DE112014002045B4

DE112014002045B4 - Nucleinsäure-Analysator und Nucleinsäure-Analysenverfahren unter Verwendung des Analysators

Info

Publication number: DE112014002045B4
Application number: DE112014002045.1T
Authority: DE
Inventors: Fujioka Michiru; Motohiro Yamazaki; Toru Yokoyama
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2034-05-10
Also published as: CN105143469A; WO2014188887A1; JP6158318B2; US20160109368A1; JPWO2014188887A1; DE112014002045T5; US10041884B2; CN105143469B

Abstract

Es wird ein Nucleinsäure-Analysator bereitgestellt, bei dem keine manuellen Bearbeitungsschritte durch eine sehr erfahrene Bedienungsperson, wie einen Wissenschaftler, erforderlich sind und der leicht zu verwenden ist, geringe Abmessungen aufweist, mehrere Proben aufnehmen kann und eine rasche Analyse durchführt. Ferner wird ein Nucleinsäure-Analysenverfahren unter Verwendung des Analysators bereitgestellt. Der Analysator und das Verfahren führen den Nachweis in einer Mehrzahl von Belichtungszeiten durch, liefern ein Programm zur Bestimmung eines Schwellenwerts für den Signalnachweis und stellen fest, ob ein schwacher Signalpeak ein falscher Signalpeak ist.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäure-Analysatoren zum gleichzeitigen Erfassen einer Probe, die mit mehreren Farben markiert ist, sowie Nucleinsäure-Analysenverfahren unter Verwendung des Analysators. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Nucleinsäure-Analysator zum Nachweis von DNA, Proteinen oder dergleichen und ein Nucleinsäure-Analysenverfahren unter Verwendung des Analysators.
Hintergrund
Zu Analysatoren, die zur schnellen Identifizierung (nämlich Nucleinsäure-Sequenzanalyse, Basenlängeanalyse einer charakteristischen Genomsequenz oder dergleichen) von verschiedenen Spezies von Organismen, wie Mensch., Tiere, Pflanzen, Bakterien und Viren, verwendet werden, gehören beispielsweise Applied Biosystems 3500 Series Genetic Analyzers (Life Technologies Corp.) unter Anwendung eines Kapillar-Elektrophoreseverfahrens.
Um die Analysenverfahren zu erleichtern, beschäftigt man sich mit der Entwicklung von Vorrichtungen und Techniken zu vollständig integrierter Analyse von Zielnucleinsäuren (d. h. integriert von der Eingabe einer Probe bis zur Ausgabe eines Ergebnisses).
Eine analytische Technik zur Bestimmung einer Zielnucleinsäuresequenz ermöglicht dem Anwender die Durchführung einer Bestimmung in einem klinischen Test, eine forensische Beurteilung und dergleichen. Beispielsweise lässt sich ein großer Teil von Allgemeinerkrankungen bei Menschen auf der Grundlage einer DNA-Sequenz von Basenpaaren mit weniger als etwa 1000 Basen als Zielort bestimmen, ohne dass damit eine Analyse des vollständigen menschlichen Genoms verbunden ist. Gleichermaßen wird eine genaue Messung der Basenlänge von etwa zwanzig charakteristischen Genomsequenzen, die in kurzen, hintereinander auftretenden Wiederholungen (”Short Tandem Repeat”) ausgebildet sind (nachstehend als STR-Analyse bezeichnet) sehr gebräuchlich zum Identifizieren eines gegebenen Individuums.
Daher kann die Zielnucleinsäureanalyse vor Ort unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden, z. B. im Labor einer Universität oder eines Krankenhauses, am Patientenbett, als forensische Beurteilung oder als umweltbezogene Messung, je nach Ziel der Analyse. Jedoch beinhaltet die Durchführung der Analyse eine komplizierte manuelle Vorbereitung einer Probe und eine Datenanalyse durch den Wissenschaftler oder eine Person mit Erfahrung.
Daher wird in der Literatur als ein Beispiel für ein Verfahren zur Verringerung der erforderlichen Erfahrung und zur Erleichterung der Analyse eine effiziente Interpretation von Doppelpeaks aufgrund einer Heteroverbindung, die schwer zu interpretieren sind, bei einer Basensequenzanalyse unter Verwendung eines DNA-Sequenziergeräts beschrieben (vergleiche PTL 1). Dabei handelt es sich um ein Verfahren zur Durchführung einer Sequenzanalyse eines von Mutter- und Vaterseite abgeleiteten Polymorphismus mit einem Doppelnachweis-Chromatogramm bei einer Basensequenzanalyse in einer vorher vorbereiteten Umgebung.
Literaturverzeichnis
Patentliteratur

PTL 1: JP 2006084471 A

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Technisches Problem
Das in PTL 1 beschriebene Verfahren ist dann geeignet, wenn eine Sequenzanalyse an einem Polymorphismus in Heterobindung durchgeführt wird. Wenn jedoch keine Sequenzanalyse vorgenommen wird, sondern eine STR-Analyse, bei der eine mehrfache Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt und die Fluoreszenz in mehreren Farben (fünf bis sechs Farben) nachgewiesen wird, wird angenommen, dass ein echtes Signal in mehreren Farben zur gleichen Zeit ohne Bezug auf ein relatives Verhältnis von Peakhöhen nachgewiesen werden kann.
In PTL 1 wird jedoch die Beseitigung eines falschen Signals aufgrund eines ”Pull-up-Peaks” nicht berücksichtigt. Daher kann eine unzutreffende Analyse aufgrund des ”Pull-up-Peaks” durchgeführt werden und es bleibt das Problem, dass möglicherweise ein echter, zu analysierender Peak beseitigt wird. Dies führt zu der Einschränkung, dass für eine Analyse mit hoher Genauigkeit die Analyse von einer Person mit Erfahrung durchgeführt werden muss.
Außerdem gibt es, abgesehen vom vorerwähnten Beispiel, Fälle, bei denen die Datenanalyse von einer erfahrenen Person durchgeführt werden muss, wie in den nachstehenden Beispielen erläutert wird.
Beispielsweise wird in den meisten Fällen eine STR-Analyse mit Amplifikation (Multiplex-PCR), die auf mehrere Sequenzorte abzielt, durchgeführt. Bei einer derartigen Analyse wird im Allgemeinen eine Konzentration einer aus einer biologischen Probe extrahierten Genom-DNA bestimmt und eine Multiplex-PCR wird innerhalb des angegebenen Bereiches vorgenommen, wobei eine Elektrophorese durchgeführt wird. Die Anzahl an Wiederholungen wird sodann aufgrund der gewonnenen Signale analysiert, und beispielsweise wird ein Individuum identifiziert. Bei einer derartigen Analyse von Signalen treten Probleme auf, z. B. ein irreguläres Gleichgewicht von Peakhöhen von Allelen oder ein Signal, das unter der Nachweisschwelle liegt, wenn die Menge der Genom-DNA zu gering ist.
Auch wenn das Probengenom im Überschuss vorliegt, können fehlerhafte Ergebnisse auftreten, einschließlich vermehrte Unterbrechungen (”Stutters”), Erzeugung einer nichtspezifischen Bande, Hinzufügung von unvollständigen Nichtmatrizen und ein ”Pull-up-Peak”. Diese Erscheinungen können zu Fehlinterpretationen eines STR-Profils führen.
Ein weiteres Problem besteht darin, dass ein Einfluss eines ”Übersprechens” (”Crosstalk”) aufgrund eines parallelen Nachweises von Signalen bei der Analyse von mehreren Proben zu berücksichtigen ist.

(1) Somit besteht ein Bedürfnis nach einer Nucleinsäure-Sequenzanalyse und einem Basenlängen-Analysator für eine charakteristische Genomsequenz, wobei die Bedienung einfach sein soll und keine Bedienungsperson mit Erfahrung, z. B. einen Wissenschaftler, erfordern soll. Beispielsweise besteht ein Bedürfnis nach einem System, bei dem sämtliche manuellen Vorgänge wegfallen. Dadurch ist ein geringerer Trainingsaufwand erforderlich. Eine Person, die mit einer schwierigen Umgebung konfrontiert ist, z. B. bei der Leistung von erster Hilfe, wie eine Krankenschwester oder ein Polizist, soll das Analysensystem leicht bedienen können.

Neben den vorstehend beschriebenen verringerten Anforderungen an die Erfahrung besteht auch ein Bedürfnis nach den nachstehend aufgeführten Verbesserungen bei der Nucleinsäure-Sequenzanalyse oder der Basenlängenanalyse einer charakteristischen Genomsequenz.

(2) Es besteht ein Bedürfnis nach einem Analysensystem, das rasch ein Analysenergebnis liefert. Für die klinische Anwendung, z. B. bei der Sequenzierung einer krankheitsverursachenden Substanz zur Ermittlung einer geeigneten Behandlung im Krankenhaus oder dergleichen, um eine antibakterielle oder antivirale Pharmakotherapie innerhalb kurzer Zeit nach Ankunft eines Notfallpatienten durchzuführen, soll eine Analyse innerhalb von kurzer Zeit (z. B. innerhalb von 90 Minuten) durchgeführt werden können. Die erstrebenswerte Zeitspanne bis zum Erhalt eines Ergebnisses bei der Identifizierung einer Person bei einer Anfangsuntersuchung, durch die Polizei ist wesentlich kürzer (z. B. innerhalb von 90 Minuten) als die gemäß dem Stand der Technik erforderliche Zeitspanne von einigen Tagen bis mehreren Wochen. Ohne Begrenzung auf die vorstehenden Anwendungsmöglichkeiten sollen Daten erzeugt werden, die innerhalb von kurzer Zeit analysierbar sind. Ferner kann eine rasche Analyse in vorteilhafter Weise zu einem erhöhten Probendurchsatz innerhalb der gleichen Zeit führen.
(3) Eine Verkleinerung des Analysators ist erstrebenswert. Die meisten Nucleinsäure-Sequenzanalysensysteme erfordern ein ganzes Labor und entsprechende Unterstützungsmöglichkeiten. Nucleinsäure-Sequenzanalysensysteme mit hohem Durchsatz, wie MiSeq (Illumina, Inc.), Iontorrent PGM (Life Technologies Corp.) und FLX (Roche Diagnosis Corp.), die kürzlich auf dem Markt erschienen, erfordern für die Installation nur einen einfachen Tisch. Jedoch ist eine große Analyseneinheit für die Probenvorbereitung zur Durchführung der Analyse erforderlich. Beispielsweise erfordert die Sequenzanalyse oder STR-Analyse im Allgemeinen eine Einrichtung zur Probenvorbereitung, wie eine Extraktion der Genom-DNA aus einer biologischen Probe, die Anpassung der Konzentration, die Amplifikation eines Zielorts durch eine Nucleinsäure-Amplifikationsmethode oder die Anpassung an eine Analysenbibliothek. Daher ist eine Verkleinerung zur Anwendung sowohl im Labor als auch am Behandlungsort und beim Betrieb vor Ort von Bedeutung. Eine Verkleinerung stellt auch eine wichtige Aufgabe bei der Verringerung der Kosten pro Probe dar.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, einen Nucleinsäure-Analysator bereitzustellen, der einfach anzuwenden ist, geringe Abmessungen aufweist, zur Aufnahme von mehreren Proben befähigt ist und eine rasche Analyse durchführen kann. Ferner soll ein Nucleinsäure-Analysenverfahren unter Verwendung des Analysators bereitgestellt werden.
Lösung der Aufgabe
Zur Überwindung der vorerwähnten Probleme weist ein erfindungsgemäßes Nucleinsäure-Analysenverfahren die folgenden Hauptmerkmale auf.

(1) Nucleinsäure-Analysenverfahren, umfassend: eine Stufe der Bestrahlung einer Analysenprobe, die eine Mehrzahl von DNA-Fragmenten enthält, mit Licht; eine Stufe zum Erfassen der von der Analysenprobe hervorgerufenen Fluoreszenz, die den DNA-Fragmenten entspricht, mit einem Abbildungselement innerhalb einer vorgegebenen Nachweiszeit; eine Stufe zum Festlegen einer Untergrenze der Fluoreszenzintensität, die für die Analyse der Analysenprobe erforderlich ist, innerhalb eines nachweisbaren Bereiches der Fluoreszenzintensität des Abbildungselements; eine Stufe zur Ermittlung der Fluoreszenzintensität für jedes der DNA-Fragmente, auf der Grundlage der Untergrenze; eine Stufe zum Erfassen eines Peaks der Fluoreszenzintensität, der für jedes der DNA-Fragmente gewonnen worden ist, und des Bestimmens der Zeitinformation, die dem Peak entspricht; und eine Stufe zur Anzeige der Entsprechung der Fluoreszenzintensität mit der Zeitinformation für jedes der DNA-Fragmente. Die Anzeige zeigt mindestens einen oder mehrere Peaks an, darunter einen ersten Peak mit einer ersten Fluoreszenzintensität und einen zweiten Peak mit einer Fluoreszenzintensität, die geringer als die erste Fluoreszenzintensität ist. Die Untergrenze wird an einen. vorgegebenen Wert und an eine Fluoreszenzintensität angepasst, wobei die Messung unter Verwendung der angepassten Untergrenze als Untergrenze des Abbildungselements durchgeführt wird und als Fluoreszenzintensität von mindestens einem oder mehreren Peaks, einschließlich des zweiten Peaks, zurückgesetzt wird, wodurch festgestellt wird, ob mindestens einer oder mehrere Peaks, einschließlich des zweiten Peaks, falsche Signalpeaks darstellen.

Ferner wird ein erfindungsgemäßer Nucleinsäure-Analysator mit den folgenden Hauptmerkmalen bereitgestellt.

(2) Der Nucleinsäure-Analysator umfasst eine Belichtungseinheit zum Bestrahlen einer Analysenprobe, die eine Mehrzahl von DNA-Fragmenten enthält, mit Licht; eine Nachweiseinheit zum Nachweisen der Fluoreszenzintensität, die von der Analysenprobe hervorgerufen wird, entsprechend den DNA-Fragmenten, mit einem Abbildungselement innerhalb einer vorgegebenen Nachweiszeit; einen Speicher zum Speichern einer Untergrenze der Fluoreszenzintensität, die für die Analyse der Analysenprobe innerhalb eines nachweisbaren Bereiches der Fluoreszenzintensität des Abbildungselements erforderlich ist; eine arithmetische Steuereinheit zur Steuerung der entsprechenden Einheiten und zur Durchführung der arithmetischen Verarbeitung; und eine Anzeigeeinheit zum Anzeigen eines Ergebnisses der arithmetischen Steuereinheit. Die Nachweiseinheit empfängt die Fluoreszenzintensität der einzelnen DNA-Fragmente auf der Grundlage der Untergrenze. Die arithmetische Steuereinheit erfasst einen Peak der Fluoreszenzintensität, die von den einzelnen DNA-Fragmenten erhalten worden ist, und bestimmt die Zeitinformation entsprechend dem Peak. Die Anzeigeeinheit zeigt die Entsprechung der Fluoreszenzintensität mit der Zeitinformation für jedes der DNA-Fragmente an. Die Anzeigeeinheit zeigt mindestens einen oder mehrere Peaks an, einschließlich eines ersten Peaks mit einer ersten Fluoreszenzintensität und eines zweiten Peaks mit einer Fluoreszenzintensität, die schwacher als die erste Fluoreszenzintensität ist. Die arithmetische Steuereinheit passt die Untergrenze an einen vorgegebenen Wert an, setzt die Fluoreszenzintensität zurück, wobei die Messung unter Verwendung der angepassten Untergrenze als Untergrenze des Abbildungselements, als Fluoreszenzintensität mindestens eines oder mehrerer Peaks, einschließlich des zweiten Peaks, vorgenommen wird und bestimmt daher, ob mindestens einer oder mehrere Peaks, einschließlich des zweiten Peaks, falsche Signalpeaks sind.

Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Nucleinsäure-Analysator bereit, der leicht anzuwenden ist, geringe Abmessungen aufweist, mehrere Proben aufnehmen kann und eine rasche Analyse durchführt. Ferner wird ein Nucleinsäure-Analysenverfahren unter Verwendung des Analysators bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung einer Kapillar-Elektrophoresevorrichtung gemäß der vorliegenden Ausführungsform.
2 ist eine schematische Darstellung eines Bestrahlungssystems gemäß der vorliegenden Ausführungsform.
3 ist ein Fließdiagramm zur Erläuterung eines elektrophoretischen Analysenverfahrens.
4 ist eine Darstellung zur Erläuterung eines Beispiels von Emissionsspektren von fluoreszierenden Farbstoffen.
5 ist ein Fließdiagramm zur Erläuterung eines STR-Analysenverfahrens.
6 ist ein Fließdiagramm zur Erläuterung eines STR-Analysenverfahrens gemäß der vorliegenden Ausführungsform.
7 ist eine Darstellung eines Eingabebildschirms eines Steuercomputers gemäß der vorliegenden Ausführungsform.
8 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung eines Reaktionsbehälters gemäß der vorliegenden Ausführungsform.
9A ist eine Darstellung einer beispielhaften Signalwellenform zur Darlegung der Wirkungen der vorliegenden Ausführungsform.
9B ist eine Darstellung einer beispielhaften Signalwellenform zur Darlegung der Wirkungen der vorliegenden Ausführungsform.
9C ist eine Darstellung einer beispielhaften Signalwellenform zur Darlegung der Wirkungen der vorliegenden Ausführungsform.
9D ist eine Darstellung einer beispielhaften Signalwellenform zur Darlegung der Wirkungen der vorliegenden Ausführungsform.
10 ist eine Darstellung eines beispielhaften Ausgabe-Bildschirms eines Berichts gemäß der vorliegenden Ausführungsform.
Beschreibung der Ausführungsformen
Nachstehend werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
Kapillar-Elektrophoresevorrichtung
1 ist eine schematische Darstellung einer Kapillarelektrophoresevorrichtung gemäß der vorliegenden Ausführungsform. Die Struktur der Vorrichtung wird nachstehend unter Bezugnahme auf 1 beschrieben.
Ein Hauptkörper 101 der Vorrichtung ist über ein Kommunikationskabel mit einem Steuercomputer 125 verbunden. Eine Bedienungsperson steuert die entsprechenden Funktionen der Vorrichtung mit dem Steuercomputer 125 und erhält Daten, die von einem optischen Detektor 112 erfasst werden. Der Steuercomputer umfasst einen Datenanzeigebildschirm (nicht dargestellt) zur Anzeige der empfangenen Daten.
Die Kapillarelektrophoresevorrichtung der vorliegenden Ausführungsform umfasst Folgendes: Eine Kapillarenanordnung 114, die eine oder mehrere Kapillaren 102 umfasst, die ein Trennmedium zum Trennen einer vorher angepassten Analysenprobe enthalten, eine Transportanlage 122 zum Transportieren verschiedener Analysenbehälter zu einem Kapillarkathodenende 126, einen Pumpmechanismus 103 zum Injizieren des Trennmediums in die Kapillaren, eine Thermostatenkammer 115 zum Einstellen der Temperatur der Kapillarenanordnung, ein Hochspannungsnetzteil 104 zum Anlegen einer hohen Spannung an das Trennmedium, eine Lichtquelle 111 zum Bestrahlen der Kapillaren mit einem kohärenten Laserstrahl und einen optischen Detektor 112 zum optischen Erfassen der von der Probe emittierten Fluoreszenz.
Bei der Kapillarenanordnung 114 handelt sich um ein ersetzbares Bauteil mit einer oder mehreren (z. B. 2 bis 96) Kapillaren 102. Sie umfasst einen Beladungskopf 124, eine Nachweiseinheit 113 und einen Kapillarenkopf. Ein Ende der Kapillarenanordnung 114 umfasst einen Beladungskopf 124 zum Zuführen der Analysenprobe in die Kapillaren und bildet ein Kathodenende, wo eine negative Spannung angelegt wird. Am anderen Ende ist die Mehrzahl von Kapillaren durch den Kapillarenkopf miteinander verbunden und an einen Gelblock 106 in einer druckbeständigen, luftdichten Struktur angeschlossen. Die Nachweiseinheit 113, in der die Bestrahlung mit dem Laserstrahl erfolgt, ist zwischen dem Beladungskopf 124 und dem Kapillarenkopf angeordnet.
Die Kapillarenanordnung 114 kann durch eine andere Anordnung ersetzt werden, die je nach der Messung eine abweichende Anzahl an Kapillaren oder eine abweichende Länge der Kapillaren aufweist. Ferner wird dann, wenn die Qualität der Kapillaren beschädigt oder beeinträchtigt worden ist, die Kapillarenanordnung durch eine neue ersetzt.
Bei der Kapillare 102 handelt es sich um eine Glasröhre mit einem Innendurchmesser von einigen zehn bis einhundert Mikrometern und einem Außendurchmesser von einigen einhundert Mikrometern. Die Kapillarenoberfläche ist mit einer Polyimidschicht überzogen, um die Festigkeit zu verbessern. An einem Teil, der mit dem Laserstrahl bestrahlt wird, und in der Nähe davon ist jedoch der Polyimidüberzug auf der Kapillarenoberfläche entfernt. Der innere Teil der Kapillare ist mit dem Trennmedium zum Trennen von DNA-Molekülen in der Analysenprobe gefüllt. Das Trennmedium umfasst beispielsweise ein Trenngel auf der Basis von Polyacrylamid (nachstehend als Polymer bezeichnet), das von verschiedenen Firmen für Elektrophoresezwecke angeboten wird. Es ist darauf hinzuweisen, dass in der vorliegenden Ausführungsform als Beispiel für das Halteelement des Trennmediums eine Kapillare aus einer Glasröhre und dergleichen vorliegt, was aber keine Beschränkung hierauf bedeutet. Es können auch ein Glassubstrat oder ein Harzsubstrat für die Mikrofluidik verwendet werden.
Der Pumpmechanismus 103 umfasst eine Spritze 105 und ein mechanisches System zur Ausübung von Druck auf die Spritze. Der Gelblock 106 ist ein Verbindungsteil, das die einzelnen Spritzen 105, die Kapillarenanordnung 114, einen Anodenpufferbehälter 108 und einen Polymerbehälter 107 verbindet. Wenn die Kapillare mit dem Polymer, das das Trennmedium darstellt, gefüllt wird, das elektrische Ventil 110 geschlossen wird und die Spritze 105 betätigt wird, kann das Polymer im Inneren der Spritze 105 in die Kapillare injiziert werden.
Eine Thermostatenkammer 115 stellt einen Temperatursteuermechanismus zur Steuerung der Temperatur der Kapillarenanordnung 114 dar. Die Thermostatenkammer 115 ist mit einem Wärmeisolator abgedeckt, um die Temperatur im Inneren der Kammer konstant zu halten. Die Temperatur wird durch einen Heiz- und Kühlmechanismus 117 gesteuert. Dies ermöglicht es, die Temperatur des Großteils der Kapillarenanordnung konstant zu halten, z. B. auf 60°C.
Die Transportanlage 122 umfasst drei Elektromotoren und lineare Aktoren und kann sich somit in Richtung der drei Achsen nach oben und nach unten, nach links und nach rechts sowie nach vorne und nach hinten bewegen. Ferner können an einem beweglichen Tisch 123 der Transportanlage 122 mindestens ein oder mehr Behälter angebracht werden. Die Transportanlage 122 transportiert jeweils einen Pufferbehälter 118, einen Waschbehälter 119, einen Behälter 120 für Abfallflüssigkeit und einen Probenbehälter 121 auf dem beweglichen Tisch 123 zum Kathodenende 126 der Kapillaren.
Eine optische Nachweiseinheit umfasst ein Bestrahlungssystem mit einer Lichtquelle 111 zum Bestrahlen der Nachweiseinheit 113 mit Anregungslicht und den optischen Detektor 112 zum Erfassen der Emission aus der Nachweiseinheit 113. Daten 128, die vom optischen Detektor 112 erfasst werden, werden über ein Steuersubstrat 127 zum Steuercomputer 125 übertragen. In der optischen Nachweiseinheit können ein Beugungsgitter oder ein Prisma für die Spektroskopie verwendet werden und ein Abbildungselement, wie CCD oder CMOS, kann daher für den optischen Nachweis herangezogen werden. Alternativ kann der optische Nachweis durch eine Kombination einer Mehrzahl von dichroitischen Spiegeln und einem Photomultiplier durchgeführt werden.
Bestrahlungssystem
2 ist eine schematische Darstellung eines Bestrahlungssystems gemäß der vorliegenden Ausführungsform. 2(a) ist eine Seitenansicht und 2(b) ist eine Vorderansicht. Das Bestrahlungssystem umfasst die Lichtquelle 111 zum Oszillieren eines Laserstrahls 201, einen Strahlteiler 203 zum Teilen des Laserstrahls, einen Reflektionsspiegel 202 zur Veränderung der Bewegungsrichtung des Laserstrahls, eine Sammellinse 204 zum Sammeln des Laserstrahls an der Nachweiseinheit 113 der Kapillarenanordnung. Es ist darauf hinzuweisen, dass in der Darstellung zur Vereinfachung optische Elemente, wie Filter, Polarisatoren und Wellenlängenplättchen weggelassen sind. Der oszillierende Laserstrahl 201 aus der Lichtquelle 111 verändert seine Bewegungsrichtung, wenn er durch den Reflektionsspiegel 202 reflektiert wird, und wird durch den Strahlteiler 203 in zwei Strahlen geteilt. Die Kapillaren in der Nachweiseinheit 113 werden von oben und von unten mit den beiden Strahlen über den Reflektionsspiegel 202 und die Sammellinse 204 bestrahlt. Eine Beobachtung der von der Nachweiseinheit emittierten Fluoreszenz durch den optischen Detektor 112 ermöglicht das Erfassen eines Signals der vorbehandelten Probe.
Die Lichtquelle 111 emittiert Anregungslicht zum Anregen einer Probenkomponente. Bei der Lichtquelle 111 kann es sich je nach Zweckmäßigkeit um einen Flüssigkeitslaser, einen Gaslaser oder einen Halbleiterlaser handeln. Alternativ kann eine LED verwendet werden. Bei der Lichtquelle 111 handelt es sich beispielsweise um einen Halbleiterlaser mit einer Wellenlänge von 515,5 nm und einer Ausgangsleistung von 50 mW. Die Anregungswellenlänge hängt von der Vorbehandlungsfluoreszenz ab. Wellenlängen von 505 nm, 488 nm, 532 nm oder 633 nm können ebenfalls je nach Zweckmäßigkeit herangezogen werden.
Ferner kann die Bestrahlung der Kapillarenanordnung 114 je nach Zweckmäßigkeit variabel sein, indem man nur eine Seite der Kapillarenanordnung mit dem Anregungslicht bestrahlt, die Belichtungszeit der Lichtquelle variiert oder einen Verschluss an der optischen Achse vorsieht. Die Bestrahlung der Kapillaren mit dem Anregungslicht kann durchgeführt werden, indem man beispielsweise eine Bestrahlung von 50 msec und eine Datenübertragung (keine Bestrahlung während der Datenübertragung) als einen Satz von Bestrahlungsbedingungen wiederholt oder eine Bestrahlung von 50 msec, eine Datenübertragung, eine Bestrahlung von 100 msec und eine Datenübertragung als einen Zyklus der Bestrahlungsbedingungen wiederholt. Dies führt zu kleineren Fluoreszenzsignal-Datenwerten, die unter den vorgenannten Bedingungen mit einer Bestrahlungszeit erhalten werden; jedoch können auch Fluoreszenzsignaldaten mit einer Bestrahlungszeit von 100 msec erhalten werden, wodurch man den Nachweisbereich von Fluoreszenzsignalen erweitert. Diese Erweiterung des Nachweisbereiches ergibt eine starke Wirkung. Bei der Analyse durch einen Wissenschaftler oder dergleichen war es erforderlich, die Menge der Genom-DNA vorher innerhalb eines Nachweisbereiches einer Elektrophoresevorrichtung anzupassen.
Wenn es nicht erforderlich ist, die Menge der Genom-DNA vorher als Ergebnis des erweiterten Nachweisbereiches anzupassen, wie vorstehend beschrieben, ist nicht mehr die Ausführung durch einen Wissenschaftler erforderlich. Der Analysator muss auch nicht mehr eine Funktion zur Einstellung der Konzentration aufweisen, was die Bereitstellung einer rasch arbeitenden, klein bemessenen und zweckmäßigen Vorrichtung erlaubt.
Betrieb der Elektrophoresevorrichtung
Zunächst wird der grundlegende Betrieb der Elektrophoresevorrichtung beschrieben. Wie in 3 dargestellt, umfasst der Betrieb die Vorbereitung, das Einfüllen des Elektrophoresemediums 303, einen vorgeschalteten Lauf 306, die Probeninjektion 309 und die Elektrophorese 312 in der angegebenen Reihenfolge.
Nachstehend wird die vorerwähnte Vorbereitung beschrieben. Die für die Vorrichtung zuständige Bedienungsperson installiert in der Vorrichtung den Pufferbehälter 118, der den Elektrophoresepuffer enthält, den Waschbehälter 119 zum Waschen der Kapillaren, den Abfallflüssigkeitsbehälter 120 zur Aufnahme des aus den Kapillaren ausgetragenen Polymers, den Polymerbehälter 107, der das Polymer, d. h. das Trennmedium, enthält, und den Probenbehälter 121, der eine zu messende Probe enthält.
Es ist darauf hinzuweisen, dass ein Reaktionsbehälter gemäß Darstellung in 8, wonach der Pufferbehälter 118, der Waschbehälter 119, der Abfallflüssigkeitsbehälter 120 und der Probenbehälter 121 zu einem einzigen integrierten Behälter vereinigt sind, verwendet und zur Vereinfachung des Betriebs für die Bedienungsperson installiert werden kann.
Der in 8 dargestellte Reaktionsbehälter kann bei der Amplifikation von Genom-DNA verwendet werden. Es kann ein Aufbau herangezogen werden, bei dem Flüssigkeiten, wie Reagenzien, den entsprechenden Teilen durch das Prinzip eines Diaphragmas zugeführt werden, während ein elastischer Körper, z. B. aus Kautschuk, im Bodenteil des Behälters verwendet wird. Genom-DNA wird in einem Probenzugabegefäß 800 platziert und in ein Amplifikationsreagenzgefäß 801 übertragen, der das Nucleinsäure-Amplifikationsreagenz enthält, das für die isotherme Amplifikationsreaktion, wie eine PCR-Reaktion, das LAMP-Verfahren oder das NASBA-Verfahren, verwendet wird, bei denen es sich um Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren unter Verwendung von DNA-Polymerase oder dergleichen handelt. Das Amplifikationsverfahren ist nicht auf die vorgenannten Verfahren beschränkt. Nach gründlichem Mischen der übertragenen Probe wird die gemischte Flüssigkeit anschließend in ein Reaktionsgefäß 802 übertragen, das eine Temperatureinstellfunktion aufweist, und eine Zielnucleinsäuresequenz wird amplifiziert. Das Amplifikationsprodukt wird in den Probenbehälterteil 121 übertragen.
Ferner werden vor der Messung sämtliche Verbindungsgänge, einschließlich der Kapillaren, die für die Elektrophorese herangezogen werden, mit dem Polymer unter Verwendung des Pumpmechanismus 103 gefüllt. Es ist darauf hinzuweisen, dass im Fall einer kontinuierlichen Verwendung der Vorrichtung diese Stufe nicht erforderlich ist, da die Verbindungsgänge bereits mit dem Polymer gefüllt sind.
Verfahren zur elektrophoretischen Analyse Nachstehend wird das Elektrophoreseverfahren (Stufen (1) bis (14)) unter Bezugnahme auf die 1, 3, 4 und 8 beschrieben.

(1) Stufe 300: Zunächst erfolgt vor der Analyse einer Probe eine Kalibrierung der Wellenlänge. Bei der Kalibrierung der Wellenlänge erfolgt die Erfassung eines Fluoreszenzsignals durch den optischen Detektor 112. Wenn beispielsweise ein CCD als optischer Detektor 112 verwendet wird, wird ein jeder Fluoreszenzwellenlänge entsprechendes Bauteil für den Nachweis bereitgestellt. Der optische Detektor 112 wird so eingestellt, dass jeder der mehreren Fluoreszenzfarbstoffe, die durch das Beugungsgitter oder dergleichen gebeugt werden, mit der höchsten Empfindlichkeit erfasst wird.

Als Beispiele für derartige Fluoreszenzfarbstoffe lassen sich die Fluoreszenzfarbstoffe des AmpFLSTR-Kits (Life Technologies Corp.) erwähnen, das die Fluoreszenzfarbstoffe mit den Bezeichnungen 6FAM, VIC, NED, PET und LIZ enthält. Ein Emissionsspektrum der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe ist in 4 dargestellt. Das Emissionsspektrum der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe weist eine breite Struktur auf, wie in 4 dargestellt ist.
Beispielsweise empfängt ein CCD-Element zum Nachweis einer mit NED markierten Probe Signale unter Einschluss von Fluoreszenzsignalen mit einer Wellenlänge, die von der NED-Wellenlänge abweicht, obgleich eine Intensitätsdifferenz besteht. Ferner wird die von NED emittierte Fluoreszenz auch in einem weiteren Element, das sich vom Zielelement unterscheidet, erfasst, um eine weitere Wellenlänge zu erfassen. Da jedoch das Verhältnis der Signalintensität für jede Fluoreszenz theoretisch konstant bleibt, sollte eine umgekehrte Transformation auf der Grundlage dieses Werts eine Peakwellenform ergeben, die nur der Zielfluoreszenz-Wellenlänge zugeordnet werden kann. Dies gilt für Fluoreszenzfarbstoffe mit anderen Wellenlängen und somit wird angenommen, dass eine erfasste Wellenform eine einfache Summe von Spektren darstellt, wo sich ein Fluoreszenzspektrum mit einem weiteren Fluoreszenzspektrum überlappt.
Wenn daher die Verhältnisse der Signalintensität für die Mehrzahl von fluoreszierenden Farbstoffen zur Verfügung stehen, führt deren Angabe in einer Matrix und die Multiplikation einer ursprünglich erfassten Wellenform mit einer umgekehrten Matrix davon zu Peakwellenformen der entsprechenden fluoreszierenden Farbstoffe. Dieses Verhältnis der Signalintensität lässt sich vorher durch Elektrophorese erhalten, indem man eine Eichprobe oder dergleichen verwendet (vergleiche z. B. JP 2002525576 A , JP 2011030502 A oder JP 2002078500 A ). Es ist darauf hinzuweisen, dass dieser Vorgang (Berechnung von Matrixkoeffizienten) im Allgemeinen jedes Mal durchgeführt wird, wenn die Kapillaren aufgrund einer Beeinträchtigung oder einer Längenänderung ersetzt werden.

(2) Stufe 301: Die Vorrichtung startet die Analyse nach einem Befehl durch die Bedienungsperson am Steuercomputer 125.
(3) Stufe 302: Zunächst wird der Abfallflüssigkeitsbehälter 120 durch die Transportanlage 122 zum Kapillarkathodenende 126 transportiert.
(4) Stufe 303: Der Pumpmechanismus 103 injiziert dann das Polymer in die Multikapillarenanordnung 114 (Befüllen mit Elektrophoresemedium).
(5) Stufe 304: Nach Beendigung der Injektion einer vorgegebenen Polymermenge wird der Waschbehälter 119 von der Transportanlage 122 zum Kapillarkathodenende 126 transportiert, wobei das Kapillarkathodenende gewaschen und gleichzeitig mit der Lösung getränkt wird.
(6) Stufe 305: Nach dem Waschen der Kapillaren wird der Pufferbehälter 118 von der Transportanlage 122 zum Kapillarkathodenende 126 transportiert.
(7) Stufe 306: Anschließend wird ein vorgeschalteter Lauf durchgeführt. Der vorgeschaltete Lauf wird vor den Hauptanalysestufen durchgeführt, wodurch das Polymer in den Kapillaren in einen für die Analyse geeigneten Zustand gebracht wird. Normalerweise wird eine Spannung von einigen bis mehreren zehn Kilovolt für einige bis mehrere zehn Minuten angelegt.
(8) Stufe 307: Nach Beendigung des vorgeschalteten Laufs wird das Kapillarkathodenende 126 erneut im Waschbehälter 119 gewaschen.
(9) Stufe 308: Der Probenbehälter 121 wird zum Kapillarkathodenende transportiert.
(10) Stufe 309: Anschließend wird durch Anlegen einer Spannung von einigen Kilovolt an die Kapillarkathode ein elektrisches Feld zwischen der Probenlösung und einer Anodenelektrode 109 erzeugt und die Probe in der Probenlösung wird der Kapillare zugeführt.
(11) Stufe 310: Nach Zufuhr der Probe wird das Kapillarkathodenende 126 erneut im Waschbehälter 119 gewaschen.
(12) Stufe 311: Der Pufferbehälter 118 wird zum Kapillarkathodenende 126 transportiert.
(13) Stufe 312: Anschließend wird eine vorgegebene Spannung angelegt und die Elektrophorese wird eingeleitet.

Dabei bewirkt die Elektrophorese, dass eine Probe in einer Kapillare durch Einwirkung eines zwischen dem Kathoden- und Anodenpuffer erzeugten elektrischen Felds bewegt wird und sich die Probe unter Ausnutzung eines Beweglichkeitsunterschieds, der von den Eigenschaften der Probe abhängt, auftrennt. Wenn es sich bei der Probe um DNA handelt, hängt die Beweglichkeit von der Basenlänge ab. DNA mit einer kürzeren Basenlänge und somit mit einer höheren Beweglichkeit durchläuft die Nachweiseinheit früher. Da an der DNA vorher ein fluoreszierendes Material angebracht worden ist, wird DNA von kürzerer Basenlänge früher in der Nachweiseinheit optisch erfasst. Normalerweise werden die Messzeit und die Zeit für das Anlegen der Spannung entsprechend einer Probe mit der längsten Wanderungszeit eingestellt.

(14) Stufe 313: Wenn eine vorgegebene Zeitspanne ab Beginn des Anlegens der Spannung verstrichen ist, werden Daten erhoben und anschließend wird das Anlegen der Spannung beendet, um die Analyse zu beenden. Die vorstehende Vorgehensweise stellt das grundlegende Verfahren für die Elektrophorese dar.

Allgemeines STR-Analysenverfahren
Nachstehend wird ein Analysenverfahren für eine allgemeine STR-Analyse unter Bezugnahme auf 5 beschrieben.

(1) Stufe 500: Signaldaten werden durch Elektrophorese gewonnen.
(2) Stufe 501: Informationen über die Kapillarposition innerhalb eines Detektors 112, die vorher gewonnen worden sind, werden hinzugefügt.
(3) Stufe 502: Ferner werden Informationen 300 über die Wellenlängeneichung hinzugefügt.

Die nachstehenden Stufen 503 bis 505 entsprechen einem STR-Analysenverfahren.

(4) Stufe 503: Es werden nur Zielsignale extrahiert. Informationen, wie Nachweiszeit, Höhe und Breite der einzelnen Peaks werden aus den Signalen berechnet (Peakerfassung).
(5) Stufe 504: Eine Größenbestimmung einer Analysenprobe auf der Grundlage der in Stufe 503 gewonnenen Informationen und der Peakerfassungsinformationen wird durchgeführt, wobei ein DNA-Fragment von bekannter Größe gleichzeitig mit der Probe ebenfalls der Elektrophorese unterworfen wird (Größenbestimmung).
(6) Stufe 505: Mit diesen Informationen über die Größe wird eine Verbindung mit vorherigen Informationen über eine Allele des Analysenziels hergestellt (Allelenbenennung).
(7) Stufe 506: Die Basenlänge oder die Anzahl an Wiederholungen einer Sequenz werden berechnet und Profildaten werden erhalten.
(8) Stufe 507: Ein Spezialist bestätigt diese Profildaten und interpretiert die Daten auf der Grundlage seiner Kenntnisse und seiner Erfahrung.

STR-Analysenverfahren gemäß der vorliegenden Anmeldung
Nachstehend wird ein STR-Analysenverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung unter Bezugnahme auf 6 beschrieben. Es ist darauf hinzuweisen, dass das allgemeine STR-Analysenverfahren im Rahmen von 5 beschrieben worden ist, während unter Bezugnahme auf 6 ein Analysenverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben wird. Insbesondere umfasst ein Verfahren, das sich von dem von 5 unterscheidet, die Stufen 600 bis 602 und 608 bis 609 von 6. Das vorstehende Verfahren ermöglicht eine Analyse, die leicht anzuwenden ist und keine erfahrene Bedienungsperson, z. B. einen Wissenschaftler, benötigt.
Obgleich nachstehend ein STR-Analysenverfahren beschrieben wird, ist das vorliegende Analysenverfahren nicht darauf beschränkt, sondern ist auch auf die DNA-Basensequenzanalyse anwendbar.

(1) Stufe 600: Zunächst wird eine Signalanalysenbedingung festgelegt. Ein Hersteller oder Administrator der Vorrichtung legt die Bedingung vorher fest, so dass eine Interpretation von Profildaten rasch routinemäßig vorgenommen werden kann, wobei keine damit berufsmäßig befassten Personen benötigt werden.

Dabei ist auf die Interpretation eines falschen Peaks hinzuweisen. Die meisten falschen Peaks lassen sich einem Rauschpeak, der durch die Hardware erzeugt wird, zuordnen, z. B. ein Dunkelstrom in der Optik der Vorrichtung, ein Peak, der von einer in einer vorhergehenden Analyse verwendeten Probe mitgeschleppt worden ist, ein Übersprech-Peak (Crosstalk-Peak) aufgrund eines geringen Verlusts, wenn eine Mehrzahl von Kapillaren in der Nachweiseinheit enthalten ist, ein Überstrahlungspeak (Pull-up-Peak), der in geringem Umfang auftritt, selbst wenn eine Matrixtransformation durch Berechnung von Matrixkoeffizienten vorher vorgenommen worden ist, oder ein Peak, der einer Stutter-Erscheinung zuzuschreiben ist, d. h. einem ungewünschten amplifizierten Objekt bei einem Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren. Ein die Daten interpretierender Spezialist führt eine Analyse durch Bestimmen eines festgelegten Schwellenwerts auf der Grundlage vorheriger Erfahrungen durch oder bestimmt einen falschen Peak aus einem erhaltenen Profilmuster.
Dagegen werden bei der vorliegenden Ausführungsform, bei der eine Analyse durch einen Experten nicht erforderlich ist, die Bedingungen für eine automatische Interpretation von falschen Peaks zunächst auf einem Bildschirm zur Festlegung der Bedingungen für die Signalanalyse gemäß Darstellung in 7 festgelegt. Ein Hersteller der Vorrichtung oder ein Benutzer der Analysenvorrichtung kann verschiedene Einstellungen vornehmen.
Ein Bildschirm gemäß der Darstellung in 7 wird zum Festlegen von Schwellenwerten für die empfangenen Signale (oberer Schwellenwert und unterer Schwellenwert) verwendet. Für den oberen Schwellenwert kann eine obere Nachweisgrenze des Detektors eingestellt werden. Alternativ kann ein Wert eingestellt werden, bei dem eine lineare Beziehung von einem schwachen Signal zu einem starken Signal erhalten werden kann, um die quantitative Aussagekraft der erhaltenen Signale aufrechtzuerhalten. Zu den Einstellungswerten für den unteren Schwellenwert gehören das Hardware-Rauschen, das Übertragen (Carryover) und das Übersprechen (Crosstalk). Es ist erstrebenswert, dass diese Punkte vom Hersteller, der mit dem Verhalten der Vorrichtung gut vertraut ist, definiert werden. Eine Person, die die Vorrichtung bedient, kann diese Werte verändern, und zwar auf der Grundlage von Werten, die vom Hersteller empfohlen worden sind und in Entsprechung zu den Analysenbedingungen, den Anwendungsbedingungen oder den Umwelteinflüssen.
Anschließend wird die Einstellung für einen Überstrahlungspeak (Pull-up-Peak) durchgeführt. Ein Einstellverfahren kann zwei Optionen gemäß den nachstehenden Ausführungen umfassen. Eine Ausführung besteht darin, vorher einen Überstrahlungspeak unter Anwendungsbedingungen zu messen und zu bewerten und anschließend einen festen Wert als Verhalten der Vorrichtung festzulegen. Die andere Option besteht darin, ein Verhältnis zu einem Ausgangspeak des Überstrahlungspeaks zu bestimmen. Eine Überstrahlung ist stark abhängig von der Signalintensität einer weiteren Wellenlänge, die beim Nachweis zur gleichen Zeit erhalten worden ist. Aus dieser Korrelation ermöglicht eine ständige Berechnung eines Verhältnisses zu einem Signal einer anderen Wellenlänge (Ausgangspeak), das zum gleichen Zeitpunkt wie ein Überstrahlungspeak, bei dem es sich um einen falschen Peak handelt, erhalten worden ist, die Beseitigung von falschen Peaks. Wenn eine größere Anzahl von Ausgangspeaks vorhanden ist, kann die Berechnung für jede Wellenlänge vorgenommen werden. Ferner können die berechneten Werte summiert werden, um den Überstrahlungspeak zu erhalten. Es ist erstrebenswert, dass diese Verhältnisse vorher auf ähnliche Weise wie beim Bestimmen des festgelegten Werts bestimmt werden. Der Überstrahlungspeak hängt von der Vorrichtung ab, ferner vom Nachweissystem, vom Amplifikationsreagenz und der Matrixtransformation durch Matrixberechnung. Daher kann die vorherige Bestimmung jedes Mal durchgeführt werden, wenn einer dieser Faktoren verändert wird, bevor der Einstellwert verändert wird. Ferner kann der Schwellenwert in Abhängigkeit vom Analysenverfahren, z. B. einer Nucleinsäure-Sequenzanalyse oder einer ”Short Tandem Repeat”-Analyse verändert werden.
Alternativ können aufgrund der Tatsache, dass der in 8 dargestellte Reaktionsbehälter mit Amplifikationsreagenz gefüllt ist, die vorstehenden Informationen in einem am Reaktionsbehälter angeordneten Barcode angebracht werden, was es ermöglicht, dass die Vorrichtung ein vom Reagenz abhängiges Verhältnis realisiert.
Wenn die Verhältnisse der Signalintensität für die Mehrzahl von fluoreszierenden Farbstoffen im für die Analyse verwendeten Reagenz verfügbar sind, führt deren Wiedergabe in einer Matrix und die Multiplikation einer ursprünglich erfassten Peakwellenform mit einer umgekehrten Matrix davon zu Wellenformen der entsprechenden fluoreszierenden Farbstoffe. Die vorherige Bewertung bezieht sich auf den vorherigen Erhalt dieser Verhältnisse der Signalintensität, indem man die Elektrophorese mit einer Eichprobe oder dergleichen durchführt. Ferner kann das Verhältnis der Signalintensität automatisch zur Einstelleinrichtung für den Pull-up-Peak nach der Elektrophorese unter Verwendung der Eichprobe wiedergegeben werden.
Die nachstehenden Ausführungen befassen sich mit einer Stutter-Bande. Ein Einstellverfahren kann zwei Optionen gemäß den nachstehenden Ausführungen umfassen. Eine Option besteht darin, einen falschen Peakwert, der einer Stutter-Bande für jede Allele zuzuordnen ist, aus Informationen, die vorher von der Herstellerfirma des Reagenz oder von einem Anwender über erhaltene Signale, die der Stutter-Bande in Relation zu jedem Allelen-Peak (z. B. Verhältnis des Peaks zur Allele) zuzuordnen sind, zu erhalten. Die andere Methode besteht darin, einen feststehenden Wert einzustellen. Was die Stutter-Bande betrifft, kann ein Fleck, wo ein Peak auftritt, abgeschätzt werden, und somit ist es möglich, Bedingungen aus den vorherigen Informationen festzulegen, bei denen ein Einfluss der Stutter-Bande nicht berücksichtigt wird, wenn sich ein Allelenpeak nicht in Nachbarschaft hierzu befindet. Was die unteren Schwellenwerte betrifft, ergibt eine Summe der hier festgelegten Werte einen grundlegenden unteren Schwellenwert zur Bestimmung eines durch den Detektor gewonnenen Signals. Signale werden gemäß dem aus den Einstellungen für die vorerwähnten Punkte gewonnenen Schwellenwert analysiert.
Weitere Punkte für die Analyse gemäß Darstellung in 7 umfassen beispielsweise den ”Nachweis” in einer dargestellten Drucktaste. Ein vom Detektor erfasstes Signal ergibt Informationen über einen Punkt, an dem die Fluoreszenzintensität und die Nachweiszeit angegeben sind. Um einen Peak als eine Fortsetzung dieser den Punkt betreffenden Informationen erkennbar zu machen, werden verschiedene Verfahren zur Durchführung einer Kurvenanpassung eingestellt, z. B. eine Polynomnäherung.
Beim Punkt ”Qualität” an einer dargestellten Drucktaste wird die Qualität des durch die Kurvenanpassung oder dergleichen erhaltenen Peaks geprüft. Gemäß den hier eingestellten Bedingungen wird festgestellt, ob der erhaltene Peak erwünscht ist. Punkte für die Qualitätsprüfung umfassen die Bestimmung, ob die halbe Breite eine bestimmte Breite übersteigt. Wenn die halbe Breite größer als diese bestimmte Breite ist, besteht die Möglichkeit, dass der Peak zu breit ist, um eine richtige Größenermittlung durchzuführen.
Ein Beispiel für den Punkt ”Allele” bei der dargestellten Drucktaste besteht in der Bestimmung, ob erhaltene Allelenpeaks heterozygot sind, wenn die Intensität eines Peaks eine bestimmte Intensität in Bezug zur Intensität des anderen Peaks aufweist. Weitere Einstellungspunkte umfassen die Einstellung der Anzahl von Peaks, die in Nachbarschaft zu Allelen erhalten werden. Üblicherweise werden ein oder zwei Peaks erhalten. Daher kann ein Wert eingestellt werden, um klar ein Analysenergebnis anzuzeigen, wenn eine andere Anzahl von Peaks erhalten wird.
Die Einstellungen der Bedingungen für die Signalanalyse (600) umfassen die vorstehenden Punkte, sind aber nicht hierauf beschränkt.

(2) Stufe 601: Als nächste Stufe werden die Reagenzinformationen gelesen. Dabei zeigt 8 einen in der Vorrichtung installierten Reaktionsbehälter, der das Amplifikationsreagenz oder dergleichen enthält. Speziell umfasst die Vorrichtung das Gefäß 800 zur Zugabe der Probe, das Gefäß 801 für das Amplifikationsreagenz, das Reaktionsgefäß 802 und den Probenbehälter 121.

Beim Installieren des in 8 dargestellten Reaktionsbehälters, der das Amplifikationsreagenz oder dergleichen enthält, an der Vorrichtung, ist der Reaktionswirkungsgrad je nach der Lagerungsdauer des Reaktionsbehälters unterschiedlich. Beispielsweise nimmt die Aktivität von DNA-Polymerase, die für die Nucleinsäure-Amplifikation verwendet wird, mit länger werdender Lagerungsdauer ab. Bei einem Behälter mit einer kurzen Lagerungsdauer und einem Behälter mit einer langen Lagerungsdauer werden beim Versetzen beider Behälter mit der gleichen Probe unterschiedliche Signalintensitäten erhalten und somit muss der Detektor einen breiteren dynamischen Bereich aufweisen.
Die Aufzeichnung des Herstellungsdatums des Reagenz in einem Barcode oder dergleichen bei der Herstellung des Reaktionsbehälters und das Lesen des Barcodes oder dergleichen nach Installation des Reaktionsbehälters ermöglichen es der Vorrichtung, den Lagerstatus des Reagenz zu erfahren. Die Temperaturbedingungen bei der Amplifikationsstufe werden unter Berücksichtigung dieser Informationen, der Aktivitätsinformationen über das Reagenz, die vorher ermittelt worden sind, und der Informationen über den dynamischen Bereich des Detektors festgelegt. Wenn es sich bei der Amplifikationsreaktion um eine PCR-Reaktion handelt, wird die Anzahl der Temperaturzyklen erhöht oder verringert. Wenn das Isothermen-Amplifikationsverfahren verwendet wird, nimmt die Reaktionszeit zu oder ab. Die Einstellung der Temperaturbedingungen ermöglicht es, die erwünschte Signalintensität zu erhalten. Daher ist ein breiter dynamischer Bereich nicht mehr erforderlich.

(3) Stufe 602: Anschließend wird die Elektrophorese durchgeführt.

Es ist erstrebenswert, dass die Bestrahlung mit Anregungslicht bei der Elektrophorese in geeigneter Weise variabel ist. Die Gewinnung von Signalen für eine Mehrzahl von Belichtungszeiten ermöglicht eine Zunahme des Bereichs der Signalintensität, der vom Detektor erfasst werden kann. Daher ist ein Detektor mit einem breiten dynamischen Bereich nicht erforderlich, was eine einfache Analyse bei vernünftigen Kosten ermöglicht. Ferner ist eine Einstellung der Genom-DNA-Konzentration nicht erforderlich, so dass eine rasch arbeitende und einfache Vorrichtung geschaffen werden kann.

(4) Stufe 603: Gewinnung von Daten durch Elektrophorese.
(5) Stufe 604: Eingabe von Informationen über die Kapillarenposition in einen Detektor 112, die vorher gewonnen worden sind.
(6) Stufe 605: Ferner Eingabe von Informationen über die Wellenlängeneichung (605).
(7) Stufe 606: Es werden nur Zielsignale extrahiert. Informationen, wie Nachweiszeit sowie Höhe und Breite eines jeden Peaks werden aus den Signalen berechnet (Peakerfassung).
(8) Stufe 607: Durchführung der Größenermittlung einer Analysenprobe auf der Grundlage dieser Informationen und der Peak-Nachweisinformationen, wobei ein DNA-Fragment, das fluoreszierend markiert ist, von bekannter Größe ebenfalls gleichzeitig der Elektrophorese unterworfen wird (Größenermittlung).
(9) Stufe 608: Anschließend werden die Nachweiszeiten von Signalpeaks in entsprechenden Farben, die in den entsprechenden Wellenlängenbereichen erhalten worden sind, verglichen. Wenn Peaks in der gleichen Probe und in der gleichen Nachweiszeit nachgewiesen werden, jedoch bei unterschiedlichen Nachweiswellenlängen, wird ein unterer Schwellenwert für einen der Peaks auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität des Ausgangspeaks und eines Werts, der bei den Einstellungen der Bedingungen für die Signalanalyse (600) festgelegt worden ist, verändert.

Nachstehend wird unter Bezugnahme auf die 9A bis 9C ein Beispiel beschrieben, bei dem Signale mit kurzen und langen Belichtungszeiten erfasst werden. Für die unteren Schwellenfaktoren in Abhängigkeit von der Belichtungszeit wird ein unterer Schwellenwert davon gemäß der Länge der Belichtungszeit verändert. Beispielsweise hängt das Hardware-Rauschen von der Belichtungszeit ab. Je länger die Belichtungszeit ist, desto größer ist das Hardware-Rauschen und umgekehrt. 9A zeigt Daten, wobei Signale mit nur einer Belichtungszeit erhalten werden. Eine mit dem Farbstoff A versetzte Probe liefert Daten, bei denen die Signale gesättigt sind (900) und somit eine Peakhöhe nicht analysiert werden kann. Daher kann ein Pull-up-Peak nicht berechnet werden und es kann somit nicht festgestellt werden, ob ein mit dem Farbstoff B erhaltener Peak (901) einem Pull-up-Vorgang oder der Probe zuzuordnen ist.
Jedoch ermöglicht ein Nachweis bei langen und kurzen Belichtungszeiten gemäß Darstellung in den 9B und 9C den Nachweis einer Peakhöhe aus Daten, die bei der kurzen Belichtungszeit erfasst worden sind, selbst wenn die Signale wie in 9B gesättigt sind. Dabei zeigt 9B einen Fall der langen Belichtungszeit und 9C einen Fall der kurzen Belichtungszeit.
Im Ergebnis erfährt man den Grad des Einflusses durch den Pull-up-Peak. Wenn der untere Schwellenwert nicht verändert wird, wird der Peak als über dem Schwellenwert liegend bestimmt, wie mit dem Bezugszeichen 902 in 9C dargestellt ist. Eine erneute Berechnung des Schwellenwerts und eine Veränderung des unteren Schwellenwerts gemäß Darstellung in 9D ermöglicht die Bestimmung des Peaks als falscher Peak, der durch den Pull-up-Peak beeinflusst ist, wie mit dem Bezugszeichen 903 angegeben wird.
Ferner können in einem Fall, bei dem der Nachweis z. B. gemäß 9 unter kurzen und langen Belichtungszeiten durchgeführt wird, selbst dann, wenn ein Peak bei der langen Belichtungszeit erkennbar ist, während der Peak bei der kurzen Belichtungszeit nicht erkennbar ist, durch Kombination der Daten der kurzen und langen Belichtungszeiten Daten von Peaks, die unter Verwendung optimaler Schwellenwerte gemäß der vorgenannten Vorgehensweise erkennbar sind, als einzige Daten verwendet werden. Wenn beispielsweise ein Peak bei der kurzen Belichtungszeit unter dem unteren Schwellenwert liegt, jedoch bei der langen Belichtungszeit über dem unteren Schwellenwert liegt, werden die Peakdaten bei der langen Belichtungszeit verwendet.

(10) Stufe 609: Wenn ferner eine Normierung zum Ausgleich der Signalintensität auf einen konstanten Wert von dem Gesichtspunkt aus vorgenommen worden ist, dass die vom markierten DNA-Fragment bekannter Größe, das in Stufe 607 verwendet worden ist, erhaltene Fluoreszenzintensität unter den entsprechenden Kapillaren gleich ist, kann ein für die Normierung verwendeter Koeffizient auch auf einen Schwellenwert und die Neuberechnung angewandt werden und ein Zurücksetzen wird zusammen mit der Normierung durchgeführt.
(11) Stufe 610: Mit dem neu berechneten Schwellenwert wird eine Verbindung mit den vorherigen Informationen über die Zielallele (Allelen-Benennung) hergestellt.
(12) Stufe 611: Die Basenlänge oder die Anzahl der Wiederholungen einer Sequenz werden berechnet und Profildaten werden erhalten. Die erhaltenen Profildaten brauchen nicht von einem Experten oder dergleichen interpretiert werden.

Das in 6 dargestellte Fließdiagramm stellt ein Beispiel dar; somit kann die Analysenreihenfolge verändert werden. Beispielsweise kann die Stufe 608, bei der der Pull-up-Peak bestimmt wird, nach der Stufe 603, bei der Signale gewonnen werden, und der Stufe 606, bei der Peaks nachgewiesen werden, durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird die Elektrophorese durch eine Elektrophoreseeinrichtung durchgeführt und dabei erhaltene Daten werden durch eine getrennte Analysensoftware analysiert. Durch Durchführung der Analyse beim vorerwähnten Verfahren kann der Pull-up-Peak in der Elektrophoresevorrichtung angezeigt werden. Alternativ kann der Einfluss des Pull-up-Vorgangs vorher in Betracht gezogen werden und vom Fluoreszenzsignalpeak des anderen beeinflussten Farbstoffes subtrahiert werden, bevor der Peak angezeigt wird.
Ein Bericht über die erhobenen Daten kann auf dem Steuerungscomputer angezeigt oder ausgedruckt werden. 10 zeigt einen beispielhaften Bericht. Der Bericht umfasst die für die Analyse verwendete Software und deren Version, den Reagenztyp, den Probentyp und die Bedingungen für die Schwellenwerte. Die Anwendung eines jeden Schwellenwerts ist mit einem Kontrollkästchen oder dergleichen an dem in 7 dargestellten Einstellungsbildschirm wählbar. Ausgewählte Schwellenwerte können in den Bericht aufgenommen werden. Der Bericht kann tatsächliche Wellenformdaten und Informationen über jede Allele (z. B. die Anzahl von Wiederholungen) umfassen. Ein Peak, bei dem der Schwellenwert gemäß der vorliegenden Erfindung neu festgesetzt wird, wird nachstehend erläutert. Bei der Darstellung einer Wellenform für einen blauen Farbstoff gemäß 10 kann ein Schwellenwert durch eine punktierte Linie dargestellt werden, wobei ein neu zurückgesetzter Teil mit ”Pull-up-Schwellenwert” bezeichnet wird.
In 10 ist ein Faktor, der zur Modifikation des Schwellenwerts beiträgt, nämlich der Pull-up-Vorgang, dargestellt. Jedoch können sämtliche Schwellenwerte, die angewandt worden sind, angezeigt werden. Eine Modifikation eines Schwellenwerts, z. B. der Vorgang des Hinzufügens oder Entfernens eines Schwellenwerts, kann am Bildschirm des Steuerungscomputers vorgenommen werden.
Wie vorstehend ausgeführt, ermöglicht die vorliegende Erfindung die Bestimmung eines Pull-up-Peaks aus Signalen, die in der gleichen Nachweiszeit wie das Signal, das vorher als charakteristisch bewertet worden ist, erhalten worden sind. Ferner ist erfindungsgemäß eine Bestimmung auf der Grundlage der Kenntnisse und Erfahrungen eines Experten nicht erforderlich, was eine automatische Unterscheidung eines falschen Peaks ermöglicht und die Analyse vereinfacht.
Ferner ermöglicht die Kombination einer Mehrzahl von Bestrahlungszeiten mit Anregungslicht und die Bestimmung des Pull-up-Peaks aus Signalen, die in der gleichen Nachweiszeit wie das Signal, das vorher als charakteristisch bewertet worden ist, erhalten worden sind, die Feststellung, ob es sich beim erhaltenen Peak um einen falschen Peak handelt, der durch den Pull-up-Vorgang, der einer Sättigung in einer anderen Wellenlänge zuzuschreiben ist, beeinflusst wird.
Außerdem werden durch Berechnung des Pull-up-Peaks durch Identifizieren des Ausgangspeaks ein Bestimmen eines maximalen Werts – als fixierter Wert – von falschen Signalen unter Einschluss von Signalen des Pull-up-Peaks und ein Einstellen eines übermäßigen Schwellenwerts nicht benötigt.
Infolgedessen wird ein echter Peak, der aufgrund der Bestimmung des maximalen Werts ausgeschlossen worden ist, nicht mehr ausgeschlossen. Mit anderen Worten, das Erweitern eines unteren Nachweisbereichs macht es beispielsweise möglich, dass eine Anpassungsfunktion der Probenkonzentration nicht mehr erforderlich ist, was die Bereitstellung einer rasch arbeitenden und klein bemessenen Vorrichtung ermöglicht.
Bezugszeichenliste

101: Hauptkörper der Vorrichtung
102: Kapillare
103: Pumpmechanismus
104: Hochspannungsnetzteil
105: Spritze
106: Gelblock
107: Polymerbehälter
108: Anodenpufferbehälter
109: Anodenelektrode
110: Elektrisches Ventil
111: Lichtquelle
112: Optischer Detektor
113: Nachweiseinheit
114: Multikapillarenanordnung
115: Thermostatenkammer
116: Ventilator
117: Heiz- und Kühlmechanismus
118: Pufferbehälter
119: Waschbehälter
120: Abfallflüssigkeitsbehälter
121: Probenbehälter
122: Transportvorrichtung
123: Beweglicher Tisch
124: Beladungskopf
125: Steuercomputer
126: Kapillarenkathodenende
127: Steuersubstrat
128: Erfasste Daten
201: Laserstrahl
202: Reflektionsspiegel
203: Strahlteiler
204: Sammellinse

Claims

Nucleinsäure-Analysenverfahren, umfassend die folgenden Schritte: Bestrahlen einer Analysenprobe, die eine Mehrzahl von DNA-Fragmenten enthält, mit Licht; Erfassen der Fluoreszenz, die von der Analysenprobe angeregt worden ist, entsprechend den DNA-Fragmenten mit einem Abbildungselement innerhalb einer vorgegebenen Nachweiszeit; Einstellen einer Untergrenze der Fluoreszenzintensität, die für die Analyse der Analysenprobe innerhalb eines nachweisbaren Bereichs der Fluoreszenzintensität des Abbildungselements erforderlich ist; Erfassen der Fluoreszenzintensität für jedes der DNA-Fragmente auf der Grundlage der Untergrenze; Nachweisen eines Peaks der Fluoreszenzintensität, die für jedes der DNA-Fragmente erfasst worden ist, und Bestimmen der Zeitinformationen entsprechend dem Peak; und Anzeigen der Entsprechung der Fluoreszenzintensität und der Zeitinformationen für jedes der DNA-Fragmente, wobei die Anzeige mindestens einen oder mehrere Peaks anzeigt, einschließlich eines ersten Peaks mit einer ersten Fluoreszenzintensität und eines zweiten Peaks mit einer Fluoreszenzintensität, die schwächer als die erste Fluoreszenzintensität ist, und wobei die Untergrenze an einen vorgegebenen Wert angepasst wird und die Fluoreszenzintensität bei Durchführung der Messung unter Verwendung der angepassten Untergrenze als Untergrenze des Abbildungselements als Fluoreszenzintensität mindestens eines oder mehrerer Peaks, einschließlich des zweiten Peaks zurückgesetzt wird, wodurch festgestellt wird, ob mindestens einer oder mehrere Peaks, einschließlich des zweiten Peaks, falsche Signalpeaks sind.
Nucleinsäure-Analysenverfahren nach Anspruch 1, wobei es sich beim vorgegebenen Wert um einen feststehenden Wert handelt, der vorher auf der Grundlage des Verhaltens einer bei der Analyse der Analysenprobe verwendeten Vorrichtung und der Anwendungsbedingungen der Vorrichtung eingestellt worden ist.
Nucleinsäure-Analysenverfahren nach Anspruch 1, wobei der vorgegebene Wert vorher eingestellt und mit einem Verhältnis unter Verwendung des ersten Peaks als Referenz berechnet wird.
Nucleinsäure-Analysenverfahren nach Anspruch 1, wobei der vorgegebene Wert entsprechend einem Analysenverfahren der Analysenprobe variiert.
Nucleinsäure-Analysenverfahren nach Anspruch 1, wobei die vorgegebene Nachweiszeit mindestens zwei Bestrahlungszeiten, die sich voneinander unterscheiden, umfasst.
Nucleinsäure-Analysenverfahren nach Anspruch 1, wobei Informationen, einschließlich der angepassten Untergrenze, in Form eines Berichts angezeigt werden.
Nucleinsäure-Analysenverfahren nach Anspruch 3, wobei der angepasste Peakwert erhalten wird, indem man den vorbestimmten Wert, der mit dem Verhältnis unter Verwendung des ersten Peaks als Referenz berechnet worden ist, von mindestens einem oder mehreren Peaks, einschließlich des zweiten Peaks, subtrahiert.
Nucleinsäure-Analysator, umfassend: eine Lichtbestrahlungseinheit, die so aufgebaut ist, dass eine Analysenprobe, die eine Mehrzahl von DNA-Fragmenten umfasst, mit Licht bestrahlt wird; eine Nachweiseinheit, die so aufgebaut ist, dass die Fluoreszenzintensität, die von der Analysenprobe angeregt wird, entsprechend den DNA-Fragmenten mit einem Abbildungselement innerhalb einer vorgegebenen Nachweiszeit nachgewiesen wird; ein Speicher, der so aufgebaut ist, dass er die Untergrenze der Fluoreszenzintensität, die für die Analyse der Analysenprobe innerhalb eines nachweisbaren Bereichs der Fluoreszenzintensität des Abbildungselements erforderlich ist, speichert; eine arithmetische Steuereinheit, die so aufgebaut ist, dass sie die entsprechenden Einheiten steuert und eine arithmetische Verarbeitung durchführt; und eine Anzeigeeinheit, die so aufgebaut ist, dass sie ein Ergebnis der arithmetischen Steuereinheit anzeigt; wobei die Nachweiseinheit die Fluoreszenzintensität für jedes der DNA-Fragmente auf der Basis der Untergrenze erfasst, wobei die arithmetische Steuereinheit einen Peak der Fluoreszenzintensität nachweist, der für jedes der DNA-Fragmente erfasst worden ist, und die Zeitinformationen entsprechend dem Peak bestimmt, wobei die Anzeigeeinheit die Entsprechung der Fluoreszenzintensität mit den Zeitinformationen für jedes der DNA-Fragmente anzeigt, wobei die Anzeigeeinheit mindestens einen oder mehrere Peaks, einschließlich eines ersten Peaks einer ersten Fluoreszenzintensität und eines zweiten Peaks mit einer Fluoreszenzintensität, die schwächer als die erste Fluoreszenzintensität ist, anzeigt, und wobei die arithmetische Steuereinheit die Untergrenze an einen vorgegebenen Wert anpasst, die Fluoreszenzintensität bei Durchführung der Messung unter Verwendung der angepassten Untergrenze als Untergrenze des Abbildungselements als Fluoreszenzintensität mindestens eines oder mehrerer Peaks, einschließlich des zweiten Peaks, zurücksetzt und dadurch bestimmt, ob mindestens ein oder mehrere Peaks, einschließlich des zweiten Peaks, falsche Signalpeaks sind.
Nucleinsäure-Analysator nach Anspruch 8, wobei es sich beim vorgegebenen Wert um einen feststehenden Wert handelt, der vorher auf der Grundlage des Verhaltens einer Vorrichtung, die bei der Analyse der Analysenprobe verwendet wird, und der Anwendungsbedingungen der Vorrichtung eingestellt worden ist.
Nucleinsäure-Analysator nach Anspruch 8, wobei der vorbestimmte Wert vorher eingestellt und mit einem Verhältnis unter Verwendung des ersten Peaks als Referenz berechnet wird.
Nucleinsäure-Analysator nach Anspruch 8, wobei der vorgegebene Wert entsprechend einem Analysenverfahren der Analysenprobe variiert.
Nucleinsäure-Analysator nach Anspruch 8, wobei die vorher bestimmte Nachweiszeit mindestens zwei Bestrahlungszeiten, die sich voneinander unterscheiden, umfasst.
Nucleinsäure-Analysator nach Anspruch 8, wobei Informationen, einschließlich der angepassten Untergrenze, an einer Anzeigeeinheit in Form eines Berichts angezeigt werden.
Nucleinsäure-Analysator nach Anspruch 10, wobei der angepasste Peakwert durch Subtrahieren des vorgegebenen Werts, der mit dem Verhältnis unter Verwendung des ersten Peaks als Referenz erhalten worden ist, von mindestens einem oder mehreren Peaks, einschließlich des zweiten Peaks, erhalten worden ist.