EP4077724A1 - Verfahren und vorrichtung zum ermitteln einer in einem fluid enthaltenen kopienanzahl einer dna-sequenz - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum ermitteln einer in einem fluid enthaltenen kopienanzahl einer dna-sequenz

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EP4077724A1
EP4077724A1 EP20835768.1A EP20835768A EP4077724A1 EP 4077724 A1 EP4077724 A1 EP 4077724A1 EP 20835768 A EP20835768 A EP 20835768A EP 4077724 A1 EP4077724 A1 EP 4077724A1
Authority
EP
European Patent Office
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reaction
compartments
copies
fluid
detection
Prior art date
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Pending
Application number
EP20835768.1A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Daniel Sebastian Podbiel
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Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP4077724A1 publication Critical patent/EP4077724A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
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    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the invention is based on a method and a device for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid according to the preamble of the independent claims.
  • the present invention also relates to a computer program.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the approach presented here enables, for example, an absolute quantification of the number of copies of a DNA sequence contained in a sample. Sequence also using a detection reaction with a low sensitivity. Furthermore, the approach presented here creates a possibility of advantageously using detection reactions which have a low specificity and / or a known false-positive rate in order to determine a valid test result.
  • the approach presented here presents a method for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid, the method comprising a step of dividing at least part of the fluid into at least two partitions, which can also be referred to as compartments, reaction compartments or aliquots , includes.
  • the method further comprises a step of setting a reaction condition for the fluid divided into the at least two partitions / compartments in order to enable a reaction in the at least two partitions / compartments and to obtain a reaction result in each case.
  • the method comprises a step of recognizing a strength of a signal, for example an optical signal, which represents the reaction results of the reactions that may have taken place in the partitions / compartments.
  • the method also includes a step of evaluating the signal, for example the optical signal, in order to determine the number of copies taking into account a reaction-specific detection probability function, which determines the probability of an amplification reaction taking place in a partition / a compartment depending on the initial in this partition / indicates the number of copies present in this compartment.
  • a reaction-specific detection probability function which determines the probability of an amplification reaction taking place in a partition / a compartment depending on the initial in this partition / indicates the number of copies present in this compartment.
  • an optical signal can be recognized with a spatial resolution, for example, so that the optical signal includes or depicts information from a plurality of partitions / compartments.
  • a method for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid, which is also referred to below as a DNA target or as a gene target, which has a splitting step, a setting step, a step of recognizing and comprises a step of evaluating.
  • the sample liquid also referred to as fluid
  • the setting step a reaction condition for the fluid divided into at least two partitions / compartments is set in order to enable a reaction in the at least two partitions / compartments of the fluid and, if necessary, to bring it about and thus to obtain a (for example positive or negative) reaction result.
  • a signal in particular an optical signal
  • the signal in particular the optical signal, that is to say the reaction results of at least two compartments, is evaluated in order to determine the number of copies in the fluid (within the scope of a statistical uncertainty).
  • a necessary condition such as an externally adjustable, physical condition for the basic course of the detection reaction and a sufficient reaction condition such as DNA target molecules are present in sufficient number of copies and are detected
  • the method can be used, for example, in the medical field for examinations of patient samples, for example.
  • the sample liquid examined by means of the method is, for example, an aqueous solution, for example obtained from a biological substance, for example of human origin, such as a body fluid, a smear, a secretion, sputum, a tissue sample or a device with attached sample material.
  • a biological substance for example of human origin
  • Species of medical, clinical, diagnostic or therapeutic relevance such as, for example, are located in the sample liquid Bacteria, viruses, cells, circulating tumor cells, cell-free DNA or other biomarkers and / or in particular components from the objects mentioned.
  • the sample liquid contains DNA molecules which have been extracted or obtained from at least one of the above-mentioned species.
  • the sample liquid is a master mix or components thereof, for example for carrying out at least two (independent) amplification reactions in the at least two compartments, for example at least one receiving unit, in particular for DNA detection at the molecular level by for example an isothermal amplification reaction or a Polymerase chain reaction.
  • a sample liquid is referred to here as a fluid, for example.
  • the necessary reaction condition represents, for example, an external influence that is necessary for a specific reaction to take place in the fluid.
  • the compartments can be provided, for example, within cavities, microcavities or as droplets in an immiscible second phase.
  • more than one reaction is possible at the same time due to a large number of compartments.
  • the signal in particular an optical signal, for example a fluorescence signal, which emanates from the compartments and which in particular indicates the occurrence of at least one specific reaction possibly occurring in the compartments, can for example be provided by a detection device such as a sensor with spatial resolution and a light source optical excitation of the fluorescent probes can be detected.
  • a detection device such as a sensor with spatial resolution and a light source optical excitation of the fluorescent probes can be detected.
  • the method can quantify within a comprehensive measuring range and / or quantify using detection reactions with a reduced sensitivity, in particular with a detection limit that is genuinely greater than one copy per compartment, which does not require quantitative sample analysis in a state-of-the-art would allow digital PCR carried out by the technique (a detection limit in the range of one copy per reaction compartment is required for this).
  • the step of dividing at least some of the sample liquid wedge / fluid can be distributed to at least two reaction compartments, so that partitions / aliquots of the fluid are used as There are reaction compartments in which mutually independent detection reactions can take place.
  • the partitions of the fluid can be present in cavities or microcavities or be implemented as droplets / droplets in a second phase, such as an oil and using surfactants, which stabilize the interfaces of the droplets and counteract an undesirable combination of the droplets / reaction compartments.
  • the sample liquid / the fluid in the distributing step, at least part of the sample liquid / the fluid can be distributed to microcavities which are used to produce the reaction compartments, with target-specific primers and / or probes, for example (among other things) being able to be upstream in the microcavities which can be used to detect at least one specific DNA target.
  • target-specific primers and / or probes for example (among other things) being able to be upstream in the microcavities which can be used to detect at least one specific DNA target.
  • the sample liquid wedge / fluid in the distributing step, can be distributed to microcavities which are used to produce the reaction compartments, the microcavities and in particular the reaction compartments present in the microcavities having at least two different volumes.
  • the quantification range can be increased further, since when there is a concentration of a DNA target in the sample liquid, the absolute number of the number of copies present in a reaction compartment scales with the volume of the reaction compartment. Consequently, for example - with a certain detection limit of a reaction in a compartment of, for example, x copies per compartment - through an additional use of smaller Reaction compartments, even larger DNA target concentrations in the sample liquid can be determined quantitatively.
  • the necessary reaction condition can represent a physical condition for the possible effect of a detection reaction.
  • the physical condition can be, for example, a temperature, a temperature profile or the addition of a further fluid or substance, by means of which a reaction, in particular in the partitions of the fluid present in the compartments, can advantageously be enabled and possibly triggered.
  • a signal in particular an optical signal, which originates, for example, from at least two reaction compartments, can be generated by means of at least one type of fluorescence probe and recognized by a detection unit.
  • the at least one type of fluorescent probe can be shaped, for example, as a substance that is added to the fluid and, for example, binds to components that are present in the fluid.
  • the optical signal is made recognizable.
  • the fluorescence probe can initially be composed of a fluorophore and a quencher, with a Förster resonance energy transfer initially not generating any discernible optical fluorescence signal from the fluorescence probe.
  • the fluorescent probe By binding the fluorescent probe to a DNA molecule, the fluorescent probe can be cleaved, for example, by an exonuclease activity of a polymerase enzyme, so that the fluorophore and quencher are (spatially) separated from one another and a recognizable fluorescence signal is generated by the fluorophore.
  • the presence of a specific DNA sequence can thereby advantageously be detected optically, for example in combination with the running of an amplification reaction.
  • the step of recognizing can be carried out again at least one more time in order to be able to recognize a further signal, in particular a further optical signal, the reaction results of the reactions that may have occurred in at least two compartments represents.
  • the step of recognition can advantageously be carried out several times so that, for example, a plurality of measured values can be evaluated, in particular in order to be able to follow the course of a (positive or negative) detection reaction over time using an optical signal.
  • the step of recognition is carried out several times in order to detect different signals, in particular different optical signals, in particular optical signals of different wavelengths.
  • different fluorescent probes can be used in this way.
  • at least two different fluorescence probes with different absorption and emission spectra can also be used in a reaction compartment, which in particular allow conclusions to be drawn about the presence of different DNA targets in the compartment.
  • spectral multiplexing is made possible so that the sample liquid can be examined for the presence of at least two different DNA targets in a reaction compartment.
  • a time interval can be varied or variable between the steps of recognition, in particular wherein in the step of evaluating a cycle and additionally or alternatively a time interval can be determined at which a value of the optical signal, an increase in the value of the optical signal and additionally or alternatively, a rate of change of the value of the rise of the optical signal can become a maximum.
  • the time interval, a temperature or the cycle can be varied in such a way that a maximum value, for example a luminosity, intensity or the like, is obtained for the optical signal.
  • a c t value can be determined which correlates with the number of copies initially contained in the sample and can possibly advantageously be used to validate the reaction result.
  • a step of recognizing and a step of evaluating can be carried out at least partially in parallel with one another in time. In this way, a course of the reaction can advantageously be determined and / or a required time period for determining the reaction results in the compartments and, from this, the number of copies can be shortened.
  • the absolute number of copies initially contained in the fluid can be calculated using the reaction results of the at least two partitions / compartments on the basis of a binomial distribution and / or taking into account the quantitative detection characteristics of a reaction, for example in the form of a reaction-specific detection probability function.
  • the binomial distribution includes the Poisson distribution and the Gauss distribution as a general distribution function as borderline cases.
  • the quantitative detection characteristic of a reaction describes in particular the probability of the onset of the reaction depending on the number of copies initially present in the reaction compartment (and under defined boundary conditions, which are produced in particular in the step of distributing and / or in the step of setting).
  • the number of copies of at least one gene target initially present in the sample liquid can thus advantageously be determined using a known reaction-specific detection probability function with statistical significance.
  • This method can be implemented, for example, in software or hardware or in a mixed form of software and hardware, for example in a control device.
  • control device which is designed to carry out, control or implement the steps of a variant of a method presented here in corresponding devices.
  • This embodiment variant of the invention in the form of a control device also enables the object on which the invention is based to be achieved quickly and efficiently.
  • the control device can have at least one processing unit for processing signals or data, at least one storage unit for storing signals or data, at least one interface to a sensor or an actuator for reading in sensor signals from the sensor or for outputting control signals to the actuator and / or have at least one communication interface for reading in or outputting data that is embedded in a communication protocol.
  • the computing unit can be, for example, a signal processor, a microcontroller or the like, wherein the storage unit can be a flash memory, an EEPROM or a magnetic storage unit.
  • the communication interface can be designed to read in or output data wirelessly and / or wired, a communication interface that can input or output wired data, for example, feed this data electrically or optically from a corresponding data transmission line or output it into a corresponding data transmission line.
  • a control device can be understood to mean an electrical device that processes sensor signals and outputs control and / or data signals as a function thereof.
  • the control device can have an interface which can be designed in terms of hardware and / or software.
  • the interfaces can be part of a so-called system ASIC, for example, which contains a wide variety of functions of the control device.
  • the interfaces are separate, integrated circuits or at least partially consist of discrete components.
  • the interfaces can be software modules that are present, for example, on a microcontroller alongside other software modules.
  • control device controls a method for determining a number of copies of at least one DNA sequence contained in a fluid.
  • the control device can, for example, access sensor signals such as a setting signal for setting a reaction condition and an optical signal that represents the reaction results of the reactions that may have occurred in the compartments.
  • the control takes place via actuators such as a setting unit, which is designed to output the setting signal, and a recognition unit, which is designed to recognize the optical signal.
  • a computer program product or computer program with program code which can be stored on a machine-readable carrier or storage medium such as a semiconductor memory, a hard disk memory or an optical memory, and for carrying out, implementing and / or controlling the steps of the method according to one of the embodiments described above is also advantageous is used, especially when the program product or program is executed on a computer or device.
  • FIG. 1 shows a flowchart of an exemplary embodiment of a method for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid
  • FIG. 2 shows a flowchart of an exemplary embodiment of a method for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid
  • FIG. 3 shows a flowchart of a step in the evaluation of a method for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid according to an exemplary embodiment
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a series of measurements carried out by means of a method for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid, according to an exemplary embodiment
  • FIG. 5 shows a block diagram of an exemplary embodiment of a control device.
  • FIG. 1 shows a flow chart of a method 100 for determining a number of copies of at least one DNA sequence contained in a fluid according to an exemplary embodiment.
  • the method 100 can be used, for example, in the field of molecular laboratory diagnostics.
  • the method 100 can be controlled, for example, by a control device, as is described in one of the following figures.
  • a step 102 of the method 100 at least part of the fluid is divided into at least two partitions / compartments.
  • the method 100 comprises a further step 105 of setting a necessary reaction condition for the fluid divided into the at least two partitions / compartments in order to enable a reaction in the at least two partitions / compartments and to obtain a reaction result each.
  • a strength of a signal for example an optical signal, is recognized, which represents the reaction results of the reactions that may have occurred in the compartments.
  • a step 115 of evaluating the signal the signal is evaluated.
  • the evaluation is carried out taking into account the statistical distribution of the number of copies in the compartments and using a reaction-specific detection probability function, which indicates the probability of an amplification reaction taking place in the compartments as a function of the number of copies initially present in the compartments.
  • a reaction-specific detection probability function which indicates the probability of an amplification reaction taking place in the compartments as a function of the number of copies initially present in the compartments.
  • a quantitative reaction result is thus determined on the basis of a statistical evaluation of at least two (mutually independent) detection reactions.
  • a large number of compartments are generally favorable, typically more than 10, better 50 to 1000 or even 10,000 to 100,000.
  • the number of compartments scales with the Quantification range, depending on how large this should turn out to be, a correspondingly large number of mutually independent reaction compartments is required.
  • step 102 of dividing is carried out before step 105 of setting.
  • the first step of distributing / partitioning / aliquoting the fluid / sample liquid is the basis of the subsequent evaluation.
  • a “compartment” or “reaction compartment” is understood to mean a limited / delimited volume of liquid in which a detection reaction can possibly take place.
  • the compartments can be produced, for example, within microcavities or by creating droplets in a second immiscible liquid.
  • the microcavities can in particular first be filled with the sample liquid via an adjacent channel and then with a second liquid that cannot be mixed with the sample liquid, e.g. B. an oil, are sealed, the sample liquid from the area adjacent to the microcavities is (completely) displaced.
  • the partitioning or division of the fluid is characteristic of the method presented here; the quantification takes place in particular by counting the positive / negative reactions in the compartments.
  • the reaction condition represents, for example, a physical condition, such as, for example, a temperature or a temperature profile, as a result of which, for example, a reaction in the partition / compartment can be enabled.
  • a physical condition such as, for example, a temperature or a temperature profile
  • the specific detection reaction only takes place if at least one molecule that can be detected by the reaction is located in a compartment. Otherwise there is a false-positive reaction result in one compartment.
  • the result of the reaction in a reaction compartment is obtained, for example, by means of an optical signal, for example by means of a fluorescence probe certainly.
  • the fluorescence probe is implemented, for example, as a substance that can bind to another substance in the fluid, for example, and thereby make the reaction result recognizable.
  • the renewed recognition is symbolized by means of an arrow 125.
  • a time interval between the steps 110 of recognition is varied or variable.
  • a cycle and / or time interval can be determined at which a value of the optical signal, an increase in the value and / or a rate of change of the value becomes a maximum.
  • the optical signal can also be used to control the temperature profile in a compartment and thus in particular to control the setting of a necessary reaction condition.
  • the absolute number of copies of at least one DNA sequence initially contained in the fluid (the expected value of the number of copies) is calculated using the reaction results of the reactions possibly occurring in the individual compartments, generally on the basis of a binomial distribution.
  • the binomial distribution includes the Poisson distribution and the Gauss distribution as a general distribution function as borderline cases.
  • a variant used so far is digital PCR.
  • digital PCR a PCR master mix, which contains at least one fluorescence probe and the sample material to be analyzed, is initially divided into a large number of spatially separated, ie mutually independent, reaction compartments. After thermocycling of the reaction compartments, the fluorescence signal is used to determine in which reaction compartments an amplification has taken place. By simply counting the positive (and negative) reactions, the amount of target-specific DNA initially present in the sample can then be absolutely quantified on the basis of Poisson statistics.
  • the quantification based on Poisson statistics in digital PCR is based on highly sensitive PCR detection reactions that can reliably detect the presence of a single DNA target molecule in a reaction compartment.
  • the sensitivity the so-called limit-of-detection, LOD
  • the specificity i.e. the accuracy with which a certain target can be reliably detected. If the specificity of the detection reaction is too low, this can lead to false-positive results.
  • LOD limit-of-detection
  • a detection reaction e.g. primer design
  • a suitable compromise must therefore be found between the sensitivity and the specificity of the reaction. It is possible that the specification of a very high specificity of a detection reaction is not compatible with a very high sensitivity in the single copy area.
  • the newly presented approach can contain several copies of a DNA sequence in one reaction compartment and, based on a “quantitative amplification characteristic of a detection reaction”, conclusions can be drawn statistically about the number of copies of the DNA sequence initially present in the fluid .
  • the “quantitative amplification characteristic of a detection reaction” describes the probability of an amplification reaction taking place for the detection of a DNA sequence depending on the number of copies of the DNA sequence to be amplified by the reaction initially present in the reaction compartment. The statistical calculation can in particular take place by means of the binomial distribution.
  • the method 100 is presented for this purpose, which provides an absolute quantification of a DNA sequence / target DNA in a sample, which is referred to here as a fluid or sample liquid, even with a reduced sensitivity, that is, with a so-called limit of detection (LOD)> 1 enables the detection reaction.
  • the method 100 takes into account a general detection characteristic of an amplification reaction with regard to sensitivity and specificity (that is, in particular, possibly including a false positive rate), in particular an onset behavior of the amplification reaction in order to determine a valid test result therefrom.
  • the method 100 is presented, which in step 102 of introduction enables a liquid with sample material contained therein, which is referred to here as fluid, to be divided into a plurality of reaction compartments, which are also referred to as compartments and can be present in microcavities, for example.
  • the method 100 includes the step 105 of setting to produce suitable physical conditions, such as temperature or temperature profile, in the compartments, which, for example, enable amplification reactions to take place in them.
  • the reaction results are detected in the individual compartments, for example by means of an optical signal which is caused by a fluorescence probe.
  • an optical signal emanates from each individual compartment, which indicates the reaction result in the compartment.
  • the “optical signal” mentioned here then comprises the plurality of optical signals which emanate from the individual compartments.
  • a statistical evaluation of the reaction results is carried out in several compartments on the basis of the binomial distribution as a general distribution function with the limiting cases of the Poisson distribution and the Gaussian distribution, for example, taking into account a quantitative detection reaction characteristic, in particular using a quantitative description of the onset behavior of the detection reaction, that means in particular taking into account the sensitivity and specificity (that is to say in particular also, if necessary, including a false positive rate) of the detection reaction.
  • a statistically secured test result is derived and, if necessary, the absolute number of copies initially present in the fluid is calculated, for example at least one DNA sequence with statistical significance.
  • a large number of given detection reactions can thereby be used for an absolute quantification of DNA copies initially present in a sample liquid of at least one gene target.
  • a lower sensitivity of the detection reactions that is to say a limit-of-detection really greater than one, is sufficient.
  • detection reactions which are characterized by a higher specificity and lower sensitivity can be used for a quantification.
  • the method 100 described here which is based on the more general binomial statistics, can be used to quantify within of a different measuring range can be achieved. According to this exemplary embodiment, however, this is dependent on the sensitivity characteristic of the amplification reaction.
  • the method 100 presented here comprises steps 102, 105, 110, 115.
  • step 102 of the method 100 the fluid with the sample material contained therein is divided into a multiplicity of reaction compartments.
  • the fluid contains nucleic acids.
  • the compartments in particular all have the same volume.
  • suitable physical conditions such as temperature or temperature profile, are established in the compartments, which enable amplification reactions to take place in them.
  • these are nucleic acid-based methods such as the polymerase chain reaction or an isothermal amplification method.
  • the reaction result is detected in the individual compartments, for example on the basis of an optical signal which is produced by at least one fluorescence probe.
  • a quantitative polymerase chain reaction can be used as the detection reaction using a master mix with a target-specific fluorescence probe which indicates the presence of a specific PCR product.
  • the reaction kinetics can be followed in real time on the basis of an (increase in) fluorescence signal.
  • a statistical evaluation of the reaction results takes place in several compartments.
  • the evaluation takes place on the basis of the binomial distribution as a general distribution function with the borderline cases of the Poisson distribution and the Gauss distribution and taking into account the quantitative characteristics of the detection reaction. This means in particular using the onset behavior of the reaction with regard to sensitivity and specificity.
  • a statistically secured positive or negative test result is derived therefrom, optionally a calculation of the absolute number of copies of at least one DNA sequence / gene target initially present in the sample liquid with statistical probability is carried out. If, for example, a quantitative polymerase chain reaction is used as the detection reaction, the amount of DNA initially present in the sample can also be inferred from an optional comparison of the reaction kinetics in the individual compartments with standard reactions (which take place with a defined initial number of copies) and With combined with the statistically determined test result based on the reaction compartments.
  • FIG. 2 shows a flow chart of a method 100 for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid according to an exemplary embodiment.
  • the method 100 shown here can correspond or be similar to the method 100 described in FIG. 1.
  • Steps 105, 110 are shown differently, since according to this exemplary embodiment they can be carried out in parallel. This means that, according to this exemplary embodiment, when the steps of the method 100 are carried out repeatedly, a step 105 of setting and a step 110 of recognition can be carried out at least partially in parallel with one another. According to this exemplary embodiment, steps 102, 115 can still be carried out unchanged.
  • the method 100 is also presented, which enables the determination of the absolute number of copies of at least one DNA sequence present in the fluid, with a detection reaction with a reduced sensitivity, that is, a limit-of-detection (LOD) genuinely greater than one can be used for this. Furthermore, a derivation of a valid, possibly quantitative test result is thereby also made possible using detection reactions with limited sensitivity and specificity which, taken by themselves, do not produce a valid test result.
  • LOD limit-of-detection
  • step 105 and step 110 are carried out in parallel, that is, the detection of the fluorescence signal takes place at several times during the implementation of the amplification reaction.
  • the course of the reaction can also be determined, which can enable an even more reliable detection of positive and negative detection reactions.
  • the cycle at which the increase in the fluorescence signal or the rate of change of the increase in the fluorescence signal becomes maximum (“c t value”) can be determined. Since this value also corresponds to the initial value in the fluid If the number of copies contained is correlated, it can optionally also be used to validate the test result.
  • FIG. 3 shows a flowchart of a step 115 of evaluating a method for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid according to an exemplary embodiment.
  • the evaluation step 115 can correspond to the evaluation steps 115 described in one of FIGS. 1 or 2.
  • step 115 in particular on the basis of the reaction result from the step of recognizing the method, that means, for example, a measured positive rate, and using a predetermined function g, the quantitative characteristics of the onset behavior of the detection reaction p s (c) and the statistical distribution of the Sample DNA on the compartments B he (r) taken into account, the absolute number of copies initially present in the fluid is calculated.
  • the determination of the function g is described in more detail, which enables the calculation of the amount of DNA of a gene target initially present in a sample on the basis of the measured positive rate for a specific detection reaction under specific boundary conditions with statistical significance.
  • the quantitative characteristic of a detection reaction in a given microfluidic compartment is first (approximately) by a function p s (c), which, for example, also as
  • Detection probability function Probability-of-Detection (POD) function or as "sensitivity characteristic of a detection reaction" can be described (at least for a relevant measurement range), which indicates the probability that an amplification reaction will occur if exactly c copies are present in a compartment takes place in this compartment.
  • POD Probability-of-Detection
  • the Heaviside function Q can be used here, for example, so that where c L0D indicates the limit-of-detection (LOD) of the detection reaction.
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a series of measurements 400 carried out by means of a method for determining a number of copies of a DNA sequence contained in a fluid, according to an exemplary embodiment.
  • the reaction results of the series of measurements 400 shown here, inter alia, with the aid of curve diagrams can be generated, for example, by means of a method as explained in one of the FIGS. 1 to 3 described above.
  • an exemplary experimental series of measurements 400 of schematic representations of fluorescence microscopic recordings is shown, which were made in the step of recognition.
  • a PCR detection reaction using target-specific primers and a fluorescence probe for a diagnostically relevant gene target was used.
  • FIG. 4 (j) shows a plot of the experimentally determined positive rates (measuring points) and the calculated positive rates (curves), which result from modeling the onset behavior of the amplification reaction using the Heaviside (inset, thin line) and Gaussian description (inset , thick line) result when using suitable parameters characteristic of the amplification reaction, plotted against the mean number of copies per compartment.
  • the onset of the amplification reaction in the range of mean initial copy numbers per compartment c between 2 and 20 can be mapped quantitatively.
  • the number of copies initially present in a sample liquid can now be determined from an experimentally determined positive rate.
  • the control device 500 has a setting unit 505, a recognition unit 510 and an evaluation unit 515.
  • the setting unit 505 is designed to provide a setting signal 520 to a setting device 525, for example, which is designed as a heating device and / or cooling device, for example, to enable a reaction in the at least two partitions / compartments and to obtain a reaction result.
  • the recognition unit 510 is designed to recognize an optical signal 530 which represents the reaction results 532 of the reactions that may have taken place in the partitions / compartments.
  • the optical signal 530 can be recognized by a sensor device 535, for example.
  • the evaluation unit 515 is designed to evaluate the optical signal 530 and / or the reaction results 532 and to determine the number of copies therefrom.
  • the number of copies can be shown graphically in a diagram, for example, as an evaluation result 540.
  • the number of copies determined is of medical, clinical, diagnostic or therapeutic relevance, so that a patient can be treated depending on the number of copies determined and, if necessary, with the inclusion of further information.
  • an exemplary embodiment comprises an “and / or” link between a first feature and a second feature, this is to be read in such a way that the exemplary embodiment according to one embodiment includes both the first feature and the second feature and, according to a further embodiment, either only the has the first feature or only the second feature.
  • Exemplary specifications for the method according to the invention are given below:
  • Number of reaction compartments 2 to 1,000,000, preferably 10 to 30,000

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren (100) zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl (300) einer DNA-Sequenz, wobei das Verfahren (100) einen Schritt (102) des Aufteilens, einen Schritt (105) des Einstellens, einen Schritt (110) des Erkennens und einen Schritt (115) des Auswertens umfasst. Im Schritt (102) des Aufteilens wird wenigstens ein Teil des Fluids in zumindest zwei Kompartimente aufgeteilt. Im Schritt (105) des Einstellens wird eine Reaktionsbedingung für das in die zumindest zwei Kompartimente aufgeteilte Fluid eingestellt, um jeweils eine Reaktion in den zumindest zwei Kompartimenten zu ermöglichen und je ein Reaktionsergebnis zu erhalten. Im Schritt (110) des Erkennens wird ein Signal, beispielsweise ein optisches Signal erkannt, das die Reaktionsergebnisse der in den Kompartimenten möglicherweise erfolgten Reaktionen repräsentiert. Im Schritt (115) des Auswertens wird das optische Signal ausgewertet, um die Kopienanzahl unter Berücksichtigung der statistischen Verteilung der Kopien auf die Kompartimente und unter Berücksichtigung einer reaktionsspezifischen Nachweiswahrscheinlichkeitsfunktion zu ermitteln, welche die Wahrscheinlichkeit für das Ablaufen einer Amplifikationsreaktion in einem Kompartiment in Abhängigkeit von der initial in dem Kompartiment vorliegenden Kopienanzahl angibt.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren und Vorrichtung zum Ermiteln einer in einem Fluid enthaltenen
Kopienanzahl einer DNA-Sequenz
Stand der Technik
Die Erfindung geht von einem Verfahren und einer Vorrichtung zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz nach Gattung der unabhängigen Ansprüche aus. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Computerprogramm.
Die Amplifikation von Target-spezifischen DNA-Basensequenzen spielt insbesondere in der molekulardiagnostischen Analyse von Patientenproben eine herausragende Rolle. Seit der Entwicklung der so genannten Polymerase- Kettenreaktion (PCR) haben sich eine Vielzahl verschiedener Nachweisvarianten und Amplifikationsreaktionen für Nukleinsäuren etabliert.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund werden mit dem hier vorgestellten Ansatz ein verbessertes Verfahren, weiterhin ein verbessertes Steuergerät, das dieses Verfahren verwendet, sowie schließlich ein entsprechendes Computerprogramm gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Durch die in den abhängigen Ansprüchen aufgeführten Maßnahmen sind vorteilhafte Weiterbildungen und Verbesserungen der im unabhängigen Anspruch angegebenen Vorrichtung möglich.
Der hier vorgestellte Ansatz ermöglicht beispielsweise eine absolute Quantifizierung von in einer Probe enthaltenen Kopienanzahl einer DNA- Sequenz auch unter Verwendung einer Nachweisreaktion mit einer geringen Sensitivität. Weiterhin wird durch den hier vorgestellten Ansatz eine Möglichkeit geschaffen, um vorteilhafterweise Nachweisreaktionen einzusetzen, die eine geringe Spezifität und/oder eine bekannte Falsch- Positivrate aufweisen, um ein valides Testergebnis zu ermitteln.
Mit dem hier vorgestellten Ansatz wird ein Verfahren zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz vorgestellt, wobei das Verfahren einen Schritt des Aufteilens wenigstens eines Teils des Fluids in zumindest zwei Partitionen, welche auch als Kompartimente, Reaktionskompartimente oder Aliquots bezeichnet werden können, umfasst. Ferner umfasst das Verfahren einen Schritt des Einstellens einer Reaktionsbedingung für das in die zumindest zwei Partitionen/Kompartimente aufgeteilte Fluid, um eine Reaktion in den zumindest zwei Partitionen/Kompartimenten zu ermöglichen und je ein Reaktionsergebnis zu erhalten. Weiterhin umfasst das Verfahren einen Schritt des Erkennens einer Stärke eines Signals, beispielsweise eines optischen Signals, das Reaktionsergebnisse der in den Partitionen/Kompartimenten möglicherweise erfolgten Reaktionen repräsentiert. Schließlich umfasst das Verfahren noch einen Schritt des Auswertens des Signals, beispielsweise des optischen Signals, um die Kopienanzahl unter Berücksichtigung einer reaktionsspezifischen Nachweiswahrscheinlichkeitsfunktion zu ermitteln, welche die Wahrscheinlichkeit für das Ablaufen einer Amplifikationsreaktion in einer Partition/einem Kompartiment in Abhängigkeit von der initial in dieser Partition/diesem Kompartiment vorliegenden Kopienanzahl angibt.
Im Schritt des Erkennens kann hierbei beispielsweise ein optisches Signal mit einer räumlichen Auflösung erkannt werden, sodass das optische Signal Informationen aus mehreren Partitionen/Kompartimenten umfasst oder abbildet.
Es wird somit beispielsweise ein Verfahren zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz, welche im Folgenden auch als DNA-Target oder als Gen-Target bezeichnet wird, vorgestellt, das einen Schritt des Aufteilens, einen Schritt des Einstellens, einen Schritt des Erkennens und einen Schritt des Auswertens umfasst. Im Schritt des Aufteilens wird die Probenflüssigkeit, auch als Fluid bezeichnet, auf wenigstens zwei Partitionen/Kompartimente beispielsweise unter der Verwendung wenigstens einer Aufnahmeeinheit verteilt. Im Schritt des Einstellens wird eine Reaktionsbedingung für das in zumindest zwei Partitionen/Kompartimente aufgeteilte Fluid eingestellt, um eine Reaktion in den zumindest zwei Partitionen/Kompartimenten des Fluids zu ermöglichen und gegebenenfalls zu bewirken und so ein (beispielsweise positives oder negatives) Reaktionsergebnis zu erhalten. Im Schritt des Erkennens wird ein Signal, insbesondere ein optisches Signal erkannt, das die Reaktionsergebnisse der in den Kompartimenten möglicherweise erfolgten Reaktionen repräsentiert. Im Schritt des Auswertens wird das Signal, insbesondere das optische Signal, also die Reaktionsergebnisse wenigstens zweier Kompartimente ausgewertet, um die Kopienanzahl in dem Fluid (im Rahmen einer statistischen Unsicherheit) zu ermitteln.
Im Schritt des Einstellens kann auch zwischen einer notwendigen Bedingung wie beispielsweise einer von außen einstellbaren, physikalischen Bedingung für das prinzipielle Ablaufen der Nachweisreaktion und einer hinreichenden Reaktionsbedingung wie beispielsweise DNA-Target-Moleküle liegen in ausreichender Kopienanzahl vor und werden nachgewiesen unterschieden werden, wobei im Schritt des Einstellens insbesondere von außen einstellbare, physikalische und für das mögliche Ablaufen einer Nachweisreaktion erforderliche Umgebungsbedingungen geschaffen werden und die Verteilung der DNA-Target-Moleküle auf die Kompartimente insbesondere im Schritt des Aufteilens erfolgt.
Das Verfahren kann beispielsweise im medizinischen Bereich für Untersuchungen von beispielsweise Patientenproben eingesetzt werden. Bei der mittels des Verfahrens untersuchten Probenflüssigkeit handelt es sich beispielsweise um eine wässrige Lösung, beispielsweise gewonnen aus einer biologischen Substanz, beispielsweise humanen Ursprungs, wie einer Körperflüssigkeit, eines Abstrichs, eines Sekrets, Sputum, einer Gewebeprobe oder einer Vorrichtung mit angebundenem Probenmaterial. In der Probenflüssigkeit befinden sich beispielsweise Spezies von medizinischer, klinischer, diagnostischer oder therapeutischer Relevanz wie beispielsweise Bakterien, Viren, Zellen, zirkulierende Tumorzellen, zellfreie DNA oder andere Biomarker und/oder insbesondere Bestandteile aus den genannten Objekten. Insbesondere liegen in der Probenflüssigkeit DNA-Moleküle vor, welche aus wenigstens einer der oben genannten Spezies extrahiert oder gewonnen worden sind. Insbesondere handelt es sich bei der Probenflüssigkeit um einen Mastermix oder Bestandteile davon, beispielsweise für die Durchführung wenigstens zweier (voneinander unabhängiger) Amplifikationsreaktionen in den wenigstens zwei Kompartimenten beispielsweise wenigstens einer Aufnahmeeinheit insbesondere für einen DNA-Nachweis auf molekularer Ebene durch beispielsweise eine isothermale Amplifikationsreaktion oder eine Polymerase- Kettenreaktion. Eine derartige Probenflüssigkeit wird hier beispielsweise als Fluid bezeichnet. Die notwendige Reaktionsbedingung repräsentiert beispielsweise einen äußeren Einfluss, der für das Ablaufen einer bestimmten Reaktion in dem Fluid notwendig ist. Die Kompartimente können beispielsweise innerhalb von Kavitäten, Mikrokavitäten oder als Tröpfchen in einer nicht mischbaren zweiten Phase bereitgestellt werden. Vorteilhafterweise ist durch eine Vielzahl von Kompartimenten mehr als eine Reaktion zeitgleich möglich. Das Signal, insbesondere ein optisches Signal, beispielsweise ein Fluoreszenzsignal, welches von den Kompartimenten ausgeht und welches insbesondere das Ablaufen wenigstens einer bestimmten in den Kompartimenten gegebenenfalls ablaufenden Reaktion anzeigt, kann beispielsweise von einer Erkennungseinrichtung, wie beispielsweise einem Sensor mit räumlicher Auflösung und einer Lichtquelle zur optischen Anregung der Fluoreszenzsonden erfasst werden. Vorteilhafterweise kann durch das Verfahren eine Quantifizierung innerhalb eines umfassenden Messbereichs durchgeführt werden und/oder eine Quantifizierung erfolgen unter Verwendung von Nachweisreaktionen mit einer verringerten Sensitivität, insbesondere mit einer Nachweisgrenze echt größer als eine Kopie pro Kompartiment, welche keine quantitative Probenanalyse in einer nach dem Stand-der-Technik durchgeführten digitalen PCR erlauben würde (hierfür ist eine Nachweisgrenze im Bereich von einer Kopie pro Reaktions- Kompartiment erforderlich).
Gemäß einer Ausführungsform kann im Schritt des Aufteilens eine Verteilung von wenigstens eines Teils der Probenflüssigkeil/ des Fluids auf wenigstens zwei Reaktionskompartimente erfolgen, sodass Partitionen/ Aliquots des Fluids als Reaktionskompartimente vorliegen, in denen voneinander unabhängige Nachweisreaktionen erfolgen können. Vorteilhafterweise kann dies durch einen automatisierten Vorgang ermöglicht werden. Beispielsweise können die Partitionen des Fluids in Kavitäten oder Mikrokavitäten vorliegen oder als Droplets/ Tröpfchen in einer zweiten Phase realisiert sein wie beispielsweise einem Öl und unter Verwendung von Surfactants, welche die Grenzflächen der Droplets stabilisieren und einer unerwünschten Vereinigung der Droplets/ Reaktionskompartimente entgegenwirken.
Gemäß einer Ausführungsform kann im Schritt des Verteilens eine Verteilung wenigstens eines Teils der Probenflüssigkeit/ des Fluids auf Mikrokavitäten, welche zur Herstellung der Reaktionskompartimente dienen, erfolgen, wobei in den Mikrokavitäten beispielsweise (unter anderem) Target-spezifische Primer und/oder Sonden vorgelagert sein können, welche zum Nachweis wenigstens eines bestimmten DNA-Targets eingesetzt werden können. Durch eine definierte Vorlagerung verschiedener Target-spezifischer Primer und/oder Sonden in vorgegebenen Mikrokavitäten der Vorrichtung kann die Probe so beispielsweise unter Verwendung einer kompakten Aufnahmeeinheit auf unterschiedliche DNA- Targets hin untersucht werden. Insbesondere können dazu auch Nachweisreaktionen mit einer eingeschränkten Multiplex-Performance eingesetzt werden.
Gemäß einer Ausführungsform kann im Schritt des Verteilens eine Verteilung wenigstens eines Teils der Probenflüssigkeil/ des Fluids auf Mikrokavitäten, welche zur Herstellung der Reaktionskompartimente dienen, erfolgen, wobei die Mikrokavitäten und insbesondere die in den Mikrokavitäten vorliegenden Reaktionskompartimente wenigstens zwei unterschiedliche Volumina aufweisen. Auf diese Weise kann beispielsweise der Quantifizierungsbereich weiter vergrößert werden, da bei einer vorliegenden Konzentration eines DNA-Targets in der Probenflüssigkeit die absolute Anzahl der in einem Reaktionskompartiment vorliegenden Kopienanzahl mit dem Volumen des Reaktionskompartiments skaliert. Folglich können beispielsweise - bei einer bestimmten Nachweisgrenze einer Reaktion in einem Kompartiment von beispielsweise x Kopien pro Kompartiment - durch eine zusätzliche Verwendung von kleineren Reaktionskompartimenten auch größere DNA-Target-Konzentrationen in der Probenflüssigkeit quantitativ ermittelt werden.
Gemäß einer Ausführungsform kann im Schritt des Einstellens die notwendige Reaktionsbedingung eine physikalische Bedingung für das mögliche Bewirken einer Nachweisreaktion repräsentieren. Die physikalische Bedingung kann beispielsweise eine Temperatur, ein Temperaturverlauf oder das Zugeben eines weiteren Fluids oder Stoffs sein, durch die vorteilhafterweise eine Reaktion, insbesondere in den in den Kompartimenten vorliegenden Partitionen des Fluids ermöglicht und gegebenenfalls ausgelöst werden kann.
Gemäß einer Ausführungsform kann im Schritt des Erkennens ein Signal, insbesondere ein optisches Signal, welches beispielsweise von wenigstens zwei Reaktionskompartimenten ausgeht, mittels wenigstens einer Art von Fluoreszenzsonde erzeugt werden und von einer Detektionseinheit erkannt werden. Die wenigstens eine Art von Fluoreszenzsonde kann beispielsweise als ein Stoff ausgeformt sein, der dem Fluid beigefügt wird und sich beispielsweise an Bestandteile, die in dem Fluid vorliegen, bindet. Durch das Binden wird beispielsweise das optische Signal erkennbar gemacht. Beispielsweise kann die Fluoreszenzsonde dazu initial aus einem Fluorophor und einem Quencher aufgebaut sein, wobei durch einen Förster- Resonanzenergietransfer zunächst kein erkennbares optisches Fluoreszenzsignal von der Fluoreszenzsonde erzeugt wird. Durch ein Binden der Fluoreszenzsonde an ein DNA-Molekül kann die Fluoreszenzsonde beispielsweise durch eine Exonuklease-Aktivität eines Polymerase- Enzyms gespalten werden, sodass Fluorophor und Quencher (räumlich) getrennt voneinander vorliegen und ein erkennbares Fluoreszenzsignal von dem Fluorophor generiert wird. Vorteilhafterweise kann dadurch beispielsweise in Kombination mit dem Ablaufen einer Amplifikationsreaktion das Vorliegen einer bestimmten DNA-Sequenz optisch nachgewiesen werden.
Gemäß einer Ausführungsform kann der Schritt des Erkennens zumindest ein weiteres Mal erneut ausgeführt werden, um ein weiteres Signal, insbesondere ein weiteres optisches Signal erkennen zu können, das Reaktionsergebnisse der in wenigstens zwei Kompartimenten möglicherweise erfolgten Reaktionen repräsentiert. Vorteilhafterweise ist der Schritt des Erkennens mehrfach ausführbar, sodass beispielsweise eine Mehrzahl von Messwerten ausgewertet werden kann, insbesondere um den zeitlichen Verlauf einer (positiven oder negativen) Nachweisreaktion anhand eines optischen Signals verfolgen zu können.
Gemäß einer Ausführungsform wird der Schritt des Erkennens mehrfach ausgeführt, um unterschiedliche Signale, insbesondere unterschiedliche optische Signale, insbesondere optische Signale unterschiedlicher Wellenlänge zu detektieren. Beispielsweise können auf diese Weise unterschiedliche Fluoreszenzsonden zum Einsatz kommen. Insbesondere können auch in einem Reaktionskompartiment wenigstens zwei unterschiedliche Fluoreszenzsonden mit unterschiedlichen Absorptions- und Emissionsspektren zum Einsatz kommen, welche insbesondere auf das Vorhandensein unterschiedlicher DNA-Targets in dem Kompartiment zurückschließen lassen. Auf diese Weise wird beispielsweise ein spektrales Multiplexing ermöglicht, sodass in einem Reaktionskompartiment die Probenflüssigkeit auf das Vorhandensein wenigstens zweier unterschiedlicher DNA-Targets hin untersucht werden kann.
Gemäß einer Ausführungsform kann zwischen den Schritten des Erkennens ein Zeitintervall variiert werden oder variabel sein, insbesondere wobei im Schritt des Auswertens ein Zyklus und zusätzlich oder alternativ ein Zeitintervall bestimmt werden kann, an dem ein Wert des optischen Signals, ein Anstieg des Werts des optischen Signals und zusätzlich oder alternativ eine Änderungsrate des Werts des Anstiegs des optischen Signals maximal werden kann. Hierbei kann beispielsweise das Zeitintervall, eine Temperatur oder der Zyklus derart variiert werden, dass ein maximaler Wert, beispielsweise eine Leuchtstärke, Intensität oder dergleichen für das optische Signal erhalten wird. Vorteilhafterweise kann dadurch bei Verwendung einer zyklischen Nachweisreaktion, beispielsweise einer Polymerase- Kettenreaktion ein ct-Wert bestimmt werden, der mit der initial in der Probe enthaltenen Kopienanzahl korreliert und gegebenenfalls vorteilhafterweise zu einer Validierung des Reaktionsergebnisses herangezogen werden kann. Ferner kann bei einem wiederholten Ausführen der Schritte des Verfahrens ein Schritt des Erkennens und ein Schritt des Auswertens zumindest teilweise zeitlich parallel zueinander ausgeführt werden. Vorteilhafterweise kann dadurch ein Verlauf der Reaktion ermittelt werden und/oder eine erforderliche Zeitdauer für die Ermittlung der Reaktionsergebnisse in den Kompartimenten und daraus der Kopienanzahl verkürzt werden.
Gemäß einer Ausführungsform kann im Schritt des Auswertens die in dem Fluid initial enthaltene absolute Kopienanzahl unter Verwendung der Reaktionsergebnisse der wenigstens zwei Partitionen/Kompartimente auf Basis einer Binomialverteilung und/oder unter Einbeziehung der quantitativen Nachweischarakteristik einer Reaktion, beispielsweise in Form einer reaktionsspezifischen Nachweiswahrscheinlichkeitsfunktion berechnet werden. Die Binomialverteilung schließt dabei als allgemeine Verteilungsfunktion als Grenzfälle die Poisson-Verteilung und die Gauss-Verteilung ein. Die quantitative Nachweischarakteristik einer Reaktion beschreibt dabei insbesondere die Wahrscheinlichkeit für das Einsetzen der Reaktion in Abhängigkeit von der initial in dem Reaktionskompartiment vorgelegenen Kopienanzahl (und unter definierten Randbedingungen, welche insbesondere im Schritt des Verteilens und/oder im Schritt des Einstellens hergestellt werden). Vorteilhafterweise kann so unter Verwendung einer bekannten reaktionsspezifischen Nachweiswahrscheinlichkeitsfunktion mit statistischer Signifikanz die initial in der Probenflüssigkeit vorgelegene Kopienanzahl wenigstens eines Gen-Targets ermittelt werden.
Dieses Verfahren kann beispielsweise in Software oder Hardware oder in einer Mischform aus Software und Hardware beispielsweise in einem Steuergerät implementiert sein.
Der hier vorgestellte Ansatz schafft ferner ein Steuergerät, das ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen, anzusteuern bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form eines Steuergeräts kann die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden. Hierzu kann das Steuergerät zumindest eine Recheneinheit zum Verarbeiten von Signalen oder Daten, zumindest eine Speichereinheit zum Speichern von Signalen oder Daten, zumindest eine Schnittstelle zu einem Sensor oder einem Aktor zum Einlesen von Sensorsignalen von dem Sensor oder zum Ausgeben von Steuersignalen an den Aktor und/oder zumindest eine Kommunikationsschnittstelle zum Einlesen oder Ausgeben von Daten aufweisen, die in ein Kommunikationsprotokoll eingebettet sind. Die Recheneinheit kann beispielsweise ein Signalprozessor, ein Mikrocontroller oder dergleichen sein, wobei die Speichereinheit ein Flash-Speicher, ein EEPROM oder eine magnetische Speichereinheit sein kann. Die Kommunikationsschnittstelle kann ausgebildet sein, um Daten drahtlos und/oder leitungsgebunden einzulesen oder auszugeben, wobei eine Kommunikationsschnittstelle, die leitungsgebundene Daten einiesen oder ausgeben kann, diese Daten beispielsweise elektrisch oder optisch aus einer entsprechenden Datenübertragungsleitung einiesen oder in eine entsprechende Datenübertragungsleitung ausgeben kann.
Unter einem Steuergerät kann vorliegend ein elektrisches Gerät verstanden werden, das Sensorsignale verarbeitet und in Abhängigkeit davon Steuer- und/oder Datensignale ausgibt. Das Steuergerät kann eine Schnittstelle aufweisen, die hard- und/oder softwaremäßig ausgebildet sein kann. Bei einer hardwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen beispielsweise Teil eines sogenannten System-ASICs sein, der verschiedenste Funktionen des Steuergeräts beinhaltet. Es ist jedoch auch möglich, dass die Schnittstellen eigene, integrierte Schaltkreise sind oder zumindest teilweise aus diskreten Bauelementen bestehen. Bei einer softwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen Softwaremodule sein, die beispielsweise auf einem Mikrocontroller neben anderen Softwaremodulen vorhanden sind.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung erfolgt durch das Steuergerät eine Steuerung eines Verfahrens zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl wenigstens einer DNA-Sequenz. Hierzu kann das Steuergerät beispielsweise auf Sensorsignale wie ein Einstellsignal zum Einstellen einer Reaktionsbedingung und ein optisches Signal, das die Reaktionsergebnisse der in den Kompartimenten möglicherweise erfolgten Reaktionen repräsentiert, zugreifen. Die Ansteuerung erfolgt über Aktoren wie eine Einstelleinheit, die ausgebildet ist, um das Einstellsignal auszugeben, und eine Erkennungseinheit, die ausgebildet ist, um das optische Signal zu erkennen.
Von Vorteil ist auch ein Computerprogrammprodukt oder Computerprogramm mit Programmcode, der auf einem maschinenlesbaren Träger oder Speichermedium wie einem Halbleiterspeicher, einem Festplattenspeicher oder einem optischen Speicher gespeichert sein kann und zur Durchführung, Umsetzung und/oder Ansteuerung der Schritte des Verfahrens nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen verwendet wird, insbesondere wenn das Programmprodukt oder Programm auf einem Computer oder einer Vorrichtung ausgeführt wird.
Ausführungsbeispiele des hier vorgestellten Ansatzes sind in den Zeichnungen dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels eines Verfahrens zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz;
Fig. 2 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels eines Verfahrens zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz;
Fig. 3 ein Ablaufdiagramm eines Schrittes des Auswertens eines Verfahrens zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA- Sequenz gemäß einem Ausführungsbeispiel;
Fig. 4 eine schematische Darstellung einer mittels eines Verfahrens zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz durchgeführten Messreihe gemäß einem Ausführungsbeispiel; und
Fig. 5 ein Blockschaltbild eines Ausführungsbeispiels eines Steuergeräts.
In der nachfolgenden Beschreibung günstiger Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.
Fig. 1 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 100 zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl wenigstens einer DNA-Sequenz gemäß einem Ausführungsbeispiel. Das Verfahren 100 ist beispielsweise im Bereich der molekularen Labordiagnostik einsetzbar. Das Verfahren 100 ist beispielsweise von einem Steuergerät ansteuerbar, wie es in einer der nachfolgenden Fig. beschrieben ist.
In einem Schritt 102 des Verfahrens 100 erfolgt ein Aufteilen wenigstens eines Teils des Fluids in zumindest zwei Partitionen/Kompartimente. Das Verfahren 100 umfasst einen weiteren Schritt 105 des Einstellens einer notwendigen Reaktionsbedingung für das in die zumindest zwei Partitionen/Kompartimente aufgeteilte Fluid, um eine Reaktion in den zumindest zwei Partitionen/Kompartimenten zu ermöglichen und je ein Reaktionsergebnis zu erhalten. In einem Schritt 110 des Erkennens wird eine Stärke eines Signals, beispielsweise eines optischen Signals erkannt, das Reaktionsergebnisse der in den Kompartimenten möglicherweise erfolgten Reaktionen repräsentiert. In einem Schritt 115 des Auswertens des Signals wird das Signal ausgewertet. Die Auswertung erfolgt unter Berücksichtigung der statistischen Verteilung der Kopienanzahlen in den Kompartimenten und unter Verwendung einer reaktionsspezifischen Nachweiswahrscheinlichkeitsfunktion, welche die Wahrscheinlichkeit für das Ablaufen einer Amplifikationsreaktion in den Kompartimenten in Abhängigkeit von der initial in den Kompartimenten vorliegenden Kopienanzahl angibt. Auf diese Weise kann auf Grundlage der in den Kompartimenten erzielten Reaktionsergebnisse die initial in dem Fluid vorgelegene Kopienanzahl wenigstens eines Targets/ einer DNA-Sequenz mit statistischer Genauigkeit ermittelt werden.
Die Ermittlung eines quantitativen Reaktionsergebnisses erfolgt dabei also auf Grundlage einer statistischen Auswertung wenigstens zweier (voneinander unabhängiger) Nachweisreaktionen. Um eine möglichst genaue Quantifizierung in einem großen Messbereich zu erzielen, sind im Allgemeinen eine Vielzahl von Kompartimenten günstig, typischerweise mehr als 10, besser 50 bis 1000 oder sogar 10000 bis 100000. Die Anzahl der Kompartimente skaliert mit dem Quantifizierungsbereich, je nachdem wie groß dieser ausfallen soll, ist eine dementsprechend große Anzahl an voneinander unabhängigen Reaktionskompartimenten erforderlich.
Der Schritt 102 des Aufteilens wird gemäß diesem Ausführungsbeispiel vor dem Schritt 105 des Einstellens durchgeführt. Der erste Schritt des Verteilens/ Partitionierens/ Aliquotierens des Fluids/ der Probenflüssigkeit ist hierbei Basis der nachfolgenden Auswertung. Unter einem „Kompartiment“ oder „Reaktionskompartiment“ wird in diesem Zusammenhang ein begrenztes/ abgegrenztes Flüssigkeitsvolumen verstanden, in dem möglicherweise eine Nachweisreaktion stattfinden kann. Die Herstellung der Kompartimente kann beispielsweise innerhalb von Mikrokavitäten erfolgen oder aber auch durch die Erzeugung von Tröpfchen in einer zweiten nicht-mischbaren Flüssigkeit. Für eine Erzeugung der Reaktionskompartimente in Mikrokavitäten können die Mikrokavitäten insbesondere zunächst mit der Probenflüssigkeit über einen angrenzenden Kanal befüllt und anschließend mit einer zweiten nicht mit der Probenflüssigkeit mischbaren Flüssigkeit, z. B. einem Öl, versiegelt werden, wobei die Probenflüssigkeit aus dem an die Mikrokavitäten angrenzenden Bereich (vollständig) verdrängt wird.
Die Partitionierung bzw. Aufteilung des Fluid ist charakteristisch für das hier vorgestellte Verfahren, die Quantifizierung erfolgt insbesondere durch ein Abzählen der positiven/ negativen Reaktionen in den Kompartimenten.
Gemäß diesem Ausführungsbeispiel repräsentiert die Reaktionsbedingung beispielsweise eine physikalische Bedingung, wie beispielsweise eine Temperatur oder einen Temperaturenverlauf, wodurch beispielsweise eine Reaktion in der Partition/dem Kompartiment ermöglicht werden kann. Anzumerken ist hierbei, dass im Allgemeinen die spezifische Nachweisreaktion insbesondere nur dann erfolgt, wenn sich wenigstens ein von der Reaktion nachweisbares Molekül in einem Kompartiment befindet. Andernfalls liegt ein falsch-positives Reaktionsergebnis in einem Kompartiment vor.
Das Reaktionsergebnis in einem Reaktionskompartiment wird beispielsweise mittels eines optischen Signals, beispielsweise mittels einer Fluoreszenzsonde bestimmt. Die Fluoreszenzsonde ist beispielsweise als ein Stoff realisiert, der sich beispielsweise an einen anderen Stoff im Fluid binden kann und dadurch das Reaktionsergebnis erkennbar macht. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird das erneute Erkennen mittels eines Pfeils 125 symbolisiert. Weiterhin optional ist gemäß diesem Ausführungsbeispiel zwischen den Schritten 110 des Erkennens ein Zeitintervall variiert oder variabel. Weiterhin kann im Schritt 115 des Auswertens ein Zyklus und/oder Zeitintervall bestimmt werden, an dem ein Wert des optischen Signals, ein Anstieg des Werts und/oder eine Änderungsrate des Werts maximal wird. Bei der Verwendung eines Fluoreszenz- Farbstoffes mit einer temperaturabhängigen Fluoreszenz kann auf diese Weise beispielsweise ein Tracking von Temperaturzyklen - beispielsweise im Zusammenhang mit der Durchführung von Polymerase- Kettenreaktionen - erzielt werden. Auf diese Weise kann das optische Signal neben der Funktion des Reaktionsnachweises in einem Kompartiment auch zur Kontrolle des Temperaturverlaufs in einem Kompartiment und damit insbesondere zur Kontrolle des Einstellens einer notwendigen Reaktionsbedingung eingesetzt werden.
Gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 115 des Auswertens die in dem Fluid initial enthaltene absolute Kopienanzahl wenigstens einer DNA- Sequenz (der Erwartungswert der Kopienanzahl) unter Verwendung der Reaktionsergebnisse der in den einzelnen Kompartimenten möglicherweise ablaufenden Reaktionen allgemein auf Basis einer Binomialverteilung berechnet. Die Binomialverteilung schließt dabei als allgemeine Verteilungsfunktion als Grenzfälle die Poisson-Verteilung und die Gauss-Verteilung ein. Dadurch wird - unter Verwendung einer Nachweisreaktion mit einer verringerten Sensitivität, insbesondere mit einer Nachweisgrenze, d. h. einem Limit-of-Detection (LOD) echt größer als 1 - eine Berechnung der Kopienanzahl wenigstens einer DNA- Sequenz auch bei einem initialen Vorliegen mehrerer Kopien der DNA-Sequenz in einem Nachweiskompartiment ermöglicht.
In anderen Worten wird eine Möglichkeit für eine quantitative DNA-Analytik auf Grundlage einer nachweisreaktionsspezifischen Amplifikationscharakteristik geschaffen. Eine bisher verwendete Variante stellt die digitale PCR dar. Bei der digitalen PCR wird ein PCR-Mastermix, der wenigstens eine Fluoreszenzsonde sowie das zu analysierende Probenmaterial enthält, zunächst auf eine Vielzahl räumlich getrennter, d. h. voneinander unabhängiger Reaktionskompartimente aufgeteilt. Nach einem Thermocycling der Reaktionskompartimente, wird anhand des Fluoreszenzsignals ermittelt, in welchen Reaktionskompartimenten eine Amplifikation erfolgt ist. Durch bloßes Abzählen der positiven (und negativen) Reaktionen lässt sich anschließend auf Grundlage der Poisson-Statistik die initial in der Probe vorliegende Menge an Target-spezifischer DNA absolut quantifizieren.
Die auf der Poisson-Statistik beruhende Quantifizierung bei der digitalen PCR basiert dabei auf hochsensitiven PCR-Nachweisreaktionen, die bereits das Vorliegen eines einzelnen DNA-Targetmoleküls in einem Reaktionskompartiment zuverlässig nachweisen können. Die Sensitivität (das so genannte Limit-of- Detection, LOD) einer Nachweisreaktion kann jedoch geringer sein und konkurriert i.A. mit der Spezifität, also der Genauigkeit, mit der ein bestimmtes Target zuverlässig nachgewiesen werden kann. Ist die Spezifität der Nachweisreaktion zu gering, kann dies zu falsch-positiven Resultaten führen. Im Allgemeinen muss bei dem Design einer Nachweisreaktion (z. B. Primer-Design) daher ein geeigneter Kompromiss zwischen der Sensitivität und der Spezifität der Reaktion gefunden werden. Möglicherweise ist die Vorgabe einer sehr hohen Spezifität einer Nachweisreaktion nicht mit einer sehr hohen Sensitivität im Einzelkopien-Bereich vereinbar.
Gegenüber dem bisher verwendeten Ansatz können sich bei dem neu vorgestellten Ansatz mehrere Kopien einer DNA-Sequenz in einem Reaktionskompartiment befinden und auf Grundlage einer „quantitativen Amplifikationscharakteristik einer Nachweisreaktion“ kann in statistischer Weise auf die initial in dem Fluid vorliegende Kopienanzahl der DNA-Sequenz zurückgeschlossen werden. Die „quantitative Amplifikationscharakteristik einer Nachweisreaktion“ beschreibt dabei die Wahrscheinlichkeit für das Ablaufen einer Amplifikationsreaktion für den Nachweis einer DNA-Sequenz in Abhängigkeit von der initial in dem Reaktionskompartiment vorliegenden Kopienanzahl der von der Reaktion zu amplifizierenden DNA-Sequenz. Die statistische Berechnung kann insbesondere mittels der Binomialverteilung erfolgen.
Gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird dazu das Verfahren 100 vorgestellt, welches eine absolute Quantifizierung von einer DNA-Sequenz/ Target-DNA in einer Probe, die hier als Fluid oder Probenflüssigkeit bezeichnet wird, auch bei einer verringerten Sensitivität, das bedeutet bei einem so genannten Limit-of- Detection (LOD) > 1 der Nachweisreaktion ermöglicht. Ferner ist durch das Verfahren 100 gemäß diesem Ausführungsbeispiel eine allgemeine Nachweischarakteristik einer Amplifikationsreaktion bezüglich Sensitivität und Spezifität (das heißt insbesondere auch gegebenenfalls unter Einbeziehung einer Falsch- Positivrate) berücksichtigt, insbesondere ein Einsetzungsverhalten der Amplifikationsreaktion, um daraus ein valides Testergebnis zu ermitteln.
Daher wird das Verfahren 100 vorgestellt, welches im Schritt 102 des Einbringens eine Aufteilung einer Flüssigkeit mit darin enthaltenem Probenmaterial, die hier als Fluid bezeichnet ist, auf eine Vielzahl von Reaktionskompartimenten, die auch als Kompartimente bezeichnet werden und beispielsweise in Mikrokavitäten vorliegen können, ermöglicht. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren 100 den Schritt 105 des Einstellens zur Herstellung geeigneter physikalischer Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur oder Temperaturverlauf, in den Kompartimenten, welche beispielsweise das Ablaufen von Amplifikationsreaktionen in diesen ermöglichen. Im Schritt 110 des Erkennens wird eine Detektion der Reaktionsergebnisse in den einzelnen Kompartimenten beispielsweise durch ein optisches Signal durchgeführt, welches von einer Fluoreszenzsonde hervorgerufen wird. Hierzu wird ferner angemerkt, dass von jedem einzelnen Kompartiment ein optisches Signal ausgeht, welches das Reaktionsergebnis in dem Kompartiment anzeigt. Das hier genannte „optische Signal“ umfasst dann die Mehrzahl von optischen Signalen, welche von den einzelnen Kompartimenten ausgehen. Im Schritt 115 des Auswertens wird eine statistische Auswertung der Reaktionsergebnisse in mehreren Kompartimenten auf Basis der Binomialverteilung als allgemeiner Verteilungsfunktion mit den Grenzfällen der Poisson-Verteilung und der Gauss- Verteilung beispielsweise unter Einbeziehung einer quantitativen Nachweisreaktionscharakteristik durchgeführt, insbesondere unter Verwendung einer quantitativen Beschreibung des Einsetzungsverhaltens der Nachweisreaktion, das bedeutet insbesondere unter Berücksichtigung von Sensitivität und Spezifität (das heißt insbesondere auch gegebenenfalls unter Einbeziehung einer Falschpositivrate) der Nachweisreaktion. Ferner erfolgt eine Ableitung eines statistisch abgesicherten Testergebnisses und gegebenenfalls eine Berechnung der absolut in dem Fluid initial vorgelegenen Kopienanzahl beispielsweise wenigstens einer DNA-Sequenz mit statistischer Signifikanz.
Vorteilhafterweise kann dadurch eine Vielzahl von gegebenen Nachweisreaktionen für eine absolute Quantifizierung von initial in einer Probenflüssigkeit vorliegenden DNA-Kopien wenigstens eines Gen-Targets verwendet werden. Insbesondere ist auch eine geringere Sensitivität der Nachweisreaktionen, das bedeutet ein Limit-of-Detection echt größer als eins, ausreichend. Insbesondere können Nachweisreaktionen, die sich durch eine höhere Spezifität und geringere Sensitivität auszeichnen, für eine Quantifizierung eingesetzt werden. Im Vergleich zu beispielsweise einer digitalen PCR nach dem Stand der Technik, welche auf den durch die Poisson-Statistik beschriebenen Bereich begrenzt ist, kann mit dem hier beschriebenen Verfahren 100, welches auf Grundlage der allgemeineren Binomialstatistik fußt, gegebenenfalls unter Verwendung derselben Aliquotiervorrichtung eine Quantifizierung innerhalb eines anderen Messbereichs erzielt werden. Diese ist gemäß diesem Ausführungsbeispiel jedoch abhängig von der Sensitivitätscharakteristik der Amplifikationsreaktion. Durch eine Kombination unterschiedlich gestalteter Nachweisreaktionen mit unterschiedlicher Sensitivität und/oder Spezifität für ein Gen-Target kann eine Quantifizierung innerhalb eines größeren Messbereichs vorteilhafterweise durchgeführt werden. Ebenfalls können gemäß diesem Ausführungsbeispiel auf Grundlage des hier vorgestellten Verfahrens 100 auch Nachweisreaktionen mit einer geringen Spezifität und einer bekannten signifikanten Falsch- Positivrate für die Ermittlung eines validen Testergebnisses eingesetzt werden. Dabei kann durch die Aliquotierung der Probenflüssigkeit auf eine Vielzahl von Kompartimenten und die Durchführung voneinander (nahezu) unabhängiger Amplifikationsreaktionen auf Grundlage eines experimentell ermittelten Anteils positiver Reaktionen unter Einbeziehung einer bekannten reaktionsspezifischen Falsch- Positivrate auf die tatsächliche Beschaffenheit der Probe mit statistischer Signifikanz zurückgeschlossen werden. Das hier vorgestellte Verfahren 100 umfasst in der grundlegenden Ausführungsform die Schritte 102, 105, 110, 115. Im Schritt 102 des Verfahrens 100 wird das Fluid mit darin enthaltenem Probenmaterial auf eine Vielzahl von Reaktionskompartimenten aufgeteilt. Das Fluid enthält insbesondere Nukleinsäuren. Die Kompartimente weisen gemäß diesem Ausführungsbeispiel insbesondere alle dasselbe Volumen auf. Im Schritt 105 des Verfahrens 100 werden geeignete physikalische Bedingungen, wie Temperatur oder Temperaturverlauf, in den Kompartimenten hergestellt, welche das Ablaufen von Amplifikationsreaktionen in diesen ermöglichen. Insbesondere handelt es sich um Nukleinsäure-basierte Verfahren wie beispielsweise die Polymerase- Kettenreaktion oder eine isothermale Amplifikationsmethode. Im Schritt 110 des Verfahrens 100 erfolgt eine Detektion des Reaktionsresultats in den einzelnen Kompartimenten, beispielsweise auf Grundlage eines optischen Signals, welches von wenigstens einer Fluoreszenzsonde hervorgerufen wird. Beispielsweise kann als Nachweisreaktion eine quantitative Polymerase- Kettenreaktion eingesetzt werden unter Verwendung eines Mastermix mit einer Target-spezifischen Fluoreszenzsonde, die das Vorhandensein eines spezifischen PCR-Produkts anzeigt. Auf diese Weise lässt sich anhand eines (Anstiegs des) Fluoreszenzsignals die Reaktionskinetik in Echtzeit verfolgen. Im Schritt 115 des Verfahrens 100 erfolgt eine statistische Auswertung der Reaktionsergebnisse in mehreren Kompartimenten. Insbesondere erfolgt die Auswertung auf Basis der Binomialverteilung als allgemeiner Verteilungsfunktion mit den Grenzfällen der Poisson-Verteilung und der Gauss-Verteilung und unter Einbeziehung der quantitativen Charakteristik der Nachweisreaktion. Das bedeutet insbesondere unter Verwendung des Einsetzungsverhaltens der Reaktion bezüglich Sensitivität und Spezifität. Daraus wird ein statistisch abgesichertes positives oder negatives Testergebnis abgeleitet, optional erfolgt eine Berechnung der absolut in der Probenflüssigkeit mit statistischer Wahrscheinlichkeit initial vorgelegenen Kopienanzahl wenigstens einer DNA-Sequenz/ eines Gen-Targets. Bei Einsatz beispielsweise einer quantitativen Polymerase- Kettenreaktion als Nachweisreaktion kann ferner zusätzlich durch einen optionalen Vergleich der Reaktionskinetik in den einzelnen Kompartimenten mit Standard- Reaktionen (welche mit einer definierten initial vorliegenden Kopienanzahl erfolgen) auf die initial in der Probe vorliegende DNA-Menge zurückgeschlossen werden und mit dem statistisch ermittelten Testergebnis auf Basis der Reaktionskompartimente kombiniert werden.
Fig. 2 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 100 zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz gemäß einem Ausführungsbeispiel. Das hier dargestellte Verfahren 100 kann dem in Fig. 1 beschriebenen Verfahren 100 entsprechen oder ähneln. Lediglich abweichend sind die Schritte 105, 110 dargestellt, da sie gemäß diesem Ausführungsbeispiel parallel durchführbar sind. Das bedeutet, dass gemäß diesem Ausführungsbeispiel bei einem wiederholten Ausführen der Schritte des Verfahrens 100 ein Schritt 105 des Einstellens und ein Schritt 110 des Erkennens zumindest teilweise zeitlich parallel zueinander ausführbar sind. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel sind weiterhin die Schritte 102, 115 unverändert ausführbar.
Auch gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird das Verfahren 100 vorgestellt, das die Bestimmung der absoluten Kopienanzahl wenigstens einer in dem Fluid vorliegenden DNA-Sequenz ermöglicht, wobei eine Nachweisreaktion mit einer verringerten Sensitivität, das bedeutet einem Limit-of-Detection (LOD) echt größer als eins dazu eingesetzt werden kann. Ferner wird dadurch eine Ableitung eines validen, gegebenenfalls quantitativen Testergebnisses auch unter Verwendung von Nachweisreaktionen mit begrenzter Sensitivität und Spezifität erlaubt, die für sich genommen kein valides Testergebnis erbringen.
In anderen Worten werden gemäß diesem Ausführungsbeispiel Schritt 105 und Schritt 110 parallel ausgeführt, das bedeutet es erfolgt die Detektion des Fluoreszenzsignals zu mehreren Zeitpunkten während der Durchführung der Amplifikationsreaktion. Dadurch kann zusätzlich der Reaktionsverlauf ermittelt werden, was eine noch zuverlässigere Erkennung von positiven und negativen Nachweisreaktionen ermöglichen kann. Insbesondere kann gemäß diesem Ausführungsbeispiel beispielsweise bei einer quantitativen Polymerase- Kettenreaktion zusätzlich der Zyklus, an dem der Anstieg des Fluoreszenzsignals bzw. die Änderungsrate des Anstiegs des Fluoreszenzsignals maximal wird („ct- Wert“), bestimmt werden. Da dieser Wert ebenfalls mit der initial in dem Fluid enthaltenen Kopienanzahl korreliert, kann er gegebenenfalls zusätzlich zur Validierung des Testergebnisses herangezogen werden.
Fig. 3 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Schrittes 115 des Auswertens eines Verfahrens zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz gemäß einem Ausführungsbeispiel. Der Schritt 115 des Auswertens kann dem in einer der Fig. 1 oder 2 beschriebenen Schritten 115 des Auswertens entsprechen.
In Schritt 115 wird insbesondere auf Grundlage des Reaktionsresultats aus dem Schritt des Erkennens des Verfahrens, das bedeutet beispielsweise einer gemessenen Positivrate, und unter Verwendung einer vorgegebenen Funktion g, die die quantitative Charakteristik des Einsetzungsverhaltens der Nachweisreaktion ps(c) sowie die statistische Verteilung der Proben-DNA auf die Kompartimente Bh e(r) berücksichtigt, die initial in dem Fluid vorliegende absolute Kopienanzahl berechnet.
Im Folgenden wird die Ermittlung der Funktion g genauer beschrieben, welche die Berechnung der initial in einer Probe vorgelegenen DNA-Menge eines Gen- Targets auf Grundlage der gemessenen Positivrate für eine spezifische Nachweisreaktion unter spezifischen Randbedingungen mit statistischer Signifikanz ermöglicht. Insbesondere wird zur Bereitstellung einer Funktion g zunächst die quantitative Charakteristik einer Nachweisreaktion in einem gegebenen mikrofluidischen Kompartiment (näherungsweise) durch eine Funktion ps(c), welche beispielsweise auch als
Nachweiswahrscheinlichkeitsfunktion, Probability-of-Detection (POD)- Funktion oder als „Sensitivitätscharakteristik einer Nachweisreaktion“ bezeichnet werden kann, beschrieben (zumindest für einen relevanten Messbereich), welche die Wahrscheinlichkeit angibt, dass bei einem Vorliegen von genau c Kopien in einem Kompartiment eine Amplifikationsreaktion in diesem Kompartiment erfolgt. Für eine (vereinfachte) approximative Beschreibung kann hier beispielsweise die Heaviside- Funktion Q herangezogen werden, sodass wobei cL0D das Limit-of-Detection (LOD) der Nachweisreaktion angibt. Im Allgemeinen eignen sich zur quantitativen Charakterisierung des Einsetzungsverhaltens einer Amplifikationsreaktion ps(c) auch kompliziertere Funktionen, wie beispielsweise Polynome, welche auf Grundlage einer Vielzahl von experimentellen Datensätzen ermittelt worden sind und die Assay- Charakteristik in dem verwendeten Test-Setup damit noch genauer abbilden.
Eine weitere (approximative) Beschreibung ergibt sich etwa durch die Faltung der oben stehenden Heaviside- Funktion PS,0,LOD (.c) mit einer Gauss- Funktion der Breite w, sodass ein kontinuierliches Einsetzen der Amplifikationsreaktion abhängig von der initial in einem Kompartiment vorliegenden Kopienanzahl c abgebildet werden kann durch die Funktion
Bei einer Anzahl von Kompartimenten n und einer mittleren Anzahl an initialen Kopien pro Kompartiment c ergibt sich die folgende Binomialverteilung Bn c- (c), welche den Anteil an Kompartimenten, in denen sich initial genau c Kopien befinden, beschreibt:
Mit der oben eingeführten Funktion ps(c ) zur quantitativen Beschreibung der Amplifikationscharakteristik ergibt sich dann der Anteil / an Kompartimenten, in denen eine positive Nachweisreaktion i erfolgt, zu
Mit der approximativen Heaviside-Beschreibung des Einsetzens der Amplifikationsreaktion PS,0,LOD (.c) folgt die Formel sodass / = f(n, c, cL0D). Für die Gausssche Beschreibung ergibt sich entsprechend / = f(n, c, cL0D,w). Gemäß dieser (näherungsweisen, empirischen) Beschreibungen der Reaktionscharakteristik hängt der Anteil an Kompartimenten /, in denen eine Amplifikationsreaktion stattfindet, direkt mit der mittleren Anzahl c an initialen Kopien pro Kompartiment und dem beispielsweise empirisch bekannten Limit-of-Detection cL0D der Nachweisreaktion sowie gegebenenfalls der Breite des Einsetzens w zusammen. Dementsprechend kann bei einer unbekannten Probe anhand der gemessenen Positivrate / und bei einem bekannten cL0D (und gegebenenfalls einem bekannten w) auf die initiale mittlere Kopienanzahl pro Kompartiment c zurückgeschlossen werden und damit die absolute Kopienanzahl in der Probe ermittelt werden, sofern zumindest in einem Teilbereich/ Intervall eine Monotonie der Funktion g( ,n, cL0D,w ) = c bzgl. einer Änderung von / vorliegt.
Bei der im vorherigen Absatz gewählten kontinuierlichen Beschreibung mittels Integral-Termen können die Binomial- Koeffizienten mittels der Beta-Funktion beschrieben werden. Neben der kontinuierlichen Darstellung kann auch durchgehend eine diskrete Beschreibung verwendet werden, sodass und sich die anderen Formeln analog dazu ergeben.
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung einer mittels einem Verfahren zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz durchgeführten Messreihe 400 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Die hier unter anderem anhand von Kurvendiagrammen dargestellten Reaktionsergebnisse der Messreihe 400 sind beispielsweise mittels eines Verfahrens erzeugbar, wie es in einer der vorangehend beschriebenen Fig. 1 bis 3 erläutert wurde. In anderen Worten wird gemäß diesem Ausführungsbeispiel unter anderem eine beispielhafte experimentelle Messreihe 400 aus schematischen Darstellungen fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen gezeigt, welche im Schritt des Erkennens gemacht wurden. Hierbei wurde eine PCR-Nachweisreaktion unter Verwendung von Target-spezifischen Primern sowie einer Fluoreszenzsonde für ein diagnostisch relevantes Gen-Target verwendet. In den Ansätzen befand sich jeweils eine definierte Menge an Template-DNA, die das Gen-Target enthält. Die mittleren Kopienanzahlen pro Kompartiment c betrugen 2, 5, 10 und 20 Kopien pro Kompartiment (cpc). In den schematischen Darstellungen fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen in Fig. 4 (a)-(d), welche nach dem Thermocycling gemacht wurden, erscheinen die Reaktionskompartimente, in denen eine Amplifikation erfolgte, hell, die übrigen erscheinen dagegen dunkel. Die zugehörigen quantitativen PCR-Amplifikationskurven sind ebenfalls in schematischer Weise in Fig. 4 (e)-(h) dargestellt. Die Positivrate der Nachweisreaktionen erstreckt sich von 42% bei c = 2 initialen Kopien pro Kompartiment (cpc), über 77% bei 5 cpc und 93% bei 10 cpc, hin zu 100% bei 20 cpc (siehe Fig. 4 (a)-(d)). Unter Einbeziehung der mittleren initial vorliegenden Kopienanzahl c sowie der Binomialstatistik (siehe Fig. 4 (i) zur Illustration der Verteilungsfunktionen bei der Verwendung von 96 Kompartimenten und mittleren Kopienzahlen pro Kompariment von 1, 2, 5, 10 und 20 Kopien pro Kompartiment, cpc) kann auf Grundlage der Messreihe 400 anhand der experimentell ermittelten Positivraten / auf die Sensitivitätscharakteristik ps(c) der Nachweisreaktion zurückgeschlossen werden:
Fig. 4 (j) zeigt dazu einen Plot der experimentell ermittelten Positivraten (Messpunkte) sowie der berechneten Positivraten (Kurven), welche sich aus der Modellierung des Einsetzungsverhaltens der Amplifikationsreaktion mittels der Heaviside- (Inset, dünne Linie) und der Gaussschen Beschreibung (Inset, dicke Linie) ergeben unter der Verwendung geeigneter für die Amplifikationsreaktion charakteristischer Parameter, aufgetragen über die mittlere Kopienanzahl pro Kompartiment. Die in Fig. 4 (j) abgebildeten Kurven zeigen die berechneten Positivraten, welche sich für die Parameter CLOD = 2.6 (Heaviside- Einsetzen, dünne Linie) bzw. CLOD = 2.5, w = 2.95 (Gausssches Einsetzen, dicke Linie) ergeben. Insbesondere bei Verwendung der Gaussschen Beschreibung kann eine gute Übereinstimmung mit den experimentell ermittelten Positivraten erzielt werden. Dementsprechend kann das Einsetzen der Amplifikationsreaktion in dem Bereich mittlerer initialer Kopienzahlen pro Kompartiment c zwischen 2 und 20 quantitativ abgebildet werden. Umgekehrt kann nun unter Verwendung der gewonnenen quantitativen Beschreibung des Einsetzungsverhaltens der Amplifikationsreaktion aus einer experimentell ermittelten Positivrate die initial in einer Probenflüssigkeit vorliegende Kopienanzahl ermittelt werden.
Fig. 5 zeigt ein Blockschaltbild eines Steuergeräts 500 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Das Steuergerät 500 weist gemäß diesem Ausführungsbeispiel eine Einstelleinheit 505, eine Erkennungseinheit 510 und eine Auswerteeinheit 515 auf. Die Einstelleinheit 505 ist dabei ausgebildet, um ein Einstellsignal 520 an beispielsweise eine Einstelleinrichtung 525 bereitzustellen, die beispielsweise als eine Heizeinrichtung und/oder Kühleinrichtung ausgeformt ist, um eine Reaktion in den zumindest zwei Partitionen/Kompartimenten zu ermöglichen und ein Reaktionsergebnis zu erhalten. Die Erkennungseinheit 510 ist ausgebildet, um ein optisches Signal 530 zu erkennen, das die Reaktionsergebnisse 532 der in den Partitionen/Kompartimenten möglicherweise erfolgten Reaktionen repräsentiert. Das optische Signal 530 ist dabei beispielsweise von einer Sensoreinrichtung 535 erkennbar. Die Auswerteeinheit 515 ist ausgebildet, um das optische Signal 530 und/oder die Reaktionsergebnisse 532 auszuwerten und um daraus die Kopienanzahl zu ermitteln. Die Kopienanzahl ist beispielsweise als Auswerteergebnis 540 in einem Diagramm grafisch darstellbar. Beispielsweise ist die ermittelte Kopienanzahl von medizinischer, klinischer, diagnostischer oder therapeutischer Relevanz, sodass abhängig von der ermittelten Kopienanzahl und ggf. unter Einbeziehung weiterer Informationen die Behandlung eines Patienten erfolgen kann.
Umfasst ein Ausführungsbeispiel eine „und/oder“-Verknüpfung zwischen einem ersten Merkmal und einem zweiten Merkmal, so ist dies so zu lesen, dass das Ausführungsbeispiel gemäß einer Ausführungsform sowohl das erste Merkmal als auch das zweite Merkmal und gemäß einer weiteren Ausführungsform entweder nur das erste Merkmal oder nur das zweite Merkmal aufweist. Nachfolgend sind beispielhafte Spezifikationen zu dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt:
Anzahl der Reaktionskompartimente: 2 bis 1.000.000, bevorzugt 10 bis 30.000
Volumen eines Reaktionskompartiments:
5 pl bis 100 pl, bevorzugt 500 pl bis 1 mI Nachweisreaktion:
Eine isothermale Amplifikationsreaktion oder eine (quantitative) Polymerase- Kettenreaktion

Claims

Ansprüche
1. Verfahren (100) zum Ermitteln einer in einem Fluid enthaltenen Kopienanzahl einer DNA-Sequenz, wobei das Verfahren (100) die folgenden Schritte umfasst:
Aufteilen (102) wenigstens eines vorgegebenen Teils des Fluids in zumindest zwei Kompartimente;
Einstellen (105) einer Reaktionsbedingung für das in die zumindest zwei Kompartimente aufgeteilte Fluid, um jeweils eine Reaktion in den zumindest zwei Kompartimenten zu ermöglichen und je ein Reaktionsergebnis (532) zu erhalten;
Erkennen (110) einer Stärke eines Signals (530), das Reaktionsergebnisse (532) der in den Kompartimenten erfolgten Reaktionen repräsentiert; und
Auswerten (115) des Signals (530), um die Kopienanzahl unter Berücksichtigung einer reaktionsspezifischen Nachweiswahrscheinlichkeitsfunktion zu ermitteln, welche die Wahrscheinlichkeit für das Ablaufen einer Amplifikationsreaktion in einem Kompartiment in Abhängigkeit von der initial in dem Kompartiment vorliegenden Kopienanzahl angibt.
2. Verfahren (100) gemäß Anspruch 1, wobei im Schritt (115) des Auswertens für die Ermittlung der Kopienanzahl eine Binomialverteilungsfunktion für eine statistische Beschreibung der Verteilung der (initial vorliegenden) Kopien auf die Kompartimente verwendet wird.
3. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei im Schritt (110) des Erkennens die Stärke eines optischen Signals (530) erkannt wird.
4. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei im Schritt (115) des Auswertens das Fluid auf mehrere DNA-Sequenzen hin untersucht wird.
5. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei im Schritt (105) des Einstellens wenigstens ein zusätzlicher Reaktant in das Fluid gegeben wird.
6. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Schritt (105) des Einstellens zumindest teilweise erst nach dem Schritt (102) des Aufteilens erfolgt.
7. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei im Schritt (115) des Auswertens eine Amplifikationsreaktion verwendet wird, die eine Nachweisgrenze aufweist, die echt größer als 1 Kopie pro Reaktionskompartiment ist.
8. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei im Schritt (110) des Erkennens spektrale Information eines optischen Signals (530) erfasst wird.
9. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Schritt (110) des Erkennens zumindest ein Mal erneut ausgeführt wird, um zumindest ein weiteres Signal zu erkennen und aus den Signalen die Reaktionsergebnisse der in den Kompartimenten erfolgten Reaktionen unter Verwendung der Signale zu ermitteln.
10. Verfahren (100) gemäß Anspruch 9, wobei zwischen den Schritten (110) des Erkennens ein Zeitintervall variiert wird oder variabel ist, insbesondere wobei im Schritt (115) des Auswertens ein Zyklus, eine Temperatur und/oder Zeitintervall bestimmt wird, an dem ein Wert des optischen Signals (530), ein Anstieg des Werts des optischen Signals und/oder eine Änderungsrate des Werts des Anstiegs des optischen Signals (530) maximal wird.
11. Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei bei einem wiederholten Ausführen der Schritte (105, 110) des Verfahrens (100) ein Schritt (105) des Einstellens und ein Schritt (110) des Erkennens zumindest teilweise zeitlich parallel zueinander ausgeführt werden.
12. Verfahren (100) nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Schritt (102) des Aufteilens des Fluids unter Verwendung einer Aufnahmeeinheit mit Kavitäten erfolgt.
13. Steuergerät (500), das eingerichtet ist, um die Schritte (105, 110, 115) des Verfahrens (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche in entsprechenden Einheiten (505, 510, 515) auszuführen und/oder anzusteuern.
14. Computerprogramm, das dazu eingerichtet ist, die Schritte (105, 110, 115) des Verfahrens (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 auszuführen und/oder anzusteuern.
15. Maschinenlesbares Speichermedium, auf dem das Computerprogramm nach Anspruch 14 gespeichert ist.
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