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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Zellzahl von eukaryotischen Zellen in einer Probe, bei dem mindestens eine spezifische Region im Genom mindestens einer Zelle oder eines Zelltyps identifiziert und mindestens eine Referenz-DNA bereitgestellt wird, wobei die Anzahl der Zellen mittels der Referenz-DNA berechnet wird.
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Für viele Anwendungen in der klinischen Diagnostik, beispielsweise bei der Erstellung von Blutbildern, ist die relative Quantifizierung von Zelltypen von besonderer Bedeutung. Die Bestimmung der zellulären Zusammensetzung von Blutproben und hierbei insbesondere das Differentialblutbild, d. h. die Bestimmung der Zusammensetzung der weißen Blutkörperchen (Leukozyten) im Blut, ist eine der häufigsten diagnostischen Testverfahren und somit eine Routineuntersuchung in der medizinischen Labordiagnostik. Ein Differentialblutbild kann beispielsweise durch mikroskopische Untersuchung der Blutprobe und manuelles Zählen der Zellen erstellt werden. Die Bestimmung der Zellzahl ist aber auch bei vielen anderen diagnostischen und zellbiologischen Verfahren notwendig. Hierfür stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung, die insbesondere auf Bildgebung oder Durchfluss-Zytometrie (Impedanz- oder Streulichtmethoden) beruhen. Diese automatischen Zellzähler erfassen beispielsweise die elektrische Impedanz, die optischen Auswirkungen der Lichtstreuung oder die Intensität von Fluoreszenz-Signalen. Alternative Messungen beruhen auf Zählkammern, automatisierten optischen Zellzählungen, oder Messungen des elektrischen Widerstands (CASY).
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Neben Verfahren, die eine Quantifizierung von zellulärem Material auf Basis der Zählung einzelner Zellen ermöglichen, werden vor allem auch unterschiedliche durchflusszytometrische Verfahren eingesetzt, die eine Quantifizierung von Zellen beispielsweise mit Hilfe von Referenzkügelchen in bestimmter Konzentration erlauben. Diese Methoden haben jedoch den Nachteil, dass zuvor eine arbeitsintensive Aufarbeitung der zu messenden Probe durchgeführt werden muss, die beispielsweise aufwändige Schritte wie Zentrifugieren, Filtrieren und/oder Sedimentieren umfassen kann. Ferner nutzen viele optische Durchfluss-Zytometer das Prinzip der Fluoreszenz- oder Streulichtmessung. Beide Messmethoden erfordern zur Zählung einzelner Zellen aber den Einsatz speziell vorbereiteter und gereinigter Blutproben. Beispielsweise ist es zur Vorbereitung einer Blutprobe erforderlich, eine Hämolyse der Erythrozyten und eine spezifische Markierung der Zellen vorzunehmen. Die Probenvorbereitung ist folglich sehr zeitaufwendig, so dass mittels optischer Durchfluss-Zytometrie weder schnelle noch kostengünstige Zellzahlbestimmungen in einer komplexen Probe durchgeführt werden können.
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Die oben genannten Verfahren der Zellzahlbestimmung benötigen relativ frisches Material, bei dem die Zellen lebend und möglichst vereinzelt vorliegen. Zuverlässige Bestimmungen von Zellzahlen in Geweben (z.B. von Stanzzylindern von Biopsien mit definierten Volumen, Zellen in 3D-Tissue-Engineering Gewebekonstrukten oder embryologischen Entwicklungen bei verschiedenen Organismen) oder koagulierten Blutproben sind somit kaum möglich. In der Regel benötigen diese Verfahren aufgrund der Schlauchsysteme ferner ein bestimmtes Mindestvolumen. Außerdem müssen die Proben frisch analysiert werden. Es kann aber im Laufe des Probenversands zu einem Großlabor oder durch verzögerte Messungen zu einem vermehrten Zellsterben kommen, so dass die Zellzahl entsprechend zu niedrig geschätzt würde. Die Autolyse beginnt bereits nach wenigen Stunden und betrifft zunächst insbesondere die Granulozyten. Ein Versand von Blutproben im gefrorenen Zustand ist bisher nicht möglich, da die Zellen dabei lysiert werden. Zudem bestehen bei allen Messverfahren Messungenauigkeiten, die eine Validierung mit einem anderen Verfahren unter Umständen sinnvoll machen. Bei sehr kleinen Zellmengen (z.B. Liquordiagnostik) oder bei sehr kleinen Probenmengen ist die Analyse nicht mit allen Verfahren möglich.
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Aus der
DE 10 2017 004 108 A1 ist aber ein alternatives Verfahren bekannt, welches auf der Analyse der DNA-Methylierung beruht. Dabei werden genomische Bereiche adressiert, die in den zu untersuchenden Blutzellen grundsätzlich methyliert sind. Das Verfahren umfasst die Identifikation eines Chromatinbereichs, der in den unterschiedlichen Blutzellen zuverlässig methyliert ist, und die Bereitstellung einer unmethylierten Referenz-DNA, die beispielsweise durch PCR hergestellt werden kann. Mittels dieses bekannten epigenetischen Verfahrens kann eine Bestimmung der Zellzahl auch an koagulierten Blutproben und gefrorenem Material durchgeführt werden.
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Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung der Zellzahl von eukaryotischen Zellen in einer Probe bereitzustellen, mit dem auch Zellzahlen in Geweben bestimmt werden können und das bei unterschiedlichsten Zelltypen beim Menschen und anderen Organismen sicher anwendbar ist.
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Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Bestimmung der Zellzahl von eukaryotischen Zellen in einer Probe gelöst, welches umfasst:
- - Identifizieren mindestens einer spezifischen Region im Genom mindestens einer Zelle oder eines Zelltyps, wobei die spezifische Region eine konservierte genomische Region ist;
- - Bereitstellen mindestens einer Referenz-DNA, die mindestens eine Referenz-Nukleotidsequenz umfasst, die mit der Sequenz der spezifischen Region mit Ausnahme mindestens eines Nukleotidaustauschs identisch ist;
- - Einbringen einer vorbestimmten Menge der Referenz-DNA in die Probe;
- - Quantifizieren der DNA der spezifischen Region und der Referenz-DNA; und
- - Berechnen der Anzahl der Zellen basierend auf dem Verhältnis der genomischen DNA der zu testenden Zellen und der Referenz-DNA.
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Erfindungsgemäß wird zur Bestimmung der Zellzahl, unabhängig von epigenetischen Veränderungen, eine Referenz-DNA verwendet, die eine von der entsprechenden zellulären Sequenz in einem oder mehreren Nukleotiden abweichende Sequenz aufweist. Vor der Quantifizierung der DNA werden die Zellen mit dieser Referenz-DNA in bekannter Konzentration versetzt. Dabei sollte die Konzentration vorzugsweise ungefähr der zu erwarteten Zellzahl entsprechen. Durch die Quantifizierung lässt sich das Verhältnis von zellulärer DNA und Referenz-DNA relativ genau bestimmen, z.B. mittels digitaler PCR, Pyrosequenzierung oder Amplikon-Sequenzierungsverfahren. Im Vergleich mit einer Referenzkurve kann dann daraus die Zellzahl bestimmt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich grundsätzlich für die Zellzahlbestimmung unterschiedlichster Zelltypen und unterschiedlichster Spezies umsetzen. Allerdings muss für jede Spezies eine entsprechende Referenz-DNA generiert werden. Im Gegensatz zu dem epigenetischen Verfahren gemäß
DE 10 2017 004 108 A1 ist das erfindungsgemäße Verfahren für unterschiedlichste humane Zelltypen sicher anwendbar. Auch die Zellen anderer Organismen können mit einer entsprechenden Referenz-DNA unabhängig von epigenetischen Veränderungen quantifiziert werden. Im Gegensatz zu konventionellen Verfahren können die Proben auch gefroren gelagert oder versendet werden, da lediglich der DNA-Gehalt im Verhältnis zum Volumen bestimmt wird. Dabei wird zunächst eine Referenz-DNA erstellt, die grundsätzlich die gleiche Sequenz aufweist wie eine konservierte genomische Region in den zu testenden Zellen, die allerdings in einer oder mehreren Basen einen Sequenzunterschied aufweist. Die optimale Anzahl der Austausche hängt dabei von der Art des Analyseverfahrens ab. Für dPCR haben sich beispielsweise 2-10, vorzugsweise 2-8 oder 2-6, insbesondere 2-5, 3-5 oder 2-4 Austausche im Bereich der Bindungsstelle der Sonde als vorteilhaft herausgestellt, da ein einzelner Austausch ggf. immer noch unspezifische Bindungen zulässt. Eine Höchstgrenze für die Sequenzunterschiede gibt es theoretisch nicht, wobei es möglicherweise eher zu einem PCR-Bias kommt, wenn die beiden Sequenzen sehr unterschiedlich wären. Die Referenz-DNA (z.B. ca. 100 Basenpaare) kann beispielsweise synthetisch, mittels PCR oder als Plasmid-DNA, erstellt werden. Von Vorteil ist dabei, wenn die DNA-Konzentration der Referenz-DNA genau bestimmt werden kann.
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Aus der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich ferner die folgenden weiteren Vorteile:
- - Die Proben können vor der Analyse tiefgefroren werden;
- - Zellzahlen können in Geweben bestimmt werden;
- - Sehr kleine Probenmengen reichen aus (theoretisch < 10 µl);
- - Einfache Analyse;
- - Isolierte DNA kann zu Analysezwecken sehr leicht versendet werden;
- - Es ist keine Bisulfitbehandlung notwendig;
- - Aufgrund der Sequenz ist eine eindeutige Zuordnung (Referenz-DNA versus zelluläre DNA) möglich;
- - Im Hochdurchsatzverfahren kann das erfindungsgemäße Verfahren sehr kostengünstig durchgeführt werden.
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In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass zwei oder mehr unterschiedliche Referenz-DNAs in die Probe eingebracht werden, wobei die Referenz-DNAs unterschiedlichen spezifischen Regionen entsprechen. Durch die Verwendung von mehreren unterschiedlichen Referenz-Sequenzen kann ein breiteres Spektrum von Zellzahlen zuverlässig abgedeckt werden. Außerdem kann durch die parallele Bestimmung verschiedener spezifischer genomischer Regionen eine weitere Validierung und zusätzliche Genauigkeit erreicht werden.
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In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist ferner vorgesehen, dass die Referenz-DNA jeweils der Sequenz einer bestimmten Spezies entspricht, die sich von anderen Spezies abgrenzt. Dies wäre für den Fall vorteilhaft, dass humane und andere Zellen gemischt vorliegen, z.B. Zellen auf murinen Feederzellen.
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In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Referenz-DNA in unterschiedlichen Konzentrationen in die Probe eingebracht wird. Die Referenz-DNAs können beispielsweise im Vorfeld in unterschiedlichen Konzentrationen gemischt werden und dann als „Leiter“ mit einem Aliquot der Probe versetzt werden.
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Die Berechnung der Anzahl der Zellen kann beispielsweise derart erfolgen, dass unterschiedliche Referenz-DNAs in unterschiedlicher Konzentration der Probe zugefügt werden, um einen größeren Bereich abzudecken. D. h., um den Messbereich zu verbreitern, können weitere Referenz-DNAs zugesetzt werden, die andere Sequenzmodifikationen aufweisen. Durch den Einsatz unterschiedlicher Konzentrationen der Referenzmoleküle kann in vorteilhafter Weise eine Referenzkurve erstellt werden, mittels der dann die Zellzahl präzise bestimmt werden kann. Hierdurch kann auch die Konzentration der Referenzmoleküle ermittelt werden, die ungefähr der zu erwarteten Zellzahl entspricht und somit die höchst mögliche Genauigkeit der Messung gewährleistet. Alternativ kann die Kopienzahl der Referenz-DNA auch berechnet und die Zellzahl somit auch ohne Referenzkurve bestimmt werden. Mit beiden Methoden kann also beispielsweise die Referenz-DNA-Konzentration bestimmt werden, die einer gleichen Kopien-Zahl der Referenz-DNA und der genomischen (zellulären) DNA entspricht. Grundsätzlich sollte die Menge an Referenzmolekülen in etwa der erwarteten Kopienzahl der genomischen DNA entsprechen, da die Sensitivität in diesem Messbereich am höchsten ist. Darüber hinaus kann durch die Verwendung von unterschiedlichen Referenzmolekülen in aufsteigenden Konzentrationen ein breites Spektrum von Zellzahlen zuverlässig abgedeckt werden. Beispielsweise kann die Menge der Referenz-DNA derart eingestellt sein, dass das Verhältnis der Anzahl an Referenzmolekülen zur ungefähr erwarteten Anzahl der Zellen annähernd 2:1 ist. Unter der Voraussetzung, dass die zu analysierenden Zellen jeweils zwei Kopien ihrer DNA-Moleküle enthalten, entspricht dieses Verhältnis einer gleichen Kopien-Zahl der Referenz-DNA und der genomischen (zellulären) DNA, so dass bei dieser Ausführungsform die höchstmögliche Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens gewährleistet ist.
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Es könnten beispielsweise auch zwei oder mehr unterschiedliche Referenz-DNAs in die Probe eingebracht werden, wobei die Referenz-DNAs der gleichen spezifischen Region entsprechen, aber unterschiedliche Nukleotidaustausche umfassen. Auf diese Weise ließe sich beispielsweise das Verhältnis der Referenz-DNAs zueinander berechnen.
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In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist ferner vorgesehen, dass die spezifische Region eine konservierte Region ohne Repeats und/oder Single Nucleotide Polymorphismus, vorzugsweise eine nicht transkribierte Region, umfasst. Es sollte also in vorteilhafter Weise ein konservierter Bereich ohne Repeats und Single Nucleotide Polymorphismus (SNP) gewählt werden, z.B. eine Promotor-Region eines Gens.
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In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist auch vorgesehen, dass die DNA vor dem Quantifizieren aus der Probe isoliert wird. Für die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorteilhaft, wenn sich die gesamte DNA der Probe weitgehend extrahieren lässt. Da jedoch bei der DNA-Isolation zwangsläufig starke Abweichungen entstehen, ist die Messung der DNA-Konzentration nicht zuverlässig möglich. Im Gegensatz dazu kann die Referenz-DNA mit genau eingestellter Konzentration der Probe zugesetzt werden, die dann bei der DNA-Isolation den gleichen Schwankungen in der DNA-Isolation unterworfen ist. Die Mischung der Referenz-DNA mit der Probe erfolgt also vorzugsweise vor der DNA-Isolation, um Schwankungen in der DNA-Isolation auszugleichen.
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Nach der DNA-Isolation lässt sich das Verhältnis von zellulärer DNA und Referenz-DNA relativ genau bestimmen, z.B. mittels quantitativer PCR Verfahren (insbesondere digitaler PCR), Pyrosequenzierung oder Amplicon Deep Sequencing - Verfahren.
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Erfindungsgemäß wird die Aufgabe ferner durch ein Nukleinsäuremolekül gelöst, das mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der Sequenz einer konservierten Region im Genom mindestens einer Zelle oder eines Zelltyps mit Ausnahme mindestens eines Nukleotidaustauschs identisch ist, zur Verwendung in dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren. Beispielsweise kann/können eine/mehrere der Referenz-DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NOs: 1 bis 7 gemäß Tabelle 1 für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.
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Die Erfindung umfasst auch ein Kit, welches mindestens ein solches Nukleinsäuremolekül und optional mindestens ein Oligonukleotid zum Amplifizieren und/oder Quantifizieren mindestens eines Nukleinsäuremoleküls umfasst. Dieses Kit kann zur Bestimmung der Zellzahl von eukaryotischen Zellen in einer Probe verwendet werden. Beispielsweise kann ein solches Kit eine oder mehrere der Referenz-DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NOs: 1 bis 7 (Tabelle 1) und/oder eine oder mehrere der Primer/Sonden gemäß SEQ ID NOs: 8 bis 35 (Tabelle 1) umfassen.
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Zusätzlich kann ein solches Kit mindestens eine Pufferlösung und/oder ein Reagenz zur Durchführung eines oder mehrerer der folgenden Verfahren umfassen:
- DNA-Amplifizierung, DNA-Sequenzierung, beispielsweise Pyrosequenzierung, digitale Tröpfchen PCR, barkodierte Bisulfit-Amplikon-Sequenzierung (BBA-seq), barkodierte Amplicon-Sequenzierung, „Mass Array®“ und „SNP-Genotyping“.
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Eine Vermehrung der Referenz-DNA kann beispielsweise durch Einbringen der Referenz-Nukleotidsequenz in mindestens eine prokaryotische Zelle, Vermehren der Nukleotidsequenz in der prokayotischen Zelle und Isolieren mindestens eines DNA-Moleküls, das mindestens eine Referenz-Nukleotidsequenz umfasst, aus der prokaryotischen Zelle durchgeführt werden. Das Referenzmolekül kann also beispielsweise in E. coli amplifiziert (z.B. in Form eines Plasmids) und dann aufgereinigt werden. In einem optimierten Verfahren kann die Plasmid-DNA vor dem Einsatz als Referenz-DNA mit einem Restriktionsenzym literarisiert werden.
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Alternativ kann die Referenz-DNA in vitro vermehrt oder synthetisiert werden, vorzugsweise mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Auf diese vorteilhafte Weise kann die Referenz-DNA schnell und zuverlässig hergestellt werden. Das PCR-Produkt könnte beispielsweise als selbstständiger DNS-Doppelstrang oder als klonierte Plasmid-DNA als Standard verwendet werden.
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Die Erfindung betrifft ferner mindestens ein künstliches Nukleinsäuremolekül, das mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
- a) mindestens einer Nukleotidsequenz, die mindestens eine Sequenz der Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 35 (siehe Tabelle 1) umfasst,
- b) mindestens einer Nukleotidsequenz, die zu mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, mit der Nukleotidsequenz gemäß a) identisch ist und
- c) mindestens einer Nukleotidsequenz, die dem zu einer der Nukleotidsequenzen gemäß a) oder b) komplementären Strang entspricht.
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Die erfindungsgemäßen künstlichen Nukleinsäuremoleküle können ferner in vorteilhafter Weise zur Herstellung des Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.
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Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls und/oder des erfindungsgemäßen künstlichen Nukleinsäuremoleküls und/oder des erfindungsgemäßen Kits zur Bestimmung der Zellzahl von eukaryotischen Zellen in einer Probe, d. h. zur absoluten Quantifizierung von Zellen oder Zelltypen.
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Sowohl das erfindungsgemäße Verfahren als auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle und Kits können grundsätzlich für die Zellzahlbestimmung unterschiedlichster Zelltypen in verschiedenen Anwendungsbereichen eingesetzt werden. Insbesondere sind diese beispielsweise auch für die Bestimmung der Anzahl kernhaltiger Zellen im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten (Liquor, Urin etc.) geeignet. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise die Anzahl der kernhaltigen Blutzellen zuverlässig bestimmt werden. Zellzahlen werden routinemäßig in Blutproben mittels durchflusszytometrischen Messverfahren bestimmt. Allerdings ist die Bestimmung nicht in allen Blutproben möglich (beispielsweise aufgrund von Koagulation oder zu kleinem Blutvolumen) und kann an älteren Blutproben nicht mehr zuverlässig durchgeführt werden. Die Proben müssen für die Analyse frisch versendet und zeitnah gemessen werden. Im Gegensatz dazu kann die erfindungsgemäße Bestimmung der Zellzahl auch an Blutproben erfolgen, in denen die Zellen nicht mehr vereinzelt sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ist darüber hinaus auch in Kombination mit anderen Methoden sinnvoll, da ohne großen Mehraufwand eine quantitative Information gewonnen wird, während ansonsten nur relative Verhältnisse der hämatopoetischen Zelltypen ermittelt werden können. Im Hochdurchsatzverfahren kann das erfindungsgemäße Verfahren ferner sehr kostengünstig durchgeführt werden. Die Messgenauigkeit ist dabei mit der Genauigkeit konventioneller Methoden vergleichbar.
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Eine „konservierte genomische Region“ im Sinne der Erfindung bezeichnet einen Sequenzabschnitt im Genom einer Zelle (DNA), die eine Nukleotidsequenz umfasst, welche im Lauf der Evolution weitgehend unverändert erhalten wurde, d.h. keine oder nur minimale Änderungen der Sequenz erfahren hat. Der Begriff umfasst insbesondere auch nicht-kodierende DNA-Sequenzen, wie Introns oder Promotorsequenzen.
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Die Erfindung wird im Weiteren anhand der folgenden Abbildungen und vorteilhaften Ausführungsformen beispielhaft näher erläutert.
- 1 zeigt ein exemplarisches Bild eines Ergebnisses einer digitalen Tröpfchen-PCR (ddPCR). X-Achse: Referenz, Y-Achse: Blut
- 2 zeigt ein Diagramm zur Auswertung der Ergebnisse der positiven Tröpfchen für genomische DNA bzw. Referenz-DNA, um das Verhältnis dieser DNA-Stränge im Ausgangsmaterial zu bestimmen. 150 µl Blut wurden dazu mit verschiedenen Konzentrationen der Referenz-DNAs (R2 und R3 gemäß Tabelle 1) versetzt.
X-Achse: Verdünnung oder Referenz-DNA
Y-Achse: Verhältnis von Blut zur Referenz-DNA
- Figure 3 zeigt ein Diagramm zur Bestimmung des Verhältnisses von Blut-DNA zur Referenz-DNA bzw. der Kopienzahl. Unterschiedliche Mengen der Referenz DNAs (R2-R6, R8 und R9 gemäß Tabelle 1) wurden dazu mit 150 µl Blut vermischt.
X-Achse: Kopienzahl (Verhältnis von Blut zur Referenz)
Y-Achse: Menge der eingesetzten Referenz-DNA
- 4 zeigt Diagramme eines Beispiels der Quantifizierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) mittels digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR).
- (A) X-Achse: log Zellzahl, Y-Achse: log MSC, Zellzahl ddPCR
- (B) X-Achse: log Neubauer Zellzahl, Y-Achse: log MSC (humanen mesenchymalen Stammzellen), Zellzahl ddPCR
- 5 zeigt Diagramme eines Beispiels der Zellzahlbestimmung in humanen Blutproben mittels digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR).
- (A) X-Achse: Blutzellen, automatischer Zähler, Y-Achse: Blutzellen ddPCR
- (B) Logarithmische Darstellung der Daten gemäß A.
X-Achse: log Blutzellen, automatischer Zähler
Y-Achse: log Blutzellen ddPCR
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Exemplarisch wurden für das Design der Referenz-DNAs neun genomische Bereiche ausgewählt. Diese Sequenzen haben keine homologen Abschnitte im Genom und eignen sich für das Design der ddPCR Primer. Bevorzugt sollen sie nicht in translatierten Gensequenzen liegen, da eine Beeinflussung durch RNA nicht sicher ausgeschlossen werden kann. Von den neun initialen Sequenzen haben sich sieben Sequenzen bewährt, die in Tabelle 1 aufgeführt sind. Diese Sequenzen wurden bereitgestellt, mittels Restriktionsenzymen in das Plasmid pBR322 kloniert und in E. coli amplifiziert. Die Plasmid-DNA wurde isoliert und quantifiziert. Diese Referenz-DNAs werden entweder einzeln eingesetzt oder kombiniert in verschiedenen Konzentrationen als Referenz-Leiter verwendet. Eine bestimmte Menge dieser Referenz-DNA wird der Zellprobe (z.B. 150 µl Blut) zugesetzt. Anschließend wird eine digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) durchgeführt (1). Die Ergebnisse der positiven Tröpfchen für genomische DNA bzw. Referenz-DNA werden mittels Poisson-Statistik ausgewertet, um das Verhältnis dieser DNA-Stränge im Ausgangsmaterial zu bestimmen (2). In den ddPCR Messungen wurde daraufhin das Verhältnis von Blut-DNA zu Referenz-DNA bestimmt. Daraus kann auf die Zellzahl zurückgeschlossen werden. Die Daten zeigen sowohl für die Verdünnungen als auch mit beiden Referenz-Plasmiden sehr konsistente Ergebnisse. Falls bei großen Zellzahlschwankungen erforderlich, oder als zusätzliche interne Kontrolle, kann auch die Messung einer weiteren Referenz-DNA einbezogen werden, da diese zusätzliche Sequenz das Verfahren nicht stört (3). Unterschiedliche Mengen der Referenz-DNAs wurden mit einem bestimmten Volumen Blut vermischt. Anschließend wurde das Verhältnis von Blut-DNA zu Referenz-DNA bestimmt. Die Messungen zeigen eine klare Korrelation, ohne dass die unterschiedlichen Plasmide die Messung beeinträchtigen.
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10-fach Verdünnungsreihen von drei MSC-Spendern (MSC1 - MSC3) wurden jeweils mit der gleichen Menge der Referenz-DNA R5 gemischt (0.0000897 ng) und mittels ddPCR gemessen, um die Zellkonzentration abzuschätzen (Zellen/µl). Die mittels ddPCR berechneten Zellkonzentrationen wurden mit einer Zellkonzentration korreliert, die mittels Neubauer-Zählung für die initiale Verdünnung ermittelt wurde (4 A). Die mittels ddPCR berechneten Zellkonzentrationen wurden mit Zellkonzentrationen korreliert, die mittels Neubauer-Zählung für jede Verdünnung ermittelt wurden (die herkömmliche Zählmethode war bei sehr geringen Zellzahlen (Zell-Verdünnungen kleiner als 10 Zellen/µl) nicht anwendbar (4 B).
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40 Blutproben (150µl) wurden jeweils mit der gleichen Menge der Referenz-DNA
R6 (0,01282 ng) und der gleichen Menge der Referenz-DNA
R5 (0.0038943 ng) gemischt und dann mittels ddPCR gemessen, um die Zellkonzentration abzuschätzen (Zellen/µl). Die mittels ddPCR berechnete Zellkonzentration wurde mit einer Zellkonzentration korreliert, die mittels eines automatischen Zellzählers ermittelt wurde (
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102017004108 A1 [0005, 0008]
