eingesetzt werden, können sie in der Tat die entgegengesetzte Wirkung haben. Beispielsweise stabilisiert 10% Ethanol tatsächlich das Polymeraseenzym. Die Kombination verschiedener Wasserstoffbrücken-destabilisierender Substanzen im MCR-Reaktionspuffer ermöglicht es die Schmeiztemperatur der Ziel-Nucleinsäure so zu erniedrigen, daß die MCR bei einer Temperatur gerade unterhalb der DNA-Schmelztemperatur, bei der aber mesophile Polymerasen stabil und aktiv bleiben, ausgeführt werden kann. Das Ausführen der MCR unter diesen Bedingungen gewährleistet, daß die zum Trennen der Ziel-Nucleinsäurestränge erforderliche Kraft deutlich unterhalb dem Wert liegt, bei dem die Spaltung kovalenter Intrastrang-Bindungen auftritt.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung einen quantitativen Schnelltest zur Bestimmung der Häufigkeit einer spezifischen Ziel-Nucleinsäure in einer Probe bereit. Derartige quantitative Tests sind für die Verwendung mit der Polymerase- Kettenreaktion gut bekannt (Siehe z.B. Noonan et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7160-7164). Das erfindungsgemäße Verfahren, MCR, kann einfach anstelle von PCR in dem gut bekannten quantitativen Test verwendet werden, der aufgrund der Schnelligkeit von MCR im Vergleich zu PCR in einem beträchtlich kürzerem Zeitraum als existierende Tests ausgeführt werden kann.
Gemäß einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur präparativen Erzeugung von Nucleinsäuremolekülsubstraten zur Klonierung, Sequenzanalyse oder Mutagenese bereit. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert aufgrund der höheren Genauigkeit mesophiler Polymerasen solche Substrate mit weniger Mutationen als die durch derzeitige Amplifikationsverfahren erzeugten. Demgemäß liefert das erfindungsgemäße Verfahren zuverlässigere Substrate für anschließende molekularbiologische Manipulationen.
Gemäß einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von Genomkartierung im Fernbereich bereit. Dies wird ermöglicht durch die Fähigkeit mesophiler Polymerasen Ziel-Nucleinsäuren in einem Größenbereich von 100 bis 200 Kilobasen zu amplifizieren. Derzeit kann eine Kartierung über diesen Größenbereich lediglich durchgeführt werden durch die etwas umständliche Klonierung von DNA in künstliche Hefechromosomen (YACS). Die Fähigkeit, derart große Ziel- Nucleinsäure-Bereiche zu amplifizieren, stellt jedoch eine einfachere Methode bereit. Da innerhalb des Genoms sequence tag sites (STSs) in Abständen von 50 - 100 kb identifiziert sind (siehe z.B. Olson et al., 1989, Science 245: 1434-1435), können die Bereiche zwischen nebeneinander liegenden STSs durch das erfindungsgemäße Verfahren bequem amplifiziert werden, wodurch ein Substrat zum Kartieren im Feinmaßstab mittels herkömmlicher Verfahren bereitgestellt wird.
Die nachfolgenden Beispiele sind dazu vorgesehen um bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weiter zu erläutern und sind von ihrer Natur her nicht einschränkend.

BEISPIEL 1

Bestimmung der Kraft, welche tatsächlich bereitgestellt wird durch ein bestimmtes Maanetteuchen in einem elektromagnetischen Feld

Dynabead paramagnetische Beads werden von Dynal, Oslo, Norwegen, bezogen. Die maximale auf das Bead wirkende Magnetkraft wird bestimmt durch Messen der Bead-Geschwindigkeit bei Wanderung durch einen Puffer in einer Mikrokammer in Reaktion auf ein elektromagnetisches Feld. Die Mikrokammer ist hergestellt aus einem Glasträger und einem abgedichteten Deckgias, wobei das Volumen zwischen den zwei von MCR-Puffer eingenommen wird (siehe Beispiel 4, nachstehend). Das Bead wird an einem Ende der abgedichteten, Fluid-gefüllten Kammer eingebracht. Der Träger wird danach mit einem Elektromagneten umgeben, durch den Strom geleitet wird um ein Magnetfeld zu erzeugen. Ein Computercursor wird dem Bild des Mikroskops überlagert und zur Aufzeichnung der Bead-Geschwindigkeit verwendet. Da es zwischen den Beads eine Variation gibt, wird diese Messung für mehrere Beads durchgeführt. Es werden Geschwindigkeitsmessungen durchgeführt für Feldstärken, die theoretisch eine Kraft von 10&supmin;¹&sup0;, 5x10&supmin;&sup9;, 10&supmin;&sup8;, 5x10&supmin;&sup8;, 10&supmin;&sup7; und 5x10&supmin;&sup7; Newton auf das Bead ausüben. Die tatsächliche maximale Kraft für das Mittel mehrerer Beads wird danach bestimmt durch Mitteln der beobachteten Geschwindigkeiten der Beads und Anwenden der Stokes'schen Beziehung
FM = 6πnrv
wobei r der Beadradius ist, n die Viskosität des Puffers ist und v die Geschwindigkeit des Beads ist. Dieser Wert wird danach verglichen mit der theoretischen Kraft, die das elektromagnetische Feld auf die Teilchen ausgeübt haben sollte, und er wird somit zur Kalibrierung des in jedem der nachfolgenden Beispiele zu verwendenden elektromagnetischen Felds verwendet.

BEISPIEL 2

Bestimmung der Minimalkraft, welche erforderlich ist zur Verursachung einer Spaltung kovalenter Intrastrang-Bindungen

Vor Entfernung der 5'-Dimethoxytrityl- (DMT) Gruppe wird ein 50-mer Oligodesoxynucleotid mittels Standardmethoden an seinem 3'-Hydroxyl biotinyliert. Die DMT-Gruppe wird danach in wässriger Essigsäure entfernt und das Oligonucleotid wird über C&sub1;&sub8; HPLC gereinigt. Ein Glasobjektträger wird nach Standardverfahren mit Alkylamidopropionsäure beschichtet. Das biotinylierte Oligonucleotid wird danach direkt mit der Carboxylgruppe der Alkylamidopropionsäure verestert. Danach werden Avidin-konjugierte Dynabead paramagnetische Beads auf den beschichteten Teil des Trägers zugegeben und ungebundene Beads werden abgewaschen. Der beschichtete Teil des Trägers wird danach unter MCR-Puffer gesetzt (siehe Beispiel 4) und ein Deckglas wird hinzugefügt. Der Träger wird in einen Elektromagneten gehüllt und durch Leiten von elektrischem Strom durch den Elektromagneten wird ein elektromagnetisches Feld einer geeigneten Stärke erzeugt, um eine tatsächliche Kraft von 10&supmin;¹&sup0; N auf jedes Bead auszuüben. Die tatsächliche Kraft wird erhöht, bis die Oligonucleotide bei einer Kraft von etwa 10&supmin;&sup9; N gespalten werden.
F = W/D = 6x10&supmin;¹&sup9; J/Molekül (für niedrigste Dissoziationsenergie einer Bindung in DNA)/ 3,3x10&supmin;¹&sup0; m (Maximalausdehnung einer einfachen Internucleotidbindung
Damit ist F = 2x10&supmin;&sup9; J/Molekül = 2x10&supmin;&sup9; N

BEISPIEL 3

Bestimmung der Minimalkraft, die erforderlich ist zur Destabilisierung einer Oligonucleotid-Doppelhelix

Ein 3'-Levulinyl-Oligonucleotid (50-mer, gleich wie in Beispiel 2) wird über sein 5'-Hydroxyl direkt mit der Carboxylgruppe von Alkylamidopropionsäure, mit der ein Glasobjektträger beschichtet ist, verestert. Die Levulinyl-Schutzgruppe wird danach in Base entfernt. Ein an seinem 5'-Ende mit einem paramagnetischem Bead derivatisiertes 50-mer Oligonucleotid, dessen 10 am weitesten 3'-gelegenen Nucleotide komplementär zu den 10 am weitesten 3'-gelegenen Nucleotiden des Glasgebundenen Oligonucleotids sind, wird danach in MCR-Puffer, der T7 DNA-Polymerase enthält, zugegeben (siehe Beispiel 4). Extension des Oligonucleotids ergibt einen 90-mer Doppelstrang. Ein Deckglas wird hinzugefügt und der Objektträger wird in einen Elektromagneten gehüllt und auf einen Objekttisch gegeben. Danach wird elektrischer Strom durch den Elektromagneten geleitet um eine tatsächliche Kraft von etwa 10&supmin;¹&sup0; N auf die paramagnetischen Beads auszuüben. Diese Kraft wird allmählich erhöht, bis die Stränge des Doppelstrangs bei einer Kraft von etwa 6,1x10&supmin;¹&sup0; N getrennt werden.

BEISPIEL 4

Amplifikationsprotokoll zur Amplifizierung einer Ziel- DNA Sequenz unter Verwendung von MCR

Der Vektor pBluescript SK+1 wird mit PvuII linearisiert und ein den Polylinker umspannendes 210 bp Fragment wird wie folgt amplifiziert. Ein Nanogramm verdautes Plasmid wird zu einem Eppendorf-Röhrchen zugegeben, das eine Lösung enthaltend 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,2 mM dNTPs, 0,5 mM Festphasenprimer und 0,5 mM Betain enthält.
Der Festphasenprimer ist 5'-AACAGCTATGACCATG-3' (SEQ ID Nr.:1), dessen 5'-Hydroxylgruppe mit der Carboxylgruppe von Alkylamidopropionsäure auf Glas mit gesteuerten Poren verestert ist. Der magnetische Primer ist 5'-GTAAAACGACGGCCAT-3' (SEQ ID Nr.:2), dessen 5'-Ende biotinyliert ist und an ein mit Streptavidin derivatisiertes Dynabead gebunden ist. Die Lösung wird 2 Minuten auf 97ºC erwärmt, danach auf 50ºC abkühlen gelassen. Dann werden zehn Units T7 DNA-Polymerase zugegeben und die Lösung wird 2 Minuten bei 45ºC inkubiert. Die Lösung wird 2 Minuten auf 97ºC erwärmt, danach erneut auf 50ºC abgekühlt. Zehn Units T7 DNA-Polymerase werden zugegeben und die Lösung wird erneut 2 Minuten bei 45ºC inkubiert. Die Lösung wird in eine MCR-Vorrichtung überführt , wobei das Eppendorf- Röhrchen in einem Elektromagneten sitzt, bei einer Temperatur von 45-50ºC. Danach wird ein elektromagnetisches Feld mit einer Stärke, die die Stränge eines Doppelstrangs trennt, aber innerhalb eines Strangs keine Spaltung verursacht (d.h. ein Feld, welches auf jedes Magnetbead eine tatsächliche Maximaikraft zwischen etwa 5x10&supmin;¹¹ und 1x10&supmin;&sup9; N ausübt) während 15 Sekunden angelegt, danach 5 Sekunden in umgekehrter Richtung angelegt und die Lösung wird zwei Minuten bei 45-50ºC inkubiert. Diese Schritte des elektromagnetischen Impulses und der Inkubation werden dann etwa 20 Mal wiederholt. Das entstandene amplifizierte 210 bp Produkt wird danach mittels Gelelektrophorese analysiert.

BEISPIEL 5

Amplifizierung einer Ziel- DNA Sequenz unter Verwendung von MCR

Ein MCR-Reaktionsgemisch, enthaltend 30 Attomol lineare Lambdaphagen-DNA ( 100 pg) in einer Lösung von 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,05 mM jedes dNTP, 5% Glycerin, 5% Ethylenglycol, 0,1% TWEEN Detergens und 0,5 mM jedes der zwei Oligonucleotidprimer, wurde zubereitet. Einer dieser Primer war der magnetische Primer, der an seinem 5'-Ende biotinyliert ist und nicht-kovalent an Streptavidin-beschichtete, paramagnetische Beads (Dynabead ) gebunden ist. Die Nucleotidsequenz des magnetischen Primers war:
5'-CGAACAGGTTATCGAATTCAGCCAC-3' (SEQ ID Nr.:3).
Der andere Primer war der Festphasenprimer, der über die 5'- terminale Phosphatgruppe kovalent an den Boden eines Weil einer Mikrotiterplatte (Covalink, Nunc Inc., Naperville, IL) gebunden ist, die das Reaktionsgefäß umfaßte, in dem die MCR-Reaktion durchgeführt wurde. Die Nucleotidsequenz des Festphasenprimers war:
5'-CATCGTCGTGTATTCCGGACAGTAC-3' (SEQ ID Nr.: 4).
Das MCR-Reaktionsgemisch wurde 1 Minute auf 94ºC erwärmt, auf 50ºC abgekühlt, und 1-2 Units T7 DNA-Polymerase wurden zugegeben. Die Inkubation bei 50ºC wurde etwa 1 Minute fortgesetzt. Danach wurde die Lösung etwa 1 Minute auf 94ºC erwärmt und auf 50ºC abgekühlt und in eine MCR-Vorrichtung, wie vorstehend beschrieben, eingebracht.
1-2 Units T7 DNA-Polymerase wurden zu dem MCR-Reaktionsgemisch zugegeben und es wurde für die Dauer der MCR-Amplifizierung bei 45-50ºC inkubiert. Ein durch einen Elektromagneten der MCR- Vorrichtung erzeugtes elektromagnetisches Feld wurde während etwa 15 Sekunden angelegt und danach wurde die Polarität des Felds während etwa 5 Sekunden umgekehrt, gefolgt von Inkubation in Abwesenheit des externen Magnetfelds während 5 Sekunden. Dieser Zyklus von elektromagnetischen Impulsen und Inkubationen wurde weitere 20 Male wiederholt. Das entstandene 750 bp DNA- Produkt wurde danach in einer Lösung von 90% Formamid/10 mM EDTA von den Dynabeads eluiert und -mittels Gelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse einer solchen elektrophoretischen Analyse bestätigten eine Amplifizierung eines spezifischen 750 bp MCR-Produkts.

BEISPIEL 6

Demonstration von Strangtrennung unter Verwendung elektromagnetischer Kraft

Die Fähigkeit einer Kraft, erzeugt durch ein angelegtes, elektromagnetisches Feld, welches von der vorstehend beschriebenen MCR-Vorrichtung erzeugt wird, mit einer Feldstärke um die Stränge eines 750 bp doppelsträngigen DNA- Moleküls zu trennen, wurde bestimmt. Zusätzlich wurde der für diese Bestimmung verwendete Test auch dazu verwendet, um zu bestimmen, ob gleichzeitig mit der Denaturierung des DNA- Doppelstrangs auch Strangspaltung auftrat.
Das Versuchsschema für diesen Test ist in Figur 3 gezeigt. Zwei Arten von Mikrotiter-Welis wurden vorbereitet. In beiden Wells waren etwa 0,2 Picomol eines einzelsträngigen DNA-Fragments von 750 Nucleotiden kovalent an das Mikrotiter-Well gebunden. In den Wells A war dieses DNA-Fragment unmarkiert, während in den Wells B das DNA-Fragment an seinem 5'-Ende radioaktiv markiert war. Jedes der DNA-Fragmente von 750 Nucleotiden in diesen Wells wurde mit einem einzelsträngigen DNA-Molekül von 500 Nucleotiden, welches zu den 500 3'-gelegenen Nucleotiden des 750 Nucleotid-Fragments komplementär war, annealt. Das 500 Nucleotid-Fragment war an seinem 5'-Ende biotinyliert und nicht-kovalent an Streptavidin-beschichtete Magnetbeads gebunden. In Gegenwart von geeigneten Puffern, Salzen und dNTPs wurde T7 DNA-Polymerase zugegeben und das 500 Nucleotid- Fragment wurde extendiert. In den Wells A wurde die Extendierung in der Gegenwart von (³²P)-markiertem DCTP durchgeführt, während in den Wells B keine radioaktiv markierten dNTPs vorhanden waren. Nach der Extension wurden die extendierten Stränge getrennt durch Anlegen eines externen Magnetfelds bei 50ºC wie vorstehend beschrieben. Das extendierte Produkt wurde danach wie in Beispiel 5 mit einer Formamid-Lösung von den Dynabeads eluiert und durch Elektrophorese analysiert. Die Wells wurden danach auf 90ºC erwärmt und die resultierenden Überstände wurden ebenfalls elektrophoretisch analysiert.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Figur 4 gezeigt. Eine Probe des radioaktiv markierten 750 Nucleotid-Templats ist zum Vergleich gezeigt. In den Proben aus den Wells A wird radioaktiv markierte (extendierte) DNA als eine breite, verschmierte Bande von 500-750 Nucleotiden erkannt, welche die Population der zu einem unterschiedlichen Ausmaß extendierten DNA-Moleküle darstellt. Weitere thermische Denaturierung bei 90ºC zeigt im wesentlichen keine zusätzliche radioaktiv markierte DNA, was darauf hindeutet, daß die magnetische Trennung in diesen Experimenten quantitativ war. Die Wells B zeigen weder bei 50ºC noch bei 90ºC radioaktiv markierte DNA, was darauf hindeutet, daß die magnetische Trennung ohne erhebliche Strangspaltung erreicht worden war, und daß die kovalente Bindung des radioaktiv markierten Templatstrangs gegenüber einer Erwärmung auf 90ºC stabil ist.
Diese Ergebnisse zeigen, daß DNA-Fragmente mit einer Länge von mindestens 750 Nucleotiden unter Verwendung eines externen Magnetfelds ohne eine gleichzeitig auftretende Strangspaltung quantitativ getrennt werden können, wie von der in den Beispielen 1-3 dargestellten theoretischen Diskussion vorhergesagt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Gamera Bioscience
(B) STRASSE: 200 Boston Avenue
(C) ORT: Medford
(D) BUNDESLAND: Massachusetts
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 02155
(G) TELEFON: 617-306-0827
(H) TELEFAX: 617-306-0837
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Magnetische Zyklusreaktion
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
ANMELDENUMMER: PCT/US94/06658
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
AACAGCTATG ACCATG 16
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
GTAAAACGAC GGCCAT 14
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
CGAACAGGTT ATCGAATTCA GCCAC 25
(2)ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
CATCGTCGTG TATTCCGGAC AGTAC 25

Claims

1. Verfahren zur Amplifizierung einer spezifischen einzelsträngigen Ziel-Nucleinsäure-, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Einbauen eines Festphasenprimers in einen zu der Ziel- Nucleinsäure komplementären Nucleinsäurestrang, wobei ein an die Ziel-Nucleinsäure gebundener Festphasenstrang erzeugt wird,

(b) Trennen des Festphasenstrangs von der Ziel- Nucleinsäure,

(c) Einbauen eines magnetischen Primers in einen zum Festphasenstrang komplementären Nucleinsäurestrang, wobei ein Duplex mit einem Festphasenstrang und einem magnetischen Strang erhalten wird,

(d) Trennen des Festphasenstrangs von dem magnetischen Strang durch Anlegen eines elektromagnetischen Feldes ausreichender Stärke um den Duplex zu dissoziieren,

(e) Annealen lassen von zum Festphasenstrang komplementären magnetischen Primern an den Festphasenstrang und Annealen lassen von zum magnetischen Strang komplementären Festphasenprimern an den magnetischen Strang,

(f) Extendieren der annealten Primer mit einer geeigneten DNA-Polymerase, und

(g) Wiederholen der Schritte (d) bis (f) so oft wie erforderlich um eine gewünschte Menge amplifizierter DNA zu erhalten.

2. Verfahren zur Amplifizierung einer spezifischen einzelsträngigen Ziel-Nucleinsäure, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Einbauen eines magnetischen Primers in einen zu der Ziel-Nucleinsäure komplementären Nucleinsäurestrang, wobei ein an die Ziel-Nucleinsäure gebundener magnetischer Strang erzeugt wird,

(b) Trennen des magnetischen Strangs von der Ziel- Nucleinsäure,

(c) Einbauen eines Festphasenprimers in einen zum magnetischen Strang komplementären Nucleinsäurestrang, wobei ein Duplex mit einem Festphasenstrang und einem magnetischen Strang erhalten wird,

(f) Extendieren der annealten Primer mit einer geeigneten DNA-Polymerase, und

3. Verfahren zur Amplifizierung einer spezifischen doppelsträngigen Ziel-Nucleinsäure, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Trennen der Stränge der Ziel-Nucleinsäure, wobei ein erster Strang und ein zweiter Strang erhalten wird,

(b) Einbauen eines Festphasenprimers in einen zum ersten Strang komplementären Strang, wobei ein erster Heteroduplex mit dem ersten Strang und einem Festphasenstrang erhalten wird, und Einbauen eines magnetischen Primers in einen zum zweiten Strang komplementären Strang, wobei ein zweiter Heteroduplex mit dem zweiten Strang und einem magnetischen Strang erhalten wird,

(c) Trennen der Stränge des ersten Heteroduplex und des zweiten Heteroduplex,

(d) Annealen lassen von zum Festphasenstrang komplementären magnetischen Primern an den Festphasenstrang und Annealen lassen von zum magnetischen Strang komplementären Festphasenprimern an den magnetischen Strang,

(e) Extendieren der annealten Primer mit einer geeigneten DNA-Polymerase,

(f) Trennen des Festphasenstrangs von dem magnetischen Strang durch Anlegen eines elektromagnetischen Feldes ausreichender Stärke um den Duplex zu dissoziieren,

(g) Annealen lassen von zum Festphasenstrang komplementären magnetischen Primern an den Festphasenstrang und Annealen lassen von zum magnetischen Strang komplementären Festphasenprimern an den magnetischen Strang,

(h) Extendieren der annealten Primer mit einer geeigneten DNA-Polymerase, und

(i) Wiederholen der Schritte (f) bis (h) so oft wie erforderlich um eine gewünschte Menge amplifizierter DNA zu erhalten.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der magnetische Primer ein an ein Ferritin-Molekül gebundenes Oligonucleotid ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der magnetische Primer ein an ein paramagnetisches Bead gebundenes Oligonucleotid ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Festphasenprimer ein an eine Glasmatrix gebundenes Oligonucleotid ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren durchgeführt wird in einem Puffer, umfassend:

(a) von etwa 10 bis etwa 20 mM Tris-HCl (pH 7-8),

(b) von etwa 5 bis etwa 15 mM MgCl&sub2;,

(c) etwa 1 mM DTT,

(d) von etwa 0,1 bis 0,3 mM jeweils von 4 dNTPs,

(e) etwa 0,5 mM Festphasenprimer und/oder

(f) etwa 0,5 mM magnetischen Primer, und

(g) von etwa 0 bis etwa 5,6 M Betain, und

(h) Ziel-Nucleinsäure.