DE102007027654B4

DE102007027654B4 - Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren

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Publication number: DE102007027654B4
Application number: DE102007027654A
Authority: DE
Inventors: Joachim A. Stehr; Dr. Klar Thomas A.; Prof. Dr. Feldmann Jochen; Calin Hrelescu; Dr. Parak Wolfgang; Dr. Raschke Gunnar; Ralph Sperling; Dr. Wunderlich Michael; Dr. Kürzinger Konrad; Dr. Heindl Dieter; Dr. Nichtl Alfons
Original assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Current assignee: GNA Biosolutions GmbH
Priority date: 2007-06-15
Filing date: 2007-06-15
Publication date: 2011-12-08
Anticipated expiration: 2027-06-16
Also published as: ES2389819T3; ATE555218T1; CA2689323A1; CA2689323C; WO2008151931A1; EP2162549B1; DK2162549T3; US20100291696A1; DE102007027654B8; EP2481817A1; PL2162549T3; DE102007027654A1; EP2162549A1

Abstract

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, mit den Schritten – Bereitstellen mindestens eines Nanopartikels, der durch mindestens ein an ihn gebundenes Oligonukleotid, das mit wenigstens einem Abschnitt einer nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren kann, funktionalisiert ist, – In-Kontakt-Bringen des funktionalisierten Nanopartikels mit einer Probe, in der die Nukleinsäure nachgewiesen werden soll, und – Messen einer Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung des mindestens einen Oligonukleotids mit der nachzuweisenden Nukleinsäure gibt, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren außerdem den Schritt des Anregens der Nanopartikel zur Wärmeerzeugung umfasst.

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Sie betrifft außerdem einen Kit zum Nachweis von Nukleinsäuren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 20.
Stand der Technik
Viele Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren basieren auf der Technik der Schmelzkurvenanalyse. Hierbei wird der Effekt ausgenutzt, dass doppelsträngige Nukleinsäureketten bei Temperaturerhöhung zu einsträngigen Ketten dehybridisieren können, was man in diesem Zusammenhang als „Schmelzen” bezeichnet. Die Schmelztemperatur hängt u. a. vom Grad der Komplementarität der beiden Hybridisierungspartner ab.
Aus der US-Offenlegungsschrift US-2004/0219520 A1 und dem Aufsatz von C. Mirkin et al, „One-Pot Colorimetric Differentiation of Polynucleotides with Single Base Imperfections Using Gold Nanoparticle Probes”, J. Am. Chem. Soc., 1998, No. 120, Seiten 1959–1964 ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren bekannt, bei dem Gold-Nanopartikel verwendet werden, die mit Oligonukleotiden funktionalisiert sind. Die nachzuweisenden Nukleinsäuren und die funktionalisierten Gold-Nanopartikel sind in einem wässrigen Probenmedium gelöst bzw. suspendiert. Ein Teil der Oligonukleotide hat eine Basenfolge, die mit einem ersten Abschnitt der nachzuweisenden Nukleinsäuremoleküle hybridisieren kann, und ein anderer Teil der Oligonukleotide hat eine Basenfolge, die mit einem zweiten Abschnitt der nachzuweisenden Nukleinsäuremoleküle hybridisieren kann. Aufgrund der Hybridisierung werden die Nanopartikel von den Nukleinsäuren zu großen Aggregaten verbunden, was eine Verbreiterung und Rotverschiebung ihrer Partikelplasmonenresonanz zur Folge hat. Letztere ist durch Lichtextinktionsmessungen bestimmbar. Wird nun die Temperatur der Probe schrittweise erhöht, kommt es bei einer für die nachzuweisende Nukleinsäure charakteristischen Schmelztemperatur zu einer Dehybridisierung und infolgedessen zu einer Auflösung der Aggregate. Dies kann mit einer Schmelzkurve, die die Lichtextinktion als Funktion der Temperatur angibt, als steiler Übergang beobachtet werden. Mirkin et al. berichten, dass sie Schmelzkurven von Nukleinsäuren, deren Abschnitte vollständig komplementär zu den Basensequenzen der Oligonukleotide der funktionalisierten Nanopartikel waren, von solchen Nukleinsäuren unterscheiden konnten, die in einer Base abwichen. Auch sei es gelungen, vollständig komplementäre Nukleinsäuren in einer Mischung von vollständig komplementären und in einer Base abweichenden Nukleinsäuren nachzuweisen.
Bei dem bekannten Verfahren kann nachteilig sein, dass die Bestimmung der Schmelzkurve eine beträchtliche Zeit in Anspruch nimmt, typischerweise 30 bis 120 Minuten, weil nach jedem Temperaturschritt abgewartet werden muss, bis sich in der Probe eine gleichmäßige Temperatur und ein Gleichgewicht zwischen hybridisierten und dehybridisierten Nukleinsäuren eingestellt hat. Außerdem kann das bekannte Verfahren Schwierigkeiten bereiten, Nukleinsäuren, die in einer Base abweichen, in einer Mischung von vollständig komplementären und in einer Base abweichenden Nukleinsäuren nachzuweisen.
Aus dem Aufsatz von R. C. Bailey et al., „Real-Time Multicolor DNA Detection wich Chemoresponsive Diffraction Gratings and Nanoparticle Probes”, JACS, 2003, 125, S. 13 541–13 547, ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren bekannt, bei dem Oligonukleotide an einen Goldnanopartikel und ein Beugungsgitter aus Gold gebunden sind. Die Oligonukleotide sind komplementär zu Abschnitten eines Ziel-Oligonukleotids, das sich mit dem Gitter und den Gold-Nanopartikeln in einer gemeinsamen Probe befindet. Durch langsames Erhöhen der Probentemperatur und gleichzeitiges Messen des Beugungswirkungsgrades des Gitters wird auf den temperaturabhängigen Hybridisierungsgrad rückgeschlossen.
In dem Aufsatz von G. L. Liu, „Time-Resolved Optical Sensing of Oligonucleotide Hybridization via Au Colloidal Nanoparticles”, J. Nanosci. Nanotech., 2005, Band 5, Nr. 11, S. 1933–1937, wird ein markierungsfreies Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Ziel-Nukleinsäuren an auf Gold-Nanopartikeln mobilisierten Oligonukleotiden beschrieben, die bei der Hybridisierung Komplexe bilden. Der Nachweis geschieht durch Colorimetrie.
H. M. E. Azzazy et al. geben in „Nanodiagnostics: A New Frontier for Clinical Laboratory Medicine”, Clinical Chemistry, 2006, 52: 7, S. 1238–1246 einen Überblick über nanotechnologische Ansätze in der Diagnostik. Hier wird unter anderem angesprochen, dass Goldnanopartikel mit DNA funktionalisiert werden können und dass sich mit dem Einsatz von silberbeschichteten Goldnanopartikeln die Nachweisgrenze von Oligonukleotiden um einen Faktor 50 herabsetzen lässt.
C. Sealy gibt in der Meldung „Nanoparticles turn up the heat”, nanotoday, 2006, Band 1, Nr. 2, S. 9, an, dass wärmeerzeugende Eigenschaften von Nanopartikeln zur Markierung von Proteinen Verwendung finden können.
Weiterhin ist aus dem Aufsatz von A. O. Govorov et al., „Generating heat with metal nanoparticles”, nanotoday, 2007, Bd. 2, No. 1, Seiten 30–38 bekannt, dass Gold- und Silber-Nanopartikel zur Wärmeerzeugung angeregt werden können, in dem sie mit Licht beleuchtet werden. Es wird in diesem Aufsatz auch berichtet, dass bei gleicher Anregung die von zwei benachbarten Goldpartikeln erzeugte Wärme größer ist als die von zwei einzelnen Partikeln erzeugte Wärme. Dieser kooperative Effekt wird einer Coulomb-Wechselwirkung zwischen den benachbarten Nanopartikeln zugeschrieben.
In dem Aufsatz von J. L. West et al., „Nanoshell-mediated near-infrared thermal therapy of tumors under magnetic resonance guidance”, PNAS, 2003, Bd. 100, No. 23, Seiten 13549–13554 sind Nanopartikel aus von einer Goldschale umschlossenen Silicapartikeln (”Nanoshells”) bekannt, die insbesondere unter Beleuchtung mit Infrarotlicht Wärme erzeugen. Die Autoren schlagen vor, die Nanopartikel zum thermischen Auflösen von Tumoren einzusetzen.
Schließlich offenbaren Jacobson et al. in „Remote electronic control of DNA hybridization through inductive coupling to an attached metal nanocrystal antenna”, NATURE, 2002, Bd. 415, Seiten 152–155 einen Goldnanopartikel, der kovalent an einen schleifenförmigen Nukleinsäureabschnitt gebunden ist, der die selbstkomplementären Enden eines haarnadelförmigen DNA-Moleküls miteinander verbindet. Der Goldnanopartikel wird durch induktive Kopplung an ein magnetisches Radiofrequenzfeld zur Wärmeerzeugung angeregt, um die lokale Temperatur des an den Nanopartikel gebundenen DNA-Moleküls zu erhöhen und so ein Dehybridisieren der selbstkomplementären Enden zu induzieren. In dem gleichen Aufsatz offenbaren Jacobson et al. auch ein Verfahren, bei dem Oligonukleotide an ihrem einen Ende an einen Gold-Nanopartikel gebunden sind, und an ihrem anderen Ende ein Fluorophor tragen. Dazu komplementäre Oligonukleotide sind an eine Streptavidinummantelte Agarose-Perle gebunden. Die beiden komplementären Oligonukleotide hybridisieren. Anschließend wird eine Dehybridisierung induziert, und zwar entweder durch lokale Temperaturerhöhung mittels Anregen der Gold-Nanopartikel in einem magnetischen Radiofrequenzfeld oder durch Erhöhen der Probentemperatur. In jedem Fall wird der Hybridisierungsgrad anhand der Fluoreszenz des Überstands ermittelt.
Der Erfindung zugrunde liegendes Problem
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren bereitzustellen. Weiter liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen verbesserten Kit zum Nachweis von Nukleinsäuren bereitzustellen.
Erfindungsgemäße Lösung
Zur Lösung der Aufgabe lehrt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Sie lehrt außerdem einen Satz zum Nachweis von Nukleinsäuren mit den Merkmalen des Anspruchs 20.
Nanopartikel im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Partikel, die aufgrund ihrer Größe besondere optische Eigenschaften aufweisen, insbesondere charakteristische Absorptions- oder Streuspektren, die so im Volumenmaterial nicht oder nicht so deutlich hervortreten. Lediglich beispielhaft sind die von A. O. Govorov et al., supra, und die von J. M. Jacobson et al., supra, offenbarten Metallnanopartikel genannte. Der diesbezügliche Inhalt der vorgenannten Schriften ist durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung. Die Nanopartikel haben einem Durchmesser von weniger als 500 nm, vorzugsweise weniger als 100 nm. Besonders bevorzugte Nanopartikel haben einen Durchmesser zwischen 5 und 80 nm.
Die Nanopartikel können globulär sein, es kommen aber insbesondere auch nicht-globuläre Formen in Frage, z. B. stäbchenförmige Nanopartikel. Verfahren zum Herstellen und Funktionalisieren der Nanopartikel sind z. B. aus dem Aufsatz von Mirkin et al., supra, und den darin genannten weiteren Referenzen bekannt, deren diesbezüglicher Inhalt durch verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist.
Der Begriff Oligonukleotid umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise nicht nur (Desoxy)-Oligo-Ribonukleotide, sondern auch Oligonukleotide, die ein oder mehrere Nukleotid-Analoga mit Modifikationen an ihrem Backbone (z. B. Methylphosphonate, Phosphothioate oder Peptide Nucleic Acids [PNA]), insbesondere an einem Zucker des Backbone (z. B. 2'-O-Alkylderivate, 3'- und/oder 5'-Aminoribosen, Locked Nucleic Acids [LNA], Hexitol Nucleic Acids oder Tricyclo-DNA, vergleiche hierzu den Aufsatz von D. Renneberg und C. J. Leumann, ”Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA”, J. Am. Chem. Soc., 2002, Bd. 124, Seiten 5993–6002, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist) enthalten oder die Basen-Analoga enthalten, z. B. 7-Deazapurine oder Universalbasen wie Nitroindol oder modifizierte natürliche Basen wie N4-Ethyl-Cytosin. In einer Ausführung der Erfindung sind die Oligonukleotide Konjugate oder Chimären mit nicht-nukleosidischen Analoga, z. B. PNA Die Oligonukleotide enthalten in einer Ausführung der Erfindung an einer oder mehreren Positionen nicht-nukleosidische Einheiten wie Spacer, z. B. Hexaethylenglycol oder C_n-Spacer mit n = zwischen 3 und 6. Soweit die Oligonukleotide Modifikationen enthalten, sind diese so gewählt, dass auch mit der Modifikation eine Hybridisierung mit natürlichen DNA/RNA-Analyten möglich ist. Bevorzugte Modifikationen beeinflussen das Schmelzverhalten, vorzugsweise die Schmelztemperatur, insbesondere um Hybride mit unterschiedlichen Graden der Komplementarität ihrer Aminosäuren unterscheiden zu können (Mismatch-Diskriminierung). Bevorzugte Modifikationen umfassen LNA, 8-Aza-7-Deaza-Purin, 5-Propinyl-Uracil und -Cytosin und/oder abasische Unterbrechungen im Oligonukleotid.
Hybridisieren bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung das Ausbilden eines Doppelstrangs. Mit der Erfindung ist erreichbar, dass die Doppelstränge durch eine lokale Temperaturerhöhung, z. B. aufgrund des Anregens der Nanopartikel zur Wärmeerzeugung, wenigstens teilweise dehybridisieren („schmelzen”). Das Oligonukleotid ist in einer Ausführung der Erfindung so gewählt, dass es von der nachzuweisenden Nukleinsäure bei einer Schmelztemperatur unter 80°C, vorzugsweise deutlich unter 80°C dehybridisiert. Das Oligonukleotid ist vorzugsweise so gewählt, dass es von der nachzuweisenden Nukleinsäure bei einer Schmelztemperatur größer als 40°C dehybridisiert. Die Schmelztemperatur ist die Temperatur, bei der die Schmelzkurve den maximalen Betrag der Steigung aufweist (Extrempunkt der Ableitung der Schmelzkurve). Bevorzugte Oligonukleotide sind außerdem so gewählt, dass sie für die Nukleinsäure ausreichend spezifisch sind, um diese nachzuweisen. Der Fachmann kann den Schmelzpunkt und die Spezifität unter anderem anhand der Länge des Oligonukleotids einstellen. Bevorzugte Oligonukleotide haben eine Länge zwischen 8 und 40 Basen, besonders vorzugsweise zwischen 12 und 25 Basen. Das bevorzugte Oligonukleotid ist mit einem Abschnitt der zu detektierenden Nukleinsäure wenigstens teilweise, besonders vorzugsweise vollständig oder bis auf ein oder zwei Basen komplementär.
Es ist ein erreichbarer Vorteil der Erfindung, dass durch das Anregen der Nanopartikel zur Wärmeerzeugung ein lokales Erwärmen der Probe in der Nähe der Nanopartikel erreicht werden kann. Auf diese Weise kann ein Schmelzen ausgelöst werden, ohne dass dazu die gesamte Probe erwärmt werden muss. Durch das lokale Erwärmen kann der Hybridisierungsbereich innerhalb der weiter unten diskutierten Aggregate von Nanopartikeln sehr schnell, z. B. innerhalb einiger μs, von einer Ausgangstemperatur auf eine gewünschte lokale Temperatur aufgeheizt werden, um zu überprüfen, ob dies zu einem Schmelzen führt. Es ist ein erreichbarer Vorteil der Erfindung, dass eine Schmelzkurve schneller aufgenommen werden kann als im Stand der Technik.
Die Erfindung eignet sich insbesondere für die Anwendung in Multiwell-Verfahren und bei der Hochdurchsatz-DNA-Analyse.
Aufbau und Weiterbildung der erfindungsgemäßen Lösung
Vorteilhafte Aus- und Weiterbildungen, welche einzeln oder in Kombination eingesetzt werden können, sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird der Nanopartikel mit elektromagnetischer Strahlung zur Wärmeerzeugung angeregt, z. B. mit Licht, vorzugsweise mittels eines opto-thermischen Effekts. Bevorzugte Lichtquellen sind Laser, Leuchtdioden (LEDs) und Blitzlampen. Die Lichtquelle kann das Licht gepulst oder kontinuierlich emittieren. Es kommen sowohl monochrome als auch polychrome, insbesondere weiße Lichtquellen in Frage. Licht im Sinne der vorliegenden Erfindung schließt das Spektrum elektromagnetischer Strahlung vom fernen Infrarot bis zum fernen Ultraviolett ein. Es ist auch denkbar, die Nanopartikel mit Radiofrequenzfeldern anzuregen, z. B. mit einem magnetischen Radiofrequenzfeld, vorzugsweise wie beschrieben in Jacobson et al., supra.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfasst der Nanopartikel mindestens ein Metall, vorzugsweise ein Edelmetall, z. B. Gold oder Silber. In einer Ausführung besteht der Nanopartikel vollständig aus dem Metall, in einer anderen bildet das Metall nur einen Teil des Nanopartikels, z. B. seine Hülle. Ein Beispiel für letztere Ausführung sind die von J. L. West, supra, offenbarten Silica-Goldnanoshells. Der gesamte diesbezügliche Inhalt der vorgenannten Schrift ist durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung.
Der Nanopartikel wird vorzugsweise durch Diffusion mit der nachzuweisenden Nukleinsäure in Kontakt gebracht, besonders vorzugsweise in einem wässrigen Medium, in dem die Nukleinsäure und der Nanopartikel gelöst bzw. suspendiert sind. Vorzugsweise sind in dem Medium eine Vielzahl gleichartiger Nukleinsäuren und Nanopartikel gelöst bzw. suspendiert und die Eigenschaft gibt Aufschluss über den Grad der Hybridisierung der Vielzahl von Oligonukleotiden mit der Vielzahl von Nukleinsäuren. Vorzugsweise liegen die Nanopartikel in dem Medium in einer Konzentration zwischen 0,5 und 50 nM (nMol/Liter) vor. Vorzugsweise liegen die nachzuweisenden Nukleinsäuren in einer Konzentration zwischen 100 pM und 10 mM in dem Medium vor. Ein bevorzugtes Medium enthält außerdem ein Salz, vorzugsweise Kochsalz (NaCl). Die bevorzugte Salzkonzentration liegt zwischen 0,01 und 1 M.
In einer Ausführung der Erfindung ist wenigstens ein Teil der Nanopartikel oder der Nukleinsäuren an einem Substrat immobilisiert. Es ist ein erreichbarer Vorteil dieser Ausführung der Erfindung, dass negative Einflüsse einer thermischen Konvektion oder gravitativer Sedimentationseffekte in der Probe auf die Messergebnisse vermieden werden können.
Die Eigenschaft, die über den Grad der Hybridisierung der Nukleinsäure mit dem Oligonukleotid Aufschluss gibt, ist vorzugsweise eine optische Eigenschaft, z. B. die Farbe oder Farbintensität eines Farbmarkers, z. B. eines Farbstoffmoleküls oder eines kolloidalen Halbleiternanokristalls (Quantum Dot). So kann beispielsweise ein Farbmarker an einen der Hybridisierungspartner, vorzugsweise die zu detektierende Nukleinsäure, gebunden sein, oder es kann ein Farbmarker verwendet werden, der bei der Hybridisierung zwischen den Hybridisierungspartnern interkalieren kann. Besonders vorzugsweise wird bei dieser Ausführung der Erfindung ausgenutzt, dass bestimmte Fluoreszenzmarker, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, in der Nähe von Nanopartikeln ihre Fluoreszenz wenigstens teilweise einbüßen (Quenching). Mit dieser Ausführung der Erfindung ist erreichbar, dass anhand der Farbintensität oder Farbe auf den Grad der Hybridisierung geschlossen werden kann.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist die Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung gibt, eine Eigenschaft des Nanopartikels, vorzugsweise eine optische Eigenschaft des Nanopartikels. Vorzugsweise nutzt die Erfindung aus, dass Nanopartikel, dadurch, dass sie einander benachbart sind, ihre optischen Eigenschaften ändern können, insbesondere in der Weise, dass ihr Extinktionsspektrum spektral verschoben und/oder verbreitert wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsvariante umfasst die zu detektierende Nukleinsäure mindestens zwei Abschnitte und es werden mindestens zwei Nanopartikel bereitgestellt, wobei mindestens einer der Nanopartikel mit einem Oligonukleotid funktionalisiert ist, das mit dem ersten Abschnitt der Nukleinsäure hybridisieren kann, und mindestens einer der Nanopartikel mit einem Oligonukleotid funktionalisiert ist, das mit dem zweiten Abschnitt der Nukleinsäure hybridisieren kann. Die funktionalisierten Nanopartikel werden mit einer Probe, in der die Nukleinsäure nachgewiesen werden soll, in Kontakt gebracht und die Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung der Oligonukleotide mit der nachzuweisenden Nukleinsäure gibt, wird gemessen. In dieser Ausführung der Erfindung ist erreichbar, dass, wenn die Nanopartikel durch die Hybridisierung miteinander verbunden werden, die relative Nähe der Nanopartikel eine messbare Änderung ihrer optischen Eigenschaften hervorruft. Vorzugsweise sind die Oligonukleotid-funktionalisierten Nanopartikel so ausgebildet, dass sie einer head-to-head Konfiguration mit der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren, d. h., dass die Abschnitte der Oligonukleotide, mit denen sie an ihre Nanopartikel gebunden sind, sich im hybridisierten Zustand am nächsten sind. Es sind aber auch head-to-tail und tail-to-tail Konfigurationen denkbar, wie z. B. in Schema 1 des Aufsatzes von C. A. Mirkin, supra, offenbart.
In einer anderen denkbaren Ausführung der Erfindung ist sowohl das mindestens eine Oligonukleotid als auch die zu detektierende Nukleinsäure an einen Nanopartikel gebunden. Auch mit dieser Ausführung der Erfindung ist erreichbar, dass durch die Hybridisierung zwei Nanopartikel aneinander gebunden werden, was eine messbare Änderung der optischen Eigenschaften zur Folge haben kann.
Vorzugsweise sind bei wenigstens einem Teil der Nanopartikel jeweils mehrere Oligonukleotide an einen gemeinsamen Nanopartikel gebunden. Es ist ein erreichbarer Vorteil dieser Ausführung der Erfindung, dass bei der Hybridisierung der Oligonukleotide mit der Nukleinsäure Cluster aus drei oder mehr Nanopartikel entstehen können. Dadurch kann vorteilhafterweise ausgenutzt werden, dass die Veränderung der Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung gibt, mit der Größe des Aggregats zunimmt. Dies kann insbesondere den Nachweis der Änderung der Eigenschaft und damit der Hybridisierung erleichtern.
Bei einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren werden wenigstens die folgenden drei Schritte durchlaufen: a) Messen der Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung der Nukleinsäure mit den Oligonukleotiden gibt, bei einer vorgegebenen Ausgangstemperatur, b) Anregen des mindestens einen Nanopartikels zur Wärmeerzeugung; und c) erneutes Messen der Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung der Nukleinsäure mit dem Oligonukleotid gibt. Mit dieser Ausführung der Erfindung ist es erreichbar, durch Vergleich der Messergebnisse vor und nach dem Anregen der Nanopartikel zur Wärmeerzeugung ein Schmelzsignal zu ermitteln, das ein Maß für die Änderung des Grads der Hybridisierung aufgrund des lokalen Erwärmens der Probe ist.
In einer Ausführung der Erfindung werden die Schritte a) bis c) mehrmals durchlaufen, wobei der mindestens eine Nanopartikel bei den Durchläufen unterschiedlich stark zur Wärmeerzeugung angeregt wird, vorzugsweise von Durchlauf zu Durchlauf zunehmend, z. B. durch Beleuchten mit unterschiedlichen Lichtmengen. Die bei den Durchläufen ermittelten Schmelzsignale werden vorzugsweise miteinander verglichen. Dadurch kann eine Schmelzsignalkurve aufgenommen werden, die das Schmelzsignal als Funktion des Grads der Anregung der Nanopartikel zur Wärmeerzeugung angibt. Vorzugsweise werden zwischen 5 und 50, besonders vorzugsweise zwischen 10 und 20 Schmelzsignale aufgenommen. Aus der Schmelzsignalkurve kann eine Schmelzschwelle ermittelt werden, die den Grad der Anregung angibt, bei dem ein Schmelzen einsetzt. Es ist mit dieser Ausführung der Erfindung erreichbar, die Nukleinsäure anhand einer Schmelzschwelle, die für die Nukleinsäure bei gegebener Ausgangstemperatur und gegebenen Oligonukleotiden spezifisch ist, nachzuweisen.
Bei einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird die Schmelzschwelle für mehrere Ausgangstemperaturen bestimmt, um eine Schmelzschwellenkurve zu ermitteln. Vorzugsweise werden dazu die Schritte a) bis c) mehrmals mit einer ersten vorgegebenen Ausgangstemperatur durchlaufen, wobei der mindestens eine Nanopartikel bei den Durchläufen unterschiedlich stark zur Wärmeerzeugung angeregt wird, und die Schmelzsignale der Durchlaufe werden verglichen, um eine erste Schmelzschwelle zu ermitteln. Außerdem werden die Schritte a) bis c) mehrmals bei einer zweiten vorgegebenen Ausgangstemperatur durchlaufen, wobei der Nanopartikel bei den Durchlaufen unterschiedlich stark zur Wärmeerzeugung angeregt wird, um eine zweite Schmelzschwelle zu ermitteln. Besonders vorzugsweise wird der Vorgang bei weiteren Ausgangstemperaturen wiederholt, wobei die Ausgangstemperatur hierzu besonders vorzugsweise schrittweise erhöht wird. Mit dieser Ausführung der Erfindung ist es erreichbar, die Nukleinsäure anhand einer Schmelzschwellenkurve, die für die Nukleinsäure spezifisch ist, nachzuweisen.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die Schmelzschwelle mit zunehmender Ausgangstemperatur zumindest in einem Ausgangstemperaturbereich monoton abnimmt. Sie führen das darauf zurück, dass bei zunehmender Ausgangstemperatur die zusätzliche lokale Erwärmung durch das Anregen der Nanopartikel, die notwendig ist, um ein Schmelzen auszulösen, abnimmt. In einer Ausführung der Erfindung wird der Steigung der Schmelzschwellenkurve in einem vorgegebenen Anfangstemperaturbereich ermittelt. Hierdurch ist ein Nachweis der Nukleinsäure anhand einer für die Nukleinsäure spezifischen Steigung erreichbar. In einer anderen Ausführung der Erfindung wird die Schmelzschwellenkurve linear zu einem Nullpunkt der Schmelzschwelle extrapoliert. Mit dieser Ausführung der Erfindung ist erreichbar, dass eine Nukleinsäure anhand eines für sie spezifischen Nullpunkts nachgewiesen wird.
Bei den durch die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit den Oligonukleotiden gebildeten Nanopartikel-Aggregaten kann es bei bestimmten Temperaturen zu einem Annealing (Aggregatwachstum) kommen, bei dem die Größe der Aggregate zunimmt. Einzelheiten zu diesem Effekt sind in dem Aufsatz von J. J. Storhoff et al., ”What controls the optical properties of DNA-linked gold nanoparticle assemblies?”, J. Am. Cem. Soc., 2000, No. 122, Seiten 4640 offenbart, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist. Diese Annealingtemperatur kann bei gegebenen Oligonukleotiden für bestimmte Nukleinsäuren spezifisch sein. In einer Ausführung der Erfindung wird die Nukleinsäure deshalb anhand einer Annealingtemperatur, die bei gegebenen Oligonukleotiden für die Nukleinsäure spezifisch ist, nachgewiesen.
Die Schmelzschwelle kann eine Funktion der Aggregatgröße sein, z. B. weil ein Aggregat die Wärme nicht so schnell an die Umgebung abgeben kann, wie ein einziger Nanopartikel, was einen Wärmestau in dem Aggregat zur Folge hat. Als Ursache kommt auch ein kooperativer Effekt mehrerer Nanopartikel in Frage, der dazu führt, dass Aggregate von Nanopartikeln bei gleicher Anregung mehr Wärme erzeugen, als einzelne Nanopartikel, siehe den Aufsatz von A. O. Govorov et al., supra, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist. Vorzugsweise sinkt die Schmelzschwelle mit der Aggregatgröße. In einer Ausführung der Erfindung wird die Nukleinsäure deshalb dadurch nachgewiesen, dass eine Schmelzschwelle bei einer Ausgangstemperatur, die im Wesentlichen größer oder gleich der Annealingtemperatur ist, unterhalb eines bestimmten Werts liegt.
Alternativ kann die Nukleinsäure dadurch nachgewiesen werden, dass unterhalb der Annealingtemperatur eine Schmelzschwelle nach einem Annealingprozess niedriger ist als davor (Hysterese). Beispielsweise kann mindestens eine Schmelzschwelle bei mindestens einer Ausgangstemperatur unterhalb der Annealingtemperatur ermittelt werden, dann vorübergehend die Ausgangstemperatur auf oder über die Annealingtemperatur angehoben werden, und dann wiederum mindestens eine Schmelzschwelle bei mindestens einer Ausgangstemperatur unterhalb der Annealingtemperatur ermittelt werden. Durch den Vergleich der Schmelzschwellen kann ein Annealing und damit die Nukleinsäure, für die die Annealingtemperatur spezifisch ist, nachgewiesen werden.
Mit der Erfindung ist es auch möglich, mehrere verschiedene Nukleinsäuren in derselben Probe nachzuweisen. Wenn beispielsweise die erste Nukleinsäure eine Schmelztemperatur hat, die unterhalb der Schmelztemperatur der zweiten nachzuweisenden Nukleinsäure hegt, kann die erste Nukleinsäure durch das Vorhandensein einer Schmelzschwelle bei einer Temperatur unterhalb ihrer Schmelztemperatur, und die zweite Nukleinsäure durch Nachweis einer Schmelzschwelle bei einer Temperatur unterhalb der Schmelztemperatur der zweiten Nukleinsäure aber oberhalb der Schmelztemperatur der ersten Nukleinsäure nachgewiesen werden. In einer Ausführung der Erfindung werden die Schritte a) bis c) deshalb mindestens ein erstes und ein zweites Mal durchlaufen, wobei die vorgegebene Ausgangstemperatur bei den Durchläufen unterschiedlich ist und die Schmelzsignale der Durchläufe verglichen werden.
Um die erste Nukleinsäure bei der ersten Ausgangstemperatur anhand ihrer Schmelzschwelle von der zweiten Nukleinsäure unterscheiden zu können, kann es vorteilhaft sein auszunutzen, dass die erste Nukleinsäure bei oder sogar schon unterhalb der ersten Temperatur ein Annealing zeigt, die zweite Nukleinsäure jedoch nicht. Denn wie oben erläutert, kann das Annealing zu einem deutlichen Absenken der Schmelzschwelle führen. Bei einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung liegt die erste Temperatur deshalb bei oder über einer Annealingtemperatur der ersten nachzuweisenden Nukleinsäure.
Es ist auch denkbar, mehrere unterschiedliche Nukleinsäuren durch die Verwendung unterschiedlicher Nanopartikel nachzuweisen, die unterschiedliche Anregungseigenschaften haben, z. B. indem sie bei gleicher Anregung unterschiedliche Wärmemengen erzeugen. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden deshalb mehrere Fraktionen von Nanopartikel bereitgestellt, die unterschiedliche Anregungseigenschaften haben, z. B. indem auf die gleiche Anregung mit unterschiedlicher Erwärmung reagieren, und die Nanopartikel einer ersten Fraktion für eine erste zu detektierende Nukleinsäure funktionalisiert sind und die Nanopartikel der zweiten Fraktion für eine zweite zu detektierende Nukleinsäure funktionalisiert sind, die von der ersten Nukleinsäure unterschiedlich ist. Die Nanopartikelfraktionen können sich z. B. dadurch unterscheiden, dass die Nanopartikel unterschiedliche Größe haben, oder aus unterschiedlichen Materialen oder Materialkombinationen bestehen oder unterschiedliche Anteile eines bestimmten Materials oder einer bestimmten Materialkombination haben. Dadurch, dass die Nanopartikel unterschiedliche Anregungseigenschaften zeigen, können die Fraktionen unterschieden werden. Wenn die verschiedenen Nanopartikel z. B. bei gleicher Anregung unterschiedliche Wärmemengen erzeugen, sind die Schmelzschwellen relativ zueinander verschoben und jeweils charakteristisch für die zugehörige Nanopartikelfraktion. Auch ist es denkbar, dass die Nanopartikel einer Fraktion stärker auf eine Anregung einer Art, z. B. elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge, reagieren und eine andere Fraktion stärker auf eine Anregung einer anderen Art, z. B. elektromagnetische Strahlung einer anderen Wellenlänge. In einer Ausführung der Erfindung werden die Fraktionen deshalb durch unterschiedliche Anregungsarten angeregt. Vorzugsweise sind dazu zwei, drei oder mehr Anregungsquellen vorgesehen, besonders vorzugsweise Laser unterschiedlicher Wellenlänge. Dadurch kann erreicht werden, dass die Schmelzschwelle für die erste zu detektierende Nukleinsäure sich deutlich von der für die zweite zu detektierende Nukleinsäure unterscheidet. Hierdurch können mehrere Nukleinsäuren in der gleichen Probe nachgewiesen werden. Natürlich können auch noch dritte, vierte oder weitere Fraktionen mit Nanopartikeln bereitgestellt werden, die bei der gleichen Anregung wiederum unterschiedliche Wärmemengen erzeugen. Auf diese Weise können zahlreiche unterschiedliche Nukleinsäuren nachgewiesen werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird im Folgenden anhand schematischer Zeichnungen an Ausführungsbeispielen in weiteren Einzelheiten näher erläutert.
Es zeigen:
1: schematisch eine Ausführung der Erfindung, bei der die Nanopartikel durch Beleuchten mit Laserlicht zur Wärmeerzeugung angeregt werden und bei der durch Messen einer Transmission von Licht durch die Probe Aufschluss über den Grad der Hybridisierung in der Probe gewonnen wird;
2: schematisch eine Ausführung der Erfindung, bei der der Grad der Hybridisierung durch Messen der Fluoreszenz (Photolumineszenz) eines Farbstoffs in der Probe gemessen wird;
3: schematisch eine Ausführung der Erfindung, bei der durch Messen der Intensität von Streulicht auf den Grad der Hybridisierung geschlossen wird;
4: schematisch ein Aggregat von durch nachzuweisende Nukleinsäuren verbundenen funktionalisierten Goldnanopartikeln;
5: Extinktionskurven von vereinzelten und zu Aggregaten verbundenen Goldnanopartikeln;
6: Schmelzkurven von Goldnanopartikel-Aggregaten, die entweder mit vollständig komplementären oder bis auf eine Base vollständig komplementären Nukleinsäuren verbunden sind;
7: schematisch Goldnanopartikel-Aggregate, die in einer Lösung frei diffundieren;
8: schematisch Goldnanopartikel-Aggregate, die auf einem Substrat lokalisiert sind;
9: ein Beispiel für die Änderung der Extinktion einer Probe mit Goldnanopartikel-Aggregaten, nachdem diese durch Beleuchten mit Licht zur Wärmeerzeugung angeregt wurden;
10: ein Beispiel für die Änderung der Extinktion, nachdem die Nanopartikel-Aggregate wiederholt beleuchtet wurden;
11: ein Beispiel für eine Schmelzsignalkurve mit einer Schmelzschwelle;
12: ein Beispiel für eine Schmelzschwellenkurve ohne Hysterese;
13: ein Beispiel für eine Schmelzschwellenkurve mit Hysterese;
14: den Vergleich zweier Schmelzschwellenkurven mit gleicher Steigung, bei denen durch Extrapolation der Schmelzschwellen-Nullpunkt bestimmt wurde;
15: ein Beispiel für die Bestimmung zweiter unterschiedlicher Nukleinsäuren in derselben Probe durch Messen zweiter Schmelzsignale bei unterschiedlichen Anfangstemperaturen;
16: ein Beispiel für die Bestimmung zweiter unterschiedlicher Nukleinsäuren mittels zweiter Nanopartikel-Fraktionen, die sich in der Größe der Nanopartikel unterscheiden.
In 1 ist ein Beispiel der Erfindung zu sehen, bei dem in einer Küvette 1 als Probenbehälter eine Probe 2 enthalten ist, in der mit Oligonukleotiden 3, 4 funktionalisierte Nanopartikel 5 (siehe 16) suspendiert sind und frei diffundieren können. Genauer enthält die Probe 6 nM Goldnanopartikel 5, die mit einem ersten Oligonukleotid 3 funktionalisiert sind, das mit einem ersten Abschnitt der zu detektierenden Nukleinsäure hybridisieren kann, und 6 nM Goldpartikel, die mit einem zweiten Oligonukleotid 4 funktionalisiert sind, das mit einem zweiten Abschnitt der zu detektierenden Nukleinsäure hybridisieren kann. Weiter enthält die Probe 240 nM der zu detektierenden Nukleinsäuremoleküle und 300 mM NaCl. Die Goldnanopartikel 5 können mit einer gepulsten Nd:YLF Laserlichtquelle 6 durch 300 ns lange Pulse einer Wellenlänge von 527 nm zur Wärmeerzeugung angeregt werden. Ein Diodenlaser 7 mit einer Wellenlänge von 650 nm, der die Probe 2 durchstrahlt und dessen Licht anschließend auf eine schnelle Photodiode 8 fällt, dient zur Messung einer Extinktion der Probe 2 bei dieser Wellenlänge. Die Probenküvette 1 steht außerdem in einem Wasserbad 9, mit dem die Anfangstemperatur T_B der Probe 2 eingestellt werden kann.
2 zeigt eine Abwandlung des Beispiels aus 1, bei dem zum Nachweis der Hybridisierung nicht die Extinktion bzw. Transmission sondern die Fluoreszenz eines Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe 2 gemessen wird. Dazu ist eine Lichtquelle 10 vorgesehen, die die Fluoreszenzfarbstoffe in der Probe 2 anregen kann, und ein Photolumineszenzdetektor 11 zum Messen der Intensität des Fluoreszenzlichts.
In 3 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel zu sehen, in dem statt der Extinktion von Licht oder der Fluoreszenz die Intensität des von der Probe 2 gestreuten Lichts gemessen wird. Hierzu ist eine Abfragelichtquelle 12 vorgesehen, die Licht in die Probe einstrahlt und ein Streulichtdetektor 13, der die Intensität aus der Probe 2 herausgestreuten Lichts misst. Ein Vorteil dieser Ausführung ist, dass kein für das Licht auf zwei Seiten transparenter Probenbehälter erforderlich ist.
Wie sich mit jeweils mehreren Oligonukleotiden 3, 4 funktionalisierte Nanopartikel 5 von zu detektierende Nukleinsäuren 15 zu Aggregaten 20 verbunden werden können ist in 4 schematisch wiedergegeben. In dem vergrößerten Beispiel rechts unten in der Figur sind zwei Nanopartikel 5 durch drei Hybride in einer tail-to-tail Konfiguration verbunden. Dazu weist die Nukleinsäure 15 zwei Abschnitte auf, von denen jeweils einer mit einem an einem ersten Goldpartikel 5 angebrachten Oligonukleotid 3 und ein anderer mit einem an einem zweiten Goldpartikel 5 angebrachten Oligonukleotid 4 wenigstens teilweise komplementär ist. Der Abstand zwischen den Nanopartikeln beträgt ca. 20 nm.
5 zeigt das Ergebnis einer Messung der optischen Dichte (OD) als Maß für die Extinktion der Goldnanopartikel 5 in der Probe 2 bei zwei unterschiedlichen Anfangstemperaturen 25°C 16 und 60°C 17, die durch das Wasserbad 9 eingestellt wurden. Die Goldnanopartikel haben einen Durchmesser von 10 nm und sind mit 30 Basenpaaren langen Thiol-Oligonukleotiden funktionalisiert. Es ist erkennbar, dass das Extinktionsspektrum sich bei Temperaturerhöhung zu kürzeren Wellenlängen hin verschiebt und schmaler wird. In der Literatur wird dies auf ein wenigstens teilweises Auflösen der Goldnanopartikel-Aggregate 20 und eine damit verbundene Änderung in der Partikelplasmonenresonanz der Goldnanopartikel 5 zurückgeführt. Das Auflösen wiederum ist eine Folge des Schmelzens der Hybride.
Aus der Extinktion lässt sich, wie in 6 genauer dargestellt, auf die Schmelztemperatur schließen. 6 zeigt die normalisierte Extinktion bei einer Wellenlänge von 650 nm der Lichtquelle 7 in Abhängigkeit von der durch das Wasserbad 9 eingestellten Anfangstemperatur für zwei unterschiedliche Nukleinsäuren 15, wobei die Goldnanopartikel 5 mit den gleichen Oligonukleotiden 3, 4 funktionalisiert sind. Die Nukleinsäuren 15 unterscheiden sich dadurch, dass die Nukleinsäureabschnitte der ersten Schmelzkurve 18 zu dem Oligonukleotiden 3, 4 der Nanopartikel 5 vollständig komplementär sind, während ein Nukleinsäureabschnitt der zweiten Schmelzkurve 19 an einer Base nicht komplementär ist.
Die Kurven 18, 19 zeigt für beide Nukleinsäuren 15 einen steilen Abfall in der Extinktion bei der Schmelztemperatur. Die Nukleinsäure 15, die in einer Base nicht komplementär ist, hat jedoch eine deutlich niedrigere Schmelztemperatur (ca. 50,5°C) als die vollständig komplementäre Nukleinsäure (54°C).
Bei den oben beschriebenen Beispielen sind die Aggregate 20 in der Probe 2 suspendiert und können darin frei diffundieren, wie in 7 dargestellt. In einem anderen, in 8 dargestellten Beispiel sind einige der funktionalisierten Goldnanopartikel 5 auf einem Substrat 22 lokalisiert. Hierdurch können z. B. nachteilige Effekte der thermischen Konvektion oder gravitative Sedimentationseffekte in der Probe 2 vermieden werden.
9 zeigt in relativen Einheiten die Änderung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 650 nm in der Probe 2 aus dem Beispiel in 1, nachdem diese von dem Laser 6 mit einem Laserpuls der Spitzenleistung von 3,8 kW/mm² und einer mit dem Wasserbad 9 eingestellten Anfangstemperatur von 25°C beleuchtet worden ist. Gemessen wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 650 nm. Zunächst nimmt die Extinktion stark ab, was die Erfinder als Folge einer thermisch induzierten Partikelplasmonenresonanz-Verbreiterung der Goldnanopartikel 5 werten. Dieses Signal klingt mit einer Zeitkonstanten von 11 μs ab. Es verbleibt ein lang anhaltendes Signal, das auf ein durch ein Schmelzen verursachtes wenigstens teilweises Auflösen der Aggregate 20 hinweist. Die Differenz der Extinktion vor und nach dem Anregen der Nanopartikel 5 ist das Schmelzsignal 23.
10 zeigt in relativen Einheiten die Änderung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 650 nm bei einer Folge von fünf Anregungen der Nanopartikel 5 bei einer Wiederholrate von 5 Hz (man beachte den Zoom-Faktor von 1000 in der Zeitskala im Vergleich zu 9). Die schrittweise Abnahme der Extinktion ist die Folge einer Akkumulation dissoziierter Aggregate 20 in der Probe 2. Die darauf folgende Zunahme der Extinktion ist vermutlich zum Teil Ergebnis einer Re-Hybridisierung und zum Teil einer Diffusion nicht-dissoziierter Aggregate 20 aus der Probe 2 in den Bereich, in dem die Probe 2 von der Lichtquelle 7 durchleuchtet wird.
Die in 11 dargestellte Schmelzsignalkurve ist dadurch entstanden, dass eine jeweils 550 μs nach der Anregung der Nanopartikel 5 gemessene Änderung der Extinktion in relativen Einheiten gegen die aufgewandte Pulsleistungsdichte des Lasers 6 aufgetragen worden ist. Unterhalb einer Schwelle von ca. 2 kW/mm² Pulsleistungsdichte des Lasers 6 kann kein messbares Schmelzsignal 23 beobachtet werden. Danach ist eine im Wesentlichen lineare Abnahme des Schmelzsignals als Funktion der Leistung erkennbar. Die Schmelzschwelle 24 kann durch Bestimmen eines Schnittpunkts 25 der linearen Fits in dem Bereich ohne messbares Signal 26 und in dem im Wesentlichen linear abfallenden Bereich 27 ermittelt werden.
12 zeigt die Abhängigkeit der Schmelzschwelle von der durch das Wasserbad 9 eingestellten Anfangstemperatur. Die Schmelzwelle nimmt mit zunehmender Anfangstemperatur ab. Je näher die Anfangstemperatur an der Schmelztemperatur liegt, desto geringere Temperaturerhöhungen müssen mittels angeregter Nanopartikel 5 induziert werden, um ein Schmelzen auszulösen. Um größenabhängige Effekte auf die Schmelzschwelle aufgrund mit der Zeit anwachsender Aggregratgröße auszuschließen, wurden die Schmelzschwellen einmal mit zunehmender Temperatur 28 und einmal mit abnehmender Temperatur 29 gemessen. In der Probe 2 befand sich die vollständig komplementäre Nukleinsäure 15 als nachzuweisende Nukleinsäure. Die bidirektionale Messung zeigte innerhalb der Messfehler identische Ergebnisse.
13 zeigt die gleiche Messung mit einer Nukleinsäure 15, die mit einer Base nicht komplementär ist (M in der Figur). In diesem Fall fällt, anders als in 12, die Schmelzschwelle bei einer Temperatur von 45°C stark ab und es zeigt sich eine Hysterese, wenn die Temperatur wieder abgesenkt wird 29. Die Hysterese wird auf ein Annealing bei einer Annealingtemperatur von 45°C zurückgeführt. Die durch das Annealing verursachte Zunahme der Größe der Aggregate 20 senkt die Schmelzschwelle, weil die Goldnanopartikel bei gleicher Anregung eine größere Temperaturerhöhung hervorrufen, unter anderem wegen eines abnehmenden Oberflächen/Volumen-Verhältnisses der Aggregate. Mit Hilfe des Annealingeffekts können deshalb unterschiedliche Nukleinsäuren 15 voneinander unterschieden werden.
In 14 wurden Abschnitte der Schmelzschwellenkurven für die vollständig komplementäre Nukleinsäure 28 und für die in einer Base abweichende Nukleinsäure nach dem Annealing 29 extrapoliert 30, 31. Die durch die Extrapolation ermittelten Schmelzschwellen-Nullpunkte 32, 33 sind unterschiedlich und können zum Nachweis bzw. zum Unterscheiden der Nukleinsäuren 15 herangezogen werden.
15 erläutert, wie mit nur zwei Anregungen der Nanopartikel 5 bei zwei unterschiedlichen Anfangstemperaturen zwei Nukleinsäuren 15 in derselben Probe 2 nachgewiesen werden können. Dazu sind die Schmelzschwellenkurve 34 einer Probe 2, die ausschließlich vollständig komplementäre Nukleinsäuremoleküle enthält, die Schmelzschwellenkurve 35 einer Probe 2, die ausschließlich in einer Base abweichende Nukleinsäuremoleküle enthält, und die Schmelzschwellenkurve 36 einer Probe, die eine 1:1 Mischung beider Nukleinsäuren enthält, wiedergegeben. Sowohl die Schmelzschwellenkurve 35 als auch die Schmelzschwellenkurve 36 zeigen einen markanten Abfall der Schmelzschwelle bei 45°C, der Annealingtemperatur der in einer Base abweichenden Nukleinsäure 15. Andererseits ist bei der Mischung auch bei 53°C noch eine Schmelzschwelle nachweisbar, während dies bei der Probe 2, die nur in einer Base abweichende Nukleinsäuren enthält, nicht der Fall ist, weil hier bereits alle Aggregate dissoziiert sind. Auf diese Weise können mit nur zwei Anregungen bei zwei verschiedenen Temperaturen die drei Proben 2 in folgender Weise unterschieden werden: Die beiden Paare von Anregungsleistung und Anfangstemperatur sind in der 15 als Punkte 37, 38 (Laserleistungsdichte 1,4 kW/mm², Temperatur 45°C bzw. 53°C) dargestellt. Die Ergebnisse sind in der darunter angegebenen Tabelle dargestellt. Im Fall A der Probe 2, die nur vollständig komplementäre Nukleinsäuren enthält, wird bei 45°C kein Schmelzsignal gemessen, das auf ein Schmelzen hinweist, weil die Leistungsdichte der Anregung unter der Schmelzschwelle liegt. Jedoch wird bei 53°C ein Schmelzen beobachtet, da hier die Schmelzschwelle niedriger hegt. Im Fall B der Probe 2, die nur in einer Base abweichende Nukleinsäuren enthält, ist die Verschiebung der Schmelzschwelle bei 45°C groß genug, um bereits dort ein Schmelzsignal zu erhalten. Bei 53°C wird hingegen kein Schmelzsignal mehr festgestellt, weil diese Temperatur über der Schmelztemperatur liegt und deshalb auch ohne Anregung bereits alle Aggregate 20 dissoziiert sind. Im Fall C der gemischten Probe 2 führen beide Messungen zu einem Schmelzsignal: bei der niedrigen Temperatur aufgrund der durch das Annealing abgesenkte Schmelzschwelle der in einer Base abweichenden Nukleinsäure und bei der hohen Temperatur aufgrund der noch nicht vollständig dissoziierten Aggregate der vollständig komplementären Nukleinsäure. Das Protokoll erlaubt es somit, die drei Proben klar zu unterscheiden, ohne dass zeitaufwändige schrittweise Erhöhungen der Anfangstemperatur notwendig sind. Grundsätzlich kann die Methode in entsprechender Weise auf mehr als zwei unterschiedliche nachzuweisende Nukleinsäuren erweitert werden.
16 erläutert, wie unterschiedliche Nukleinsäuren durch die Verwendung unterschiedlich großer Nanopartikel 5, 39 unterschieden werden können. Eine erste Fraktion von Nanopartikeln 5 ist mit Oligonukleotiden 3, 4 für eine erste Nukleinsäure 15 funktionalisiert. Eine zweite Fraktion von Nanopartikeln 39 ist mit anderen Oligonukleotiden 40, 41 für eine andere Nukleinsäure 42 funktionalisiert. Weil die unterschiedlichen Nanopartikeln 5, 39 bei gleicher Anregung unterschiedliche Wärmemengen erzeugen, ist die Schmelzschwelle bei beiden Fraktionen deutlich verschieden. Dieses Verfahren lässt sich durch weitere Fraktionen von Nanopartikeln grundsätzlich auch auf eine größere Anzahl von zu detektierenden Nukleinsäuren erweitern. Es ist auch denkbar, das in 16 beispielhaft dargestellte Verfahren mit dem in 15 beispielhaft dargestellten Verfahren zu kombinieren, um eine noch größere Anzahl von Nukleinsäuren nachzuweisen.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, mit den Schritten – Bereitstellen mindestens eines Nanopartikels, der durch mindestens ein an ihn gebundenes Oligonukleotid, das mit wenigstens einem Abschnitt einer nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren kann, funktionalisiert ist, – In-Kontakt-Bringen des funktionalisierten Nanopartikels mit einer Probe, in der die Nukleinsäure nachgewiesen werden soll, und – Messen einer Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung des mindestens einen Oligonukleotids mit der nachzuweisenden Nukleinsäure gibt, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren außerdem den Schritt des Anregens der Nanopartikel zur Wärmeerzeugung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel mit elektromagnetischer Strahlung zur Wärmeerzeugung angeregt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel ein Edelmetall umfasst.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Eigenschaft eine optische Eigenschaft des Nanopartikels ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Verfahren außerdem mindestens ein Farbmarker bereitgestellt wird und die Eigenschaft eine optische Eigenschaft des Farbmarkers ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu detektierende Nukleinsäure mindestens zwei Abschnitte umfasst, und mindestens zwei Nanopartikel bereitgestellt werden, wobei mindestens einer der Nanopartikel mit einem Oligonukleotid funktionalisiert ist, das mit dem ersten Abschnitt der Nukleinsäure hybridisieren kann, und mindestens einer der Nanopartikel mit einem Oligonukleotid funktionalisiert ist, das mit dem zweiten Abschnitt der Nukleinsäure hybridisieren kann.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei wenigstens einem Teil der Nanopartikel jeweils mehrere Oligonukleotide an einen gemeinsamen Nanopartikel gebunden sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die Schritte durchläuft: a) Messen der Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung der Nukleinsäure mit dem Oligonukleotid gibt, bei einer vorgegebenen Ausgangstemperatur, b) Anregen des Nanopartikels zur Wärmeerzeugung, und c) erneutes Messen der Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung der Nukleinsäure mit dem Oligonukleotid gibt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte a) bis c) mindestens ein erstes und ein zweites Mal durchlaufen werden, wobei der Nanopartikel bei den Durchlaufen unterschiedlich stark zur Wärmeerzeugung angeregt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass bei jedem Durchlauf aus einem Vergleich der Eigenschaft vor und nach der Anregung des Nanopartikels ein Schmelzsignal ermittelt wird und aus dem Vergleich der Schmelzsignale eine Schmelzschwelle bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure anhand einer Schmelzschwelle, die für die Nukleinsäure bei gegebener Ausgangstemperatur spezifisch ist, nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Schmelzschwelle für mehrere Ausgangstemperaturen bestimmt wird, um eine Schmelzschwellenkurve zu ermitteln.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Steigung der Schmelzschwellenkurve ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Schmelzschwellenkurve linear zu einem Nullpunkt der Schmelzschwelle extrapoliert wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Nukleinsäure anhand einer Annealingtemperatur, die für die Nukleinsäure spezifisch ist, nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure dadurch nachgewiesen wird, dass eine Schmelzschwelle bei einer Ausgangstemperatur, die im Wesentlichen größer oder gleich der Annealingtemperatur ist, unterhalb eines bestimmten Werts liegt.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens die folgenden Schritte durchläuft: – Ermitteln mindestens einer Schmelzschwelle bei mindestens einer Ausgangstemperatur unterhalb der Annealingtemperatur – vorübergehendes Anheben der Ausgangstemperatur auf oder über die Annealingtemperatur – Ermitteln mindestens einer Schmelzschwelle bei mindestens einer Ausgangstemperatur unterhalb der Annealingtemperatur – Vergleichen der vor und nach dem vorübergehenden Anheben der Ausgangstemperatur über die Annealingtemperatur ermittelten Schmelzschwellen.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte a) bis c) mindestens ein erstes und ein zweites Mal durchlaufen werden, wobei die vorgegebene Ausgangstemperatur bei den Durchläufen unterschiedlich ist, bei jedem Durchlauf aus einem Vergleich der Eigenschaft vor und nach der Anregung des Nanopartikels ein Schmelzsignal ermittelt wird und die Schmelzsignale der Durchläufe verglichen werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Fraktionen von Nanopartikeln bereitgestellt werden, die unterschiedliche Anregungseigenschaften haben, die Nanopartikel einer ersten Fraktion für eine erste zu detektierende Nukleinsäure funktionalisiert sind, und die Nanopartikel einer zweiten Fraktion für eine zweite zu detektierende Nukleinsäure funktionalisiert sind, die von der ersten Nukleinsäure unterschiedlich ist.
Ein Kit zum Nachweis von Nukleinsäuren, der umfasst: – mindestens einen Nanopartikel, der durch mindestens ein an ihn gebundenes Oligonukleotid, das mit wenigstens einem Abschnitt einer nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren kann, für die nachzuweisende Nukleinsäure funktionalisiert ist, – Mittel zum Messen einer Eigenschaft, die Aufschluss über den Grad der Hybridisierung des Oligonukleotids mit der nachzuweisenden Nukleinsäure gibt, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit außerdem Mittel zum optischen Aufheizen der Nanopartikel umfasst.