Verfahren zur Auftrennung von in Lösung befindlichen doppelstrangigen Nukleinsäuren in einzelsträngige
Nukleinsäuren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auftrennung von in wäßriger Lösung befindlichen doppelstrangigen Nuklein- säuren in einzelsträngige Nukleinsäuren. - Der Begriff der Nukleinsäuren umfaßt neben DNA und RNA auch PNA. Mit diesem Begriff sind weiterhin natürliche Nukleinsäuren, i.e. Nukleinsäuren voller Länge, umfaßt, als auch Nukleinsäure- fragmente. Fragmente bezeichnet dabei Teile einer (natür- lieh oder gentechnisch hergestellten) Nukleinsaure bzw. synthetisierte Nukleinsäuren. Typische Basenpaarzahlen von Fragmenten liegen beispielsweise im Bereich von kleiner als 10 bis zu über 2000. Nukleinsäuren können an einer oder an mehreren Stellen substituiert sein, beispielsweise mit Farbstoffmolekülen, Brückenmolekülen zur Immobilisierung an festen Substraten, und/oder reaktiven/kataly- tischen Molekülgruppen. Solche Substituenten berühren die typische Funktionalität der Nukleinsaure, insbesondere die Hybridisierbarkeit, nicht.
Verfahren der vorstehenden Art werden z.B. in dem Bereich der Amplifikation bzw. Vervielfältigung von Nukleinsäure- strukturen oder bei der Hybridisierung zu untersuchender Nukleinsäuren mit bekannten Nukleinsäuren zum Zwecke des Erhalts von Informationen über die Sequenz der unbekannten Nukleinsäuren (Stichworte: DNA-Hybridisierungstechniken, DNA Chips) oder auch bei der Synthese benötigt. Grundlage vieler gentechnischer Analyse- und Syntheseverfahren ist
die selektiv arbeitende PCR (Polymerase chain reaction) , eine einfache Vervielfältigungsmethode für gezielt aussuchbare DNA's oder DNA-Fragmente in einer Reaktionskammer (siehe z.B. US-A-4, 683, 195 und US-A-4, 683, 202) oder auch in situ, beispielsweise in einem Gewebeschnitt. Nach der Einführung temperaturstabiler Polymerasen hat diese Methode weite Verbreitung in gentechnischen Laboratorien gefunden. Aber auch andere Anwendungen benötigen eine Auftrennung einer doppelstrangigen Nukleinsaure in Einzel- stränge. So ist dies beispielsweise bei der einfachen Hy- bridisierungsreaktion notwendig, wenn die zu hybridisierende Nukleinsaure doppelsträngig vorliegt. Nach der Hybridisierung ist es oftmals ebenfalls notwendig, eine Auftrennung in Einzelstränge durchzuführen, beispielsweise zur Regeneration von bestimmten Bindungsstellen oder zur effizienteren Detektion der erfolgten Hybridisierung. Schließlich kann es auch erforderlich werden, Nukleinsäuren von Substraten und/oder immobilisierten Bindungspartnern zu lösen, beispielsweise im Falle von Nukleinsaure Chips. Auch hier kann eine übermäßige Erwärmung u.U. stören.
PCR ist insbesondere die gezielte Vervielfältigung eines präzise aus dem Genom ausgesuchten relativ kurzen Segments der zweisträngigen DNA in einfachen Temperaturzyklen. Die Auswahl des DNA-Segments erfolgt durch ein sogenanntes Paar von Primern, zweier DNA-Stücke mit je etwa 5-30 Basen Länge, die die beiderseitigen Enden des ausgesuchten DNA- Segments codieren. Die Vervielfältigung erfolgt durch ein Enzym namens Polymerase. Die PCR-Reaktion läuft in wäßriger Lösung ab, in der wenige Moleküle der Ausgangs- DNA und genügende Mengen an Polymerase, Primern, Triphos- phaten der natürlichen und/oder weiteren nicht-natürlichen
Nukleotide, Aktivatoren und Stabilisatoren vorhanden sind. In jedem Temperaturzyklus wird zunächst die Doppelhelix der DNA bei etwa 95°C "aufgeschmolzen", wobei die beiden Stränge voneinander getrennt werden. Bei etwa 45°C werden dann die Primer an eine genau passend komplementäre Nuk- leotidfolge der DNA-Einzelstränge angelagert ("Hybridisierung") . Bei 72°C wird die Doppelhelix durch den Anbau der komplementären Nukleotide an ein Wachstumsende der Primer durch eine besonders temperaturfeste Polymerase (Taq-Polymerase) wieder zu einer neuen Doppelhelix vervollständigt. Dadurch wird das ausgewählte DNA-Segment zwischen den Primern im Prinzip verdoppelt. In dreißig Zyklen werden also aus einem einzigen Doppelstrang der DNA als Ausgangsmaterial rund eine Milliarde DNA-Segmente erzeugt, deren beide Enden mit den Primern identisch sind.
Die Vervielfältigung der DNA erfolgt bei den heutigen PCR Geräten schon relativ schnell im Vergleich zu den früher benutzten Klonierungsmethoden in lebenden Zellen. Bei op- timiertem Steuerprogramm kann innerhalb drei Stunden mit einem handelsüblichen PCR-Gerät aus aufgeschlossenem Zellmaterial ein etwa 400 Basenpaare langes DNA-Fragment am- plifiziert werden, so daß sich die DNA Konzentration deutlich über die Nachweisgrenze (im Agarosegel unter UV Bestrahlung und Färbung mit Ethidiumbromid) erhöht.
Das Schmelzen der DNA erfolgte bisher bei einer Temperatur, die knapp über der empirisch ermittelten Schmelztemperatur liegt. Untersuchungen haben gezeigt, daß eine halbe Sekunde Erhitzung auf diese Temperatur für eine vollständige Trennung aller Doppelhelix-Strukturen genügt. Die Hybridisierung braucht ebenfalls nicht lange, wenn die Primer in genügender Konzentration vorhanden sind. Bei
optimaler Konzentration sind etwa ein bis zwei Sekunden ausreichend. Die Vervollständigung der DNA hat eine sehr hohe Geschwindigkeit: Pro Sekunde können unter optimalen Temperatur- und Konzentrationsbedingungen 50 bis 100 Basen durch eine spezielle Polymerase angebaut werden (C. R. Newton und A. Graham: PCR; Spektrum Akademischer Verlag; Heidelberg, Berlin, Oxford, 1994; Seite 31) . Da im allgemeinen nur DNA Segmente von bis zu 400 Basen Länge für die Analysen benötigt werden, reichen zehn Sekunden gut für die Verlängerung aus.
Die Zeitdauer für einen Temperaturzyklus hängt somit größtenteils von der Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeit ab, die wiederum vom Flüssigkeitsvolumen, von den Gefäßdi- mensionen und von der Wärmeleitfähigkeit der Gefäßwände und der Reaktionslösung abhängt. Bei üblichen Geräten, beispielsweise dem Primus 96, MWG Biotech AG, Deutschland, wird hierzu zum Aufheizen einer 5ml DNA Lösung mit elektrischen Leistungen von ca. 400 Watt gearbeitet. Auf jeder Temperaturstufe sind im Prinzip nur wenige Sekunden von- nöten, teilweise sogar weniger.
Es ist bekannt, durch Verringerung des Probenvolumens, Vergrößerung der spezifischen Oberfläche und durch pneuma- tisches Anlegen eines Kühlblocks die Übergangszeiten zum folgenden Temperaturniveau so kurz wie möglich zu halten (DE 197 17 085 A 1) . Dies ist jedoch nur mit erheblichem mechanischen und mikrosystemtechnischen Aufwand möglich.
Aus der Literaturstelle WO 98/00562 ist es bekannt, den Aufschmelzprozeß mittels eines elektrischen Feldes durchzuführen, welches im Zuge des Reaktionsverlaufes abgeschaltet oder invertiert wird.
Aus der Literaturstelle WO 96/41864 ist es bekannt, eine zum Aufschmelzen erforderliche Temperatur in der Lösung mittels Einstrahlung von IR- und UV-Licht einzustellen. Demgemäß kann entweder breitbandig gearbeitet werden, es kann aber auch kohärente Strahlung eingesetzt werden. In jedem Fall ist betont, daß die Wellenzahlen mit der Maßgabe auszuwählen sind, daß sie im Bereich hoher Absorptionskoeffizienten des Wassers liegen. Ähnliche Verfahren sind in den Literaturstellen US-A-5, 972, 667 und
US-A-5, 721, 123 beschrieben. In allen drei Literaturstellen wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die Einstrahlung zum Zwecke der Temperaturerhöhung der Lösung bzw. des Lösungsmediums erfolgt. Da somit eine Erwärmung der Lösung auf ca. 95°C erfolgt, muß mit entsprechend hohen Leistungen gearbeitet werden und die subsequente Abkühlung ist mit allen Problemen und Zeitverzögerungen analog der elektrischen Aufheizung behaftet.
Aus der Literaturstelle WO 98/06876 ist es bekannt, den Aufheizvorgang zum Aufschmelzen dadurch durchzuführen, daß ein in der Lösung befindliches Festkörpersubstrat mittels Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen aufgeheizt wird. Die zum Einsatz kommenden elektromagnetischen Wellen weisen Frequenzen unterhalb von 1,07 GHz auf.
Eine hohe Geschwindigkeit der PCR ist insbesondere aus den folgenden Gründen erwünscht. Im Verfolg der Entschlüsselung des menschlichen Erbgutes im "Human Genome Project" wird im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Techniken, mittels welchen die gewonnenen Informationen ausgewertet und verwertet werden, die PCR benötigen. Beispielsweise beruhen praktisch alle Biochip Technologien auf dem
Einsatz der PCR. Weiterhin existieren PCR Anwendungen, die der Diagnose dienen, beispielsweise zur Erkennung von bestimmten Tumorzellen in menschlichem Gewebe. Sollen solche Analysen beispielsweise während einer Operation am Patien- 5 ten durchgeführt werden, dann wird eine maximale Analysendauer von 10 Minuten gefordert. Bisher beschriebene PCR Geräte (A. T. Woodley et. AI., "Functional Integration of PCR Amplification and Capillary Electrophoresis in a Microfabricated DNA Analysis Device", Anal. Che . 68, 4081,
10 Dezember 1996) benötigen tpischerweise jedoch mindestens 15 Minuten bei einem Programm mit 30 Zyklen. Die Zeit, die man zum Aufschließen der Zellen und zur Freilegung der DNA benötigt, ist dabei noch nicht eingerechnet. Schließlich wird PCR beispielsweise auch bei der Selektion von gegen
15 vorgegebene Zielstoffe affinen Aptameren bzw. Ribozymen aus hochkomplexen DNA-Bibliotheken (1015 und mehr) eingesetzt.
Ein weiteres Problem der bekannten PCR Verfahren, und zwar 20 auch der Verfahren mit Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen, welche vom Medium absorbiert werden, ist die irreversible Zerstörung der Polymerase durch die hohe Temperatur während des Aufschmelzens . Obwohl es heute schon sehr gut auf Temperaturstabilität optimierte Po- 25 lymerasen gibt, sinkt die Leistungsfähigkeit der Enzyme bei jedem Zyklus beträchtlich ab. Die Halbwertszeit der Aktivität üblicher Polymerasen (von Thermus aquaticυs) bei 95 °C beträgt 40 Minuten (C. R. Newton und A. Graham: PCR; Sektrum Akademischer Verlag; Heidelberg, Berlin, Oxford, 30 1994; Seite 31) . Gerade während der letzten Zyklen wird aber eine sehr hohe Aktivität der Polymerase gefordert, da bereits sehr viele DNA Amplifikate erzeugt wurden, die alle gleichzeitig verlängert werden sollen. Es muß daher
eine entsprechend höhere Menge des teuren Enzyms eingesetzt werden. Einige PCR Verfahren begegnen diesem Problem durch eine sukzessive Verlängerung der Elongationszeiten in jedem Zyklus. Ein Polymerase-Molekül kann dann mehrmals hintereinander an unterschiedlichen Stellen während eines Zyklus eingesetzt werden. Dies erhöht jedoch wiederum die Gesamtdauer der PCR. Es wäre wünschenswert, wenn eine Optimierung der Verlängerungsgeschwindigkeit der Polymerasen gelänge, anstatt die Temperaturstabilität der Enzyme weiter verbessern zu müssen.
Den bekannten Technologien ist gemeinsam, daß der Bedarf an elektrischer Energie aufgrund der notwendigen Heiz- und Kühlprozesse relativ hoch ist mit der Folge, daß ent- sprechende Stromversorgungseinheiten vorgesehen sein müssen. Dies macht Geräte des Standes der Technik voluminös und schwer und erschwert einen vor-Ort Einsatz außerhalb eines speziell vorgesehenen Labors. Zudem werden spezielle, temperaturstabile Polymerasen benötigt, die teuer sind, zumal aufgrund der Halbwertszeiten auch eine größere Menge benötigt wird.
Daher liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mittels welchem innerhalb kürzester Zeit eine doppelsträngige Nukleinsaure in Einzelstränge zerteilt werden kann. Insbesondere ist es wünschenswert, die Zykluszeit für die PCR Amplifikation von Nukleinsäuren zu beschleunigen und auf wenige Sekunden zu reduzieren. Ebenso wünschenswert ist es, die für Po- lymerasen schädliche Erhitzung auf hohe Temperaturen zu vermeiden und so die PCR effektiver werden zu lassen und gleichzeitig teures Polymerase Enzym einzusparen, insbesondere aber auch den Einsatz weniger temperaturstabiler
Polymerasen zu gestatten. Schließlich wäre eine Verringerung des Bedarfes an elektrischer Energie zum Zwecke eines mobilen Einsatzes, beispielsweise mit Batterien, wünschenswert .
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung, daß die Zerlegung der Nukleinsäuren in Einzelstränge durch Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen durchgeführt wird, wobei die Wellenzahl und die Intensität der elektromagnetischen Wellen mit der Maßgabe ausgewählt sind, daß die Wasserstoffbruckenbindungen zwischen Nukleotiden einer doppelstrangigen Nukleinsaure durch unmittelbare Wechselwirkung der elektromagnetischen Strahlung mit der doppelstrangigen Nukleinsaure gelöst werden, wobei die Wellenzahl der elektromagnetischen Wellen in einem Transmissionsfenster von D20 liegt und wobei die wäßrige Lösung zumindest zum Teil mit D20 gebildet ist. - Als Transmis- sionsfenster ist ein Wellenzahlenbereich bezeichnet, in welchem die molare Absorptivität, messen gemäß der Litera- turstelle S.Y. Venyaminov et al . , Analytical Biochemistry 248:234-245 (1997) weniger als 5 M^cπf1, vorzugsweise weniger als 3 M^cm-1, beträgt.
Die Erfindung beruht auf den folgenden Erkenntnissen. Die genaue Struktur, die Bindungslängen, die Bindungswinkel und die Bindungsenergie der Wasserstoffbruckenbindungen zwischen den Nukleinsaure bzw. DNA Strängen und die molekularen Massenanteile der Nukleotide sind bekannt. Wenn dann die Frequenzen der elektromagnetischen Wellen zudem so ausgewählt sind, daß die Wellen mit dem Medium, i.e. Reaktionspuffer bzw. seinen mengenmäßigen Hauptkomponenten, eine möglichst geringe Wechselwirkung aufweisen, kann eine (unerwünschte) thermische Aufheizung des
Gesamtgemisches vermieden werden. Es versteht sich, daß die Frequenzen auch so gewählt sein sollten, daß keine störende Absorption durch die Polymerasen stattfindet.
Zum Schmelzen der Nukleinsaure muß dem Molekül Energie hinzugefügt werden, deren Betrag mindestens so hoch ist, wie die Bindungsenergie der Wasserstoffbrücke. Die für die Erfindung wesentliche Erkenntnis ist, daß Nukleinsäure- oleküle wegen ungleicher Verteilung elektrischer Ladungen durch elektromagnetische Wechselfelder zum Schwingen angeregt werden können. Hierbei können insbesondere die an den Wasserstoffbruckenbindungen beteiligten Molekülgruppen, beispielsweise C=0 und/oder N-H Gruppen, angeregt werden. In Frage kommende Wellenzahlen können beispiel- sweise mittels der Raman Spektroskopie ermittelt werden. Wellenzahlen mit hohem Absorptionskoeffizienten im Raman Spektrum sind im Rahmen der Erfindung geeignet. Insbesondere Streckschwingungen von C=0 und/oder N-H Gruppen führen zu einer Destabilisierung der angrenzenden Wasserstoffbruckenbindungen der Nukleinsaure. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, ist anzumerken, daß eine Auftrennung statt findet, wenn der eingetragene Quantenenergiebetrag größer als die Bindungsenthalpie der H- Brücke ist. Beispielsweise aus der Bindungsenthalpie von H = 12,6 kJ/ ol ergibt sich je Bindung ein Wert von H = 2,09 * 10"20 J. Mit E = h * v erhält man eine Frequenz von 31,5 THz bzw. eine Wellenzahl von 1051 cm"1. Wenn im Bereich solcher Frequenzen mit ausreichender Leistung Energie eingestrahlt wird, kann dies zu einer Lösung der Wasserstoffbruckenbindungen und folglich einer Vereinzelung der beiden Stränge einer doppelstrangigen Nukleinsaure führen.
Die Erfindung beruht auf der weiteren Erkenntnis, daß leichtes Wasser H20 bei den Wellenzahlen, die zu einer Auftrennung der Nukleinsäuren führen, ebenfalls in beachtlichem Maße absorbiert, und folglich zumindest ein Teil des leichten Wassers durch ein Lösungsmittel, nämlich D20 ersetzt werden kann, welches bei diesen Absorptionsbanden der Nukleinsäuren nicht oder nur geringfügig absorbiert, wenn eine störende Absorption durch das Medium und folglich dessen unerwünschte Erwärmung vermieden werden soll. Grundsätzlich ist insofern auch ein entsprechendes nichtwäßriges Lösungsmittel, in welchem die Nukleinsäuren stabil sind und die gewünschten Reaktionen störungsfrei ausgeübt werden können, einsetzbar. Durch Ein- und Ausschalten der Strahlungsquelle kann somit eine reversi- ble, nahezu isotherme Auftrennung doppelsträngiger Nukleinsäuren in einzelsträngige Nukleinsäuren erreicht werden, wobei der Beriff "isotherm" dahingehend zu verstehen ist, daß zu keinem Zeitpunkt eine Temperatur des Mediums bzw. des Reaktionspuffers erreicht wird, die der thermodynamischen Schelztemperatur aller anwesender doppelsträngiger Nukleinsäuren entspricht. In diesen Zusammenhängen ist anzumerken, daß in Falle einer gewünschten maßvollen Erwärmung der Grad der Erwärmung des Mediums bei vorgegebener Einstrahlleistung und -Dauer auch über das Mischungsverhältnis H20/D20 eingestellt werden kann. Das Gewichtsverhältnis H20/D20 im Reaktionspuffer bzw. der Lösung beträgt beispielsweise 0:100 bis 99,5/0,5, vorzugsweise 0:100 bis 50:50, höchstvorzugsweise 0:100 bis 10:90.
Es ist somit möglich, durch gezielte Einstrahlung elektromagnetischer Wellen mit definierten Wellenzahlen, insbesondere Nukleinsäure-Resonanzfrequenzen, welche abseits
von Resonanzen des Mediums bzw. der Polymerasen liegen, selektiv eine Trennung der Nukleinsäurestränge voneinander zu bewirken, und zwar ohne eine beim Stand der Technik festzustellende unerwünschte Erwärmung des Puffers und insbesondere der Polymerasen. Dies wird (neben der nicht beobachteten Erwärmung) auch dadurch belegt, daß die Trennung nur wenige Milliwatt, beispielsweise 0,1 bis 1000 Milliwatt, insbesondere 1 bis 100 Milliwatt, erfordert, bei geeigneter Anpassung der Expositionsvorrichtung und Positionierung des Reaktionsgefäßes.
Mit der Erfindung wird erreicht, daß beispielsweise bei der PCR die Aufheiz- und Abkühlungsperiode entfällt bzw. kürzer ausfällt, so daß sich die Zykluszeiten und damit die Gesamtdauer des Amplifikationsvorgangs im Vergleich zur vorbekannten PCR erheblich verkürzt. Gleichzeitig wird die zur Vervielfachung notwendige Polymerase praktisch nicht durch Hitzedenaturierung geschädigt, so daß eine kleinere Menge des teuren Enzyms eingesetzt werden kann. Es kann aber auch eine weniger hitzebeständige Polymerase eingesetzt werden. Dies beruht letztendlich darauf, daß Resonanzen der Polymerase typischerweise nicht bei gleichen Wellenzahlen wie Molekül-Resonanzen in einem (Doppel-) Strang liegen. Wesentlich ist hierbei also letz- tendlich, daß der AufSchmelzvorgang erfindungsgemäß nicht durch Temperaturerhöhung (des Mediums), sondern durch Einstrahlung elektromagnetischer Wellen mit einer definierten Nukleinsäure-Wellenzahl erfolgt.
Im Rahmen der Erfindung bevorzugt ist es, wenn die Wellenzahlen der elektromagnetischen Strahlung im Bereich von weniger als 1150 cm"1 und/oder 1200 bis 2200 cm"1 und/oder oberhalb 2700 cm"1 eingestellt ist mit der Maßgabe, daß die
eingestellte Frequenz zumindest teilweise solche Schwin- gungszustände der Nukleinsaure anregt, welche in einer Trennung ausschließlich der Wasserstof bruckenbindungen resultieren, nicht jedoch Bindungen einer Polymerase spal- tet (dies schließt geringfügige Zersetzungsraten von bis zu 10%, vorzugsweise weniger als 2%, der Rate bei Erwärmung auf 95°C ein) oder zu einer Temperaturerhöhung eines Mediums führt (dies schließt unwesentliche Temperaturerhöhungen eines nicht thermostatisierten Mediums von bis zu 20°C / min., vorzugsweise von weniger als 5°C / min. ein) . Dies ist der Wellenzahlenbereich, in welchem experimentell, beispielsweise mittels Raman Spektroskopie, geeignete Resonanzen gefunden werden können, um doppel- strängige DNA bei Temperaturen unterhalb der thermodyna- mischen DNA-Schmelztemperatur, bis hinunter zu 20°C, zu schmelzen. Durch beispielsweise Raman Spektroskopie an Lösungen mit Polymerase, jedoch ohne Nukleinsäuren, können die für die Stabilität der eingesetzten Polymerase schädlichen Wellenzahlen ermittelt und so vermieden wer- den. Im Bereich unterhalb 1150 cm"1 liegen die Phosphat- gruppenschwingunen sowie der Fingerprintbereich von Nukleinsäuren. Im Bereich zwischen 1250 und 2200 cm"1 liegen die C=0 Streckschwingungen von Nukleinsäuren. Im Bereich oberhalb von 2700 cm"1 liegen die H- Streckschwingungen von Nukleinsäuren.
Im einzelnen ist es im Bereich oberhalb von 2700"1 cm bevorzugt, wenn mit Oberwellen der C=0, N-H, O-H, R-O-H oder CONH2 (Streck-) Schwingungen gearbeitet wird, beispielsweise der 1. oder 2. Oberwelle, bis zur 6. Oberwelle. Für die C=0 Schwingungen kommen insbesondere Wellenzahlen im Bereich der 4. bis 6. Oberwelle (Grundwelle: 1668 cm"1, entspricht 5995,2 nm) in Frage, i.e.
Wellenzahlen von 5000 bis 12000 cm"1. Für die N-H Schwingungen kommen insbesondere die 3. und 4. Oberwelle (Grundwellen: 2908 cm"1, entspricht 3438,8 nm, und 2966 cm"1, entspricht 3371,5 nm) in Frage, i.e. Wellenzahlen von 7000 bis 13000 cm"1. Zweckmäßigerweise werden dabei Wellenzahlen eingestellt, für welche sowohl H20 als auch D20 eine hohe Transmission aufweisen. Vermieden werden sollten dann insbesondere Wellenzahlen kleiner ca. 8000 cm"1, da hier die Transmission von D20 deutlich abnimmt, i.e. Absorption zu beobachten ist. Ein optimaler Bereich liegt zwischen ca. 8000 und 12000 cm"1, da hier der Unterschied in der Transmission zwischen H20 und D20 am höchsten ist und andererseits eine Mehrzahl von Molekülresonanzen der Nukleinsäuren in diesem Bereich liegen.
Zusätzlich zu den erfindungsgemäß eingesetzten Wellenzahlen können elektromagnetische Wellen mit Wellenzahlen eingestrahlt werden, welche zu einer definierten moderaten Erwärmung des Mediums bzw. des Reaktionspuffers führen, wobei die Wellenzahl, die Strahlungsleistung und die
Bestrahlungsdauer mit der Maßgabe ausgewählt sind, daß das Medium auf Temperaturen von nicht mehr als 90 °C, vorzugsweise nicht mehr als 75°C, innerhalb einer Aufheizver- fahrensstufe aufgeheizt wird.
Von selbstständiger Bedeutung im Rahmen der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Verfahren zur in vitro Amplifikation von Nukleinsäuren mit den folgenden Verfahrenstufen: a) Zerlegung der Nuklein- säuren in Einzelstränge, b) Anhybridisierung von Primern an die Einzelstränge aus Stufe a) , c) Verlängerung der in Stufe b) anhybridisierten Primer durch (Desoxy-) Ribonuk- leosidtriphosphate mittels Einsatz einer Polymerase, d)
Rückführung der in Stufe c) erhaltenen Nukleinsäuren in die Stufe a) , wobei die Stufen a) - d) so oft wiederholt werden, bis ein vorgegebener Amplifikationsfaktor erreicht ist und wobei die elektromagnetische Strahlung in Stufe a) eingestrahlt wird.
Bevorzugt ist es, wenn auf Nukleinsäure-Synthese- Geschwindigkeit optimierte Polymerasen in Stufe b) eingesetzt werden. Diese brauchen nämlich nicht mehr die beim Stand der Technik erforderliche Temperaturbeständigkeit aufzuweisen. So wird der bisher langsamste und damit geschwindigkeitsbestimmende Schritt der PCR deutlich verkürzt .
Die Erfindung ist grundsätzlich bei allen PCR-Methoden einsetzbar, beispielsweise auch im Rahmen der Sequenzierreaktion mit der Kettenabruchmethode nach Sanger.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Reaktionskammer zur Aufnahme einer Lösung mit Nukleinsäuren und ggf. weiteren Reagenzien, insbesondere Polymerasen und Nukleotiden, mit einer Vorrichtung zur Erzeugung elektromagnetischer Wellen sowie einem die Reaktionskammer begrenzenden optischen Fenster, wobei die Vorrichtung zur Erzeugung elektromagnetischer Wellen Strahlung im Bereich von weniger als 1100 cm"1 und/oder 1300 bis 2100 cm"1 und/oder mehr als 2700 cm"1 erzeugt. - Als Vorrichtungen zur Erzeugung elektromag- netischer Strahlung kommen insbesondere IR-
Strahlungsquellen in Frage. Zur Erzeugung kohärenter IR- Strahlung definierter Wellenzahl sind beispielsweise IR- Laser, typischerweise Kohlenmonoxid Gaslaser,
Kohlenmonoxid Obertonlaser, Optisch-Parametrische- Oszillatoren (OPO) , Laser mit Heterodyn-Mischverfahren oder Halbleiterlaser, wie Bleisalz-Diodenlaser oder Quantenkaskaden-Laser geeignet. Halbleiterlaser sind wegen der preisgünstigen Herstellung, der geringen Betriebsleistung und der unproblematischen Temperierung besonders vorteilhaft für kleine und tragbare Geräte zur Nukleinsäure-Denaturierung. Bei Einsatz von nichtkohärenten Strahlungsquellen müssen ggf. Wellenzahlan- teile, welche im Bereich der Absorptionsbanden von H20 bzw. D20 liegen, mittels einer Wellenzahlenselektionsvorrichtung so hinreichend gedämpft oder ausgeblendet werden, daß eine strahlungsbedingte Erwärmung der Lösung auf Temperaturen oberhalb 90°C, besser oberhalb 80°C oder 75°C, verhindert wird. Dies kann beispielsweise durch Zwischenschaltung geeigneter Transmissionsfilter, Notch-Filter, sonstigen Interferenzfilter, einem Prisma- oder einem Gitter- Monochromator zwischen der Strahlungsquelle und dem optischen Fenster erfolgen. Alternativ oder zusätzlich kann das optische Fenster selbst die benötigte Filterfunktion ausüben. Es versteht sich, daß das optische Fenster für die erfindungsgemäß eingesetzten Wellenzahlen eine gute Transmission aufweisen sollte.
Das optische Fenster kann einen Teil der Wandung der Reaktionskammer bilden, die Reaktionskämmer kann aber auch insgesamt als otpisches Fenster ausgebildet sein. Die Reaktionskammer kann auf verschiedene Weisen weiter ausgebildet sein. So kann die Reaktionskammer als diskon- tinuierlicher Rührkessel-Reaktor ausgebildet sein. Dies meint, daß die Reaktionslösung stationär bleibt und ggf. agitiert wird. Es ist aber auch möglich, die Reaktionskammer als kontinuierlichen Rührkessel, beispielsweise als
Rohrreaktor, auszubilden, wobei in das Innere des Reaktors und im Falle eines Rohrreaktors in Richtung der Längserstreckung des Rohrreaktors elektromagnetische Wellen einstrahlbar sind. In einem solchen Reaktor ist die Reaktionslösung mobil und strömt zwischen einem Einlaß und einem Auslaß durch den Reaktor. Dabei ist der Reaktionsfortschritt bzw. sind die Reaktionsstufen eine Funktion der Verweilzeit bzw. des Ortes (im Falle eines Rohrreaktors in erster Näherung eindimensional entlang der Läng- serstreckung) . Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Reaktionskammer ist eine (ggf. beidseitig geschlossene) Kapillare, wobei die Kapillare hinsichtlich ihrer Längserstreckung zumindest zum Teil in Richtung des elektrischen Feldvektors der elektromagnetischen Strahlung ausgerichtet ist.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens kann die Strahlungsquelle zur periodischen Emission der Strahlung ausgebildet sein, und zwar entsprechend der Reaktionszyklen so, daß lediglich in der Verfahrenstufe a) eingestrahlt wird. Dies ist durch eine Steuereinheit möglich, welche entweder die Strahlungsquelle entsprechend periodisch ein- und ausschaltet. Ebenso kann aber auch mittels der Steuereinheit eine Abschatteinheit, beispiel- sweise eine Blende oder ein Schutter, so angesteuert werden, daß das optische Fenster gegenüber der Strahlungsquelle in den Verfahrensstufen b) bis d) abgeschattet wird.
Für das Annealing der Primer ist es aus Spezifitätsgründen oft sinnvoll, eine Temperaturregelung der Reaktionskammer auf eine konstante Temperatur oberhalb der Raumtemperatur, beispielsweise 25 - 80°C, insbesondere 40 bis 70°C oder
60°C, vorzusehen. Neben der vorstehend bereits beschriebenen Erwärmung durch (zusätzlich) Einstrahlung von von dem Lösungsmittel absorbierbarer Strahlung kann dies auch auf konventionell elektrischem Wege erfolgen. Im Falle der Strahlung kann die Regelung durch Veränderung der reflek- tiven Eigenschaften der Wände der Reaktionskammer und/oder durch eine Veränderung der Transmissionseigenschaften des optischen Fensters oder vorgeschalteter optischer Elemente erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Wände der Reaktionskammer, mit Ausnahme des optischen Fensters, reflektierend im Bereich der erfindungsgemäß eingesetzten Wellenzahlen ausgebildet. Dann wird die Ef- fektivität der Aufspaltung erhöht aufgrund der besseren Ausnutzung der eingestrahlten elektromagnetischen Wellen.
Eine oder mehrere Nukleinsäuren, und/oder für die Reaktionen der Nukleinsäuren eingesetzten Enzyme oder Kata- lysatoren können dabei in dem Reaktor immobilisiert sein. Dies kann an den Reaktorwandungen erfolgt sein, besonders bevorzugt ist aber eine Immobilisierung reaktorinnenseitig am optischen Fenster. Damit wird ein Effekt einer lösungsmittelbedingte Dämpfung der eingestrahlten elektromag- netischen Wellen noch weiter reduziert, da die Wellen zunächst unmittelbar auf die Zielmoleküle auftreffen. Auch ist eine Immobilisierung der besagten Komponenten an in der Lösung suspendierbaren Partikeln oder nicht-mischbaren Flüssigkeitstropfen möglich. Hierdurch kann eine Abtren- nung in einer an die Reaktion (en) anschließenden Trennungsverfahrenstufe erleichtert werden.
Folgend werden Details der Erfindung sowie weitere mögliche Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.
Bei der PCR durchläuft das Reaktionsgemisch im einzelnen die folgenden physikalischen und chemischen Zustand- sänderungen:
a) Das Reaktionsgemisch wird mit elektromagnetischen Wellen einer oder mehrerer definierter Wellenzahlen mit aus- reichender Leistung bestrahlt. Doppelsträngige DNA geht dabei in einzelsträngige DNA über. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wird dabei von den elektromagnetischen Wellen nicht wesentlich beeinflußt, b) Die Einstrahlung der elektromagnetischen Wellen wird beendet und das Reak- tionsgemisch wird auf eine geeignete Temperatur geregelt, die unterhalb der Anlagerungstemperatur der Primer liegt. Die Primer können sich an den komplementären Stellen der einzelsträngigen DNA anlagern, c) Das Reaktionsgemisch wird auf eine Temperatur geregelt, bei der die Polymerase mit optimaler Geschwindigkeit den komplementären Strang mit Nukleotiden auffüllt. Diese drei Stufen können so oft wie gewünscht wiederholt werden. Das entstandene doppelsträngige Reaktionsprodukt wird dabei wieder in (a) eingesetzt .
In der Praxis ist es möglich, für die Verfahrensstufen b) und c) die gleiche Temperatur, beispielsweise im Bereich von 20°C bis 80 °C, einzustellen. Der Verlauf der Gesamtreaktion ist dann isotherm. Dies ermöglicht eine beacht- liehe apparative Vereinfachung gegenüber PCR gemäß dem Stand der Technik, bei welchem mit hoher Präzision und folglich hohem technischen Aufwand unterschiedliche
Temperaturstufen angefahren und eingeregelt werden müssen, und dies zudem möglichst schnell.
Das Reaktionsgemisch setzt sich dabei aus den üblichen Komponenten zusammen, wie sie bei der konventionellen PCR oder deren Weiterentwicklungen benutzt werden. Dies sind mindestens ein geeignetes Lösungsmittel, eine sehr kleine Menge Nukleinsaure als Matritze, ein oder mehrere geeignete Oligonukleotide als Primer, Desoxynukleotid- triphosphate aller in der Matritze zwischen den Primern liegenden Nukleinbasen, und eine Substanz, welche die Kettenverlängerung katalysiert (e.g. Polymerase).
Eine (zusätzliche) Einstrahlung von anderen Wellenzahlen, als die erfindungsgemäß zur Auftrennung der Doppelstränge eingesetzten Wellenzahl, kann unter Umständen nützlich sein, um Quervernetzungen bei komplizierten Tertiärstrukturen der DNA aufzulösen und dadurch die Amplifikation des DNA-Abschnittes zu erleichtern.
Die Erfindung kann auch im Rahmen der in-situ PCR vorteilhaft verwendet werden. Hierbei wird beispielsweise ein Gewebeschnitt mit den PCR Reagentien versetzt, wobei zumindest ein Primer eine Markierung trägt. Mit Markierung sind jegliche Art von meß- oder färbetechnisch wirksame Markierungsatome oder Markierungsmoleküle gemeint. Dann wird der Gewebeschnitt dem o.g. Reaktionszyklus ausgesetzt mit dem Ergebnis, daß Nukleinsäuren mit sehr hoher Empfindlichkeit und lateraler Auflösung detektierbar sind. Mit der Erfindung wird erreicht, daß eine Austrocknung eines Gewebeschnitts und/oder eine Denaturierung von Stoffen darin aufgrund der geringeren Aufheizung zuverlässig
verhindert werden kann, und zwar unter Vermeidung der ansonsten hierfür erforderlichen Maßnahmen.
Eine Verfolgung der Aufspaltung der doppelstrangigen Nuk- leinsäuren in einzelsträngige Nukleinsäuren kann durch Beobachtung des hypochromatischen Effekts erfolgen. Hierzu wird mittels einer UV-Lichtquelle (200 - lOOOnm) die Lösung durchstrahlt und mittels eines UV-Detektors (spektrale Selektivität im Wellenlängenberich von 250 - 260 nm) gemessen. Die Anordnung ist so getroffen, daß der Reaktor, beispielsweise eine Kapillare, durchstrahlt wird. Die UV- Transmissionsmessungen erfolgen bei 260 nm. Bei den UV- Absortionsmessungen ist die gewählte UV-Wellenlänge spezifisch für einzelsträngige DNA (hyperchromatischer Effekt) . Eine hohe Transmission steht also für eine geringe Konzentration an einzelsträngiger DNA. Eine niedrige Transmission zeigt dagegen das Vorliegen einzelsträngiger DNA an.
Folgend wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsbeispielen darstellenden Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1: Raman Spektrum einer Nukleinsaure,
Fig. 2: Raman Spektren der Nukleinsaure aus Fig. 1 zusammen mit Ramanspektren von H20 und D20,
Fig. 3: Raman Spektrum von D20, H20 und der Nukleinsaure aus Figur 1 im einem Bereich höherer Wellenzahlen,
Fig. 4: eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit kohärenter Strahlungsquelle,
Fig. 5: eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit nicht-köhärenter Strahlungsquelle und Transmissionsfilter,
Fig. 6: eine schematische Darstellung einer erfindungs- gemäßen Vorrichtung mit nicht-kohärenter Strahlungsquelle und Prismenfilter,
Fig. 7: eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit nicht-köhärenter Strahlungsquelle und Gitterfilter,
Fig. 8: Transmissionsmessung H20/D20 im Bereich von 750 bis 1500 nm,
Fig. 9: Vergleich der Erwärmung H20/D20 bei Einstrahlung mit 970 nm,
Fig. 10: Vergleich der Erwärmung H20/D20 bei Einstrahlung mit 1064 nm
Die Figur 1 zeigt ein Ramanspektrum der Nukleinsaure d(GCGAATTCGC) 2, gemessen mit einem HeNe Laser mit 10 mW bei 632 nm. Insbesondere von Interesse sind die C=0 Streckschwingungen bei knapp 1700 cm"1. Die Nukleinsaure wurde in wäßriger D20 Lösung gemessen, die Menge an Nukleinsaure betrug 30mM.
In der Figur 2 erkennt man, daß die C=0 Streckschwingung der untersuchten Nukleinsaure d (GCGAATTCGC) 2 genau im Bereich von einem ausgeprägten Maximum der Biegeschwingung des leichten Wassers liegt. Demgegenüber absorbiert D20 sowie durch Isotopenaustausch entstehendes HDO bei erheblich niedrigeren Wellenzahlen und legt die C=0 Streckschwingung der Nukleinsaure gleichsam frei mit der Folge, daß eine Einstrahlung beispielsweise bei ca. 1690 cm"1 in einer wäßrigen Lösung mit leichtem Wasser zur Wassererwär- mung in beachtlichem Maße führt, während in einer Lösung mit schwerem Wasser die eingestrahlten Wellen nahezu ausschließlich zur Auftrennung der Nukleinsaure genutzt werden können. Gemessen wurde mit einem HeNe Laser, 10 mW, 632 nm.
In der Figur 3 erkennt man, daß die H-Streckschwingungen der untersuchten Nukleinsaure (jene der Figuren 1 und 2) im ansteigenden Ast der H20 Streckschwingungen liegen. Auch hier erreicht man durch den Einsatz von D20 eine Verbesse- rung, da D20 demgegenüber praktisch nicht bei den H-
Streckschwingungen der Nukleinsaure absorbiert. Die Messbedingungen der Figuren 1 bis 3 sind gleich.
In der Figur 4 erkennt man eine Reaktionskammer 1 mit für IR reflektiven Kammerwandungen 2 sowie einem optischen Fenster 3. Das optische Fenster 3 weist für Wellenzahlen im Bereich 1300 bis 2100 cm"1 eine hohe Transmission auf. Weiterhin erkennt man eine Strahlungsquelle 4, welche im Ausführungsbeispiel ein Quantenkaskaden-Diodenlaser ist. Dieser emittiert bei einer Wellenzahl von 1668 cm"1.
In den Figuren 5 bis 7 sind Vorrichtungen entsprechenden Aufbaus dargestellt, welche sich einerseits darin
unterscheiden, daß als Strahlungsquelle ein IR-Breitband- strahler 4, nämlich des Typs General Electric CXR Tungsten Lampe, eingesetzt ist. Zur Ausblendung von Wellenzahlen im Bereich der D20 Absorptionsmaxima sind verschiedene zusätzlich Maßnahmen eingerichtet. Im Falle der Figur 5 ist ein optischer Filter 5 mit einem geeigneten Absorptionsbereich vorgesehen. In den Figuren 6 und 7 erfolgt eine Aufspaltung der Strahlung mittels eines Prismas 6 (Fig. 6) oder eines optischen Gitters 7 (Fig. 7) mit anschließender Selektion gewünschter Wellenzahlen mittels einer Blende 8.
Eine Vorrichtung durch Durchführung des erfindungsgemäßen PCR-Verfahrens ist ansonsten im Prinzip wie im Stand der Technik aufgebaut. Der wesentliche Unterschied besteht darin, daß zusätzlich oder anstelle der konventionellen Einrichtungen zur Erwärmung auf 95 °C eine Einrichtung zur Einstrahlung elektromagnetischer Wellen in die Reaktionskammer eingerichtet ist und die Reaktionskammer ein op- tisches Fenster aufweist. Bezüglich Details hierzu darf auf die Figuren 4 bis 7 verwiesen werden, die weiteren Komponenten entsprechen dem üblichen Aufbau und brauchen daher nicht näher erläutert werden.
In der Figur 8 ist ersichtlich, daß die Transmissionen von H20 und D20 unterhalb von 900 nm im gemessenen Bereich nahezu gleich sind. Unmittelbar oberhalb 900 nm nimmt die Transmission von H20 drastisch ab und ist oberhalb 1140 praktisch null, während jene von D20 hoch bleibt und erst oberhalb 1200 nm deutlich abnimmt. Zwischen 1000 und 1100 nm liegt ein schwaches Transmissionfenster für H20. Im gesamten gemessenen Bereich oberhalb von 900 nm ist die Transmission von D20 höher als von H20.
In der Figur 9 sind Erwärmungskurven bei Einstrahlung mit 970 nm für H20 und D20 in Abhängigkeit von der Einstrahldauer dargestellt. Man erkennt, daß H20 sich beacht- lieh aufheizt, während D20 kaum eine Temperaturerhöhung unter gleichen Meßbedingungen erfährt. Ein Vergleich mit der Figur 8 zeigt, daß dieses Verhalten mit der beachtlich unterschiedlichen Transmission bei 970 nm zwischen H20 und D20 begründet ist. Zur Verifizierung des unterschiedlichen Erwärmungsverhaltens wurde eine weitere Messung bei 1064 nm, i.e. im schwachen Transmissionsfenster für H20 (Siehe Figur 8) durchgeführt und erwartungsgemäß wurde ein geringerer Unterschied in dem Erwärmungsverhalten zwischen H20 und D20 gefunden.
Anhand der Figur 8 in vergleichender Betrachtung mit den Figuren 9 und 10 ist auch erkennbar, daß nicht nur durch Abstimmung der Mengenanteile H20 und D20 in einer Mischung eine definierte (geringere) Erwärmung gesteuert werden kann, sondern auch durch (zusätzliche) Abstimmung der eingestrahlten Wellenlängen. Somit kann in einer Apparatur mit definierten Reaktorvolumina, definierter Menge an Reaktionslösung, definierten Wärmetransporteigenschaften der Wandungen und definierten Temperaturen der eingebrach- ten Lösungen, allein durch Wahl des vorstehenden Mengenverhältnisses und/oder der Wellenlänge in Verbindung mit der definierten Einstellung der Strahlungsleistung ein gewünschter Temperaturverlauf innerhalb eines Zyklus eingestellt werden.
Im der Tabelle 1 sind für das Aufschmelzen von Nukleinsäuren geeignete Wellenlängen bzw. Wellenzahlen durch Markierungen kenntlich gemacht.
Tabelle 1
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