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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft im Allgemeinen biochemische Analysen und, genauer
gesagt, die quantitative Analyse von Nukleinsäureproben wie DNA in einem
Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahren.
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Beschreibung
des Standes der Technik
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Die
Echtzeitbeobachtung einer DNA Amplifikation während des PCR-Verfahrens wird
durch Higuchi et al., Bio/Technology Bd. 11, Seiten 1026–1030 beschrieben.
In diesem Artikel beschreiben Higuchi et al. einen quantitativen
Assay für
eine amplifizierbare DNA-Zielsequenz, der die Anzahl der Temperaturzyklen,
die notwendig sind, um eine bestimmte Konzentration der Zielsequenz
zu erreichen, mit der Menge der Ziel-DNA korreliert, die zu Beginn
des PCR-Verfahrens vorhanden ist.
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Durch
Messung der Fluoreszenz der Proben während eines jeden Zyklus der
PCR wurde herausgefunden, dass die Anzahl der Zyklen, die notwendig
sind, um eine vorgewählte
Menge an Fluoreszenz zu erhalten, direkt mit der Konzentration der
amplifizierbaren Zielmoleküle
zu Beginn des PCR-Verfahrens variiert. In diesem Assay wurde eine
CCD-Kamera mit einem 600 nm langen Durchlassfilter auf eine Anordnung
von Wells gerichtet, die jeweils eine Reaktionsmischung enthalten.
Die Reaktionsmischungen umfassten Ethidiumbromid, einen Farbstoff,
der stark bei Wellenlängen
um 600 nm herum fluoresziert, wenn er in doppelsträngige DNA
interkaliert, jedoch nur sehr schwach, wenn er in freier Lösung vorliegt.
Die Anordnung der Mischungen wurde mit UV-Licht bei ungefähr 302 nm
geflutet, was Ethidiumbromid anregt. Die Anordnung der Proben wurde
alternierenden Denaturierungstemperaturen und Annealing-/Verlängerungstemperaturen,
d. h. thermischen Zyklen, für
eine ausreichende Anzahl von Zyklen ausgesetzt, um eine wesentliche
Amplifikation der Zielmoleküle
zu erreichen. Die Fluoreszenzintensitäten wurden durch die CCD während des
Annealing-/Verlängerungszeitraums
von jedem Zyklus nachgewiesen und die Ergebnisse der Kamera wurden
zur Speicherung und Datenverarbeitung in einen Computer überführt. Das
Kameraergebnis war im Wesentlichen ein Videobild, das jeweils zur
gleichen Zeit während
jedem Annealing-/Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus aufgenommen wurde.
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Die
Daten wurden dann in ein konventionelles Tabellenkalkulationsprogramm
in dem Computer zur Normalisierung und Bearbeitung der resultierenden
Intensitätswerte
für jedes
Well eingegeben. Jedes der Wells enthielt eine unterschiedliche
anfängliche
Konzentration der Zielnukleinsäuremoleküle. Genauer
gesagt, die Amplifikationen wurden mit einer Verdünnungsserie
von einzelsträngiger
HIV Template DNA eingeleitet. Beginnend mit 108 Templates
wurden 10-fache Verdünnungen
bis runter zu 102 Templates durchgeführt. Es wurden
HIV-spezifische Primer verwendet, um ein 142 Bp PCR-Produkt herzustellen.
Es wurde auch eine signifikante festgelegte Menge an genomischer
DNA zu jeder Reaktionsmischung hinzugefügt, um typische, natürlich vorkommende
Proben zu simulieren.
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Nachdem
die Amplifikation vollständig
war, wurde herausgefunden, dass es eine direkte Korrelation zwischen
der Anzahl der Zyklen gab, die notwendig sind, um eine vorgegebene
Fluoreszenzintensität
zu erreichen, sowie dem Logarithmus der Konzentration der anfänglichen
Nukleinsäurezielmoleküle. Wenn
der Logarithmus der anfänglichen
Templatekonzentration gegen die Anzahl der Zyklen aufgetragen wurde,
die es brauchte, um eine Fluoreszenzmenge von 190 zu erreichen,
dann war das Ergebnis eine gerade Linie. Unter Verwendung einer
linearen Regressionsanpassung war die Übereinstimmung zwischen 108 bis 103 Anfangskopien
besser als 0,99 (r2 > 0,99). Jedoch wich die Übereinstimmung
unterhalb von 103 Anfangskopien bedingt durch
die Amplifikation nicht-spezifischer Produkte signifikant ab.
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Das
von Higuchi et al. verwendete Verfahren zur Bestimmung der Anfangskopien
einer DNA hing von der Anwendung menschlicher Urteilskraft bei der
Beobachtung der aufgenommenen Wachstumskurven für die verschiedenen PCRs ab,
um die beste Fluoreszenzmenge zu bestimmen, bei der die Zyklen zu
messen sind, oder Fraktionen davon, um die Wachstumskurve eines
Standards mit bekannten Anfangskopien zu vergleichen. Die Menge
von 190 wurde dahingehend ausgewählt,
dass sie in der Mitte eines Bereichs liegt, in dem alle Wachstumskurven
relativ geradlinig waren, im Übergang
des sich nach oben krümmenden
exponentiellen Wachstums zur abfallenden Kurve bis hin zu einem
Grenzwert oder einer Asymptote. Nur die wenigen Datenpunkte in jeder
Wachstumskurve in der Nähe
der gewählten
Fluoreszenzmenge trugen zur Bestimmung der ursprünglichen Kopienzahlen bei Hintergrundrauschen
in den wenigen einzelnen Messungen kann größere Fehler bei der Endbestimmung
unbekannter Ausgangskopien bewirken, als sie vorkommen würden, wenn
eine größere Anzahl
an Messungen über
einen größeren Bereich
der Wachstumskurve in die Bestimmung mit eingeschlossen wäre, wodurch
deren Fehler verdurchschnittlicht würden und die Genauigkeit der
Ergebnisse verbessert werden würde.
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Auch
verlässt
sich das von Higuchi et al. verwendete Verfahren darauf, dass die
Form jeder Wachstumskurve genauso bleibt wie der Standard, ohne
zu bestimmen, ob sie dieses tatsächlich
tut, was eine Möglichkeit
für einen
schweren Fehler im Ergebnis zulässt.
Im Gegensatz dazu benötigt
das Verfahren und die Vorrichtung dieser Erfindung keinerlei menschliche
Intervention oder Entscheidungen bei der Verarbeitung der Daten,
ist in der Lage, fast alle Datenpunkte auf den Wachstumskurven zu
verwenden, wodurch deren Fehler verdurchschnittlicht werden und
die Genauigkeit des Ergebnisses verbessert wird, und ist zudem in
der Lage, durch Bestimmung der Formparameter von jeder Wachstumskurve,
zu bestimmen, ob seine PCR die gewünschte ist, und in den Fällen, bei
denen bekannt ist, dass es Änderungen
mit der Zeit oder Zyklen in den Reaktionsbedingungen gibt, wie thermischen
Abbau eines Enzyms, um dieses durch seine Wirkung auf die Wachstumskurvenformparameter
nachzuweisen, und um ein genaues Ergebnis trotz der veränderten
Form der Wachstumskurven zu erhalten.
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EP 640 828 A1 ist
Stand der Technik für
das vorliegende Patent gemäß Artikel
54 (3) (4) EPÜ.
EP 828 A1 betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur gleichzeitigen
Beobachtung von mehreren Nukleinsäureamplifikationen. Die Vorrichtung
ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine thermische Zyklusvorrichtung
umfasst, die ein wärmeleitendes
Bauteil umfasst, das darin mehrere ausgebildete Vertiefungen aufweist,
und einen Sensor, der derart angeordnet ist, um das Licht nachzuweisen,
das aus besagten Vertiefungen ausgestrahlt wird.
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Derzeitige
Qualitätskontrollüberprüfungen von
PCR-Ergebnissen involvieren typischerweise die Durchführung einer
elektrophoretischen Gel-Analyse der PCR-Produkte zur Verifizierung,
dass das Amplifikationsprodukt tatsächlich die gewünschte Nukleinsäuresequenz
ist, oder das Hybridisieren der PCR-Produkte mit einer markierten
DNA-Sonde mit einer Sequenz, die komplementär zu einem der gewünschten
Produktstränge
ist. Beide dieser Verfahren sind relativ zeitaufwändige Prozeduren.
Somit verbleibt ein Bedarf an einem einfacheren Verfahren zur Verifizierung
der Spezifität
der Amplifikation und es gibt zusätzlich dazu einen Bedarf an
einer Vorrichtung, die automatisch eine derartige Qualitätsprüfung während des
PCR-Verfahrens durchführen
kann.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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In
dieser Beschreibung werden die folgenden Definitionen von Begriffen
verwendet werden.
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Der
Begriff „PCR" meint das gut bekannte
Polymerasekettenreaktionsverfahren, das ursprünglich von Dr. Kary Mullis
von der Cetus Corporation entwickelt wurde, und insbesondere durch
Dr. Mullis und Andere in den US Patenten Nr. 4,683,202; 4,683,195
und 4,965,188 beschrieben wird, welche hiermit durch Referenzieren
in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden.
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Der
Begriff „Wachstumskurve" bedeutet einen Datensatz
an Messungen der Produkt-DNA (dsDNA), der auf molare Konzentrationen
umgerechnet ist, die bei oder nahe dem Ende des Verlängerungsanteils
von jedem thermischen Zyklus in einer Polymerasekettenreaktion (PCR)
vorhanden sind, die durch eine bestimmte Reaktionsmischung hergestellt
werden und die während
jedem Zyklus eines PCR-Verfahrens gemessen werden.
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Der
Begriff „Primer-beschränkte PCR" ist ein PCR-Verfahren,
bei dem die Form der Wachstumskurve mit dem ständigen Vorhandensein adäquater Polymeraseenzymaktivität konsistent
ist, um die dsDNA-Produktsynthese von allen geprimten Einzelsträngen zu
vervollständigen,
die während
der Verlängerungsanteile der
thermischen Zyklen der PCR gebildet werden, und das Plateau in der
Wachstumskurve der neu synthetisierten DNA bei hohen Produktkonzentrationen
ist asymptotisch zu der ursprünglichen
Konzentration der Primer, was damit konsistent ist, dass die Plateaus
durch Kompetition zwischen Primern und komplementären Einzelsträngen entstehen,
was die Wahrscheinlichkeit verringert, dass die geprimten Stränge gebildet
werden und letztendlich durch den Verbrauch der Primer.
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Eine „Enzym-beschränkte PCR" bedeutet eine solche,
bei der eine nicht ausreichende Polymeraseaktivität vorhanden
ist, um die Synthese von allen geprimten Strängen innerhalb des Verlängerungsanteils
von jedem Zyklus zu vervollständigen,
so dass bei hohen Produktkonzentrationen die molare PCR-Template-Konzentration
bei jedem Zyklus mit einer Geschwindigkeit anwächst, die durch die Anzahl
der Basen limitiert ist, die während
des Verlängerungsteils
des Zyklus polymerisiert werden können. Das molare Konzentrationswachstum
des Templates pro Zyklus hängt
in diesem Fall von der Länge
des Templates in den Basen ab.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung
eines bestimmten Satzes von Eigenschaften einer bestimmten PCR und
die genaue Bestimmung der Ausgangskonzentration der Zielnukleinsäuremoleküle in der
PCR zur Verfügung
zu stellen.
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Es
ist eine andere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur genauen
Bestimmung der Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen basierend
auf der Beobachtung der Fluoreszenz während jedem Zyklus des PCR-Verfahrens
zur Verfügung
zu stellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine automatisierte Vorrichtung
zur Bestimmung des einzigartigen Satzes an charakteristischen PCR-Parametern
für ein
bestimmtes Nukleinsäurezielmolekül zur Verfügung zu
stellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine automatisierte Vorrichtung
zur Verifizierung der Spezifität
einer gegebenen PCR ohne die Notwendigkeit externer Standards zur
Verfügung
zu stellen.
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Um
die oben genannten und andere Aufgaben zu lösen, stellt die Erfindung in
einer Form davon ein neues und verbessertes Verfahren zur Bestimmung
einer unbekannten molaren Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen zu Beginn
einer Polymerasekettenreaktion in einer Probenreaktionsmischung
zur Verfügung,
die geeignete Puffer, zwei komplementäre Arten von Oligonukleotidprimern,
einen molaren Überschuss
von vier Arten von Nukleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase und
besagte unbekannte molare Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen enthält. Die
zwei Arten von Primern werden in einer bekannten Konzentration (Cpo) zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren
umfasst die Schritte des Hinzufügens eines
Reportermoleküls
zu der PCR, das die Reaktion nicht wesentlich stört, aber die DNA, die durch
die Reaktion hergestellt wird, mindestens einmal pro jeden Zyklus
nachweisbar und messbar macht. Ein typisches Reportermolekül ist Ethidiumbromid,
das, wenn es mit ultraviolettem oder blaugrünem Licht angeregt wird, sehr
stark fluoresziert, wenn es in doppelsträngige DNA interkaliert ist,
aber nur sehr schwach, wenn es frei in Lösung in dem Reagenzsystem vorliegt.
Andere fluoreszierende interkalierende Farbstoffe funktionieren
auch in diesem Verfahren. Ein Beispiel ist der Farbstoff TOPRO.
Tatsächlich
kann jegliches DNA-Nachweismolekülsystem
verwendet werden, das in der Reaktionsmischung vorhanden sein kann,
ohne diese zu stören,
und es der durch die Reaktion hergestellten DNA erlaubt, nicht destruktiv
gemessen zu werden. In einer Form der Erfindung ist der fluoreszierende,
interkalierende Farbstoff, wenn er in ein Verlängerungsprodukt aufgenommen wird,
das durch besagte Polymerasekettenreaktion generiert wurde, in der
Lage, ein nachweisbares Signal auszusenden, wenn er geeignet angeregt
wird; die thermische zyklische Durchführung besagter Reaktionsmischung
für eine
Anzahl von Zyklen, die jeweils mindestens Denaturierungs- und Verlängerungszeiträume umfassen,
die ausreichend sind, um eine gewünschte Endkonzentration der
Nukleinsäuremoleküle zu etablieren; und
das Anregen besagter Reaktionsmischung während mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus. Dieses Verfahren umfasst weiterhin die Schritte
des Nachweisens und Messens der Intensität (I) des Signals während mindestens
dem Verlängerungsanteil
von jedem der Zyklen; das Umrechnen der Intensität in molare Konzentrationswerte
der dsDNA und das Speichern der molaren Konzentrationswerte für jeden
der besagten Verlängerungsanteile
von jedem der Zyklen; und das Generieren einer gemessenen Kurve
der molaren Konzentration der dsDNA gegen die Zykluszahl aus den
besagten gespeicherten Konzentrationswerten. Die Umwandlung der
Signalintensitätsmessungen
in molare Konzentrationen kann durch das übliche Verfahren des Ersetzens
der PCR-Proben mit Standardlösungen
von DNA durchgeführt
werden, die alle die gleichen Materialien in den gleichen Mengen
enthalten, außer
mehreren bekannten molaren Konzentrationen des dsDNA-Templates im
Bereich von 0, den Blindwerten, bis hin zu dem Bereich an Konzentrationen,
von denen wahrscheinlich ist, dass sie durch die PCRs hergestellt
werden. Anschließend,
durch das Abziehen der Blindwerte von den Signalen, die mit den
bekannten photometrischen Standards gemessen wurden, wodurch eine Arbeitskurve
entsteht, die gemessenes Signal, das um den Hintergrund korrigiert
wurde, mit der molaren Konzentration des Templates der dsDNA korreliert.
Es ist nicht notwendig, eine PCR durchzuführen, um diese Arbeitskurve
herzustellen. Photometrische Standardlösungen mit bekannten molaren
Konzentrationen an DNA sind alles, was notwendig ist.
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Als
nächstes
werden die Wachstumskurven-Formparameter e
S,
e
V und a für die zu verwendende PCR bestimmt,
wenn diese nicht bereits bekannt sind, durch das Durchführen der
PCR mit einer oder mehreren Standardproben mit bekannten anfänglichen
Konzentrationen der Template-DNA und das Aufnehmen von deren PCR-Wachstumskurven.
Nun, unter Verwendung der bekannten anfänglichen Primerkonzentrationen,
C
po, und den bekannten anfänglichen
Templatekonzentrationen C
O, unter Verwendung
eines 3-Variablen sukzessiven Approximationsverfahrens, bestimme
die Werte von e
S, e
V und
a, die eine beste Anpassung zwischen den gemessenen Wachstumskurven
und einer berechneten Wachstumskurve gemäß dem folgenden Verhältnis ergeben:
worin:
C
n+1 und
C
n die molaren DNA-Templatekonzentrationen
am Ende der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume sind;
e
v ist die theoretische Wahrscheinlichkeit,
dass das Template den nächsten
Zyklus überlebt;
e
S ist die theoretische Wahrscheinlichkeit,
dass das Template vollständig
synthetisiert wird;
C
O ist die molare
Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
C
po ist die anfängliche molare Primerkonzentration;
a
ist der theoretische Primer-/Komplementärstrang – Kompetitionsfaktor.
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Zuletzt
wird die anfängliche
molare Konzentration des DNA-Templates in der unbekannten Probe durch
das Durchführen
der gleichen PCR unter den gleichen Bedingungen wie für die PCRs
der bekannten Standards und die Aufnahme der Wachstumskurven bestimmt.
Nun, unter Verwendung des gleichen Verhältnisses, gebe die Werte für eV, eS und a, die
mit der bekannten Standardprobe bestimmt wurden, zusammen mit der
bekannten anfänglichen
Primerkonzentration Cpo in das gleiche Verhältnis wie
das oben beschriebene ein und variiere die unbekannte anfängliche
Konzentration CO, zur Durchführung eine
Einzelvariablen-sukzessiven Approximation, um die beste Anpassung
zwischen der berechneten theoretischen Wachstumskurve, die so generiert
wurde, und jeder gemessenen Wachstumskurve zu erhalten. Der Wert
von CO, der die beste Anpassung ergibt,
wird als das Ergebnis angenommen.
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Ein
Verfahren zur Bestimmung der besten Anpassung zwischen den berechneten
und gemessenen Wachstumskurven ist, die Differenz zwischen den gemessenen
und berechneten molaren Konzentrationen bei jedem gemessenen Zyklus
zu nehmen, diese Differenz ins Quadrat zu setzen und die Quadrate
der Differenz zu summieren. Dann variiere die zu bestimmenden Parameter,
um die Summe der Quadrate zu minimieren. Jegliches Verfahren, das äquivalente
Ergebnisse ergibt, wird funktionieren.
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Die
Qualität
der Anpassung zwischen gemessenen und berechneten Wachstumskurven
wird dadurch gemessen, wie klein der Durchschnitt der Quadrate der
Unterschiede gemacht werden kann. Ein nützliches Maß ist der quadratische Mittelwertfehler
der Anpassung oder RMS-Fehler (Root Mean Square Error of Fit). Dieser
wird durch das Teilen der Summe der Quadrate der Differenzen durch
die Anzahl der Zyklen bestimmt, die in die Anpassung aufgenommen
wurden und das Nehmen der Quadratwurzel des Ergebnisses.
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Eine
Anpassung, in der der RMS-Fehler, der so bestimmt wurde, ungefähr gleich
zu dem äquivalenten Konzentrationshintergrund
des verwendeten Verfahrens der Messung ist, ist eine Anpassung der
besten Qualität,
die möglich
ist. Seine Genauigkeit bestimmt sich größtenteils durch den Hintergrund
der Messung, nicht durch die theoretische Genauigkeit des Algorithmus.
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Die
Anzahl der Zyklen, die zur Durchführung dieses Verfahrens durchgeführt werden
sollten, sollte mindestens genügend
sein, um die molare Konzentration der Templatemoleküle für die Proben
mit den geringsten Ausgangskonzentrationen von Interesse auf einen
Wert oberhalb der Nachweisgrenze von jeglichen Mittel zu erhöhen, die
verwendet werden, um die Templatekonzentrationen am Ende von jedem
Zyklus zu messen. Größere Anzahlen
von Zyklen als diese, werden bessere Resultate ergeben, mit einem
verringerten Vorteil von zusätzlichen
Zyklen, so bald die molare Konzentration der Template-DNA sich nicht
weiter in jedem Zyklus signifikant erhöht.
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In
einer anderen Form der Erfindung wird eine neue und verbesserte
automatisierte Vorrichtung zur Bewertung der erwarteten Zweckdienlichkeit
einer Polymerasekettenreaktion in einer Reaktionsmischung in Echtzeit
zur Verfügung
gestellt, die geeignete Puffer, zwei komplementäre Arten von Oligonukleotidprimern, einen
molaren Überschuss
von vier Arten von Nukleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase und
eine unbekannte molare Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen enthält. Die zwei
Arten von Primern werden in einer bekannten molaren Konzentration
(C
po) zur Verfügung gestellt, und eine geeignete
Konzentration von mindestens einer Art von Reportermolekül, das,
wenn es in das Verlängerungsprodukt
interkaliert ist, das durch die Polymerasekettenreaktion gebildet
wird, in der Lage ist, ein nachweisbares Signal auszusenden, wenn
es geeignet angeregt wird. Diese Vorrichtung umfasst eine thermische
Zyklusvorrichtung für
die thermische zyklische Durchführung
der Reaktionsmischung für
eine Anzahl von Zyklen, wobei jeder mindestens Denaturierungs- und Annealing-/Verlängerungszeiträume umfasst,
die ausreichend sind, um eine gewünschte Endkonzentration von
Nukleinsäuremolekülen zu etablieren.
Ein Nachweissystem wird zur Verfügung
gestellt, das Mittel zur Anregung der Reaktionsmischung während mindestens
dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus zur Verfügung
stellt und Mittel zum Nachweis und zur Messung der Intensität (I) des
Signals, während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem der besagten Zyklen. Ein Mikrocomputer ist mit dem Nachweissystem
zur Aufnahme von Signalen daraus und zur Umrechnung der Intensität in molare
Konzentrationswerte der dsDNA in der Mischung und zur Speicherung
besagter molarer Konzentrationswerte für jeden der besagten Verlängerungsanteile
von jedem der besagten Zyklen verbunden. Ein Anwenderinterface wird
mit dem Computer und der thermischen Zyklusvorrichtung zur Eingabe
von Anwenderinstruktionen und zur Anzeige von Ergebnisinformationen
verbunden. Der Computer umfasst Mittel zur Generierung einer gemessenen
Kurve der molaren Konzentration der dsDNA gegen die Zykluszahl aus
besagten gespeicherten Konzentrationswerten, und Mittel zur Verwendung
sukzessiver Approximationen zur Bestimmung charakteristischer Parameterwerte
von e
V, e
S und a,
die eine beste Anpassung der gemessenen Kurve an eine theoretische
Modellkurve gemäß dem folgenden
Verhältnis
zur Verfügung
stellen:
worin:
C
n+1 und
C
n die molaren DNA-Zielkonzentrationen sind,
die während
der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume gemessen
wurden;
e
V ist die Wahrscheinlichkeit,
dass das Zielmolekül
den nächsten
Zyklus überlebt;
e
S ist die Wahrscheinlichkeit, dass das Zielmolekül synthetisiert
wird;
C
O ist die molare Konzentration
der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
C
po ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers;
a ist der Primer-/Komplementärstrang – Kompetitionsfaktor.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung umfasst das Nachweissystem eine Fluorimeter
zum Nachweis von Fluoreszenz aus der Reaktionsmischung während eines
Teils des Annealing-/Verlängerungsanteil
von jedem der besagten Zyklen.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung umfasst die Vorrichtung zusätzlich eine
optische Faserverbindung zwischen der Reaktionsmischung in dem Reaktionsschlauch
und dem Fluorimeter.
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Die
Formel oder Gleichung, die einzigartig die Wachstumskurve des doppelsträngigen DNA-Produkts (dsDNA)
während
einer Polymerasekettenreaktion beschreibt, kann, so bald sie an
die tatsächliche
Wachstumskurve der dsDNA angepasst ist, verwendet werden, um einen
unbekannten Teil der Kurve zu extrapolieren, um die dsDNA-Konzentration
in diesem Teil zu bestimmen. Sie kann auch verwendet werden, um
die Spezifität
einer gegebenen PCR ohne die Verwendung separater Kontrollen zu
verifizieren. Die Spezifität
der Reaktion kann auch verifiziert werden. Die Ausgangskonzentration
der Ziel-DNA kann abgesichert werden und eine große Anzahl
von PCRs kann auf abnorme Reaktionsbedingungen untersucht werden,
alles durch das Vergleichen der tatsächlichen Wachstumsgeschwindigkeit
der dsDNA während
der PCR mit der vorausgesagten Wachstumskurve für ein bestimmtes DNA-Zielmolekül in einer
thermischen Zyklusvorrichtung.
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In
einer Form der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung einer
unbekannten molaren Ausgangskonzentration an Zielnukleinsäuremolekülen zu Beginn
einer Polymerasekettenreaktion in einer Probenreaktionsmischung
zur Verfügung
gestellt, die geeignete Puffer, zwei komplementäre Arten von Oligonukleotidprimern,
einen molaren Überschuss
von vier Arten von Nukleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase und besagte
unbekannte molare Ausgangskonzentration der Zielnukleinsäuremoleküle enthält, worin
die zwei Arten von Primern in einer bekannten molaren Konzentration
(C
po) zur Verfügung gestellt werden, wobei
besagtes Verfahren die Schritte des Hinzufügens eines Reportermoleküls, das
die Reaktion nicht signifikant stört und kein starkes Signal
in Abwesenheit doppelsträngiger
DNA aussendet, aber die dsDNA, die durch die Reaktion hergestellt
wird, mindestens einmal pro jeden Zyklus nachweis- und messbar macht,
und die thermische zyklische Durchführung einer oder mehrerer Standardreaktionsmischungen,
die im Wesentlichen in jeder Beziehung die gleichen sind, außer dass
sie eine bekannte molare Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen aufweisen,
um eine oder mehrere Wachstumskurven mit bekannten molaren Ausgangskonzentrationen
von Zielnukleinsäuremolekülen zu erhalten.
Das Verfahren umfasst zudem die Schritte des Anregens der Reaktionsmischung
während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus, das Nachweisen und Messen der Intensität des Signals
während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem der besagten Zyklen, das Umrechnen der Intensität in molare
Konzentrationswerte der dsDNA und das Speichern der molaren Konzentrationswerte
für jeden
der besagten Verlängerungsanteile
von jedem der besagten Zyklen sowie das Generieren einer gemessenen
Kurve der molaren Konzentration der dsDNA gegen die Zykluszahl aus
den gespeicherten Konzentrationswerten. Die nächsten Schritte sind, unter
Verwendung sukzessiver Approximationen, die Bestimmung der Werte
von e
V, e
S und a,
die eine beste Anpassung der gemessenen Kurve an eine oder mehrere
bekannte Wachstumskurve gemäß dem folgenden
Verhältnis
zur Verfügung
stellen:
worin
C
n+1 und
C
n die molaren DNA-Templatekonzentrationen
sind, die während
der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume gemessen
wurden;
e
V ist die theoretische Wahrscheinlichkeit,
dass das Template den nächsten
Zyklus überlebt;
e
S ist die theoretische Wahrscheinlichkeit,
dass das Template synthetisiert wird;
C
O ist
die molare Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
C
po ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers;
a ist der theoretische Primer-/Komplementärstrang – Kompetitionsfaktor;
und
dann das Berechnen der molaren Konzentration der eingesetzten Nukleinsäure der
unbekannten Proben durch Festlegen von e
V,
e
S und a und das Anpassen der Anfangskonzentration
C
O, um eine beste Anpassung an die gemessene
Wachstumskurve von jeder unbekannten Probe zu erhalten.
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In
einer anderen Form der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung
einer unbekannten molaren Ausgangskonzentration an Zielnukleinsäuremolekülen zu Beginn
einer Polymerasekettenreaktion in einer Probenreaktionsmischung
zur Verfügung
gestellt, die geeignete Puffer, zwei komplementäre Arten von Oligonukleotidprimern,
einen molaren Überschuss
von vier Arten von Nukleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase und
die unbekannte molare Ausgangskonzentration der Zielnukleinsäure enthält, worin
die zwei Arten von Primern in einer bekannten molaren Konzentration
(C
po) zur Verfügung gestellt werden, wobei
besagtes Verfahren die Schritte des Hinzufügens eines Reportermoleküls umfasst,
das die Reaktion nicht signifikant stört und kein starkes Signal
in der Abwesenheit doppelsträngiger
DNA aussendet, aber die dsDNA, die durch die Reaktion hergestellt
wird, mindestens einmal pro jeden Zyklus nachweisbar und messbar
macht, die thermische zyklische Durchführung besagter Reaktionsmischung
für eine
Anzahl von Zyklen, die jeweils mindestens Denaturierungs- und Verlängerungszeiträume umfassen,
die ausreichend sind, um eine gewünschte Endkonzentration der
Nukleinsäuremoleküle zu etablieren,
und das Anregen der Reaktionsmischung während mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus. Die nächsten
Schritte umfassen das Nachweisen und Messen der Intensität des Signals
während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem der Zyklen, das Umrechnen der Intensität in molare Konzentrationswerte
der dsDNA und das Speichern der molaren Konzentrationswerte für jeden
der besagten Verlängerungsanteile
von jedem der besagten Zyklen sowie das Generieren einer gemessenen
Kurve der molaren Konzentration der dsDNA gegen die Zykluszahl aus
den gespeicherten Konzentrationswerten. Als nächstes werden unter Verwendung
sukzessiver Approximationen Werte von e
V,
e
S, a c
Z(n) und
A
Z(n) bestimmt, die eine beste Anpassung
der gemessenen Kurve an eine theoretische Kurve gemäß dem folgenden
Verhältnis
zur Verfügung
stellen:
worin:
C
n+1 und C
n die molaren
DNA-Templatekonzentrationen am Ende der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume sind;
e
V ist theoretisch die Wahrscheinlichkeit,
dass das Template den nächsten
Zyklus überlebt;
e
S ist theoretisch die Wahrscheinlichkeit,
dass das Template synthetisiert wird;
C
O ist
die molare Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
C
po ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers;
a ist theoretisch der Primer-/Komplementärstrang-Kompetitionsfaktor;
C
Z ist die molekulare Konzentration des Polymeraseenzyms;
A
Z ist die spezifische Aktivität des Polymeraseenzyms;
t
X ist die Verlängerungszeit in Sekunden;
L
t ist die Länge des Templates in den Basen;
L
p ist die Länge der Primer in Basen;
und
das Berechnen der molaren Konzentration der Ausgangsnukleinsäure bei
Zyklus n = 0 durch Variieren der Werte von e
V,
e
S, a, C
Z(n) und
A
Z(n) und Co, um eine beste Anpassung der
Kurvengleichung an die gemessene Wachstumskurve der unbekannten
Probe zu erhalten.
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In
einer noch anderen Form stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung
einer unbekannten molaren Ausgangskonzentration an Zielnukleinsäuremolekülen zu Beginn
einer Polymerasekettenreaktion in einer Probenreaktionsmischung
zur Verfügung,
die geeignete Puffer, zwei komplementäre Arten von Oligonukleotidprimern,
einen molaren Überschuss
von vier Arten von Nukleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase und
die unbekannte molare Ausgangskonzentration der Zielnukleinsäuremoleküle enthält, worin
die zwei Arten von Primern in einer bekannten molaren Konzentration
(C
po) zur Verfügung gestellt werden, wobei
besagtes Verfahren die Schritte des Hinzufügens eines Reportermoleküls, das
die Reaktion nicht signifikant stört und kein starkes Signal
in Abwesenheit doppelsträngiger
DNA aussendet, aber die dsDNA, die durch die Reaktion hergestellt
wird, mindestens einmal pro jeden Zyklus nachweisbar und messbar
macht, die thermische zyklische Durchführung einer oder mehrerer Standardreaktionsmischungen,
die im Wesentlichen in jeder Beziehung die gleichen sind, außer dass
sie eine bekannte molare Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremoleküle aufweisen,
um eine oder mehrere Wachstumskurven mit bekannten molaren Ausgangskonzentrationen von
Zielnukleinsäuremoleküle zu erhalten,
und das Anregen der Reaktionsmischung während mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus. Der nächste
Schritt umfasst das Nachweisen und Messen der Intensität des Signals
während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem der Zyklen, das Umrechnen der Intensität in molare Konzentrationswerte
der dsDNA und das Speichern der molaren Konzentrationswerte für jeden
der Verlängerungsanteile
in jedem der Zyklen und das Generieren einer gemessenen Kurve der
molaren Konzentration der dsDNA gegen die Zykluszahl aus den gespeicherten
Konzentrationswerten. Als nächstes werden
unter Verwendung sukzessiver Approximationen die Werte von e
V, e
S, a, C
Z(n) und A
Z(n) bestimmt,
die eine beste Anpassung der gemessenen Kurve an eine oder mehrere
bekannte Wachstumskurve gemäß dem folgenden
Verhältnis
zur Verfügung
stellen:
worin:
C
n+1 und C
n die molaren
DNA-Templatekonzentrationen am Ende der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume sind;
e
V ist theoretisch die Wahrscheinlichkeit,
dass das Template den nächsten
Zyklus überlebt;
e
S ist theoretisch die Wahrscheinlichkeit,
dass das Template synthetisiert wird;
C
O ist
die molare Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
C
po ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers;
a ist theoretisch der Primer-/Komplementärstrang-Kompetitionsfaktor;
C
Z ist die molekulare Konzentration des Polymeraseenzyms;
A
Z ist die spezifische Aktivität des Polymeraseenzyms;
t
X ist die Verlängerungszeit in Sekunden;
L
t ist die Länge des Templates in den Basen;
L
p ist die Länge der Primer in Basen;
und
danach das Berechnen der molaren Konzentration der Ausgangsnukleinsäure der
unbekannten Proben durch Festlegen von e
V,
e
S, a, C
Z(n) und
A
Z(n) und Anpassen der Ausgangskonzentration
Co, um eine beste Anpassung an die gemessene Wachstumskurve der
unbekannten Probe zu erhalten.
-
Des
Weiteren wird gemäß einer
Form der Erfindung ein automatisierte Vorrichtung zur Bewertung
der erwarteten Zweckdienlichkeit einer Polymerasekettenreaktion
in einer Reaktionsmischung in Echtzeit zur Verfügung gestellt, die geeignete
Puffer, zwei komplementäre
Arten von Oligonukleotidprimern, einen molaren Überschuss von vier Arten von
Nukleosidphosphaten, eine DNA-Polymerase und eine unbekannte molare Ausgangskonzentration
von Zielnukleinsäuremolekülen enthält, worin
die zwei Arten von Primern in einer bekannten molaren Konzentration
(C
po) zur Verfügung gestellt werden und worin
mindestens eine Art der besagten zwei Arten von Primern oder vier
Arten von Nukleosidtriphosphaten mit einem Reportermolekül markiert sind,
das kein starkes Signal in der Abwesenheit doppelsträngiger DNA
aussendet, aber die dsDNA, die durch die Reaktion hergestellt wird,
mindestens einmal pro Zyklus nachweisbar und messbar macht, wobei
besagte Vorrichtung eine thermische Zyklusvorrichtung für die thermische
zyklische Durchführung
einer oder mehrerer Standardreaktionsmischungen umfasst, die im
Wesentlichen in jeder Beziehung die gleichen sind, außer dass sie
eine bekannte molare Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen aufweisen,
um eine oder mehrere Wachstumskurven mit bekannten molaren Ausgangskonzentrationen
von Zielnukleinsäuremolekülen zu erhalten,
ein Nachweissystem einschließlich
Mittel zur Anregung der Reaktionsmischung während mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus und Mittel zum Nachweis und zur Messung der Intensität des Signals
während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem der besagten Zyklen, einen Mikrocomputer, der mit besagtem
Nachweissystem verbunden ist, zur Aufnahme von Signalen daraus und
zur Umrechnung der Intensität
in molare Konzentrationswerte der dsDNA in der Mischung und zur
Speicherung der molaren Konzentrationswerte für jeden der besagten Verlängerungsanteile
von jedem der Zyklen; und ein Anwenderinterface, das mit dem Computer
und der thermischen Zyklusvorrichtung verbunden ist, zur Eingabe
von Anwenderinstruktionen und zur Anzeige von Ergebnisinformationen.
Gemäß der Erfindung
umfasst der Computer Mittel zur Generierung einer gemessenen Kurve
der molaren Konzentration der dsDNA gegen die Zykluszahl aus den
gespeicherten Konzentrationswerten, Mittel zur Verwendung sukzessiver
Approximationen zur Bestimmung charakteristischer Parameterwerte
von e
V, e
S und a, die
eine beste Anpassung der gemessenen Kurve an besagte eine oder mehrere
Wachstumskurven gemäß dem folgenden
Verhältnis
zur Verfügung
stellen:
worin:
C
n+1 und
C
n sind die molaren DNA-Zielkonzentrationen,
die während
der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume gemessen
wurden,
e
V ist die theoretische Wahrscheinlichkeit,
dass das Zielmolekül
den nächsten
Zyklus überlebt;
e
S ist die theoretische Wahrscheinlichkeit,
dass das Zielmolekül
synthetisiert wird;
C
O ist die molare
Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
C
po ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers;
a ist der theoretische Primer-/Komplementärstrang-Kompetitionsfaktor;
und
es werden Mittel zur Berechnung der molaren Konzentration der Ausgangsnukleinsäure der
unbekannten Proben durch Festlegung von e
V,
e
S und a und die Anpassung der Ausgangskonzentration
C
O zur Verfügung gestellt, um eine beste
Anpassung der gemessenen Kurve an jede unbekannte Probe zu erhalten.
-
Die
Erfindung ist in einer anderen Form auf eine automatisierte Vorrichtung
zur Bewertung der erwarteten Zweckdienlichkeit einer Polymerasekettenreaktion
in einer Reaktionsmischung in Echtzeit gerichtet, die geeignete
Puffer, zwei komplementäre
Arten von Oligonukleotidprimern, einen molaren Überschuss von vier Arten von
Nukleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase und eine unbekannte
molare Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen enthält, worin die zwei Arten von
Primern in einer bekannten molaren Konzentration (C
po)
zur Verfügung
gestellt werden und worin mindestens eine Art der besagten zwei
Arten von Primern oder vier Arten von Nukleosidtriphosphaten mit
einem Reportermolekül
markiert sind, das kein starkes Signal in der Abwesenheit doppelsträngiger DNA
aussendet, aber die dsDNA, die durch die Reaktion hergestellt wird,
mindestens einmal pro Zyklus nachweisbar und messbar macht, wobei
besagte Vorrichtung eine thermische Zyklusvorrichtung für die thermische
zyklische Durchführung
der Reaktionsmischung für
eine vorbestimmte Anzahl von Zyklen umfasst, wobei jeder mindestens
Denaturierungs- und Annealing- / Verlängerungszeiträume umfasst,
die ausreichend sind, um eine gewünschte Endkonzentration von
Nukleinsäuremolekülen zu etablieren,
in denen die Primer verbraucht sind, und ein Nachweissystem einschließlich Mittel
zur Anregung der Reaktionsmischung während mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus und Mittel zum Nachweis und zur Messung der Intensität des Signals
während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem der besagten Zyklen. Zusätzlich umfasst die Vorrichtung
einen Mikrocomputer, der mit dem Nachweissystem verbunden ist, zur
Aufnahme von Signalen daraus und zur Umrechnung der Intensität in molare
Konzentrationswerte der dsDNA in der Mischung und zur Speicherung
der molaren Konzentrationswerte für jeden der Verlängerungsanteile
von jedem der Zyklen, ein Anwenderinterface, das mit dem Computer
und der thermischen Zyklusvorrichtung verbunden ist, zur Eingabe
von Anwenderinstruktionen an den Computer und zur Anzeige von Ergebnisinformationen.
Der Computer umfasst Mittel zur Generierung einer gemessenen Kurve der
molaren Konzentration der dsDNA gegen die Zykluszahl aus besagten
gespeicherten Konzentrationswerten, Mittel zur Verwendung sukzessiver
Approximationen zur Bestimmung charakteristischer Parameterwerte von
e
V, e
S, a, C
Z(n) und A
Z(n), die
eine beste Anpassung der gemessenen Kurve an theoretische Modellkurve gemäß dem folgenden
Verhältnis
zur Verfügung
stellen:
worin:
C
n+1 und C
n die molaren
DNA-Zielkonzentrationen, die während
der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume gemessen
wurden, sind;
e
V ist theoretisch die
Wahrscheinlichkeit, dass das Zielmolekül den nächsten Zyklus überlebt;
e
S ist theoretisch die Wahrscheinlichkeit,
dass das Zielmolekül
synthetisiert wird;
C
O ist die molare
Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
C
Z ist die molekulare Konzentration des Polymeraseenzyms;
A
Z ist die spezifische Aktivität des Polymeraseenzyms;
t
X ist die Verlängerungszeit in Sekunden;
L
t ist die Länge des Templates in den Basen;
L
p ist die Länge des Primers in Basen;
C
po ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers;
a ist theoretisch der Primer-/Komplementärstrang-Kompetitionsfaktor;
und
zusätzlich
Mittel zur Berechnung der molaren Konzentration der Ausgangsnukleinsäure bei
Zyklus n = 0 durch Variieren der Werte von e
V,
e
S, a, C
Z(n) und
A
Z(n) und Co, um eine beste Anpassung der
Kurvengleichung an die gemessene Wachstumskurve der unbekannten
Probe zu erhalten.
-
Als
eine noch weitere Ausführungsform
ist die Erfindung auf eine automatisierte Vorrichtung zur Bewertung
der erwarteten Zweckdienlichkeit einer Polymerasekettenreaktionsmischung
in Echtzeit gerichtet, die geeignete Puffer, zwei komplementäre Arten
von Oligonukleotidprimern, einen molaren Überschuss von vier Arten von
Nukleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase und eine unbekannte
molare Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen enthält, worin die zwei Arten von
Primern in einer bekannten molaren Konzentration (C
po)
zur Verfügung
gestellt werden und worin mindestens eine Art der besagten zwei
Arten von Primern oder vier Arten von Nukleosidtriphosphaten mit
einem Reportermolekül
markiert sind, das kein starkes Signal in der Abwesenheit doppelsträngiger DNA
aussendet, aber die dsDNA, die durch die Reaktion hergestellt wird,
mindestens einmal pro Zyklus nachweisbar und messbar macht, wobei
besagte Vorrichtung eine thermische Zyklusvorrichtung für die thermische
zyklische Durchführung
einer oder mehrerer Standardreaktionsmischungen umfasst, die im
Wesentlichen in jeder Beziehung die gleichen sind, außer dass
sie eine bekannte molare Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen aufweisen,
um eine oder mehrere Wachstumskurven mit bekannten molaren Ausgangskonzentrationen
von Zielnukleinsäuremolekülen zu erhalten,
und ein Nachweissystem einschließlich Mittel zur Anregung besagter
Reaktionsmischung während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus und Mittel zum Nachweis und zur Messung der Intensität des Signals
während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem der Zyklen. Die Vorrichtung umfasst auch einen Mikrocomputer,
der mit dem besagten Nachweissystem verbunden ist, zur Aufnahme
von Signalen daraus und zur Umrechnung der Intensität in molare
Konzentrationswerte der dsDNA in der Mischung und zur Speicherung
der molaren Konzentrationswerte für jeden der Verlängerungsanteile
von jedem der Zyklen, ein Anwenderinterface, das mit dem Computer
und der thermischen Zyklusvorrichtung verbunden ist, zur Eingabe von
Anwenderinstruktionen in den Computer und zur Anzeige von Ergebnisinformation.
Der Computer umfasst Mittel zur Generierung einer gemessenen Kurve
der molaren Konzentration der dsDNA gegen die Zykluszahl aus besagten
gespeicherten Konzentrationswerten und Mittel zur Verwendung sukzessiver
Approximationen zur Bestimmung charakteristischer Parameterwerte
von e
V, e
S, a, C
Z(n) und A
Z(n), die
eine beste Anpassung der gemessenen Kurve an besagte eine oder mehrere
Wachstumskurven gemäß dem folgenden
Verhältnis zur
Verfügung
stellen:
worin:
C
n+1 und C
n die molaren
DNA-Zielkonzentrationen, die während
der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume gemessen
wurden, sind;
e
V ist theoretisch die
Wahrscheinlichkeit, dass das Zielmolekül den nächsten Zyklus überlebt;
e
S ist theoretisch die Wahrscheinlichkeit,
dass das Zielmolekül
synthetisiert wird;
C
O ist die molare
Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
C
Z ist die molekulare Konzentration des Polymeraseenzyms;
A
Z ist die spezifische Aktivität des Polymeraseenzyms;
t
X ist die Verlängerungszeit in Sekunden;
L
t ist die Länge des Templates in den Basen;
L
p ist die Länge des Primers in Basen;
C
po ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers;
a ist theoretisch der Primer-/Komplementärstrang-Kompetitionsfaktor;
und
Mittel zur Berechnung der molaren Konzentration der Ausgangsnukleinsäure der
unbekannten Proben durch das Festsetzen von e
V,
e
S, a, C
Z(n) und
A
Z(n) und durch das Anpassen der Ausgangskonzentration
C
o, um eine beste Anpassung an die gemessene
Wachstumskurve von jeder unbekannten Probe zu erhalten.
-
Diese
und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden
sich aus dem Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung besser
ergeben, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Ansprüchen und begleitenden Zeichnungen
entnommen werden.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1 ist
eine Grafik der Fluoreszenz gegen die Zykluszahl für die Daten,
die dem Higuchi et al. Bericht entnommen wurden.
-
2 ist
eine Grafik der Konzentration gegen die Zykluszahl für eine der
Kurven, die in 1 gezeigt werden, in welcher
108 HIV ssDNA pro 100 μL anfängliche Kopien vorhanden waren.
-
3 ist
eine Grafik der berechneten anfänglichen
Kopien gegen die tatsächliche
anfängliche
Kopie der Higuchi et al. Daten, die durch das Verfahren dieser Erfindung
berechnet wurde.
-
4 ist
ein vereinfachtes Blockdiagramm der Vorrichtung gemäß der Erfindung.
-
Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird ein automatisiertes Verfahren zur Bestimmung
einer unbekannten molaren Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen zu Beginn
einer Polymerasekettenreaktion in einer Probenreaktionsmischung
zur Verfügung
gestellt, die geeignete Puffer, zwei komplementäre Arten von Oligonukleotidprimern,
einen molaren Überschuss
von vier Arten von Nukleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase und
die unbekannte molare Ausgangskonzentration der Zielnukleinsäuremoleküle enthält. Dieses
Verfahren involviert nicht die Verwendung eines Standards einer
bekannten Konzentration. Das Verfahren sollte vorzugsweise automatisch
durch eine automatisierte thermische Zyklusvorrichtung durchgeführt werden,
die einen Mikroprozessor umfasst, der mit einer Fluoreszenznachweisvorrichtung verbunden
ist und konventionell mit einem Tabellenkalkulationprogramm wie
Microsoft® Excel
programmiert ist. Die Reaktionsmischung umfasst bekannte Volumen
an Puffern und einen wesentlichen molaren Überschuss an dNTPs. Die zwei
Arten von Primern in der Reaktionsmischung werden spezifisch in
einer vorbestimmten bekannten molaren Konzentration (Cpo)
zur Verfügung
gestellt, so dass sie während
der letzten Zyklen des PCR-Protokolls erschöpfen. Das Verfahren umfasst
die Schritte:
- a) des Markierens mindestens
einer Art der zwei Arten von Primern oder vier Arten von Nukleosidtriphosphaten
mit einem Reportermolekül,
das, wenn es in ein Verlängerungsprodukt
eingebaut wird, das durch besagte Polymerasekettenreaktion generiert
wird, in der Lage ist, ein nachweisbares Signal auszusenden, wenn
es geeignet angeregt ist, d. h., das Hinzufügen eines Reportermoleküls, das
die Reaktion nicht signifikant stört und kein starkes Signal
in Abwesenheit doppelsträngiger
DNA aussendet, aber die dsDNA, die durch die Reaktion hergestellt
wird, mindestens einmal pro Zyklus nachweisbar und messbar macht;
- b) die thermische zyklische Durchführung der Reaktionsmischung
für eine
vorbestimmte Anzahl von Zyklen, die jeweils mindestens Denaturierungs-
und Verlängerungszeiträume umfassen,
die ausreichend sind, um eine gewünschte Endkonzentration der
Nukleinsäuremoleküle zu etablieren;
- c) das Anregen der Reaktionsmischung während mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus, so dass ein Signal durch jedes der Reportermoleküle ausgesendet
wird, die an ein Verlängerungsprodukt gebunden
sind;
- d) das Nachweisen und Messen der Intensität dieses Signals während mindestens
dem besagten Verlängerungsanteil
von jedem der besagten Zyklen;
- e) das Umrechnen des Intensitätssignals in einem Mikroprozessor
in einen molaren Konzentrationswert der dsDNA und das Speichern
des molaren Konzentrationswertes für jeden der besagten Verlängerungsanteile von
jedem der besagten Zyklen in einem Speicher;
- f) das Generieren einer gemessenen Kurve der molaren Konzentration
der dsDNA gegen die Zykluszahl in besagtem Mikroprozessor aus den
besagten gespeicherten Konzentrationswerten in besagtem Speicher;
- g) die Bestimmung der Werte von eV,
eS, CO und a unter
Verwendung eines sukzessiven Approximationsverfahrens in einem Tabellenkalkulationsprogramm
in besagtem Mikroprozessor, die eine beste Anpassung der gemessenen
Kurve zu dem folgenden Verhältnis
zur Verfügung
stellen: worin:
n die n te Zykluszahl
in der PCR ist;
Cn+1 und Cn sind
die molaren DNA-Templatekonzentrationen, die während der n ten und n + 1 ten
Zyklusverlängerungszeiträume gemessen
wurden;
eV ist die theoretische Wahrscheinlichkeit,
dass das Template den nächsten
Zyklus überlebt;
eS ist die theoretische Wahrscheinlichkeit,
dass das Template synthetisiert wird;
CO ist
die molare Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
Cpo ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers;
a ist der theoretische Primer-/Komplementärstrang-Kompetitionsfaktor.
- h) die Anzeige der molaren Konzentration der anfänglichen
Nukleinsäuremoleküle bei Zyklus
n = 0 (CO).
-
Die
Vorrichtung gemäß der Erfindung
wird als Blockdiagramm in 4 gezeigt.
Die Vorrichtung 10 umfasst eine computergesteuerte thermische
Zyklusvorrichtung 12, die eine Vielzahl von Wells 14,
zum Halten einer Vielzahl von Reagenzröhrchen 16 enthält, die
PCR-Reaktionsmischungen enthalten, einen Mikrocomputer 18,
ein Nachweissystem 20, das mit den Wells 14 in
der thermischen Zyklusvorrichtung 12 und mit dem Mikrocomputer 18 verbunden
ist, und ein Anwenderinterface 22 zwischen der thermischen
Zyklusvorrichtung 12, dem Nachweissystem 20 und
dem Mikrocomputer 18.
-
Die
thermische Zyklusvorrichtung 12 kann ein konventionelles
Produkt sein, wie das System 9600 von The Perkin-Elmer Corporation,
das bis zu 96 Reaktionsmischproben in Probenröhrchen in den Wells 14 seines thermischen
Zyklusblocks halten kann. Die Röhrchen 16 sind
typischerweise Polypropylenröhrchen
mit transparenten Kappen. Die Klappe der thermischen Zyklusvorrichtung über den
Röhrchen
ist besonders angepasst, um die eingehenden Vorrichtungen des Nachweissystems
aufzunehmen und zu unterstützen.
-
Das
Nachweissystem 20 kann in dem Fall eines Fluoreszenzmarkierungsschemas
vorzugsweise aus einer Lichtquelle, faseroptischen Verbindungen
und Lichtschläuchen
bestehen, die zwischen dem oberen Teil der Wells und einer CCD-Anordnung
verbunden sind sowie einem geeigneten Signalverstärkungs-
und Umwandlungsschaltkreis zur Umwandlung der Lichtsignale in einen
digitalen Eingang zum Computer, oder es kann ein digitales Kamerasystem
sein, wie dasjenige, das in dem Higuchi et al. Bericht verwendet
und beschrieben wurde. Das Ergebnis des Nachweissystems wird in
den Computer 18 zur Datenspeicherung und Verarbeitung weitergeleitet.
-
Das
Nachweissystem ist vorzugsweise ein Mehrfachfluorimeter, das eine
Anregungslichtquelle enthält,
die ein sichtbarer Lichtlaser oder eine ultraviolette Lampe sein
kann, eine Multiplexervorrichtung zur Verteilung des Anregungslichts
an einzelne Reaktionsröhrchen 16 durch
die faseroptischen Schläuche
und Verbindungen und zur Aufnahme von Fluoreszenzlicht aus den Reaktionsröhrchen 16,
eine Filtervorrichtung zur Abtrennung des Fluoreszenzlichts von
dem Anregungslicht nach deren Wellenlängen und eine Nachweisvorrichtung
zur Messung der Fluoreszenzlichtintensität. Die Fluoreszenz entstammt
aus einem interkalierenden Farbstoff wie Ethidiumbromid, der stark
in der Gegenwart doppelsträngiger
DNA fluoresziert. Die Fluoreszenz aus jeder PCR wird am Ende von
jedem Verlängerungsanteil
von jedem thermischen Zyklus gemessen. Die Signale werden in dem
Computer 18 prozessiert, um die molare Konzentration der
dsDNA, die in jedem Probenröhrchen 16 vorhanden
ist, zu messen. Die Serie von DNA-Konzentrationen, die so für jedes
Reaktionsröhrchen
während
jedem Verlängerungszeitraum
von jedem PCR-Zyklus gemessen wurde, wird in dem Computer 18 gespeichert.
Die gemessenen Werte gegen die Zykluszahl bestimmen die Wachstumskurve
für die PCR
in jedem Probenröhrchen 16.
-
Der
Computer 18 und das Anwenderinterface 22 können eine
einzelne spezialisierte Vorrichtung oder ein konventioneller, kommerziell
verfügbarer
Personalcomputer (PC) mit einer Tastatur und einem Videomonitor
sein. Der Computer 18 und das Anwenderinterface werden
zur Darstellung der Wachstumskurvendaten, zur Eingabe von Instruktionen
an das Tabellenkalkulationsprogramm in dem Computer, die Verarbeitung
der Daten der Wachstumskurve und die Anzeige der PCR-Ergebnisse
sowie zum zur Verfügung
stellen notwendiger thermischer Zyklussteuerungen verwendet. Der
Computer 18 führt
ein Multivariablen kleinstes Quadratkurvenanpassungsverfahren zur Bestimmung
der charakteristischen Parameter für jede der PCRs durch, die
die beste Anpassung an die Modellgleichung ergeben.
-
Somit
wird man zu schätzen
wissen, dass die Echtzeitbeobachtung von DNA während der thermischen Zyklusdurchführung gemäß der vorliegenden
Erfindung es möglich
macht, die molekulare Konzentration der Ausgangskopien der Ziel-
oder Template-DNA vorauszusagen, und dass sogar, obwohl die Primerkonzentration
verausgabt sein kann oder das exponentielle Amplifikationsverfahren
nicht vollständig
durchgeführt wurde.
Es wurde herausgefunden, dass die Form der Wachstumskurve des dsDNA-Produkts
während
eines PCR-Verfahrens in einzigartiger Weise durch die folgende Modellgleichung
bestimmt wird:
worin:
C
n+1 und
C
n die molaren Templatekonzentrationen sind,
die während
der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume gemessen
wurden;
e
V ist die Wahrscheinlichkeit,
dass das Template den nächsten
Zyklus überlebt;
e
S ist die Wahrscheinlichkeit, dass das Template
synthetisiert wird;
C
O ist die molare
Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
C
po ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers; und
a ist der theoretische Primer-/Komplementärstrang-Kompetitionsfaktor.
-
Die
Wachstumskurve der Konzentration gegen die Zykluszahl gemäß dieser
Gleichung ist eine einzigartige Kurve. Es gibt nur eine Kombination
der charakteristischen Parameter eS, eV, a und CO, die
die oben genannte Gleichung an die gemessenen Werte der tatsächlichen
Wachstumskurve für
eine bestimmte PCR anpasst.
-
Der
Parameter eS kann als ein Maß der Effizienz
der Synthese einer gegebenen Template ssDNA in dsDNA angesehen werden.
Der Parameter eV kann als ein Maß der Effizienz
des Überlebens
einer Template ssDNA von einem Zyklus zum nächsten Zyklus angesehen werden.
Diese zwei Parameter beschreiben hauptsächlich die Form oder Steigung
des exponentiellen Teils der Wachstumskurve (welcher als ein geradliniger Anteil
der Wachstumskurve erscheint, die in 2 gezeigt
wird).
-
Der
obere gekrümmte
Anteil der Wachstumskurve wird durch den Begriff „a" beschrieben, der
ein Maß der
Kompetition zwischen den Primern und den komplementären Strängen für das Annealing
eines gegebenen Ziel-DNA-Segments darstellt. Die Form oder Krümmung dieses
oberen Teils wird eine sehr allmähliche
Kurve sein, wenn es einen wesentlichen Überschuss an sowohl Primern
wie auch Enzymen gibt. Jedoch, wenn die Primerkonzentration derartig
beschränkt
ist, dass sie verbraucht wird, wie in Primer-beschränkter PCR,
dann wird der Kurvenanteil die gleiche Form haben, aber er wird
seine horizontale Asymptote erreichen, die die Konzentration des
Endprodukts und den Primerverbrauch anzeigt.
-
Es
gibt eine Reihe von nützlichen
Anwendungen, auf die diese Erfindung angewendet werden kann. Zum
Beispiel ist es für
die gemessene PCR nicht notwendig, dass sie vollständig ausgeführt wird,
z. B., Verbrauch von mindestens einem Reagenz in der Mischung. Es
ist lediglich notwendig, eine wesentliche Anzahl von Zyklen durchzuführen, damit
eine Amplifikation oberhalb des Wertes des nicht spezifischen Hintergrundsignals
erreicht wird, und dass Werte der charakteristischen Parameter bestimmt
werden können.
-
Die
sukzessiven Approximationen, die von einem konventionellen Tabellenkalkulationsprogramm
verwendet werden, wie die „Solver"-Formel in Microsoft
Excel, sind besonders geeignet und werden zur Lösung der Gleichung für diesen
einzigartigen Satz an charakteristischen Parametern verwendet. Wenn
es eine nicht ausreichende Enzymaktivität gibt, um die Synthese von
allen geprimten Einzelsträngen
zu vervollständigen, die
während
der Annealing-/Verlängerungszeiten
gebildet werden, dann wird die Wachstumskurve Enzym-beschränkt.
-
Die
Primer-beschränkte
Aktivität,
die hier zuvor diskutiert wurde, kann dahingehend ausgeweitet werden,
die Wirkungen der Enzymbeschränkung
auf die Wachstumskurve mit aufzunehmen.
-
Dieses
wird durch das Durchführen
einer Parallelberechnung bei jedem Zyklus zum Herausfinden der maximal
möglichen
Anzahl von Basen durchgeführt,
die durch die Enzymaktivität
polymerisiert werden können,
die bei diesem Zyklus vorhanden ist.
-
Berechne
aus der bekannten anfänglichen
Enzymaktivität
in „Einheiten" die anfängliche
molare Konzentration CZO. Für Taq-Polymerase
ist CZO = 3,55 × 10–10 (Mol/Liter)/(Einheit/100 μL). CZ kann sich mit höheren Zyklen verringern.
-
Die
spezifische Aktivität
der Polymerase, AZ, in Mol Basen, die pro
Sekunde pro Mol Enzym synthetisiert werden, variiert mit der Temperatur,
Mg2+ und dem Reaktionsprodukt Pyrophosphat
P2O7 4–.
-
In
diesem Fall wird angenommen, dass die Enzymmolarität C
Z sich nicht wesentlich ändert, aber dass die spezifische
Aktivität
exponentiell durch den Aufbau von Pyrophosphat gehemmt wird. Somit
gilt
worin A
max die
nicht gehemmte spezifische Aktivität ist
k
j ist
die Konzentration von [P
2O
7],
die die Aktivität
bei A
maxe
–1 blockiert.
-
Dies
resultiert in einem Pyrophosphat für jede polymerisierte Base,
somit für
doppelsträngige
Molarität Cn: [P2O7] = 2(Cn – CO)(Lt – Lp).
-
Unter
Verwendung der Annahme, wie AZ(n) mit n
variiert, ist das maximal mögliche
Wachstum der Template-Molarität
am n ten Zyklus:
-
-
Hier
ist tX die Verlängerungszeit in Sekunden, Lt ist die Länge des Templates in Basen,
LP ist die Länge der Primer in Basen.
-
Um
die Enzymbeschränkung
zu der Primer-beschränkten
PCR hinzuzufügen,
die hier zuvor diskutiert wurde, beträgt das Inkrement von jedem
Zyklus weniger als die Primer- oder
die Enzymgrenze. Die Berechnung von Cn+1 ändert sich
zu:
-
-
Die
folgenden Beispiele illustrieren die Anwendung der vorliegenden
Erfindung auf das PCR-Verfahren.
-
BEISPIELE
-
Die
Rohdaten aus dem Higuchi et al. Bericht für 108 anfängliche
Kopien von HIV ssDNA pro 100 μL wurden
auf Mol pro Liter umgerechnet und gegen die Zykluszahl aufgetragen.
Die Ergebnisse werden grafisch durch die durchgezogene Linie dargestellt,
die in 2 gezeigt wird. Die Daten werden auch in einen
Computer eingegeben und mittels dem Excel-Tabellenkalkulationsprogramm
mit der theoretischen Gleichung verglichen, um beste Anpassungswerte
für eS, eV und a zu etablieren,
wenn CO auf die bekannte molare Konzentration
eingestellt wurde, was mit 108 Kopien in
dem 100 μL
Reaktionsvolumen korrespondiert. Die resultierende Kurve wird als
gestrichelte Linie in 2 gezeigt.
-
3 ist
eine Grafik der berechneten anfänglichen
Kopien gegen bekannte anfängliche
Kopien. Sie basiert nur auf einem Satz von eS,
eV und a-Werten, der durch die beste Anpassung
der Gleichung, die oben gezeigt wird, an die Daten von Higuchi et
al. für
108 Ausgangskopien als einzigem Standard
bestimmt wurden. Diese charakteristischen Parameter eS,
eV und a wurden in der Gleichung festgelegt.
Die Gleichung wurde dann in dem Excel-Tabellenkalkulationsprogramm
verwendet, um die berechneten anfänglichen Kopien allein durch
das Variieren von CO, um eine beste Anpassung
an jeden der fünf
anderen Datensätze
von Higuchi et al. zu erhalten, zu bestimmen. 3 zeigt,
dass es eine sehr gute Übereinstimmung,
fast 1 zu 1, zwischen den tatsächlichen
bekannten anfänglichen
Kopien und den berechneten anfänglichen
Kopienwerten gemäß der Gleichung
gibt, außer
für die
geringe berechnete Kopienzahl von 102 anfänglichen Kopien.
Dieses ist wahrscheinlich dadurch bedingt, dass es eine zusätzliche
signifikante nicht spezifische Reaktion gibt, die mehr DNA als die
spezifische Reaktion herstellt.
-
Es
muss betont werden, dass die Molarität des PCR-Produkts nachprüfbar sein
muss, damit das Modellverhältnis
hält. Somit
muss die gemessene Fluoreszenz in Mol pro Liter der Reagenzmischung
umrechenbar sein. Es ist nicht notwendig, Fluoreszenz zu verwenden,
um die Konzentration des Produkts nachzuweisen und zu messen. Fluoreszenz
war nur einfach nur die hier verwendete Technik. Es kann jegliche
beobachtbare Technik oder jedes nicht destruktive messbare Phänomen kann
verwendet werden.
-
Die
Wachstumskurvenformparameter können
auf verschiedene Weisen angewendet werden. Die genaue Quantifizierung
der anfänglichen
Kopienzahl unter Verwendung eines Standards mit bekannter Konzentration
ist, wie oben beschrieben, möglich.
Wenn eine Probe Ziel-DNA-Template mit bekannter Konzentration verfügbar ist,
kann sie in einer Primer-beschränkten
PCR verwendet werden, um eine oder mehrere Wachstumskurven zu erhalten.
Führe zuerst
die PCR mit den bekannten Anfangstemplate- und Primerkonzentrationen
durch, um eine oder mehrere Modellwachstumskurven zu erhalten. Dann
passe die Daten der Primer-beschränkten Modellkurven an die Gleichung
für die
Wachstumskurven unter Verwendung der bekannten Anfangstemplate-
und Primerkonzentrationen an und bestimme die besten Anpassungswerte
für die
drei charakteristischen Parameter eS, eV und a. Dann führe PCRs unter identischen
Bedingungen mit Proben mit unbekannten Ausgangskonzentrationen des
Templates durch und nimm die Wachstumskurvendaten auf. Bestimme unter
Festlegung der drei soeben mit dem Standard bestimmten charakteristischen
Parameter die Ausgangstemplatekonzentration von jeder unbekannten
Probe als den Wert, der die berechnete Wachstumskurve am Besten
an die gemessene Wachstumskurve anpasst. Unter Verwendung dieses
Verfahrens kann die Ausgangskonzentration im Vergleich zu dem Higuchi
et al. Verfahren genauer bestimmt werden. Dies ist so, da sämtliche
Daten der Wachstumskurve verwendet werden, im Vergleich zu nur einem
oder wenigen Punkten entlang der Wachstumskurve.
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Die
Abschätzung
der Ausgangskonzentration eines Templates ohne jeglichen Standard
von bekannter Konzentration ist auch möglich. Wenn kein Standard mit
bekannter Templatekonzentration verfügbar ist, dann führe zuerst
eine Primer-beschränkte
PCR mit der unbekannten Probe durch nimm ihre Wachstumskurve auf. Dann
variiere unter Festlegung nur der bekannten Primerausgangskonzentration
die Kurvenwachstumsformparameter (die charakteristischen Parameter
eS, eV und a) zusammen
mit der anfänglichen
Templatekonzentration CO, um eine beste
Anpassung der vier Parameter an die gemessenen Wachstumskurvendaten
zu erhalten. In den meisten Anwendungen kann eine Anpassung erhalten
werden, die einen nützlichen
genauen Wert für
die Template-Ausgangskonzentration sowie Werte für die anderen charakteristischen
Parameter ergibt.
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Es
ist überraschend,
dass dieses funktioniert. Jedoch ist der Grund dafür, dass
es für
die meisten Anwendungen funktioniert, dass in einer normaler Primer-beschränkten PCR
die Form der Wachstumskurve derart durch das Amplifikationsverfahren
eingeschränkt
ist, dass es keinen großen
Bereich an anfänglichen
Templatekonzentrationen gibt, der eine sinnvolle Anpassung an eine
gemessene Kurve ergibt.
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Die
Untersuchung einer großen
Anzahl von PCRs auf abnormale Reaktionsbedingungen ist auch möglich. Typischerweise
kann eine thermische Zyklusvorrichtung, die mit einer Echtzeitnachweis-
und Beobachtungsvorrichtung verbunden ist, gleichzeitig bis zu 96
PCRs durchführen.
Diese PCRs werden alle identische PCR-Systeme sein, die unter identischen
Bedingungen durchgeführt
werden, wobei nur die Ausgangskonzentration des Templates eine unbekannte
Variable in jeder Reaktion ist. Zudem können einige der Proben bekannte
Konzentrationskontrollstandards sein.
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Alle
diese gleichzeitig durchgeführten
PCRs sollten Wachstumskurven von im Wesentlichen der gleichen Form
aufweisen. Mit anderen Worten, wenn die Daten an die Gleichung angepasst
werden, sind die bestimmten Werte der charakteristischen Parameter
eS, eV und a fast
identisch. Jedoch, wenn unter diesen einige sind, bei denen eine
nicht spezifische Reaktion begonnen hat, oder bei denen ein hemmender
kontaminierender Stoff eingeführt
wurde, oder bei denen die Bedingungen signifikant von der Norm abweichen,
dann werden diese in den meisten Anwendungen gemessene Wachstumskurven
von deutlich unterschiedlicher Form und somit unterschiedliche charakteristische
Parameter aufweisen, und das unabhängig von der Ausgangskonzentration
des Zielmoleküls.
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Es
ist ein Berechnungsverfahren der gemessenen Daten für die Vorrichtung,
das eine computergesteuerte thermische Zyklusvorrichtung mit Echtzeitnachweisfähigkeit
umfasst, zur Messung und Aufnahme der Wachstumskurve von jeder PCR-Probe
und zur Bestimmung ihrer charakteristischen Parameter. Wenn in einer
Probe einer der Parameter signifikant von der bekannten Norm für die PCR
abweicht, oder, wenn es unmöglich
ist, eine Anpassung mit guter Qualität mit einem Satz an Parametern
zu erhalten, ist dies eine Warnung, dass die Messung dieser Probe
unzuverlässig
sein kann. Eine Anpassung mit guter Qualität ist eine solche, bei der
der quadratische Mittelwert des Fehlers der Anpassung mit dem bekannten
Hintergrund der Messung vergleichbar ist.
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Zum
Beispiel sollte ein Wert für
eS ungefähr
1,0 betragen. Ein Wert von eS, der signifikant
größer als 1,0
ist, zeigt an, dass eine parallele nicht spezifische Amplifikationsreaktion
mitlaufen könnte.
Ein abnormer Wert für
a zeigt falsche Zyklustemperaturen oder Reagenzkonzentration an.
Ein Wert von eV von deutlich weniger als
1,0 kann die Gegenwart eines Hemmstoffes anzeigen. Und falls der
RMS-Fehler der besten Anpassung 5 Mal dem bekannten Messhintergrund
entspricht, dann ist es sehr wahrscheinlich, dass mit der PCR oder
der Messung etwas falsch ist.
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Umgekehrt,
wenn die Qualität
der Anpassung der Gleichung an die gemessene Kurve gut ist, mit
einem quadratischen Mittelwert des Fehlers von nicht mehr als dem
bekannten Fehler der Messung des Nachweissystems und die charakteristischen
Parameter nahe an ihren erwarteten Normwerten liegen, dann ist dieses
ein starker Beweis, dass die Messung einer jeden solchen PCR zuverlässig und
wahrscheinlich genau ist.
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In
einer bevorzugten Form der Erfindung wird eine automatisierte Vorrichtung
zur Bewertung der erwarteten Zweckdienlichkeit einer Polymerasekettenreaktion
in einer Reaktionsmischung in Echtzeit zur Verfügung gestellt, die geeignete
Puffer, zwei komplementäre
Arten von Oligonukleotidprimern, einen molaren Überschuss von vier Arten von
Nukleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase und eine unbekannte
molare Ausgangskonzentration von Zielnukleinsäuremolekülen enthält, worin besagte zwei Arten
von Primern in einer bekannten molaren Konzentration (Cpo)
zur Verfügung
gestellt werden und worin mindestens eine Art der besagten zwei
Arten von Primern oder vier Arten von Nukleosidtriphosphaten mit
einem Reportermolekül
markiert sind, das kein starkes Signal in der Abwesenheit doppelsträngiger DNA
aussendet, aber die dsDNA, die durch die Reaktion hergestellt wird,
mindestens einmal pro Zyklus nachweisbar und messbar macht, wobei
besagte Vorrichtung das folgende umfasst:
- a)
eine thermische Zyklusvorrichtung für die thermische zyklische
Durchführung
einer oder mehrerer Standardreaktionsmischungen, die im Wesentlichen
in jeder Beziehung die gleichen sind, außer dass sie eine bekannte
molare Ausgangskonzentration der Zielnukleinsäuremoleküle aufweisen, um eine oder
mehrere Wachstumskurven mit bekannten molaren Ausgangskonzentrationen
von Zielnukleinsäuremolekülen zu erhalten;
- b) ein Nachweissystem einschließlich Mittel zur Anregung besagter
Reaktionsmischung während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem Zyklus und Mittel zum Nachweis und zur Messung der Intensität von besagtem
Signal während
mindestens dem Verlängerungsanteil
von jedem der besagten Zyklen;
- c) einen Mikrocomputer, der mit besagtem Nachweissystem verbunden
ist, zur Aufnahme von Signalen daraus und zur Umrechnung besagter
Intensität
in molare Konzentrationswerte der dsDNA in besagter Mischung und
zur Speicherung besagter molarer Konzentrationswerte für jeden
der besagten Verlängerungsanteile
von jedem der besagten Zyklen;
- d) ein Anwenderinterface, das mit besagtem Computer und besagter
thermischer Zyklusvorrichtung verbunden ist, zur Eingabe von Anwenderinstruktionen
an besagten Computer und zur Anzeige von Ergebnisinformationen;
wobei besagter Computer das Folgende umfasst:
- i) Mittel zur Generierung einer gemessenen Kurve der molaren
Konzentration der dsDNA gegen die Zykluszahl aus besagten gespeicherten
Konzentrationswerten;
- ii) Mittel zur Verwendung sukzessiver Approximationen zur Bestimmung
charakteristischer Parameterwerte von eV,
eS und a, die eine beste Anpassung der gemessenen
Kurve an besagte eine oder mehrere bekannte(n) Wachstumskurve(n)
gemäß dem folgenden
Verhältnis
zur Verfügung
stellen: worin:
Cn+1 und Cn die molaren
DNA-Zielkonzentrationen, die während
der n ten und n + 1 ten Zyklusverlängerungszeiträume gemessen
wurden, sind;
eV ist theoretisch die
Wahrscheinlichkeit, dass das Zielmolekül den nächsten Zyklus überlebt;
eS ist theoretisch die Wahrscheinlichkeit,
dass das Zielmolekül
synthetisiert wird;
CO ist die molare
Konzentration der anfänglichen
Zielnukleinsäuremoleküle;
CZ ist die molekulare Konzentration des Polymeraseenzyms;
AZ ist die spezifische Aktivität des Polymeraseenzyms;
tX ist die Verlängerungszeit in Sekunden;
Lt ist die Länge des Templates in den Basen;
Lp ist die Länge des Primers in Basen;
Cpo ist die molare Ausgangskonzentration des
Primers;
a ist der Primer-/Komplementärstrang-Kompetitionsfaktor;
und
- (iii) Mittel zur Berechnung der molaren Konzentration der Ausgangsnukleinsäure der
unbekannten Proben durch Festlegung von eV,
eS, a, CZ(n) und
AZ(n) und Anpassung der Anfangskonzentration
Co, um eine beste Anpassung an die gemessene
Wachstumskurve von jeder unbekannten Probe zu erhalten.
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Es
ist somit zu erkennen, dass die vorliegende Erfindung tatsächlich ein
neues und verbessertes Verfahren und eine Vorrichtung für die quantitative
Analyse von Nukleinsäureproben
wie DNA in einem Polymerasekettenverfahren (PCR)-Verfahren zur Verfügung stellt.
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Obwohl
bestimmte Ausführungsformen
der Erfindung hierin zum Zwecke der Erklärung offenbart werden, wird
eine weitere Abwandlung davon nach der Studie dieser Beschreibung
den Fachleuten auf dem Gebiet, an die sich die Erfindung richtet,
offensichtlich sein. Zur Bestimmung des Umfangs der Erfindung sollte auf
die beigefügten
Ansprüche
Bezug genommen werden.
