DE10036486A1 - Verfahren zur Auftrennung von in Lösung befindlichen doppelstränigen Nukleinsäuren in einzelsträngige Nukleinsäuren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auftrennung von in wäßriger Lösung befindlichen doppelsträngigen Nukleinsäuren in einzelsträngige Nukleinsäuren. Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß die Zerlegung der Nukleinsäuren in Einzelstränge durch Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen durchgeführt wird, wobei die Frequenz und die Intensität der elektromagnetischen Wellen mit der Maßgabe ausgewählt sind, daß die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Nukleotiden einer doppelsträngigen Nukleinsäure durch unmittelbare Wechselwirkung der elektromagnetischen Strahlung mit der doppelsträngigen Nukleinsäure gelöst werden, wobei die Wellenzahl der elektromagnetischen Wellen in einem Transmissionsfenster von D¶2¶O liegt und wobei die wäßrige Lösung zumindest zum Teil mit D¶2¶O gebildet ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auftrennung von in wäßriger Lösung befindlichen doppelsträngigen Nuklein­ säuren in einzelsträngige Nukleinsäuren. - Der Begriff der Nukleinsäuren umfaßt neben DNA und RNA auch PNA. Mit die­ sem Begriff sind weiterhin natürliche Nukleinsäuren, i. e. Nukleinsäuren voller Länge, umfaßt, als auch Nukleinsäure­ fragmente. Fragmente bezeichnet dabei Teile einer (natür­ lich oder gentechnisch hergestellten) Nukleinsäure bzw. synthetisierte Nukleinsäuren. Typische Basenpaarzahlen von Fragmenten liegen beispielsweise im Bereich von kleiner als 10 bis zu über 2000. Nukleinsäuren können an einer oder an mehreren Stellen substituiert sein, beispielsweise mit Farbstoffmolekülen, Brückenmolekülen zur Immobili­ sierung an festen Substraten, und/oder reaktiven/kataly­ tischen Molekülgruppen. Solche Substituenten berühren die typische Funktionalität der Nukleinsäure, insbesondere die Hybridisierbarkeit, nicht.

Verfahren der vorstehenden Art werden z. B. in dem Bereich der Amplifikation bzw. Vervielfältigung von Nukleinsäure­ strukturen oder bei der Hybridisierung zu untersuchender Nukleinsäuren mit bekannten Nukleinsäuren zum Zwecke des Erhalts von Informationen über die Sequenz der unbekannten Nukleinsäuren (Stichworte: DNA-Hybridisierungstechniken, DNA Chips) oder auch bei der Synthese benötigt. Grundlage vieler gentechnischer Analyse- und Syntheseverfahren ist die selektiv arbeitende PCR (Polymerase chain reaction), eine einfache Vervielfältigungsmethode für gezielt aus­ suchbare DNA's oder DNA-Fragmente in einer Reaktionskammer (siehe z. B. US-A-4,683,195 und US-A-4,683,202) oder auch in situ, beispielsweise in einem Gewebeschnitt. Nach der Einführung temperaturstabiler Polymerasen hat diese Meth­ ode weite Verbreitung in gentechnischen Laboratorien ge­ funden. Aber auch andere Anwendungen benötigen eine Auftrennung einer doppelsträngigen Nukleinsäure in Einzel­ stränge. So ist dies beispielsweise bei der einfachen Hy­ bridisierungsreaktion notwendig, wenn die zu hybridi­ sierende Nukleinsäure doppelsträngig vorliegt. Nach der Hybridisierung ist es oftmals ebenfalls notwendig, eine Auftrennung in Einzelstränge durchzuführen, beispielsweise zur Regeneration von bestimmten Bindungsstellen oder zur effizienteren Detektion der erfolgten Hybridisierung. Schließlich kann es auch erforderlich werden, Nuklein­ säuren von Substraten und/oder immobilisierten Bindung­ spartnern zu lösen, beispielsweise im Falle von Nukleinsäure Chips. Auch hier kann eine übermäßige Erwär­ mung u. U. stören.

PCR ist insbesondere die gezielte Vervielfältigung eines präzise aus dem Genom ausgesuchten relativ kurzen Segments der zweisträngigen DNA in einfachen Temperaturzyklen. Die Auswahl des DNA-Segments erfolgt durch ein sogenanntes Paar von Primern, zweier DNA-Stücke mit je etwa 5-30 Basen Länge, die die beiderseitigen Enden des ausgesuchten DNA- Segments codieren. Die Vervielfältigung erfolgt durch ein Enzym namens Polymerase. Die PCR-Reaktion läuft in wäßriger Lösung ab, in der wenige Moleküle der Ausgangs- DNA und genügende Mengen an Polymerase, Primern, Triphos­ phaten der natürlichen und/oder weiteren nicht-natürlichen Nukleotide, Aktivatoren und Stabilisatoren vorhanden sind. In jedem Temperaturzyklus wird zunächst die Doppelhelix der DNA bei etwa 95°C "aufgeschmolzen", wobei die beiden Stränge voneinander getrennt werden. Bei etwa 45°C werden dann die Primer an eine genau passend komplementäre Nuk­ leotidfolge der DNA-Einzelstränge angelagert ("Hybridis­ ierung"). Bei 72°C wird die Doppelhelix durch den Anbau der komplementären Nukleotide an ein Wachstumsende der Primer durch eine besonders temperaturfeste Polymerase (Taq-Polymerase) wieder zu einer neuen Doppelhelix ver­ vollständigt. Dadurch wird das ausgewählte DNA-Segment zwischen den Primern im Prinzip verdoppelt. In dreißig Zyklen werden also aus einem einzigen Doppelstrang der DNA als Ausgangsmaterial rund eine Milliarde DNA-Segmente erzeugt, deren beide Enden mit den Primern identisch sind.

Die Vervielfältigung der DNA erfolgt bei den heutigen PCR Geräten schon relativ schnell im Vergleich zu den früher benutzten Klonierungsmethoden in lebenden Zellen. Bei op­ timiertem Steuerprogramm kann innerhalb drei Stunden mit einem handelsüblichen PCR-Gerät aus aufgeschlossenem Zell­ material ein etwa 400 Basenpaare langes DNA-Fragment am­ plifiziert werden, so daß sich die DNA Konzentration deutlich über die Nachweisgrenze (im Agarosegel unter UV- Bestrahlung und Färbung mit Ethidiumbromid) erhöht.

Das Schmelzen der DNA erfolgte bisher bei einer Tempera­ tur, die knapp über der empirisch ermittelten Schmelztem­ peratur liegt. Untersuchungen haben gezeigt, daß eine halbe Sekunde Erhitzung auf diese Temperatur für eine vollständige Trennung aller Doppelhelix-Strukturen genügt. Die Hybridisierung braucht ebenfalls nicht lange, wenn die Primer in genügender Konzentration vorhanden sind. Bei optimaler Konzentration sind etwa ein bis zwei Sekunden ausreichend. Die Vervollständigung der DNA hat eine sehr hohe Geschwindigkeit: Pro Sekunde können unter optimalen Temperatur- und Konzentrationsbedingungen 50 bis 100 Basen durch eine spezielle Polymerase angebaut werden (C. R. Newton und A. Graham: PCR; Spektrum Akademischer Verlag; Heidelberg, Berlin, Oxford, 1994; Seite 31). Da im allge­ meinen nur DNA Segmente von bis zu 400 Basen Länge für die Analysen benötigt werden, reichen zehn Sekunden gut für die Verlängerung aus.

Die Zeitdauer für einen. Temperaturzyklus hängt somit größtenteils von der Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeit ab, die wiederum vom Flüssigkeitsvolumen, von den Gefäßdi­ mensionen und von der Wärmeleitfähigkeit der Gefäßwände und der Reaktionslösung abhängt. Bei üblichen Geräten, beispielsweise dem Primus 96, MWG Biotech AG, Deutschland, wird hierzu zum Aufheizen einer 5 ml DNA Lösung mit elek­ trischen Leistungen von ca. 400 Watt gearbeitet. Auf jeder Temperaturstufe sind im Prinzip nur wenige Sekunden von­ nöten, teilweise sogar weniger.

Es ist bekannt, durch Verringerung des Probenvolumens, Vergrößerung der spezifischen Oberfläche und durch pneuma­ tisches Anlegen eines Kühlblocks die Übergangszeiten zum folgenden Temperaturniveau so kurz wie möglich zu halten (DE 197 17 085 A1). Dies ist jedoch nur mit erheblichem mechanischen und mikrosystemtechnischen Aufwand möglich.

Aus der Literaturstelle WO 98/00562 ist es bekannt, den Aufschmelzprozeß mittels eines elektrischen Feldes dur­ chzuführen, welches im Zuge des Reaktionsverlaufes ab­ geschaltet oder invertiert wird.

Aus der Literaturstelle WO 96/41864 ist es bekannt, eine zum Aufschmelzen erforderliche Temperatur in der Lösung mittels Einstrahlung von IR- und UV-Licht einzustellen. Demgemäß kann entweder breitbandig gearbeitet werden, es kann aber auch kohärente Strahlung eingesetzt werden. In jedem Fall ist betont, daß die Wellenzahlen mit der Maßgabe auszuwählen sind, daß sie im Bereich hoher Absorp­ tionskoeffizienten des Wassers liegen. Ähnliche Verfahren sind in den Literaturstellen US-A-5,972,667 und US-A-5,721,123 beschrieben. In allen drei Literaturstellen wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die Einstrahlung zum Zwecke der Temperaturerhöhung der Lösung bzw. des Lösungsmediums erfolgt. Da somit eine Erwärmung der Lösung auf ca. 95°C erfolgt, muß mit entsprechend hohen Leistun­ gen gearbeitet werden und die subsequente Abkühlung ist mit allen Problemen und Zeitverzögerungen analog der elek­ trischen Aufheizung behaftet.

Aus der Literaturstelle WO 98/06876 ist es bekannt, den Aufheizvorgang zum Aufschmelzen dadurch durchzuführen, daß ein in der Lösung befindliches Festkörpersubstrat mittels Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen aufgeheizt wird. Die zum Einsatz kommenden elektromagnetischen Wellen weisen Frequenzen unterhalb von 1,07 GHz auf.

Eine hohe Geschwindigkeit der PCR ist insbesondere aus den folgenden Gründen erwünscht. Im Verfolg der Entschlüsse­ lung des menschlichen Erbgutes im "Human Genome Project" wird im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Techniken, mittels welchen die gewonnenen Informationen ausgewertet und verwertet werden, die PCR benötigen. Beispielsweise beruhen praktisch alle Biochip Technologien auf dem Einsatz der PCR. Weiterhin existieren PCR Anwendungen, die der Diagnose dienen, beispielsweise zur Erkennung von bes­ timmten Tumorzellen in menschlichem Gewebe. Sollen solche Analysen beispielsweise während einer Operation am Patien­ ten durchgeführt werden, dann wird eine maximale Analysen­ dauer von 10 Minuten gefordert. Bisher beschriebene PCR Geräte (A. T. Woodley et. Al., "Functional Integration of PCR Amplification and Capillary Electrophoresis in a Mi­ crofabricated DNA Analysis Device", Anal. Chem. 68, 4081, Dezember 1996) benötigen tpischerweise jedoch mindestens 15 Minuten bei einem Programm mit 30 Zyklen. Die Zeit, die man zum Aufschließen der Zellen und zur Freilegung der DNA benötigt, ist dabei noch nicht eingerechnet. Schließlich wird PCR beispielsweise auch bei der Selektion von gegen vorgegebene Zielstoffe affinen Aptameren bzw. Ribozymen aus hochkomplexen DNA-Bibliotheken (10₁₅ und mehr) einge­ setzt.

Ein weiteres Problem der bekannten PCR Verfahren, und zwar auch der Verfahren mit Einstrahlung von elektroma­ gnetischen Wellen, welche vom Medium absorbiert werden, ist die irreversible Zerstörung der Polymerase durch die hohe Temperatur während des Aufschmelzens. Obwohl es heute schon sehr gut auf Temperaturstabilität optimierte Po­ lymerasen gibt, sinkt die Leistungsfähigkeit der Enzyme bei jedem Zyklus beträchtlich ab. Die Halbwertszeit der Aktivität üblicher Polymerasen (von Thermus aquaticus) bei 95°C beträgt 40 Minuten (C. R. Newton und A. Graham: PCR; Sektrum Akademischer Verlag; Heidelberg, Berlin, Oxford, 1994; Seite 31). Gerade während der letzten Zyklen wird aber eine sehr hohe Aktivität der Polymerase gefordert, da bereits sehr viele DNA Amplifikate erzeugt wurden, die alle gleichzeitig verlängert werden sollen. Es muß daher eine entsprechend höhere Menge des teuren Enzyms einge­ setzt werden. Einige PCR Verfahren begegnen diesem Problem durch eine sukzessive Verlängerung der Elongationszeiten in jedem Zyklus. Ein Polymerase-Molekül kann dann mehrmals hintereinander an unterschiedlichen Stellen während eines Zyklus eingesetzt werden. Dies erhöht jedoch wiederum die Gesamtdauer der PCR. Es wäre wünschenswert, wenn eine Op­ timierung der Verlängerungsgeschwindigkeit der Polymerasen gelänge, anstatt die Temperaturstabilität der Enzyme weiter verbessern zu müssen.

Den bekannten Technologien ist gemeinsam, daß der Bedarf an elektrischer Energie aufgrund der notwendigen Heiz- und Kühlprozesse relativ hoch ist mit der Folge, daß ent­ sprechende Stromversorgungseinheiten vorgesehen sein müssen. Dies macht Geräte des Standes der Technik volu­ minös und schwer und erschwert einen vor-Ort Einsatz außerhalb eines speziell vorgesehenen Labors. Zudem werden spezielle, temperaturstabile Polymerasen benötigt, die teuer sind, zumal aufgrund der Halbwertszeiten auch eine größere Menge benötigt wird.

Daher liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mittels welchem innerhalb kürzester Zeit eine doppelsträngige Nukleinsäure in Ein­ zelstränge zerteilt werden kann. Insbesondere ist es wünschenswert, die Zykluszeit für die PCR Amplifikation von Nukleinsäuren zu beschleunigen und auf wenige Sekunden zu reduzieren. Ebenso wünschenswert ist es, die für Po­ lymerasen schädliche Erhitzung auf hohe Temperaturen zu vermeiden und so die PCR effektiver werden zu lassen und gleichzeitig teures Polymerase Enzym einzusparen, insbe­ sondere aber auch den Einsatz weniger temperaturstabiler Polymerasen zu gestatten. Schließlich wäre eine Ver­ ringerung des Bedarfes an elektrischer Energie zum Zwecke eines mobilen Einsatzes, beispielsweise mit Batterien, wünschenswert.

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Er­ findung, daß die Zerlegung der Nukleinsäuren in Einzel­ stränge durch Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen durchgeführt wird, wobei die Wellenzahl und die Intensität der elektromagnetischen Wellen mit der Maßgabe ausgewählt sind, daß die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Nukleo­ tiden einer doppelsträngigen Nukleinsäure durch unmittel­ bare Wechselwirkung der elektromagnetischen Strahlung mit der doppelsträngigen Nukleinsäure gelöst werden, wobei die Wellenzahl der elektromagnetischen Wellen in einem Trans­ missionsfenster von D₂O liegt und wobei die wäßrige Lösung zumindest zum Teil mit D₂O gebildet ist. - Als Transmis­ sionsfenster ist ein Wellenzahlenbereich bezeichnet, in welchem die molare Absorptivität, messen gemäß der Litera­ turstelle S. Y. Venyaminov et al., Analytical Biochemistry 248: 234-245 (1997) weniger als 5 M^-1cm^-1, vorzugsweise weni­ ger als 3 M^-1cm^-1, beträgt.

Die Erfindung beruht auf den folgenden Erkenntnissen. Die genaue Struktur, die Bindungslängen, die Bindungswinkel und die Bindungsenergie der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Nukleinsäure bzw. DNA Strängen und die molekularen Massenanteile der Nukleotide sind bekannt. Wenn dann die Frequenzen der elektromagnetischen Wellen zudem so ausgewählt sind, daß die Wellen mit dem Medium, i. e. Reaktionspuffer bzw. seinen mengenmäßigen Hauptkompo­ nenten, eine möglichst geringe Wechselwirkung aufweisen, kann eine (unerwünschte) thermische Aufheizung des Gesamtgemisches vermieden werden. Es versteht sich, daß die Frequenzen auch so gewählt sein sollten, daß keine störende Absorption durch die Polymerasen stattfindet.

Zum Schmelze n der Nukleinsäure muß dem Molekül Energie hinzugefügt werden, deren Betrag mindestens so hoch ist, wie die Bindungsenergie der Wasserstoffbrücke. Die für die Erfindung wesentliche Erkenntnis ist, daß Nukleinsäure­ moleküle wegen ungleicher Verteilung elektrischer Ladungen durch elektromagnetische Wechselfelder zum Schwingen an­ geregt werden können. Hierbei können insbesondere die an den Wasserstoffbrückenbindungen beteiligten Molekülgrup­ pen, beispielsweise C=O und/oder N-H Gruppen, angeregt werden. In Frage kommende Wellenzahlen können beispiel­ sweise mittels der Raman Spektroskopie ermittelt werden. Wellenzahlen mit hohem Absorptionskoeffizienten im Raman Spektrum sind im Rahmen der Erfindung geeignet. Insbeson­ dere Streckschwingungen von C=O und/oder N-H Gruppen führen zu einer Destabilisierung der angrenzenden Wasserstoffbrückenbindungen der Nukleinsäure. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, ist anzumerken, daß eine Auftrennung statt findet, wenn der eingetragene Quan­ tenenergiebetrag größer als die Bindungsenthalpie der H- Brücke ist. Beispielsweise aus der Bindungsenthalpie von H = 12,6 kJ/mol ergibt sich je Bindung ein Wert von H = 2,09.10^-20 J. Mit E = h.v erhält man eine Frequenz von 31,5 THz bzw. eine Wellenzahl von 1051 cm^-1. Wenn im Bereich solcher Frequenzen mit ausreichender Leistung Energie eingestrahlt wird, kann dies zu einer Lösung der Wasserstoffbrückenbindungen und folglich einer Vereinze­ lung der beiden Stränge einer doppelsträngigen Nuklein­ säure führen.

Die Erfindung beruht auf der weiteren Erkenntnis, daß leichtes Wasser H₂O bei den Wellenzahlen, die zu einer Auf­ trennung der Nukleinsäuren führen, ebenfalls in beachtli­ chem Maße absorbiert, und folglich zumindest ein Teil des leichten Wassers durch ein Lösungsmittel, nämlich D₂O er­ setzt werden kann, welches bei diesen Absorptionsbanden der Nukleinsäuren nicht oder nur geringfügig absorbiert, wenn eine störende Absorption durch das Medium und fol­ glich dessen unerwünschte Erwärmung vermieden werden soll. Grundsätzlich ist insofern auch ein entsprechendes nicht- wäßriges Lösungsmittel, in welchem die Nukleinsäuren sta­ bil sind und die gewünschten Reaktionen störungsfrei aus­ geübt werden können, einsetzbar. Durch Ein- und Ausschalten der Strahlungsquelle kann somit eine reversi­ ble, nahezu isotherme Auftrennung doppelsträngiger Nuk­ leinsäuren in einzelsträngige Nukleinsäuren erreicht werden, wobei der Beriff "isotherm" dahingehend zu verste­ hen ist, daß zu keinem Zeitpunkt eine Temperatur des Medi­ ums bzw. des Reaktionspuffers erreicht wird, die der thermodynamischen Schelztemperatur aller anwesender dop­ pelsträngiger Nukleinsäuren entspricht. In diesen Zusam­ menhängen ist anzumerken, daß in Falle einer gewünschten maßvollen Erwärmung der Grad der Erwärmung des Mediums bei vorgegebener Einstrahlleistung und -Dauer auch über das Mischungsverhältnis H₂O/D₂O eingestellt werden kann. Das Gewichtsverhältnis H₂O/D₂O im Reaktionspuffer bzw. der Lösung beträgt beispielsweise 0 : 100 bis 99,5/0,5, vorzug­ sweise 0 : 100 bis 50 : 50, höchstvorzugsweise 0 : 100 bis 10 : 90.

Es ist somit möglich, durch gezielte Einstrahlung elektro­ magnetischer Wellen mit definierten Wellenzahlen, insbe­ sondere Nukleinsäure-Resonanzfrequenzen, welche abseits von Resonanzen des Mediums bzw. der Polymerasen liegen, selektiv eine Trennung der Nukleinsäurestränge voneinander zu bewirken, und zwar ohne eine beim Stand der Technik festzustellende unerwünschte Erwärmung des Puffers und insbesondere der Polymerasen. Dies wird (neben der nicht beobachteten Erwärmung) auch dadurch belegt, daß die Tren­ nung nur wenige Milliwatt, beispielsweise 0,1 bis 1000 Milliwatt, insbesondere 1 bis 100 Milliwatt, erfordert, bei geeigneter Anpassung der Expositionsvorrichtung und Positionierung des Reaktionsgefäßes.

Mit der Erfindung wird erreicht, daß beispielsweise bei der PCR die Aufheiz- und Abkühlungsperiode entfällt bzw. kürzer ausfällt, so daß sich die Zykluszeiten und damit die Gesamtdauer des Amplifikationsvorgangs im Vergleich zur vorbekannten PCR erheblich verkürzt. Gleichzeitig wird die zur Vervielfachung notwendige Polymerase praktisch nicht durch Hitzedenaturierung geschädigt, so daß eine kleinere Menge des teuren Enzyms eingesetzt werden kann. Es kann aber auch eine weniger hitzebeständige Polymerase eingesetzt werden. Dies beruht letztendlich darauf, daß Resonanzen der Polymerase typischerweise nicht bei gleichen Wellenzahlen wie Molekül-Resonanzen in einem (Doppel-)Strang liegen. Wesentlich ist hierbei also letzt­ endlich, daß der Aufschmelzvorgang erfindungsgemäß nicht durch Temperaturerhöhung (des Mediums), sondern durch Ein­ strahlung elektromagnetischer Wellen mit einer definierten Nukleinsäure-Wellenzahl erfolgt.

Im Rahmen der Erfindung bevorzugt ist es, wenn die Wellen­ zahlen der elektromagnetischen Strahlung im Bereich von weniger als 1150 cm^-1 und/oder 1200 bis 2200 cm^-1 und/oder oberhalb 2700 cm^-1 eingestellt ist mit der Maßgabe, daß die eingestellte Frequenz zumindest teilweise solche Schwin­ gungszustände der Nukleinsäure anregt, welche in einer Trennung ausschließlich der Wasserstoffbrückenbindungen resultieren, nicht jedoch Bindungen einer Polymerase spal­ tet (dies schließt geringfügige Zersetzungsraten von bis zu 10%, vorzugsweise weniger als 2%, der Rate bei Erwär­ mung auf 95°C ein) oder zu einer Temperaturerhöhung eines Mediums führt (dies schließt unwesentliche Temperatur­ erhöhungen eines nicht thermostatisierten Mediums von bis zu 20°C/min., vorzugsweise von weniger als 5°C/min. ein). Dies ist der Wellenzahlenbereich, in welchem experi­ mentell, beispielsweise mittels Raman Spektroskopie, geeignete Resonanzen gefunden werden können, um doppel­ strängige DNA bei Temperaturen unterhalb der thermodyna­ mischen DNA-Schmelztemperatur, bis hinunter zu 20°C, zu schmelzen. Durch beispielsweise Raman Spektroskopie an Lösungen mit Polymerase, jedoch ohne Nukleinsäuren, können die für die Stabilität der eingesetzten Polymerase schädlichen Wellenzahlen ermittelt und so vermieden wer­ den. Im Bereich unterhalb 1150 cm^-1 liegen die Phosphat­ gruppenschwingunen sowie der Fingerprintbereich von Nukleinsäuren. Im Bereich zwischen 1250 und 2200 cm^-1 liegen die C=O Streckschwingungen von Nukleinsäuren. Im Bereich oberhalb von 2700 cm^-1 liegen die H- Streckschwingungen von Nukleinsäuren.

Zusätzlich zu den erfindungsgemäß eingesetzten Wellen­ zahlen können elektromagnetische Wellen mit Wellenzahlen eingestrahlt werden, welche zu einer definierten moderaten Erwärmung des Mediums bzw. des Reaktionspuffers führen, wobei die Wellenzahl, die Strahlungsleistung und die Bestrahlungsdauer mit der Maßgabe ausgewählt sind, daß das Medium auf Temperaturen von nicht mehr als 90°C, vorzugs­ weise nicht mehr als 75°C, innerhalb einer Aufheizver­ fahrensstufe aufgeheizt wird.

Von selbstständiger Bedeutung im Rahmen der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Verfahren zur in vitro Amplifikation von Nukleinsäuren mit den folgenden Verfahrenstufen: a) Zerlegung der Nuklein­ säuren in Einzelstränger b) Anhybridisierung von Primern an die Einzelstränge aus Stufe a), c) Verlängerung der in Stufe b) anhybridisierten Primer durch (Desoxy-) Ribonuk­ leosidtriphosphate mittels Einsatz einer Polymerase, d) Rückführung der in Stufe c) erhaltenen Nukleinsäuren in die Stufe a), wobei die Stufen a)-d) so oft wiederholt werden, bis ein vorgegebener Amplifikationsfaktor erreicht ist und wobei die elektromagnetische Strahlung in Stufe a) eingestrahlt wird.

Bevorzugt ist es, wenn auf Nukleinsäure-Synthese- Geschwindigkeit optimierte Polymerasen in Stufe b) einge­ setzt werden. Diese brauchen nämlich nicht mehr die beim Stand der Technik erforderliche Temperaturbeständigkeit aufzuweisen. So wird der bisher langsamste und damit geschwindigkeitsbestimmende Schritt der PCR deutlich verkürzt.

Die Erfindung ist grundsätzlich bei allen PCR-Methoden einsetzbar, beispielsweise auch im Rahmen der Sequenzier­ reaktion mit der Kettenabruchmethode nach Sanger.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Reaktionskammer zur Aufnahme einer Lösung mit Nukleinsäuren und ggf. weiteren Reagenzien, insbesondere Polymerasen und Nukleotiden, mit einer Vor­ richtung zur Erzeugung Elektromagnetischer Wellen sowie einem die Reaktionskammer begrenzenden optischen Fenster, wobei die Vorrichtung zur Erzeugung elektromagnetischer Wellen Strahlung im Bereich von weniger als 1100 cm^-1 und/oder 1300 bis 2100 cm^-1 und/oder mehr als 2700 cm^-1 erzeugt. - Als Vorrichtungen zur Erzeugung elektromag­ netischer Strahlung kommen insbesondere IR- Strahlungsquellen in Frage. Zur Erzeugung kohärenter IR- Strahlung definierter Wellenzahl sind beispielsweise IR- Laser, typischerweise Kohlenmonoxid Gaslaser, Kohlenmon­ oxid Obertonlaser, Optisch-Parametrische-Oszillatoren (OPO), Laser mit Heterodyn-Mischverfahren oder Halbleiter­ laser, wie Bleisalz-Diodenlaser oder Quantenkaskaden-Laser geeignet. Halbleiterlaser sind wegen der preisgünstigen Herstellung, der geringen Betriebsleistung und der unprob­ lematischen Temperierung besonders vorteilhaft für kleine und tragbare Geräte zur Nukleinsäure-Denaturierung. Bei Einsatz von nicht-kohärenten Strahlungsquellen müssen ggf. Wellenzahlanteile, welche im Bereich der Absorptionsbanden von H₂O bzw. D₂O liegen, mittels einer Wellenzahlenselek­ tionsvorrichtung so hinreichend gedämpft oder ausgeblendet werden, daß eine strahlungsbedingte Erwärmung der Lösung auf Temperaturen oberhalb 90°C, besser oberhalb 80°C oder 75°C, verhindert wird. Dies kann beispielsweise durch Zwischenschaltung geeigneter Transmissionsfilter, Notch- Filter, sonstigen Interferenzfilter, einem Prisma- oder einem Gitter-Monochromator zwischen der Strahlungsquelle und dem optischen Fenster erfolgen. Alternativ oder zusätzlich kann das optische Fenster selbst die benötigte Filterfunktion ausüben. Es versteht sich, daß das optische Fenster für die erfindungsgemäß eingesetzten Wellenzahlen eine gute Transmission aufweisen sollte.

Das optische Fenster kann einen Teil der Wandung der Reak­ tionskammer bilden, die Reaktionskammer kann aber auch insgesamt als otpisches Fenster ausgebildet sein. Die Reaktionskammer kann auf verschiedene Weisen weiter ausge­ bildet sein. So kann die Reaktionskammer als diskon­ tinuierlicher Rührkessel-Reaktor ausgebildet sein. Dies meint, daß die Reaktionslösung stationär bleibt und ggf. agitiert wird. Es ist aber auch möglich, die Reaktionskam­ mer als kontinuierlichen Rührkessel, beispielsweise als Rohrreaktor, auszubilden, wobei in das Innere des Reaktors und im Falle eines Rohrreaktors in Richtung der Längser­ streckung des Rohrreaktors elektromagnetische Wellen ein­ strahlbar sind. In einem solchen Reaktor ist die Reaktionslösung mobil und strömt zwischen einem Einlaß und einem Auslaß durch den Reaktor. Dabei ist der Reaktions­ fortschritt bzw. sind die Reaktionsstufen eine Funktion der Verweilzeit bzw. des Ortes (im Falle eines Rohrreak­ tors in erster Näherung eindimensional entlang der Längs­ erstreckung). Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Reaktionskammer ist eine (ggf. beidseitig geschlossene) Kapillare, wobei die Kapillare hinsichtlich ihrer Längser­ streckung zumindest zum Teil in Richtung des elektrischen Feldvektors der elektromagnetischen Strahlung ausgerichtet ist.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens kann die Strahlungsquelle zur periodischen Emission der Strahlung ausgebildet sein, und zwar entsprechend der Reaktionszyklen so, daß lediglich in der Verfahrenstufe a) eingestrahlt wird. Dies ist durch eine Steuereinheit möglich, welche entweder die Strahlungsquelle entsprechend periodisch ein- und ausschaltet. Ebenso kann aber auch mittels der Steuereinheit eine Abschatteinheit, beispiels­ weise eine Blende oder ein Schutter, so angesteuert wer­ den, daß das optische Fenster gegenüber der Strahlungsquelle in den Verfahrensstufen b) bis d) ab­ geschattet wird.

Für das Annealing der Primer ist es aus Spezifitätsgründen oft sinnvoll, eine Temperaturregelung der Reaktionskammer auf eine konstante Temperatur oberhalb der Raumtemperatur, beispielsweise 25-80°C, insbesondere 40 bis 70°C oder 60°C, vorzusehen. Neben der vorstehend bereits beschrie­ benen Erwärmung durch (zusätzlich) Einstrahlung von von dem Lösungsmittel absorbierbarer Strahlung kann dies auch auf konventionell elektrischem Wege erfolgen. Im Falle der Strahlung kann die Regelung durch Veränderung der reflek­ tiven Eigenschaften der Wände der Reaktionskammer und/oder durch eine Veränderung der Transmissionseigenschaften des optischen Fensters oder vorgeschalteter optischer Elemente erfolgen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Wände der Reaktionskammer, mit Ausnahme des optischen Fensters, reflektierend im Bereich der erfindungsgemäß eingesetzten Wellenzahlen ausgebildet. Dann wird die Ef­ fektivität der Aufspaltung erhöht aufgrund der besseren Ausnutzung der eingestrahlten elektromagnetischen Wellen.

Eine oder mehrere Nukleinsäuren, und/oder für die Reak­ tionen der Nukleinsäuren eingesetzten Enzyme oder Kata­ lysatoren können dabei in dem Reaktor immobilisiert sein. Dies kann an den Reaktorwandungen erfolgt sein, besonders bevorzugt ist aber eine Immobilisierung reaktorinnenseitig am optischen Fenster. Damit wird ein Effekt einer lösungs­ mittelbedingte Dämpfung der eingestrahlten elektromag­ netischen Wellen noch weiter reduziert, da die Wellen zunächst unmittelbar auf die Zielmoleküle auftreffen. Auch ist eine Immobilisierung der besagten Komponenten an in der Lösung suspendierbaren Partikeln oder nicht-mischbaren Flüssigkeitstropfen möglich. Hierdurch kann eine Abtren­ nung in einer an die Reaktion(en) anschließenden Tren­ nungsverfahrenstufe erleichtert werden.

Folgend werden Details der Erfindung sowie weitere mögli­ che Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.

Bei der PCR durchläuft das Reaktionsgemisch im einzelnen die folgenden physikalischen und chemischen Zustand­ sänderungen:

a) Das Reaktionsgemisch wird mit elektromagnetischen Wel­ len einer oder mehrerer definierter Wellenzahlen mit aus­ reichender Leistung bestrahlt. Doppelsträngige DNA geht dabei in einzelsträngige DNA über. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wird dabei von den elektromagnetischen Wellen nicht wesentlich beeinflußt. b) Die Einstrahlung der elektromagnetischen Wellen wird beendet und das Reak­ tionsgemisch wird auf eine geeignete Temperatur geregelt, die unterhalb der Anlagerungstemperatur der Primer liegt. Die Primer können sich an den komplementären Stellen der einzelsträngigen DNA anlagern. c) Das Reaktionsgemisch wird auf eine Temperatur geregelt, bei der die Polymerase mit optimaler Geschwindigkeit den komplementären Strang mit Nukleotiden auffüllt. Diese drei Stufen können so oft wie gewünscht wiederholt werden. Das entstandene doppelsträngige Reaktionsprodukt wird dabei wieder in (a) eingesetzt.

In der Praxis ist es möglich, für die Verfahrensstufen b) und c) die gleiche Temperatur, beispielsweise im Bereich von 20°C bis 80°C, einzustellen. Der Verlauf der Gesamt­ reaktion ist dann isotherm. Dies ermöglicht eine beacht­ liche apparative Vereinfachung gegenüber PCR gemäß dem Stand der Technik, bei welchem mit hoher Präzision und folglich hohem technischen Aufwand unterschiedliche Tem­ peraturstufen angefahren und eingeregelt werden müssen, und dies zudem möglichst schnell.

Das Reaktionsgemisch setzt sich dabei aus den üblichen Komponenten zusammen, wie sie bei der konventionellen PCR oder deren Weiterentwicklungen benutzt werden. Dies sind mindestens ein geeignetes Lösungsmittel, eine sehr kleine Menge Nukleinsäure als Matritze, ein oder mehrere geeignete Oligonukleotide als Primer, Desoxynukleotid­ triphosphate aller in der Matritze zwischen den Primern liegenden Nukleinbasen, und eine Substanz, welche die Ket­ tenverlängerung katalysiert (e. g. Polymerase).

Eine (zusätzliche) Einstrahlung von anderen Wellenzahlen, als die erfindungsgemäß zur Auftrennung der Doppelstränge eingesetzten Wellenzahl, kann unter Umständen nützlich sein, um Quervernetzungen bei komplizierten Tertiärstruk­ turen der DNA aufzulösen und dadurch die Amplifikation des DNA-Abschnittes zu erleichtern.

Die Erfindung kann auch im Rahmen der in-situ PCR vorteil­ haft verwendet werden. Hierbei wird beispielsweise ein Gewebeschnitt mit den PCR Reagentien versetzt, wobei zumindest ein Primer eine Markierung trägt. Mit Markierung sind jegliche Art von meß- oder färbetechnisch wirksame Markierungsatome oder Markierungsmoleküle gemeint. Dann wird der Gewebeschnitt dem o. g. Reaktionszyklus ausgesetzt mit dem Ergebnis, daß Nukleinsäuren mit sehr hoher Empfind­ lichkeit und lateraler Auflösung detektierbar sind. Mit der Erfindung wird erreicht, daß eine Austrocknung eines Gewebeschnitts und/oder eine Denaturierung von Stoffen darin aufgrund der geringeren Aufheizung zuverlässig ver­ hindert werden kann, und zwar unter Vermeidung der anson­ sten hierfür erforderlichen Maßnahmen.

Eine Verfolgung der Aufspaltung der doppelsträngigen Nuk­ leinsäuren in einzelsträngige Nukleinsäuren kann durch Beobachtung des hypochromatischen Effekts erfolgen. Hierzu wird mittels einer UV-Lichtquelle (200-1000 nm) die Lösung durchstrahlt und mittels eines UV-Detektors (spek­ trale Selektivität im Wellenlängenberich von 250-260 nm) gemessen. Die Anordnung ist so getroffen, daß der Reaktor, beispielsweise eine Kapillare, durchstrahlt wird. Die UV- Transmissionsmessungen erfolgen bei 260 nm. Bei den UV- Absortionsmessungen ist die gewählte UV-Wellenlänge spezi­ fisch für einzelsträngige DNA (hyperchromatischer Effekt). Eine hohe Transmission steht also für eine geringe Konzen­ tration an einzelsträngiger DNA. Eine niedrige Trans­ mission zeigt dagegen das Vorliegen einzelsträngiger DNA an.

Folgend wird die Erfindung anhand von lediglich Aus­ führungsbeispielen darstellenden Figuren näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 Raman Spektrum einer Nukleinsäure,

Fig. 2 Raman Spektren der Nukleinsäure aus Fig. 1 zusam­ men mit Ramanspektren von H₂O und D₂O,

Fig. 3 Raman Spektrum von D₂O, H₂O und der Nukleinsäure aus Fig. 1 im einem Bereich höherer Wellenzahlen,

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer erfindungs­ gemäßen Vorrichtung mit köhärenter Strahlungsquelle,

Fig. 5 eine schematische Darstellung einer erfindungs­ gemäßen Vorrichtung mit nicht-köhärenter Strahlungsquelle und Transmissionsfilter,

Fig. 6 eine schematische Darstellung einer erfindungs­ gemäßen Vorrichtung mit nicht-kohärenter Strahlungsquelle und Prismenfilter,

Fig. 7 eine schematische Darstellung einer erfindungs­ gemäßen Vorrichtung mit nicht-köhärenter Strahlungsquelle und Gitterfilter,

Die Fig. 1 zeigt ein Ramanspektrum der Nukleinsäure d(GCGAATTCGC)₂, gemessen mit einem HeNe Laser mit 10 mW bei 632 nm. Insbesondere von Interesse sind die C=O Streckschwingungen bei knapp 1700 cm^-1. Die Nukleinsäure wurde in wäßriger D₂O Lösung gemessen, die Menge an Nuk­ leinsäure betrug 30 mM.

In der Fig. 2 erkennt man, daß die C=O Streckschwingung der untersuchten Nukleinsäure d(GCGAATTCGC)₂ genau im Bereich von einem ausgeprägten Maximum der Biegeschwingung des leichten Wassers liegt. Demgegenüber absorbiert D₂O sowie durch Isotopenaustausch entstehendes HDO bei erheb­ lich niedrigeren Wellenzahlen und legt die C=O Streck­ schwingung der Nukleinsäure gleichsam frei mit der Folge, daß eine Einstrahlung beispielsweise bei ca. 1690 cm^-1 in einer wäßrigen Lösung mit leichtem Wasser zur Wassererwär­ mung in beachtlichem Maße führt, während in einer Lösung mit schwerem Wasser die eingestrahlten Wellen nahezu ausschließlich zur Auftrennung der Nukleinsäure genutzt werden können. Gemessen wurde mit einem HeNe Laser, 10 mW, 632 nm.

In der Fig. 3 erkennt man, daß die H-Streckschwingungen der untersuchten Nukleinsäure (jene der Fig. 1 und 2) im ansteigenden Ast der H₂O Streckschwingungen liegen. Auch hier erreicht man durch den Einsatz von D₂O eine Verbesse­ rung, da D₂O demgegenüber praktisch nicht bei den H- Streckschwingungen der Nukleinsäure absorbiert. Die Mess­ bedingungen der Fig. 1 bis 3 sind gleich.

In der Fig. 4 erkennt man eine Reaktionskammer 1 mit für IR reflektiven Kammerwandungen 2 sowie einem optischen Fenster 3. Das optische Fenster 3 weist für Wellenzahlen im Bereich 1300 bis 2100 cm^-1 eine hohe Transmission auf. Weiterhin erkennt man eine Strahlungsquelle 4, welche im Ausführungsbeispiel ein Quantenkaskaden-Diodenlaser ist. Dieser emittiert bei einer Wellenzahl von 1668 cm^-1.

In den Fig. 5 bis 7 sind Vorrichtungen entsprechenden Aufbaus dargestellt, welche sich einerseits darin unter­ scheiden, daß als Strahlungsquelle ein IR-Breitband­ strahler 4, nämlich des Typs General Electric CXR Tungsten Lampe, eingesetzt ist. Zur Ausblendung von Wellenzahlen im Bereich der D₂O Absorptionsmaxima sind verschiedene zusätzlich Maßnahmen eingerichtet. Im Falle der Fig. 5 ist ein optischer Filter 5 mit einem geeigneten Absorp­ tionsbereich vorgesehen. In den Fig. 6 und 7 erfolgt eine Aufspaltung der Strahlung mittels eines Prismas 6 (Fig. 6) oder eines optischen Gitters 7 (Fig. 7) mit anschließender Selektion gewünschter Wellenzahlen mittels einer Blende 8.

Eine Vorrichtung durch Durchführung des erfindungsgemäßen PCR-Verfahrens ist ansonsten im Prinzip wie im Stand der Technik aufgebaut. Der wesentliche Unterschied besteht darin, daß zusätzlich oder anstelle der konventionellen Einrichtungen zur Erwärmung auf 95°C eine Einrichtung zur Einstrahlung elektromagnetischer Wellen in die Reaktion­ skammer eingerichtet ist und die Reaktionskammer ein op­ tisches Fenster aufweist. Bezüglich Details hierzu darf auf die Fig. 4 bis 7 verwiesen werden, die weiteren Komponenten entsprechen dem üblichen Aufbau und brauchen daher nicht näher erläutert werden.

Claims (7)

1. Verfahren zur Auftrennung von in wäßriger Lösung be­ findlichen doppelsträngigen Nukleinsäuren in einzel­ strängige Nukleinsäuren,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Zerlegung der Nukleinsäuren in Einzelstränge durch Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen durch­ geführt wird,
wobei die Wellenzahl und die Intensität der elektroma­ gnetischen Wellen mit der Maßgabe ausgewählt sind, daß die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Nukleotiden einer doppelsträngigen Nukleinsäure durch unmittelbare Wechselwirkung der elektromagnetischen Strahlung mit der doppelsträngigen Nukleinsäure gelöst werden, und
wobei die Frequenz der elektromagnetischen Wellen in einem Transmissionsfenster von D₂O liegt und
wobei die wäßrige Lösung zumindest zum Teil mit D₂O ge­ bildet ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenzahl der elektromagnetischen Strahlung im Bereich von weniger als 1150 cm^-1 und/oder 1250 bis 2200 cm^-1 und/oder oberhalb 2700 cm^-1 eingestellt ist mit der Maßgabe, daß die eingestellte Frequenz zumindest teil­ weise solche Schwingungszustände der Nukleinsäure an­ regt, welche in einer Trennung ausschließlich der Wasserstoffbrückenbindungen resultieren, nicht jedoch Bindungen einer Polymerase spaltet.

3. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2 in einem Verfahren zur in vitro Amplifikation von Nuklein­ säuren mit den folgenden Verfahrenstufen: a) Zerlegung der Nukleinsäuren in Einzelstränge, b) Anhybridisierung von Primern an die Einzelstränge aus Stufe a), c) Ver­ längerung der in Stufe b) anhybridisierten Primer durch (Desoxy-)Ribonukleosidtriphosphate mittels Einsatz einer Polymerase d) Rückführung der in Stufe c) erhaltenen Nukleinsäuren in die Stufe a), wobei die Stufen a)-d) so oft wiederholt werden, bis ein vorgegebener Amplifi­ kationsfaktor erreicht ist und wobei die elektroma­ gnetische Strahlung in Stufe a) eingestrahlt wird.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß auf Nukleinsäure-Synthese-Geschwindigkeit optimierte Polymerasen in Stufe b) eingesetzt werden.

5. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Reaktionskammer zur Aufnahme einer Lösung mit Nukleinsäuren, mit einer Vorrichtung zur Erzeugung elektromagnetischer Wellen sowie mit einem Abstrahlelement zur Abstrahlung der elektromagnetischen Strahlung, wobei das Abstrahlelement bei der Reaktionskammer angeordnet ist und wobei die Vorrichtung zur Erzeugung elektromagnetischer Strahlung Strahlung im Bereich von weniger als 1100 cm^-1 und/oder 1300 bis 2100 cm^-1 und/oder mehr als 2700 cm^-1 erzeugt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Vorrichtung zur Erzeugung elektromagnetischer Strahlung ein Laser ist, dessen Emissionsstrahl vorzugsweise durch die Reaktions­ kammer geleitet wird.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Reaktionskammer als Rohrreaktor ausgebildet ist und wobei der Emissions­ strahl des Lasers parallel, vorzugsweise koaxial, zur Achse des Rohrreaktors ist.