DE102022207161A1 - Verfahren zum Quantifizieren einer Lösung und mikrofluidische Analysevorrichtung - Google Patents
Verfahren zum Quantifizieren einer Lösung und mikrofluidische Analysevorrichtung Download PDFInfo
- Publication number
- DE102022207161A1 DE102022207161A1 DE102022207161.1A DE102022207161A DE102022207161A1 DE 102022207161 A1 DE102022207161 A1 DE 102022207161A1 DE 102022207161 A DE102022207161 A DE 102022207161A DE 102022207161 A1 DE102022207161 A1 DE 102022207161A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- solution
- fluorescence
- local maximum
- function
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000009795 derivation Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- BUHVIAUBTBOHAG-FOYDDCNASA-N (2r,3r,4s,5r)-2-[6-[[2-(3,5-dimethoxyphenyl)-2-(2-methylphenyl)ethyl]amino]purin-9-yl]-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(C(CNC=2C=3N=CN(C=3N=CN=2)[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)C=2C(=CC=CC=2)C)=C1 BUHVIAUBTBOHAG-FOYDDCNASA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Ein Verfahren zum Quantifizieren einer ersten Lösung, welche mindestens eine Nukleinsäure enthält, umfasst ein Verdünnen (32) der ersten Lösung mit einer zweiten Lösung, die mindestens einen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff enthält, ein Durchführen (33) einer Fluoreszenzmessung an der ersten Lösung, um ein Fluoreszenzsignal zu erhalten, ein Durchführen einer vorgegebenen Anzahl von Wiederholungen der beiden vorhergehenden Schritte, ein Auftragen der Fluoreszenzsignale über einer Verdünnung der ersten Lösung, ein Fitten (42) einer Funktion an die Fluoreszenzsignale, ein Ermitteln (43) eines lokalen Maximums der Funktion oder ihrer ersten Ableitung, und ein Ermitteln (44) einer Konzentration der Nukleinsäure aus einem Fluoreszenzsignal, das vor dem lokalen Maximum liegt.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Quantifizieren einer Lösung, welche mindestens eine Nukleinsäure enthält. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine mikrofluidische Analysevorrichtung, die eingerichtet ist, um die Schritte des Verfahrens durchzuführen.
- Stand der Technik
- Zur Quantifizierung von DNA mittels interkalierendem Fluoreszenzfarbstoff wird der zu vermessenden DNA-Lösung eine definierte Menge des Fluoreszenzfarbstoffs, dessen Emission nach Interkalation oder Bindung von Nukleinsäuren deutlich zunimmt hinzugegeben, und dann die Fluoreszenzintensität gemessen. Häufig verwendete Fluoreszenzfarbstoffe hierbei sind Ethidiumbromid, Propidiumiodid, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), Cyaninfarbstoffe oder Cyanin-basierte Farbstoffe. Der gemessene Wert wird mit einem gleichermaßen gemessenen Standard verglichen und darüber die vorab unbekannte Menge an DNA ermittelt. Um zu gewährleisten, dass die Messung in einem Konzentrationsbereich erfolgt, in dem ein linearer Zusammenhang zwischen der DNA-Konzentration und der Fluoreszenzintensität besteht, wird zuvor die maximale und die minimale Menge an DNA definiert, welche mittels der Methode detektiert werden kann. Bei der Messung einer zu hoch konzentrierten Probe wird eine obere Grenze der Fluoreszenzintensität festgelegt. Wenn diese überschritten wurde, kann über die Intensitätsmessung nicht mehr direkt auf die Konzentration rückgeschlossen werden, da sie aus dem linearen Messbereich fällt.
- Die
EP 3 266 880 A1 beschreibt eine fluoreszenzbasierte Quantifizierung einer Zielnukleinsäure anhand eines Datensets einer quantitativen Amplifikation von Referenzproben und eines Datensets einer quantitativen Amplifikation der Zielnukleinsäure. Aus dem Datenset der Referenzproben wird eine Referenztabelle erzeugt, die zur Quantifizierung der Zielnukleinsäure herangezogen wird. Die Datensets beschreiben jeweils eine Kurve, die mit einer sigmoidalen Funktion gefittet wird. - Offenbarung der Erfindung
- In dem Verfahren zum Quantifizieren einer ersten Lösung, welche mindestens eine Nukleinsäure, insbesondere DNA, enthält, erfolgt zunächst ein Verdünnen der ersten Lösung mit einer zweiten Lösung, die mindestens einen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff enthält. Unter einem intekalierenden Fluoreszenzfarbstoff wird insbesondere ein Fluoreszenzfarbstoff verstanden, dessen Emission nach Interkalation oder Bindung von Nukleinsäuren zunimmt. Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe können insbesondere Ethidiumbromid, Propidiumiodid, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), Cyaninfarbstoffe oder Cyanin-basierte Farbstoffe sein. Dadurch wird nicht nur die Konzentration der Nukleinsäure in der ersten Lösung verringert, sondern sie wird zudem mit dem Fluoreszenzfarbstoff in Kontakt gebracht, sodass dieser in die Nukleinsäure interkalieren oder binden kann. Mechanismen, die zu so einem Verhalten führen, können sein: Versteifung der Molekülstruktur infolge Anbindung an das Nukleinsäuregerüst, wodurch weniger Vibrationsrelaxation und höhere Fluoreszenzquantenausbeuten entstehen und/oder Ladungsinduktion und stärkere Polarisierung durch Ankopplung an Nukleinsäuren (negativ geladene Nukleinbasen), wodurch höhere Dipolmomente für optische Übergänge mit der Folge stärkerer Absorption und Fluoreszenz (höhere Übergangsmatrixelemente) induziert werden. Anschließend erfolgt ein Durchführen einer Fluoreszenzmessung an der ersten Lösung, um ein Fluoreszenzsignal zu erhalten. Die Schritte des Verdünnens und des Durchführens der Fluoreszenzmessung werden mehrfach wiederholt, wobei die Anzahl der Wiederholungen vorgegeben ist. Nach jedem Verdünnen wird somit eine Fluoreszenzmessung an einer weniger konzentrierten Lösung der Nukleinsäure durchgeführt. Da die Konzentration der Nukleinsäure noch nicht bekannt ist, können die erhaltenen Fluoreszenzsignale noch keinen Konzentrationen der Nukleinsäure, sondern zunächst nur Verdünnungsstufen zugeordnet werden.
- Nachdem die vorgegebene Anzahl von Verdünnungen und Fluoreszenzmessungen durchgeführt wurde, werden die Fluoreszenzsignale über einer Verdünnung der ersten Lösung aufgetragen. Auf der Abszisse werden also eine erste Verdünnungsstufe, eine zweite Verdünnungsstufe und so weiter aufgetragen, während auf der Ordinate die der jeweiligen Verdünnungsstufe zuzuordnenden Fluoreszenzintensitäten aufgetragen werden. Anschließend wird eine Funktion an die Fluoreszenzsignale gefittet. Bei dieser Funktion kann es sich insbesondere um sigmoidale, polynomische, exponentielle/potentielle oder logarithimsche Funktionen handeln. Es wird ein lokales Maximum der Funktion oder ein lokales Maximum einer ersten Ableitung der Funktion ermittelt. Dabei ist insbesondere das lokale Maximum zu wählen, welches zu der höchsten Verdünnungsstufe am nächsten ist. Dieses wir im Folgenden als relevantes lokales Maximum bezeichnet. Eine Konzentration der Nukleinsäure wird dann aus einem Fluoreszenzsignal ermittelt, das vor dem lokalen Maximum, insbesondere vor dem relevanten lokalen Maximum, liegt. „Vor“ bedeutet hierbei, dass die Verdünnungsstufe des Fluoreszenzsignals, das zum Ermitteln der Konzentration verwendet wird, höher ist, als die Verdünnungsstufe des lokalen Maximums. Das Ermitteln kann dabei insbesondere durch Vergleich mit einem gleichermaßen gemessenen Standard erfolgen.
- Dieses Verfahren ermöglicht eine intrinsische Kontrolle darüber, welche Verdünnungsstufe optimal für eine Quantifizierung im linearen Bereich der Beziehung zwischen Nukleinsäurekonzentration und Fluoreszenzintensität liegt. Das Auftreten eines lokalen Maximums, insbesondere eines relevanten lokalen Maximums, der Funktion dient dabei als Indikator, um zu erkennen, dass der lineare Bereich verlassen wird. Das Verfahren ist also dazu geeignet, das Quantifizieren einer Lösung, welche eine Nukleinsäure enthält, in einem automatisierten, insbesondere mikrofluidischen System, vorzunehmen, in dem ein manuelles Verdünnen und anschließendes erneutes Vermessen der Lösung nicht möglich ist. Dieses Ziel könnte nicht in einfacherer Weise durch das Festlegen einer maximalen Fluoreszenzintensität erreicht werden, ab der von einem Verlassen des linearen Bereiches auszugehen ist, da es aufgrund von Interferenzen mancher Fluoreszenzfarbstoffe, zum Beispiel Fluorophore, zu geringeren Messwerten kommen könnte.
- Die Schritte des Verdünnens und des Durchführens der Fluoreszenzmessung werden vorzugsweise jeweils mindestens viermal wiederholt. Dadurch wird sichergestellt, dass ausreichend Fluoreszenzsignale zur Verfügung stehen, um zum einen die Funktion zu fitten und zum anderen einen für die Konzentrationsermittlung geeigneten Messwert unterhalb des lokalen Maximums aufzufinden.
- Das Ermitteln der Konzentration erfolgt vorzugsweise aus einem Fluoreszenzsignal, das mindestens zwei Verdünnungsstufen vor dem lokalen Maximum, insbesondere vor dem relevanten lokalen Maximum, liegt. Eine weitere vorzugsweise Ermittlung der Konzentration kann auch an derjenigen Verdünnungsstufe erfolgen, welche dem Punkt mit der höchsten positiven Steigung vor dem lokalen Maximum, insbesondere vor dem relevanten lokalen Maximum, am nächsten liegt. Bei Verwendung des Fluoreszenzsignals, das unmittelbar vor dem lokalen Maximum, insbesondere vor dem relevanten lokalen Maximum, liegt, bestände die Gefahr, dass dieses bereits außerhalb des Bereichs einer linearen Beziehung zwischen der Konzentration der Nukleinsäure und der Fluoreszenzintensität liegt. Ein noch weiter vor dem lokalen Maximum liegendes Fluoreszenzsignal würde bereits hingegen eine unnötig hohe Verdünnung aufweisen.
- In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das lokale Maximum der Funktion, insbesondere das relevante lokalen Maximum, aus einer ersten Ableitung der Funktion ermittelt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das lokale Maximum der ersten Ableitung der Funktion, insbesondere das relevante lokalen Maximum, aus der zweiten Ableitung der Funktion ermittelt.
- Wenn sich herausstellt, dass die Funktion und ihre erste Ableitung kein lokales Maximum, insbesondere kein relevantes lokales Maximum, aufweist, dann liegen alle gemessenen Fluoreszenzsignale im Bereich eines linearen Zusammenhangs zwischen der Nukleinsäurekonzentration und der Fluoreszenzintensität. In diesem Fall ist es bevorzugt, dass die Konzentration aus dem Fluoreszenzsignal der ersten Durchführung der Fluoreszenzmessung ermittelt wird, da die erste Lösung bei dieser Messung noch am wenigsten verdünnt ist.
- Das Verfahren kann zum Betreiben einer mikrofluidischen Analysevorrichtung verwendet werden, die eingerichtet ist, um die Schritte des Verfahrens durchzuführen. Hierzu weist die mikrofluidische Analysevorrichtung zum einen bauliche Mittel auf, um die Schritte des Verdünnens und des Durchführens der Fluoreszenzmessung wiederholt durchführen zu können. Zum anderen weist sie Mittel auf, um die Fluoreszenzsignale über der Verdünnung der ersten Lösung aufzutragen, eine Funktion an die Fluoreszenzsignale zu fitten, ein lokales Maximum der Funktion zu ermitteln und eine Konzentration der Nukleinsäure aus dem Fluoreszenzsignal, das vor dem lokalen Maximum liegt, zu ermitteln. Hierzu sind diese Verfahrensschritte insbesondere als Computerprogramm implementiert.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
- Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.
-
1 zeigt schematisch einen Teil einer mikrofluidischen Analysevorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. -
2 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. -
3 zeigt in einem Diagramm einen Zusammenhang zwischen einer DNA-Konzentration und einer Fluoreszenzintensität in einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. -
4a zeigt in einem Diagramm eine polynomische Funktion, die einen Zusammenhang zwischen einer DNA-Konzentration und einer Fluoreszenzintensität in einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wiedergibt. -
4b zeigt in einem Diagramm die erste Ableitung der polynomischen Funktion gemäß4a . - Ausführungsbeispiele der Erfindung
-
1 zeigt Elemente einer mikrofluidischen Analysevorrichtung 10 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Diese Elemente sind teilweise in einer Fluidikschicht einer mikrofluidischen Kartusche angeordnet und teilweise in einem Analysegerät angeordnet, welches die mikrofluidische Kartusche aufnimmt. In der Fluidikschicht ist ein erster mikrofluidischer Kanal 11 angeordnet, der in einer ersten mikrofluidischen Kammer 12 mündet. Er ist dazu eingerichtet, um eine erste Lösung 21 in die erste mikrofluidische Kammer 12 zu transportieren. Bei der ersten Lösung 21 handelt es sich um eine wässrige Lösung von DNA in einem Puffermedium. Die Konzentration der DNA ist unbekannt. Über einen zweiten mikrofluidischen Kanal 13 ist die erste mikrofluidische Kammer 12 mit einer zweiten mikrofluidischen Kammer 14 verbunden. In der zweiten mikrofluidischen Kammer 14 ist eine zweite Lösung 22 bevorratet. Die zweite Lösung 22 enthält einen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff (beispielsweise enthalten in der Qubit™ 1X dsDNA HS Working Solution von Thermo Fisher Scientific). Die erste mikrofluidische Kammer 12 weist ein transparentes Fenster auf, oberhalb dessen ein Fluoreszenzsensor 15 des Analysegeräts angeordnet ist. Der Fluoreszenzsensor 15 verfügt über eine Lichtquelle, um Fluoreszenz in der ersten Lösung 21 anzuregen, und über einen Sensor, um die Fluoreszenzantwort zu detektieren. Er ist mit einem elektronischen Rechengerät 16 verbunden, das außerdem mit einem nicht dargestellten Pneumatikmanifold des Analysegeräts verbunden ist. Über das Pneumatikmanifold kann eine Pneumatikschicht der Kartusche angesteuert werden, um so Flüssigkeitsströme in der Fluidikschicht zu steuern. - In
2 ist der Ablauf eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung dargestellt. Dieses ist als Computerprogramm im elektronischen Steuergerät 16 implementiert. Nach dem Start 30 des Verfahrens erfolgt zunächst ein Vorlegen 31 der ersten Lösung 21 in der ersten mikrofluidischen Kammer 12, in dem diese durch den ersten mikrofluidischen Kanal 11 in diese hineingepumpt wird. Anschließend erfolgt ein Verdünnen 32 der ersten Lösung 21 mit der zweiten Lösung 22, wobei das Verdünnungsverhältnis im vorliegenden Ausführungsbeispiel 1:2 beträgt. Das Verdünnen erfolgt, indem ein Teil der in der zweiten mikrofluidischen Kammer 14 bevorrateten zweiten Lösung 22 durch einen zweiten mikrofluidischen Kanal 13 in die erste mikrofluidische Kammer 12 gepumpt wird. Anschließend erfolgt ein Durchführen 33 einer Fluoreszenzmessung an der ersten Lösung 21 mittels des Fluoreszenzsensors 15. Die Verfahrensschritte 32 und 33 werden so oft wiederholt, bis eine Prüfung 34 ergibt, dass sechs Verdünnungen der ersten Lösung durchgeführt wurden und sechs Fluoreszenzsignale aufgenommen wurden. - Nun erfolgt ein Auftragen 41 der Fluoreszenzsignale über eine Verdünnung der ersten Lösung.
3 zeigt in einem Diagramm den Zusammenhang zwischen der Konzentration C von DNA in der ersten Lösung 21 und den gemessenen Fluoreszenzintensitäten I in relativen Einheiten (RFU = relative fluorescence unit). Es ist erkennbar, dass nur für die drei niedrigsten Konzentrationen ein linearer Zusammenhang zwischen der Konzentration C und der Fluoreszenzintensität I besteht. Da die Konzentration C noch nicht bekannt ist, erfolgt die Auftragung stattdessen über Verdünnungsstufen. Dabei entspricht die größte in3 dargestellte Konzentration C von 5 ng/l der ersten Verdünnungsstufe und jede darauffolgende Halbierung der Konzentration C entspricht einer weiteren Verdünnungsstufe. - Nun erfolgt ein Fitten 42 einer polynomischen Funktion F an die Fluoreszenzsignale. Die gefittete Funktion F ist in
4a dargestellt. Es folgt ein Ermitteln 43 eines lokalen Maximums M der Funktion F, indem die erste Ableitung F` der Funktion F berechnet wird. Dies ist in4b dargestellt. Mittels einer gestrichelten Linie, welche die4b mit der4a verbindet, ist die Lage des Maximums M in der Funktion F in4a dargestellt. Alternativ wird ein lokales Maximum M` der ersten Ableitung F` der Funktion F berechnet. Dies kann durch Bilden der zweiten Ableitung erfolgen. - Es folgt nun eine Prüfung 44, ob ein lokales Maximum M oder M` gefunden wurde. Wenn dies wie in
4a und4b dargestellt ist, der Fall ist, dann folgt ein Ermitteln 45 der Konzentration C aus dem Fluoreszenzsignal I2, das vor dem lokalen Maximum M oder M` liegt. Die Beziehung zwischen der Fluoreszenzintensität I und der Konzentration C wird dabei durch eine Referenzmessung hergestellt. Eine Kammer mit der Referenzprobe ist ebenfalls in der Fluidikschicht der mikrofluidischen Kartusche angeordnet, in1 jedoch nicht dargestellt. - Sollte die Prüfung 44 ergeben, dass kein lokales Maximum M oder M` gefunden wurde, so erfolgt ein Ermitteln 46 der Konzentration C aus dem Fluoreszenzsignal der ersten Durchführung 33 der Fluoreszenzmessung.
- Nachdem die Konzentration C durch einen der Verfahrensschritte 45 oder 46 ermittelt wurde, wird das Verfahren beendet 47.
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
-
- EP 3266880 A1 [0003]
Claims (7)
- Verfahren zum Quantifizieren einer ersten Lösung (21), welche mindestens eine Nukleinsäure enthält, aufweisend die folgenden Schritte: a) Verdünnen (32) der ersten Lösung (21) mit einer zweiten Lösung (22), die mindestens einen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff enthält, b) Durchführen (33) einer Fluoreszenzmessung an der ersten Lösung (21), um ein Fluoreszenzsignal zu erhalten, c) Durchführen einer vorgegebenen Anzahl von Wiederholungen der Schritte a) und b), d) Auftragen (41) der Fluoreszenzsignale über einer Verdünnung der ersten Lösung, e) Fitten (42) einer Funktion (F) an die Fluoreszenzsignale, f) Ermitteln (43) eines lokalen Maximums (M, M') der Funktion (F) oder ihrer ersten Ableitung (F`), und g) Ermitteln (45) einer Konzentration (C) der Nukleinsäure aus einem Fluoreszenzsignal, das vor dem lokalen Maximum (M, M') liegt.
- Verfahren nach
Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte a) und b) jeweils mindestens viermal wiederholt werden. - Verfahren nach
Anspruch 1 oder2 , dadurch gekennzeichnet, dass das Ermitteln (44) der Konzentration aus einem Fluoreszenzsignal (I2) erfolgt, das mindestens zwei Verdünnungsstufen vor dem lokalen Maximum (M, M') liegt. - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis3 , dadurch gekennzeichnet, dass das lokale Maximum (M) der Funktion (F) aus der ersten (F`) Ableitung der Funktion (F) ermittelt wird. - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis4 , dadurch gekennzeichnet, dass das lokale Maximum (M`) der ersten (F`) Ableitung der Funktion (F) aus der zweiten (F") Ableitung der Funktion (F) ermittelt wird. - Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis5 , dadurch gekennzeichnet, dass ein Ermitteln (46) der Konzentration (C) aus einem Fluoreszenzsignal der ersten Durchführung der Fluoreszenzmessung erfolgt, wenn die Funktion (F) und ihre erste Ableitung (F`) kein lokales Maximum (M, M') aufweisen. - Mikrofluidische Analysevorrichtung (10), dadurch gekennzeichnet, dass sie eingerichtet ist, um die Schritte des Verfahrens nach einem der
Ansprüche 1 bis6 durchzuführen.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE102022207161.1A DE102022207161A1 (de) | 2022-07-13 | 2022-07-13 | Verfahren zum Quantifizieren einer Lösung und mikrofluidische Analysevorrichtung |
PCT/EP2023/066940 WO2024012839A1 (de) | 2022-07-13 | 2023-06-22 | Verfahren zum quantifizieren einer nukleinsäurelösung und mikrofluidische analysevorrichtung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE102022207161.1A DE102022207161A1 (de) | 2022-07-13 | 2022-07-13 | Verfahren zum Quantifizieren einer Lösung und mikrofluidische Analysevorrichtung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE102022207161A1 true DE102022207161A1 (de) | 2024-01-18 |
Family
ID=87036288
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE102022207161.1A Pending DE102022207161A1 (de) | 2022-07-13 | 2022-07-13 | Verfahren zum Quantifizieren einer Lösung und mikrofluidische Analysevorrichtung |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE102022207161A1 (de) |
WO (1) | WO2024012839A1 (de) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3266880A1 (de) | 2016-07-05 | 2018-01-10 | Credo Biomedical Pte Ltd. | Verfahren zur echtzeit-quantifizierung einer nukleinsäure |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014062741A1 (en) * | 2012-10-15 | 2014-04-24 | Dna Software, Inc. | Determining nucleic acid concentration by counting nucleic acid copies |
-
2022
- 2022-07-13 DE DE102022207161.1A patent/DE102022207161A1/de active Pending
-
2023
- 2023-06-22 WO PCT/EP2023/066940 patent/WO2024012839A1/de unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3266880A1 (de) | 2016-07-05 | 2018-01-10 | Credo Biomedical Pte Ltd. | Verfahren zur echtzeit-quantifizierung einer nukleinsäure |
US10510436B2 (en) | 2016-07-05 | 2019-12-17 | Credo Biomedical Pte Ltd. | Using serial dilutions of reference samples to construct a reference table for sigmoidal fitting in real-time PCR copy number analysis |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2024012839A1 (de) | 2024-01-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE60025400T2 (de) | Vorrichtung und verfahren zum kalibrieren eines abtastsystems für mikroarrays | |
EP2380008B1 (de) | Verfahren und system zur charakterisierung einer probe mittels bildgebender fluoreszenzmikroskopie | |
DE102009028295A1 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Parameters, insbesondere des chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) oder des organischen Gesamtkohlenstoffgehalts (TOC), einer Flüssigkeitsprobe | |
AT517366B1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung einer Materialeigenschaft eines Bitumenmaterials | |
DE102012217419B4 (de) | Analyseverfahren für Röntgenstrahlbeugungsmessdaten | |
DE112014002045T5 (de) | Nucleinsäure-Analysator und Nucleinsäure-Analyseverfahren unter Verwendung des Analysators | |
DE102015220322B4 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur automatisierbaren Ermittlung der Bestimmungsgrenze und des relativen Fehlers bei der Quantifizierung der Konzentration einer zu untersuchenden Substanz in einer Messprobe | |
DE102022207161A1 (de) | Verfahren zum Quantifizieren einer Lösung und mikrofluidische Analysevorrichtung | |
EP4016082B1 (de) | Verfahren und vorrichtung zum detektieren einer präsenz eines fluoreszenzmustertyps auf einem organschnitt mittels immunfluoreszenzmikroskopie | |
DE102018126183B4 (de) | Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines fluoreszierenden und/oder fluoreszenzmarkierten Analyten und Kalibrierverfahren zur Vorbereitung dieser Bestimmung | |
DE102016208967A1 (de) | Photometer mit quantitativer Volumenerfassung | |
DE3623052A1 (de) | Fluoreszenz-analysator | |
DE102020202358B4 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines qPCR-Verfahrens | |
EP1282724B1 (de) | Phenolfreie färbelösung für bakterien | |
DE102014106918A1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur automatisierten Durchführung von affinitätsbasierten Assays | |
DE102012024203A1 (de) | Verfahren zur Ermittlung der Sequenz von Biopolymeren | |
DE102022115328A1 (de) | Verfahren zum Entfernen des Hintergrunds einer Fluoreszenzlebenszeitmessung und Verfahren zum Quantifizieren einer Zielsubstanz | |
DE102020202360B4 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines qPCR-Verfahrens | |
DE112018005745T5 (de) | Fluorophor-Multiplexierung über PH-Modulation | |
WO2021170180A1 (de) | Verfahren und vorrichtung zur auswertung einer qpcr-kurve | |
EP3872445A1 (de) | Schichtdickenmessung durch auswertung des spektrums der fluoreszenzemission | |
EP4286852A1 (de) | Verfahren zum erkennen eines biofilms in geschlossenen anlagen | |
WO2021122979A1 (de) | Verfahren und vorrichtung zum ermitteln einer in einem fluid enthaltenen kopienanzahl einer dna-sequenz | |
DD301863A7 (de) | Verfahren zur Bestimmung natuerlicher und nichtnatuerlicher absorbierender Stoffe in waessrigen Medien | |
DE102022130251A1 (de) | Mikroskopanordnung und Verfahren zur Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R163 | Identified publications notified |