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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf Verfahren, Apparate und Computerprogrammprodukte
zum Kennzeichnen von Nucleinsäuresequenzen
und genauer gesagt auf Verfahren, Apparate und Computerprogrammprodukte
zum Bestimmen der Mengen von Nucleinsäuresequenzen in Proben.
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Allgemeiner Stand der
Technik
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Die
quantitative Nucleinsequenzanalyse spielt auf den Gebieten der biologischen
und medizinischen Forschung eine zunehmend wichtige Rolle. Beispielsweise
wurde eine quantitative Genanalyse zur Bestimmung der Genommenge
eines bestimmten Gens eingesetzt, wie im Fall des menschlichen HER-2-Oncogens,
das in ungefähr
30% der Fälle
von Brustkrebs beim Menschen amplifiziert wird. D. J. Slamon et
al., Science 235, 177–182
(1987). In jüngerer
Zeit wurde die Gen- und Genomquantifizierung auch bei der Bestimmung
und Überwachung
der Pegel des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) bei einem Patienten
in all den verschiedenen Phasen der HIV-Infektion und Erkrankung
angewandt. M. R. Furtado et al., J Virol. 69, 2092–2100 (1995).
Es wurde behauptet, dass höhere
Pegel von zirkulierendem HIV und das Unvermögen, die Virusreplikation nach der
Infektion wirksam zu kontrollieren, mit einer negativen Prognose
der Erkrankung zusammenhängen könnten; anders
ausgedrückt,
es könnte
ein Zusammenhang zwischen dem Virusgehalt (HIV-Replikation) und
der Pathogenese der Erkrankung bestehen. M. Paitak et al., Science
259, 1749–1754
(1993). Demgemäß kann eine
genaue Bestimmung der HIV-Nucleinsäurepegel
in einer frühen
Phase der Infektion als nützliches
Instrument zur Diagnostizierung der Krankheit dienen, während die
Fähigkeit
zur korrekten Überwachung
der veränderlichen
Pegel an viraler Nucleinsäure
bei einem Patienten im gesamten Krankheitsverlauf den Klinikern
entscheidende Informationen über
die Wirksamkeit einer Behandlung und das Fortschreiten der Erkrankung
liefern kann. Außerdem
stellt die Bestimmung von Virion-assoziierten HIV RNA-Pegeln im
Plasma eine Markierung der Virusreplikation dar, und zwar mit einer
umfassenden potentiellen Anwendbarkeit bei der Bewertung der Wirksamkeit
einer Antiretrovirus-Therapie. Id.
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Mehrere
Verfahren zur quantitativen Analyse von Nucleinsäuresequenzen wurden beschrieben. Die
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die Reverse-Transcriptase-PCR
(RT-PCR) ermöglichten die
Analyse kleiner Ausgangsmengen von Nucleinsäure (d.h. so wenig wie ein
Zelläquivalent).
Siehe z.B. S. Edmands et al. 1994, PCR Methods Applic. 3, 317–19; I.
R. Rodriguez et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20, 3528. Frühe Berichte über eine
quantitative PCR handeln von einer Quantifizierung des PCR-Produkts,
messen jedoch nicht die anfängliche Zielsequenzmenge.
F. Ferre 1992, PCR Methods Applic. 2, 1–9. Im Allgemeinen umfassen
diese Verfahren das Messen des PCR-Produkts am Ende eines Temperaturwärmewechsels
und das In-Beziehung-Setzen dieses Pegels mit der DNA-Ausgangskonzentration.
Leider weist die absolute Menge an erzeugtem Produkt nicht immer
ein folgerichtiges Verhältnis
zur Menge an Zielsequenz auf, die am Beginn der Reaktion vorhanden
ist, und zwar insbesondere bei klinischen Proben. Eine solche „Endpunkt"-Analyse zeigt das Vorhandensein oder
Fehlen einer Ausgangsnucleinsäure,
bietet jedoch im Allgemeinen keine genaue Maßeinheit für die Anzahl von DNA-Zielen.
Id. Sowohl die Kinetik als auch die Effizienz der Amplifikation
einer Zielsequenz hängen von
der Ausgangsabundanz dieser Sequenz ab, sowie von der Sequenzübereinstimmung
der Primer und der Zielmatrize, und können auch von in der Probe
vorhandenen Inhibitoren beeinflusst sein. Bei einer PCR-Analyse
von RNA-Proben sind die variablen Effizienzen sowohl beim Reverse-Transcription-
als auch beim Amplifikationsschritt mögliche Quellen einer Variabilität. Aus diesen
Gründen
liefert ein Vergleich der Menge an von der Probe abgeleitetem PCR-Produkt
mit der Menge an Produkt aus einem separat amplifizierten externen
Kontrollstandard keine genaue Basis für eine Quantifizierung.
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Ein
spezifischer Ansatz für
eine Nucleinsäureamplifikation
besteht in der Messung der Menge an PCR-Produkt in der Logarithmus-Phase
der Reaktion vor dem Plateau. Siehe z.B. Kellogg et al. 1990, Anal. Biochem.
189, 202–208;
S. Pang et al. 1990, Nature 343, 85–89. Dieses Verfahren erfordert,
dass jede Probe dieselben Einsatzmengen an Nucleinsäure aufweist
und dass jede Probe bei der Analyse mit identischer Effizienz amplifiziert,
und zwar bis hinauf zur quantitativen Analyse. Eine Gensequenz (die
in allen Proben in einer relativ konstanten Menge vorhanden ist)
kann für
eine Normalisierung der Effizienz der Probenamplifikation verwendet
werden. Bei Anwendung herkömmlicher
Verfahren zur PCR-Detektion und Quantifizierung ist es jedoch äußerst mühsam sicherzustellen,
dass alle Proben während der
Logarithmus-Phase der Reaktion analysiert werden, und zwar sowohl
für das
Zielgen als auch für
das Normalisierungsgen.
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Ein
weiteres Verfahren, die quantitative Konkurrenz-PCR (QC-PCR), wurde
entwickelt und ebenfalls weithin für die PCR-Quantifizierung verwendet. Siehe
z.B. P. D. Siebert und J. W. Larrick 1992, Nature 359, 557–558; M.
J. Piatak et al. 1993, BioTechniques 14, 70–81; X. Tan et al. 1994, Biochim.
Biophys. Acta 1215, 157–162;
L. Raeymaekers 1995, Genome Res. 5, 91–94. Die QC-PCR beruht auf
der Einbeziehung einer bekannten Menge eines internen Kontrollkonkurrenten
bei jeder Reaktionsmischung. Die Effizienz jeder Reaktion wird auf
den internen Konkurrenten normiert. Um eine relative Quantifizierung
zu erhalten, wird das unbekannte Ziel-PCR-Produkt üblicherweise
durch Gelelektrophorese mit dem bekannten Konkurrenz-PCR-Produkt
verglichen. Die relative Menge an zielspezifischer und Konkurrenz-DNA
wird gemessen; dieses Verhältnis
wird zur Berechnung der Ausgangszahl von Zielmatrizen herangezogen.
Grundsätzlich
ist bei dieser Art von Analyse die DNA-Ausgangskonzentration umso
höher,
je größer das
Verhältnis
zwischen zielspezifischem Produkt und konkurrenzspezifischem Produkt
ist. Der Erfolg einer QC-PCR-Analyse
beruht auf der Entwicklung einer internen Kontrolle, welche mit
derselben Effizienz wie das Zielmolekül amplifiziert. Das Design
des Konkurrenten und die Prüfung
der Amplifikationseffizienzen erfordern jedoch großen Aufwand.
Beim QC-PCR-Verfahren zur RNA-Quantifizierung wird eine konkurrierende
RNA-Matrize, welche auf die Zielsequenz, die von Interesse ist,
abgestimmt ist, sich von dieser aber durch eine eingebrachte interne
Deletion unterscheidet, bei einer konkurrierenden Titration der
Reverse-Transcription- und
PCR-Schritte verwendet, wobei sie eine strikte interne Kontrolle
schafft. Siehe z.B. A. Rashtchian 1994, PCR Methods. Applic. 4,
S83–S91.
M. Clementi et al. 1993, PCR Methods Applic. 2, 191–196; M. Becker-Andre
1991, Meth. Molec. Cell. Biol. 2, 189–201; R. K. McCulloch et al.
1995, PCR Methods Applic. 4, 219–226. Zunehmende Mengen bekannter Kopienzahlen
einer konkurrierenden Matrize werden zu Replikationsanteilen der
Testprobe hinzugefügt, und
die Quantifizierung beruht auf einer Bestimmung der relativen (nicht
absoluten) Mengen der verschieden bemessenen amplifizierten Produkte,
die von den Wildtyp- und konkurrierenden Matrizen abgeleitet sind,
und zwar nach einer elektrophoretischen Trennung.
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Abgesehen
davon, dass sie ein zeitaufwendiges und mühsames stromabwärts gerichtetes
Processing wie z.B. eine Hybridisierung oder Gelelektrophorese erfordern,
sind diese Analysen im dynamischen Bereich eingeschränkt (d.h.
hinsichtlich der Sensibilität
gegenüber
einem Bereich von Zielnucleinsäurekonzentrationen).
Bei Konkurrenzanalysen kann die Sensibilität gegenüber Unterschieden in der Matrizenkonzentration
beispielsweise beeinträchtigt werden,
wenn entweder die Ziel-DNA oder die hinzugefügte Konkurrenz-DNA in viel größerer Menge
als die jeweils andere vorhanden ist. Der dynamische Bereich der
die Menge an Endprodukt messenden Analysen kann auch dadurch eingeschränkt sein, dass
die gewählte
Anzahl an Zyklen bei manchen Reaktionen vor den anderen Reaktionen
eine „Plateau"-Stufe des Produkts
erreicht haben könnte.
Siehe z.B. L. Raeymaekers, oben. Unterschiede in den Matrizen-Ausgangspegeln
könnten
daher bei diesen Reaktionen nicht gut widergespiegelt werden. Weiters
können
geringe Unterschiede in der gemessenen Menge an Produkt zu weithin
variierenden Schätzungen
der Matrizen-Ausgangskonzentration führen, was Ungenauigkeiten aufgrund
veränderlicher
Reaktionsbedingungen, Veränderungen
bei der Probenahme oder aufgrund des Vorhandenseins von Inhibitoren
zur Folge hat.
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Im
Bestreben, den zur Bestimmung einer anfänglichen Nucleinsäuremenge
nötigen
Umfang an Postamplifikationsanalyse zu verringern, wurden zusätzliche
Verfahren zur Messung der Nucleinsäureamplifikation in „Echtzeit" entwickelt. Diese
Verfahren nutzen im Allgemeinen fluoreszierende Markierungen (z.B.
fluoreszierende Farbstoffe), welche die Menge an Nucleinsäure, die
amplifiziert wird, anzeigen können,
und nutzen das Verhältnis zwischen
der Anzahl an Zyklen, die zur Erzielung eines ausgewählten Fluoreszenzsignalpegels
erforderlich ist, und der Konzentration von amplifizierbaren Zielen,
die am Beginn des PCR-Prozesses vorhanden sind. Die EP-A-0 640 828
beschreibt beispielsweise eine quantitative Analyse für eine amplifizierbare
Nucleinsäure-Zielsequenz,
welche die Anzahl an Temperaturzyklen, die zum Erreichen einer bestimmten
Konzentration von Zielsequenz erforderlich ist, mit der Menge an
Ziel-DNA, die am Beginn des PCR-Prozesses vorhanden ist, in eine
Wechselbeziehung bringt. Bei diesem Analysesystem wird ein Satz
von Reaktionsmischungen für
die Amplifikation vorbereitet, wobei eine Zubereitung eine unbekannte
Konzentration an Zielsequenz umfasst und andere Zubereitungen bekannte
Konzentrationen (Standards) der Sequenz enthalten. Die Reaktionsmischungen
enthalten auch einen fluoreszierenden Farbstoff, der fluoresziert,
wenn er an doppelsträngige
DNA bindet. Die Reaktionsmischungen werden für eine Reihe von Zyklen parallel
in einem Wärmekreislauf
geführt,
um eine ausreichende Amplifikation der Ziele zu erreichen. Die von
den Reaktionsmischungen ausgestrahlte Fluoreszenz wird in Echtzeit überwacht
(d.h. beim Auftreten der Amplifikationsreaktionen), und die Anzahl
an Zyklen, die für
jede Reaktionsmischung erforderlich ist, um bis zu einer beliebigen
Intensitätsschwelle
(einem beliebigen Fluoreszenzwert oder AFV) fluoreszieren zu können, wird
bestimmt. Die Anzahl an Zyklen, die für die Mischung einer unbekannten
Nucleinsäure
zur Erreichung des AFV-Werts erforderlich
ist (CT), wird danach mit der Anzahl an Zyklen,
die für
die bekannten Mischungen zur Erreichung des AFV-Werts erforderlich
ist, verglichen. Dieses Verfahren beruht auf einem direkten Zusammenhang
zwischen der Anzahl an Zyklen, die zur Erzielung einer bestimmten
Fluoreszenzintensität
erforderlich ist, und dem Logarithmus der Konzentration der Nucleinsäureziele.
Dieses Verhältnis
wird somit verwendet, um in der Mischung von unbekannter Konzentration
die anfängliche
Menge an Zielnucleinsäuresequenz
zu erhalten. Das Verfahren sorgt für die Auswahl eines beliebigen
Schwellenwerts, an dem die Anzahlen von Amplifikationszyklen zu
messen sind, und zwar indem aufgezeichnete Amplifikationsprofile
(Amplifikationskurven) analysiert werden, um einem AFV zu finden,
bei dem die unbekannten Amplifikationsprofile mit dem Standard-Amplifikationsprofil
zu vergleichen sind. Der anfänglichen
Auswahl des AFV- oder Grenzwerts wird jedoch keine besondere Bedeutung
zugeschrieben, da ein beispielhafter AFV-Wert dazu ausgewählt wird,
in der Mitte eines Bereichs zu liegen, in dem alle Amplifikationskurven
relativ gerade sind (d.h. im Übergang
von einer exponentiell ansteigenden Amplifikation zu einer Abwärtskurve,
bis hin zu einer Asymptote). Überdies
werden ähnliche
Ergebnisse bei der Nucleinsäurequantifizierung
für einen
recht umfassenden Bereich von AFV-Werten gemeldet. Ein Defizit dieses bekannten
Verfahrens besteht darin, dass das Verfahren unterhalb einer anfänglichen
Kopienzahl von 103 Zielsequenzmolekülen hinsichtlich
einer genauen Bestimmung der Anfangskonzentration unzuverlässig ist.
Ein weiteres Defizit dieses Verfahrens besteht darin, dass angenommen
wird, dass die Form jeder Amplifikationskurve dieselbe bleibt, egal,
ob dies tatsächlich
der Fall ist oder nicht. Letztendlich werden nur einige Datenpunkte
in der Nähe
des beliebigen Grenzwerts zur Bestimmung der anfänglichen Zielnucleinsäurekonzentration
herangezogen.
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C.
A. Heid et al. 1996 (Genome Research 6, 986–994) und U. Gibson et al.
1996 (Genome Research 6, 995–1001)
berichten über
Verfahren zur quantitativen Echtzeit-PCR für eine DNA- bzw. RNA-Quantifizierungsanalyse.
Beide Analysen nutzen Doppelfluoreszenz-Reportersysteme und beruhen
auf der Verwendung der 5'-Nuclease-Analyse, die
von Holland et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276–7280, beschrieben
wurde. Bei diesen Verfahren erzeugt ein Computeralgorithmus ein
Amplifikationsdiagramm durch einen Vergleich der Menge an Reporterfarbstoff-Emission
mit der Anzahl an Amplifikationszyklen, die aufgetreten sind. Der
Algorithmus berechnet den Zyklus (CT), bei
dem jede PCR-Amplifikation
einen willkürlich
ausgewählten Schwellen-
oder Grenzwert (d.h. üblicherweise
das 10-Fache der Standardabweichung von der Grundlinie) erreicht.
Die relative Fluoreszenzemissionsschwelle beruht auf der Grundlinie
der Reporterfarbstoff-Emission während
der ersten 10–15
Amplifikationszyklen. Es wurde gezeigt, dass der berechnete CT-Wert
zur Anzahl der in der Probe vorhandenen Zielkopien proportional
ist. Somit erweist sich der CT-Wert als
quantitative Messung der Kopien des Ziels, die in jeder Probe zu
finden sind.
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Wie
in der vorhergehenden Erörterung
aufgezeigt, lehrt der Stand der Technik, dass eine Methode zur Durchführung einer
quantitativen Analyse einer Echtzeit-Nucleinsäureamplifikation darin besteht,
eine Reihe von Ablesungen genau oberhalb und unterhalb eines auserkorenen
Grenzpegels auszuwählen,
eine lineare Regression an diese Punkte anzupassen und für jene „Zykluszahl" aufzulösen, bei welcher
die angepasste Linie den Grenzpegel durchschneidet. Die Auswahl
eines Grenzpegels ist demgemäß einigermaßen willkürlich, wie
das Auswählen eines
Grenzpegels, der etwa das 10-Fache eines Grundlinienwerts ist, oder
des Höchstwerts
von Proben, die kein Ziel enthalten, oder eines bestimmten Grenzpegels,
wobei das Darüberliegende
als akzeptabler "Lärm" angesehen wurde.
Ein Defizit eines solchen Grenz-Auswahlkriteriums besteht darin,
dass eine lineare Anpassung an die Daten unangebracht ist, wenn
der Grenzwert mit einem Zeitpunkt in der Amplifikation übereinstimmt,
während
welchem sich die Amplifikationsgeschwindigkeit verändert (d.h.
in einer frühen
Phase der Amplifikation).
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Früher wurde
nicht erkannt, dass geringe Unterschiede in der Auswahl von Grenzpegeln,
die bei Quantifizierungsalgorithmen verwendet werden, eine erhebliche
Auswirkung auf die endgültige
Qualität
(d.h. Genauigkeit) der Quantifizierung haben können. Es besteht weiterhin
ein Bedarf an der Bereitstellung eines objektiven und automatischen
Verfahrens zum Auswählen
bevorzugter Grenzwerte, welches den Anwendern von Amplifikations verfahren eine
genauere und zuverlässigere
Bestimmung der Anfangskonzentrationen von Zielnucleinsäuren ermöglicht,
als dies bei derzeitigen Verfahren der Fall ist. Es besteht auch
weiterhin ein Bedarf an der Bereitstellung von Verfahren zur Bestimmung
dynamischer Grenzpegel, die von einem Versuch oder von einer Bestimmung
zum anderen bzw. zur anderen leicht verändert werden können.
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Kurzfassung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung
verbesserter Verfahren, Apparate und Computerprogrammprodukte zum
Bestimmen der Mengen von Nucleinsäuresequenzen in Testproben.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
von Verfahren, Apparaten und Computerprogrammprodukten zum genaueren
Messen der Mengen von Nucleinsäuresequenzen
in Testproben, wobei eine Mehrzahl von Kalibrier- und Vergleichsproben
verwendet wird, welche entsprechende bekannte Mengen der Nucleinsäuresequenz
enthalten.
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Diese
und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden gemäß der vorliegenden
Erfindung bereitgestellt durch Verfahren, Apparate und Computerprogrammprodukte
zum Bestimmen der Mengen von Nucleinsäuresequenzen, die amplifiziert
werden, wobei ein bevorzugter Grenzpegel verwendet wird, welcher
durch ein statistisches Kriterium bestimmt wird. Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden insbesondere eine Mehrzahl von
bekannten Mengen einer Nucleinsäuresequenz in
entsprechenden Kalibrierproben (d.h. Standards) und eine unbekannte
Menge der Nucleinsäuresequenz
in einer Testprobe während
eines Zeitintervalls parallel amplifiziert. Diese Proben können beispielsweise
unter Anwendung eines isothermen Amplifikationsreaktionsverfahrens
wie z.B. der Strangverdrängungsamplifikation
(SDA) oder eines Wärmewechselreaktionsverfahrens
wie z.B. der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden.
Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenz, die in den Kalibrier-
und Testproben amplifiziert wird, werden danach unter Anwendung
herkömmlicher
Techniken an Messpunkten im Zeitintervall gemessen. Die Kennwerte
der Mengen der Nucleinsäuresequenz,
die amplifiziert wird, können
die Form von Fluoreszenzsignalen (z.B. Fluoreszenzintensitäten oder
einer nachweisbaren Fluoreszenzenergieübertragung) annehmen, wenn
die Proben fluoreszierende Indikatoren (z.B. fluoreszierende Farbstoffe,
Markierungen, interkalierende Substanzen etc.) enthalten. Andere
Kennwerte, die für
eine Echtzeitmessung geeignet sind (z.B. radioaktive Signale), können ebenfalls
verwendet werden.
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Danach
wird ein Schritt durchgeführt,
um für einen
ersten potentiellen Grenzpegel einen entsprechenden ersten Satz
von Zeitpunkten im Zeitintervall zu bestimmen, in dem die gemessenen
Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenz, die in jeder Kalibrierprobe
amplifiziert wird, dem ersten Grenzpegel entsprechen. Dieser Schritt
wird danach für
jeden aus einer Anzahl von verschiedenen potentiellen Grenzpegeln
wiederholt, so dass für
jeden potentiellen Grenzpegel entsprechende Sätze von Zeitpunkten im Zeitintervall
erhalten werden können.
Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird danach ein Schritt
durchgeführt,
um bezüglich
eines statistischen Kriteriums zu bestimmen, welcher der Sätze von
Punkten im Zeitintervall das statistische Kriterium verglichen mit
den bekannten Mengen der Nucleinsäuresequenz in den Kalibrierproben
besser erfüllt.
Eine Menge der Nucleinsäuresequenz
in der Testprobe wird dann basierend auf jenem Satz von Punkten
bestimmt, von dem festgestellt wurde, dass er das statistische Kriterium
besser oder am besten erfüllt.
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Der
Schritt des Bestimmens, welcher der Sätze von Punkten das statistische
Kriterium besser erfüllt,
kann den Schritt des Bestimmens, welcher der Sätze von Punkten im Zeitintervall
eine bessere lineare Anpassung gegenüber Logarithmen der bekannten
Ausgangsmengen der Nucleinsäuresequenz
in den Kalibrierproben liefert, umfassen. Vorzugsweise umfasst dieser
Schritt die Schritte des Anpassens von Regressionslinien an entsprechende „Graphs" jedes Satzes von
Zeitpunkten im Zeitintervall über Logarithmen
der bekannten Ausgangsmengen der Nucleinsäuresequenz in den Kalibrierproben.
Daraufhin werden Standardabweichungen der Anpassungen zwischen jedem
Satz von Zeitpunkten und entsprechenden Regressionslinien bestimmt.
Der Satz von Zeitpunkten, der vorzugsweise mit der geringsten Standardabweichung
der Anpassung übereinstimmt,
wird dann dazu verwendet, aus den potentiellen Grenzpegeln den bevorzugten
Grenzpegel auszuwählen
und danach, basierend auf dem bevorzugten Grenzpegel, die Ausgangsmenge
der Nucleinsäure
in der Testprobe zu bestimmen. Dieses vorteilhafte Ergebnis wird
vorzugsweise dadurch erzielt, indem eine Zeit bestimmt wird, in
der die gemessenen Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenz
in der Testprobe dem bevorzugten Grenzpegel entsprechen, und diese
Zeit daraufhin an die „bevorzugte" Regressionslinie
angepasst wird, die mit dem bevorzugten Satz von Zeitpunkten übereinstimmt. Der
Logarithmus der Ausgangskonzentration der Nucleinsäuresequenz
in der Testprobe kann danach aus der bevorzugten Regressionslinie
ermittelt werden.
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Gemäß einem
weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine
Kurvenanpassungsoperation durchgeführt, um den bevorzugten Kennwert-Grenzpegel
(z.B. den bevorzugten Fluoreszenzsignal-Grenzpegel) genauer abzuschätzen. Vorzugsweise
sind entsprechende „Daten"-Kurven insbesondere
an „Graphs" von gesonderten
Punkten der gemessenen Fluoreszenzsignale einzelner Kalibrier- und
Testproben angepasst, und zwar verglichen mit Punkten im Zeitintervall,
in dem die entsprechenden Fluoreszenzsignale gemessen wurden. Hier kann
eine nicht parametrische Kurvenglättungsoperation durchgeführt werden,
nachdem die gesonderten Punkte auf eine gemeinsame Grundlinie normiert wurden.
Wie von den Erfindern hier festgestellt, ist es möglich, die
Genauigkeit des bevorzugten Kennwert-Grenzpegels sogar noch weiter
zu verbessern, indem für
alle „geglätteten" Datenkurven untere
Vertrauensgrenzkurven ermittelt werden. Die unteren Vertrauensgrenzkurven
können
ebenso unter Anwendung einer nicht parametrischen Glättungsoperation
geglättet
werden. Jeder der obenstehend beschriebenen Sätze von Zeitpunkten im Zeitintervall kann
dann durch Bestimmung von Schnittpunkten zwischen jeder geglätteten unteren
Vertrauensgrenzkurve und den entsprechenden potentiellen Grenzpegeln
bestimmt werden.
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Wie
obenstehend beschrieben, kann ein Satz von Zeitpunkten, der mit
einer geringsten Standardabweichung der Anpassung übereinstimmt, dazu
verwendet werden, einen bevorzugten Grenzpegel genau zu bestimmen
und danach, basierend auf dem bevorzugten Grenzpegel, die Ausgangsmenge
der Nucleinsäure
in der Testprobe zu bestimmen. Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung können
jedoch Vergleichsproben, die bekannte Ausgangsmengen der Nucleinsäuresequenz
enthalten, ebenfalls zur Ermöglichung
einer Bestimmung eines bevorzugten Grenzpegels verwendet werden.
Nach der Anpassung entsprechender Regressionslinien für jeden
Satz von Zeitpunkten im Zeitintervall, der den Kalibrierproben entspricht, kann
insbesondere ein mittlerer Vorhersagefehler (APE) zwischen jeder
Regressionslinie und jenen eines entsprechenden Satzes von Zeitpunkten,
der den Vergleichsproben entspricht, bestimmt werden. Der potentielle
Grenzpegel, welcher jener Regressionslinie entspricht, die den geringsten,
damit verbundenen mittleren Vorhersagefehler aufweist, kann dann
zur Bestimmung der Ausgangskonzentration der Nucleinsäuresequenz
in der Testprobe verwendet werden.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung umfasst einen Apparat zum Bestimmen einer
Menge einer Nucleinsäuresequenz
in einer Testprobe. Dieser bevorzugte Apparat umfasst Mittel, wie
zum Beispiel ein Fluoreszenzmesswerkzeug, zum Messen von Kennwerten
der Mengen einer Nucleinsäuresequenz,
die in zumindest einer Testprobe, die eine unbekannte Ausgangsmenge
der Nucleinsäuresequenz
enthält,
und auch in einer Mehrzahl von Kalibrierproben, die entsprechende
bekannte Ausgangsmengen der Nucleinsäuresequenz enthalten, amplifiziert
wird, und zwar an entsprechenden Messpunkten im Zeitintervall. Ebenso
wird ein Computerprogrammprodukt zum Steuern der Funktion der Messmittel
und zum Durchführen
numerischer Operationen bezüglich
der obenstehend beschriebenen Schritte bereitgestellt.
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Das
bevorzugte Computerprogrammprodukt umfasst insbesondere ein computerlesbares
Speichermedium mit computerlesbaren Programmcodemitteln, die in
dem Medium verwirklicht sind. Die bevorzugten computerlesbaren Programmcodemittel umfassen
computerlesbare Programmcodemittel zum Bestimmen – für einen
ersten potentiellen Kennwert-Grenzpegel – von ersten Punkten in dem
Zeitintervall, in dem die Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenz,
die in den Kalibrierproben amplifiziert wird, dem ersten Grenzpegel
entsprechen. Vorzugsweise werden Programmcodemittel auch bereitgestellt
zum Bestimmen – für einen
zweiten potentiellen Kennwert-Grenzpegel – von zweiten Punkten in dem
Zeitintervall, in dem die Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenz,
die in den Kalibrierproben amplifiziert wird, dem zweiten Grenzpegel
entsprechen. Außerdem
bestimmen die Programmcodemittel bezüglich eines statistischen Kriteriums,
wie z.B. der geringsten Standardabweichung der Anpassung an eine
Regressionslinie oder des geringsten mittleren Vorhersagefehlers
bezüglich
einer Regressionslinie, welche von der ersten oder zweiten Mehrzahl von
Punkten im Zeitintervall das statistische Kriterium verglichen mit
den bekannten Mengen der Nucleinsäuresequenz in den Kalibrierproben
besser erfüllt. Daraufhin
wird die Ausgangsmenge der Nucleinsäuresequenz in der Testprobe
bestimmt, und zwar basierend auf jenen der ersten oder zweiten Grenzpunkte,
von denen festgestellt wurde, dass sie das statistische Kriterium
besser erfüllen.
Bevorzugte Programmcodemittel werden auch bereitgestellt, um detailliertere
Versionen der obenstehend beschriebenen Schritte als numerische
Operationen durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Werkzeug bereit, welches
die Mengen von Nucleinsäuresequenzen
in Testproben genauer bestimmen kann, indem die Grenzpegel, bei
denen Messungen der Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenzen
in Kalibrierproben ausgewertet werden, genauer bestimmt werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 ist
ein Flussdiagramm, welches Schritte darstellt, die durch Verfahren
zum Bestimmen der Mengen von Nucleinsäuresequenzen in Proben gemäß der vorliegenden
Erfindung durchgeführt
werden.
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2 ist
eine grafische Darstellung von Amplifikationsdaten für Kalibrier-
und Testproben, welche Mengen einer Nucleinsäuresequenz enthalten.
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3 ist
eine grafische Darstellung von Amplifikationsdaten und glatten Kurven,
die unter Anwendung einer nicht parametrischen Glättungsoperation
gemäß der vorliegenden
Erfindung daraus ermittelt wurden.
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4A ist
eine grafische Darstellung der Zeit zum Überschreiten eines potentiellen
Grenzpegels im Vergleich zu einer Nucleinsäure-Ausgangskonzentration,
und zwar für
einen potentiellen Fluoreszenzgrenzpegel von 1,12.
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4B ist
eine grafische Darstellung der Zeit zum Überschreiten eines potentiellen
Grenzpegels im Vergleich zu einer Nucleinsäure-Ausgangskonzentration,
und zwar für
einen potentiellen Fluoreszenzgrenzpegel von 1,103.
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4C ist
eine grafische Darstellung der Zeit zum Überschreiten eines potentiellen
Grenzpegels im Vergleich zu einer Nucleinsäure-Ausgangskonzentration,
und zwar für
einen potentiellen Fluoreszenzgrenzpegel von 1,094.
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5 ist
eine grafische Darstellung, die bevorzugte Fluoreszenzgrenzpegel
vergleicht, welche unter Anwendung eines anderen statistischen Kriteriums
bestimmt wurden.
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6 stellt
eine allgemeine Hardware-Beschreibung eines Apparats zum Bestimmen
der Mengen von Nucleinsäuresequenzen
in Testproben gemäß der vorliegenden
Erfindung dar.
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Beschreibung
von bevorzugten Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die
angeschlossenen Zeichnungen, in denen bevorzugte Ausführungsformen der
Erfindung gezeigt werden, detaillierter beschrieben. Diese Erfindung
kann jedoch in verschiedenen Formen verwirklicht sein und sollte
nicht als auf die hier dargelegten Ausführungsformen beschränkt gedeutet
werden. Vielmehr werden diese Ausführungsformen bereitgestellt,
damit diese Offenbarung gründlich
und vollständig
ist, und vermitteln dem Fachmann den vollen Umfang der Erfindung.
Gleiche Ziffern beziehen sich durchwegs auf gleiche Elemente.
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Unter
Bezugnahme auf die 1–5 werden
nun bevorzugte Verfahren 10 zum Bestimmen der Mengen von Nucleinsäuresequenzen
in Proben detaillierter beschrieben. Diese Verfahren umfassen die
Schritte 12, 14 des Amplifizierens einer Mehrzahl
von bekannten Ausgangsmengen einer Nucleinsäuresequenz (z.B. RNA, DNA)
in entsprechenden Kalibrierproben (d.h. Standards) und auch des
Amplifizierens einer unbekannten Ausgangsmenge der Nucleinsäuresequenz
in zumindest einer Testprobe während
entsprechender Zeitintervalle. Vorzugsweise sind die Nucleinsäuresequenzen
in den Kalibrier- und Testproben dieselben, die Proben können jedoch
möglicherweise
unterschiedliche Nucleinsäuresequenzen
enthalten oder verschiedene Mengen unterschiedlicher Nucleinsäuresequenzen können in
einer Durchschnittsprobe parallel amplifiziert werden. Diese Amplifikationsschritte
können
unter Anwendung herkömmmlicher
Techniken durchgeführt
werden und können
während
entsprechender, nicht überlappender
Zeitintervalle für
jede Probe getrennt durchgeführt
werden. Diese getrennten Zeitintervalle können dann für Analysezwecke auf eine gemeinsame
Ausgangszeit und ein gemeinsames Zeitintervall normiert werden.
Noch bevorzugter werden die Schritte 12, 14 des
Amplifizierens jeder Nucleinsäuresequenz
in den Kalibrier- und Testproben jedoch an getrennten Proben während eines
einzigen Zeitintervalls parallel durchgeführt.
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Wie
der Fachmann versteht, können
die Proben gemäß irgendeinem
bekannten Nucleinsäureamplifikationsverfahren,
einschließlich
Wärmewechsel-Amplifikationsverfahren
sowie isothermer Amplifikationsverfahren, amplifiziert werden. Die
vorliegende Erfindung ist vorteilhaft in Hinblick auf eine Verbesserung
der Quantifizierung von Nucleinsäuren, die
entweder durch Wärmewechselverfahren
oder durch isotherme Verfahren amplifiziert wurden, obwohl die vorliegende
Erfindung für
isotherme Amplifikations verfahren besondere Vorteile bieten kann. Geeignete
Wärmewechselverfahren,
die bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen
die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR; US-A-4 683 202, US-A-4 683 195 und US-A-4 965 188); die Reverse-Transcriptase-PCR
(RT-PCR); die DNA-Ligase-Kettenreaktion (LCR; internationale Patentanmeldung
Nr. WO-A-89/09835); und die Amplifikation auf Basis einer Transcription
(D. Y. Kwoh et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173–1177), ohne
darauf beschränkt
zu sein. Geeignete isotherme Amplifikationsverfahren, die bei der
Anwendung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen die Strangverdrängungsamplifikation
(SDA; Walker et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392–396); die
Q-β-Replikase
(Lizardi et al. 1988, Bio/Technology 6, 1197–1202); die auf Nucleinsäure basierende Sequenzamplifikation
(NASBA; R. Sooknanan und L. Malek 1995, Bio/Technology 13, 563–65) und
die sich selbst erhaltende Sequenzreplikation (3SR; Guatelli et
al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874–1878), ohne darauf beschränkt zu sein.
Beispielhafte SDA-Verfahren sind in der U.S.-A-5 445 166 von Walker
und in der U.S.-A-5 270 184 von Walker et al. beschrieben.
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Danach
werden Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenz, die in den Kalibrier-
und Testproben amplifiziert wird, an entsprechenden Messpunkten
im Zeitintervall gemessen, Schritt 16, wobei ein Messwerkzeug zur
Anwendung kommt, wie zum Beispiel der Model 7700 Sequence Detector,
hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems, einer Abteilung
von Perkin Elmer, Foster City, Kalifornien, oder der Fluoroskan
II, hergestellt von LabSystems, Inc., Rochester, New York. Die Kennwerte
der Mengen der Nucleinsäuresequenz,
die in den Kalibrier- und Testproben amplifiziert wird, können die
Form von Fluoreszenzsignalen (z.B. Fluoreszenzintensitäten oder
einer Fluoreszenzenergieübertragung)
annehmen, wenn die Proben Fluoreszenzindikatoren (z.B. fluoreszierende
Markierungen) enthalten. Demgemäß kann das
Messwerkzeug einen oder mehrere Photodetektoren zum Messen der Fluoreszenzsignale
aus den Proben, die eine parallele Amplifikation durchmachen, enthalten.
Das Messwerkzeug kann auch einen computergesteuerten Schrittschaltmotor enthalten,
damit jede Kalibrier- und Testprobe als Probenreihe angeordnet und
während
des Schritts des Messens der Fluoreszenzintensität automatisch und wiederholt
gegenüber
einem Photodetektor positioniert werden kann. Ein bevorzugtes Messwerkzeug
wird nachstehend unter Bezugnahme auf 6 detaillierter
beschrieben.
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Wie
obenstehend dargelegt, können
die Kennwerte einer Zielnucleinsäurekonzentration
die Form fluoreszierender Signale annehmen, obwohl der Fachmann
erkennen wird, dass andere Kennwerte einer Nucleinsäurekonzentration
bekannt sind und bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können.
Zur Veranschaulichung können
Kennwerte einer Nucleinsäurekonzentration durch
Markierungen bereitgestellt werden, welche Signale produzieren,
die durch Fluoreszenz, Radioaktivität, Kolorimetrie, Röntgenstrahlbeugung
oder -absorption, Magnetismus oder enzymatische Aktivität nachweisbar
sind. Geeignete Markierungen umfassen beispielsweise Fluorophore,
Chromophore, radioaktive Isotope (z.B. 32P
oder 125I, elektronendichte Reagenzien,
Enzyme und Liganden mit spezifischen Bindungspartnern (z.B. Biotin-Avidin).
Das Markieren von Nucleinsäuren
kann durch eine Reihe von Mitteln erzielt werden, einschließlich durch
chemische Modifikation eines Nucleinsäureprimers oder einer Sonde. Geeignete
fluoreszierende Markierungen können nicht
kovalent bindende Markierungen (z.B. interkalierende Farbstoffe)
wie z.B. Ethidiumbromid, Propidiumbromid, Chromomycin, Acridinorange
und dergleichen umfassen. Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung
wird jedoch die Verwendung kovalent bindender fluoreszierender Mittel
bevorzugt. Solche kovalent bindende fluoreszierende Markierungen umfassen
Fluorescein und Derivate davon wie z.B. FAM, HEX, TET und JOE (welche
alle von der Applied Biosystems Division von Perkin Elmer, Foster City,
Kalifornien, zu erhalten sind); Rhodamin und Derivate wie z.B. Texas
Red (Molecular Probes, Eugene, Oregon); ROX und TAMRA (Applied Biosystems,
Foster City, CA); Lucifer Yellow; Cumarinderivate und dergleichen.
Andere bevorzugte Kennwerte einer Nucleinsäurekonzentration bestehen in
der Fluoreszenzenergieübertragung
(FET), bei der eine fluoreszierende Reporter (oder „Donor")-Markierung und
eine Quencher (oder „Acceptor")-Markierung hintereinander
verwendet werden, um ein nachweisbares Signal zu produzieren, das
zu der in der Reaktionsmischung vorhandenen Menge an amplifiziertem
Nucleinsäureprodukt
(z.B. in Form einer doppelsträngigen
Nucleinsäure)
proportional ist. Wiederum eine andere, bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung
nützliche
Nachweismethode ist die von Walker et al. in der U.S.-A-5 593 867
beschriebene Fluoreszenzpolarisierungs(FP)-Detektion einer Nucleinsäureamplifikation.
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Nach
dem Messen von Kennwerten der Mengen von Nucleinsäuresequenzen
in Schritt 16 wird danach ein Schritt 18 durchgeführt, um
für einen ersten
potentiellen Grenzpegel (z.B. einen ersten normierten Fluoreszenzpegel)
einen entsprechenden ersten Satz von Zeitpunkten zu bestimmen, und
zwar in dem Zeitintervall, in dem die Kennwerte (z.B. ein Fluoreszenzsignal)
der Mengen der Nucleinsäuresequenz,
die in jeder Kalibrier- und
Testprobe amplifiziert wird, dem ersten Grenzpegel entsprechen.
Dieser Schritt wird daraufhin für
jeden aus einer Mehrzahl verschiedener potentieller Grenzpegel wiederholt,
so dass für
jeden potentiellen Grenzpegel entsprechende Sätze von Zeitpunkten im Zeitintervall erhalten
werden können.
Wie nachstehend detaillierter beschrieben, können die „Kennwerte" (z.B. Fluoreszenzsignale) ungefilterte
Kennwerte (d.h. Ursprungsdaten) sein, oder die Kennwerte können beispielsweise
durch Erzeugung einer unteren Vertrauensgrenzkurve aus den ungefilterten
Kennwerten gefiltert werden.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird danach ein Schritt 20 durchgeführt, um
bezüglich
eines statistischen Kriteriums zu bestimmen, welcher der Sätze von
Punkten im Zeitintervall das statistische Kriterium verglichen mit
den bekannten Mengen der Nucleinsäuresequenz in den Kalibrierproben
besser erfüllt.
Eine Menge der Nucleinsäuresequenz
in der Testprobe wird dann basierend auf jenem Satz von Punkten
bestimmt, von dem festgestellt wurde, dass er das statistische Kriterium
besser oder am besten erfüllt.
Wie nachstehend unter Bezugnahme auf die 2–5 detaillierter
erläutert,
kann der Schritt des Bestimmens, welcher der Sätze von Zeitpunkten das statistische
Kriterium besser erfüllt,
beispielsweise den Schritt des Bestimmens, welcher der Sätze von
Zeitpunkten im Zeitintervall eine bessere lineare Anpassung gegenüber Logarithmen
der bekannten Ausgangsmengen der Nucleinsäuresequenz in den Kalibrierproben
liefert, umfassen. Dieser Schritt umfasst vorzugsweise die Schritte
des Anpassens von Regressionslinien an entsprechende „Graphs" jedes Satzes von
Zeitpunkten im Zeitintervall über
Logarithmen der bekannten Ausgangsmengen der Nucleinsäuresequenz
in den Kalibrierproben. Daraufhin werden Standardabweichungen der
Anpassungen zwischen jedem Satz von Zeitpunkten und entsprechenden
Regressionslinien bestimmt. Der Satz von Zeitpunkten, der vorzugsweise
mit der geringsten Standardabweichung der Anpassung übereinstimmt, wird
dann dazu verwendet, den bevorzugten Grenzpegel auszuwählen und
danach, basierend auf dem bevorzugten Grenzpegel, die Ausgangsmenge
der Nucleinsäuresequenz
in der Testprobe zu bestimmen.
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Die
Bestimmung jenes Satzes von Punkten, der das statistische Kriterium
besser erfüllt,
wird vorzugsweise dadurch erzielt, indem eine Zeit bestimmt wird,
in der das gefilterte (oder ungefilterte) Fluoreszenzsignal der
Testprobe dem bevorzugten Grenzpegel entspricht, und diese Zeit
daraufhin an die „bevorzugte" Regressionslinie
angepasst wird, die mit dem bevorzugten Satz von Zeitpunkten übereinstimmt. Danach
wird ein Schritt 22 durchgeführt, um aus der bevorzugten
Regressionslinie die Ausgangskonzentration der Nucleinsäuresequenz
in den Testproben zu ermitteln. Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung können
Vergleichsproben, die bekannte Ausgangsmengen der Nucleinsäuresequenz
enthalten, ebenfalls zur Ermöglichung
einer Bestimmung eines bevorzugten Grenzpegels verwendet werden.
Nach der Anpassung entsprechender Regressionslinien für jeden
Satz von Zeitpunkten im Zeitintervall, der den Kalibrierproben entspricht, kann
insbesondere ein mittlerer Vorhersagefehler (APE) zwischen jeder
Regressionslinie und jenen eines entsprechenden Satzes von Zeitpunkten,
der den Vergleichsproben entspricht, bestimmt werden. Der potentielle
Grenzpegel, welcher jener Regressionslinie entspricht, die den geringsten,
damit verbundenen mittleren Vorhersagefehler aufweist, kann dann
zur Bestimmung der Ausgangskonzentration der Nucleinsäuresequenz
in der Testprobe verwendet werden. Ein anderes statistisches Kriterium
kann ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise kann ein Kreuzvalidierungsvorhersagefehler
auf ein Mindestmaß reduziert
werden, um die Bestimmung einer Ausgangskonzentration zu ermöglichen.
Alternativ kann bei Verwendung mehrerer verschiedener Kriterien
der „Durchschnitt" der bevorzugten
Grenzpegel, welcher durch jedes unterschiedliche Kriterium erzielt
wird, verwendet werden.
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Wie
nachstehend detaillierter beschrieben, kann der Schritt 18 des
Bestimmens von Sätzen
von Punkten im Zeitintervall für
jeden potentiellen Grenzpegel die anfänglichen Schritte des Anpassens
von Kurven an entsprechende Graphs der gemessenen Kennwerte der
Mengen der Nucleinsäuresequenz, die
in entsprechenden Kalibrier- oder Testproben amplifiziert wird,
umfassen, und zwar verglichen mit entsprechenden Messzeitpunkten,
wobei eine nicht parametrische Glättungsoperation zur Anwendung kommt.
Hier kann die Amplifikation jeder Probe durch einen Satz von gesonderten
Datenpunkten dargestellt werden, welcher einen Satz von x-Werten,
die aus Messzeitpunkten bestehen, und einen übereinstimmenden Satz von y-Werten,
die aus gemessenen Fluoreszenzsignalen bestehen, enthält. Diese
x- und y-Werte werden für
jede Probe unter Anwendung herkömmlicher
Techniken auf eine gemeinsame Grundlinie normiert, und danach wird
an jedem Satz von x- und
y-Werten eine nicht parametrische Glättungsoperation durchgeführt.
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Für jeden
Satz von x- und y-Werten, die zu einer entsprechenden Kalibrier-
oder Testprobe passen und eine entsprechende Amplifikationskurve
bilden, wird insbesondere eine Wavelet-Anpassung erhalten, und über eine
Waveshrink-Operation, die im S + WAVELETSTM-Modul
des S-PLUSTM-Software-Pakets im Handel erhältlich ist,
wird eine glatte Amplifikationskurve erhalten. Dieses Software-Paket ist
bei MathSoft, Inc., Seattle, Washington, im Handel erhältlich.
Wie der Fachmann versteht, wird durch die bevorzugte Glättungsoperation
typischerweise eine Abschätzung
des Lärms
im Satz von x- und
y-Werten und/oder einer Standardabweichung (σ) um die geglättete Kurve
erzeugt.
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Als
nächstes
wird gemäß einem
weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung für jede Amplifikationskurve
eine entsprechende untere Vertrauensgrenzkurve (LCL) bestimmt, so
dass eine Schätzung
der Amplifikationszeit, die zur Erreichung eines potentiellen Grenzpegels
erforderlich ist, mit einer verringerten Anfälligkeit für Lärm in den gemessenen Kennwerten
(y-Werten) oder für
lokale Unregelmäßigkeiten
bei den Amplifikationsgeschwindigkeiten festgelegt werden kann.
Jede untere Vertrauensgrenzkurve kann beispielsweise dadurch bestimmt
werden, indem für
jede geglättete
Amplifikationskurve 2σ (oder
ein anderer bevorzugter Wert) im Fluoreszenzsignal von den y-Werten
abgezogen wird. Jede untere Vertrauensgrenzkurve wird vorzugsweise
auch unter Anwendung einer nicht parametrischen Glättungsoperation
wie z.B. einer Thin-Plate-Splines-Operation,
die aus dem FUNFITS-Modul im STATLIB-Programmierarchiv zu erhalten
ist, „geglättet". Dieses Archiv ist
im World Wide Web unter http://lib.stat.cmu.edu verfügbar. Diese unteren
Vertrauensgrenzkurven stellen ein Verhältnis zwischen gemessenen Kennwerten,
die gefiltert wurden, und der Zeit dar.
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Zu
Veranschaulichungszwecken wird nunmehr eine Anwendung der obenstehend
beschriebenen Operationen beschrieben. Unter Bezugnahme auf 2 werden
insbesondere x-y-Graphs von ungefilterten normierten Kennwerten
der Mengen einer Nucleinsäuresequenz
(d.h. eines Fluoreszenzsignals), die in einer Mehrzahl von Kalibrier-
und Testproben amplifiziert wird, im Vergleich zur Zeit (d.h. zu Amplifikationskurven)
dargestellt. Wie obenstehend beschrieben, wurden auch Wavelet-Glättungsoperationen
durchgeführt,
um für
jede Amplifikationskurve eine glatte Kurve zu erzeugen. Diese glatten
Kurven sind durch die durchgezogenen Linien veranschaulicht. Bei
dieser Anwendung wurden Kalibrierproben (d.h. Standards) für eine Amplifikation
vorbereitet, indem unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Techniken
0, 0, 40, 400, 4000, 15.000 und 40.000 Zielkopien einer Nucleinsäuresequenz
in Reaktionspuffer gemischt wurden. Diese Kalibrierproben sind durch
die Zeichenerklärung
in 2 als CS1 = 0, CS2 = 0, CS3 = 40, CS4 = 400, CS5
= 4.000, CS6 = 15.000 und CS7 = 40.000 dargestellt. Zur Bestätigung der
Genauigkeit der vorliegenden Erfindung wurden auch sechs „unbekannte" Testproben vorbereitet.
Drei der Testproben wurden mit 1.144 Zielkopien der Nucleinsäuresequenz
versetzt und die anderen drei Testproben wurden mit 10.560 Zielkopien versetzt.
Diese Testproben sind durch die Zeichenerklärung als T1 = 1.144, T2 = 1.144,
T3 = 1.144, T4 = 10.560, T5 = 10.560 und T6 = 10.560 dargestellt.
Diese sechs Testproben wurden ebenfalls als Vergleichsproben behandelt,
um ein statistisches Kriterium basierend auf einem mittleren Vorhersagefehler
(APE) darzustellen, wie nachfolgend detaillierter erläutert wird.
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Danach
werden an den Amplifikationskurven (CS1-7 und T1-6) der 2 numerische
Operationen durchgeführt,
um entsprechende untere Vertrauensgrenzkurven zu erzeugen, welche
Verhältnisse
zwischen „gefilterten" Fluoreszenzsignalen
und der Amplifikationszeit darstellen. Insbesondere können Waveshrink-Operationen
durchgeführt
werden, um geglättete
Amplifikationskurven zu erzeugen und eine entsprechende Standardabweichung
um jede Kurve zu bestimmen. Danach können untere Vertrauensgrenzkurven
durch „Filtern" der Amplifikationskurven
festgelegt werden, indem an jedem Messzeitpunkt „ 2σ" vom Fluoreszenzsignal abgezogen wird. Diese
Operation wird vorzugsweise durchgeführt, damit anschließend festgelegte
Schätzungen
der Amplifikationszeiten, die zur Erreichung eines potentiellen Fluoreszenzgrenzpegels
erforderlich sind, mit einer verringerten Anfälligkeit für Lärm oder lokale Unregelmäßigkeiten
festgelegt werden können.
Dann können
die „geglätteten" unteren Vertrauensgrenzkurven
(SLCL) festgelegt werden, indem unter Verwendung; des zuvor erwähnten Software-Pakets
an jeder unteren Vertrauensgrenzkurve eine Thin-Plate-Spline-Anpassung
durchgeführt
wird. Andere Glättungstechniken
können
ebenfalls angewandt werden. Solche Techniken können zum Beispiel Kernel-Smoother,
kubische Splines, b-Splines und eine lokal gewichtete Regression
umfassen. Dann kann ein passender Expansionsbereich für potentielle
Fluoreszenzgrenzpegel (FCLL–FCLH) ausgewählt
werden. Wie hier vom Erfinder festgelegt, ist eine genaue Auswahl
eines bevorzugten Grenzpegels für
die genaue Bestimmung der Ausgangsmenge einer Nucleinsäuresequenz
in einer Testprobe entscheidend.
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Zur
Veranschaulichung können
die obenstehend beschriebenen Operationen durchgeführt werden,
um aus den Amplifikationsdaten, die der vierten Kalibrierprobe CS4
entsprechen, eine geglättete
untere Vertrauensgrenzkurve (SLCLCS4) zu
ermitteln. Diese untere Vertrauensgrenzkurve ist in 3 am besten
dargestellt. Danach werden dieselben Operationen durchgeführt, um
aus jeder der anderen Amplifikationskurven, die den anderen Proben
entsprechen, geglättete
untere Vertrauensgrenzkurven zu erzeugen. Dann werden unter Anwendung
von dem Fachmann bekannten Techniken Schnittpunkte zwischen jeder
geglätteten
unteren Vertrauensgrenzkurve und jedem aus einer Mehrzahl von beabstandeten potentiellen
Fluoreszenzgrenzpegeln im Bereich (FCLL–FCLH) numerisch ermittelt. Aus den Schnittpunkten
zwischen einem jeweiligen Fluoreszenzgrenzpegel und jeder der geglätteten unteren
Vertrauensgrenzkurven, die den jeweiligen Grenzpegel durchschneiden,
werden dann Sätze
von Zeitpunkten entlang der x-Achse im Bereich TL–TH ermittelt.
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Unter
Bezugnahme auf 4A und unter Verwendung eines
potentiellen Fluoreszenzgrenzpegels von 1,12 als Beispiel kann ein
Graph der Zeitpunkte (ermittelt aus den Schnittpunkten zwischen jeder
SLCL-Kurve und einer horizontalen Linie bei y = 1,12) über Logarithmen
der bekannten Ausgangskonzentrationen der Kalibrierproben (x-Achse)
bestimmt werden. Eine Regressionslinie (RL1,12)
kann dann, wie dargestellt, an den Graph der Zeitpunkte über Logarithmen.
der bekannten Ausgangskonzentrationen angepasst werden. Unter Anwendung
herkömmlicher
Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wird ebenso festgestellt,
das eine Standardabweichung der Anpassung zwischen der Regressionslinie
und Punkten im Graph 0,428 beträgt. Unter
Verwendung eines potentiellen Fluoreszenzgrenzpegels von 1,103 wird
ein Graph der Zeitpunkte (ermittelt aus den Schnittpunkten zwischen
jeder SLCL-Kurve und einer horizontalen Linie bei y = 1,103) über Logarithmen
der bekannten Ausgangskonzentrationen der Kalibrierproben (x-Achse)
bestimmt, wie in 4B am besten dargestellt. Eine
Regressionslinie (RL1,103) wird dann an
den Graph der Zeitpunkte über
Logarithmen der bekannten Ausgangskonzentrationen angepasst. Dann
wird festgestellt, dass eine Standardabweichung der Anpassung zwischen
der Regressionslinie und den Punkten im Graph 0,180 beträgt. Schließlich kann
unter Verwendung eines potentiellen Fluoreszenzgrenzpegels von 1,094
ein Graph der Zeitpunkte (ermittelt aus den Schnittpunkten zwischen
jeder SLCL-Kurve und einer horizontalen Linie bei y = 1,094) über Logarithmen
der bekannten Ausgangskonzentrationen der Kalibrierproben (x-Achse)
bestimmt werden, wie in 4C am
besten dargestellt. Eine Regressionslinie (RL1,094)
wird dann, wie dargestellt, an den Graph der Zeitpunkte über Logarithmen
der bekannten Ausgangskonzentrationen angepasst. Dann wird festgestellt,
dass eine Standardabweichung der Anpassung zwischen der Regressionslinie
und den Punkten im Graph 0,226 beträgt.
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Wie
obenstehend beschrieben, wird dann jener Grenzpegel, der die geringste
Standardabweichung der Anpassung ergibt, zum Abbilden der Schnittpunkte
zwischen dem ausgewählten
Grenzpegel und den geglätteten
unteren Vertrauensgrenzkurven, die den Testproben entsprechen, gemäß den Logarithmen
der Ausgangskonzentrationen der Testproben verwendet. Basierend
auf einer Analyse von nur drei potentiellen Fluoreszenzgenzpegeln
im Bereich FCLL–FCLH sollte
die Regressionslinie RL1,103, die einem
normierten Fluoreszenzgrenzpegel von 1,103 entspricht, beispielsweise
zum Bestimmen der Ausgangskonzentration der Testproben T1–T6 verwendet
werden.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann eine Mehrzahl von „Vergleichs"-Proben mit bekannten
Konzentrationen der Nucleinsäuresequenz
parallel zu den Kalibrier- und Testproben amplifiziert werden. Die
Zeiten, die mit den Schnittpunkten (d.h. Schnittpunktzeiten) zwischen
einem potentiellen Fluoreszenzgrenzpegel (z.B. 1,12, 1,103 und 1,094)
und den geglätteten
unteren Vertrauensgrenzkurven, die den Vergleichsproben entsprechen, übereinstimmen,
können
dann mit entsprechenden Regressionslinien verglichen werden. Ein
mittlerer Vorhersagefehler kann dann als das arithmetische Mittel
jedes Zeitfehlers zwischen einer jeweiligen Schnittpunktzeit und
der übereinstimmenden „Schnittpunktzeit", die durch die Regressionslinie
an der bekannten Ausgangskonzentration der Vergleichsprobe vorhergesagt
wurde, ermittelt werden.
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Basierend
auf der Regressionslinie der 4A wird
ein mittlerer Vorhersagefehler (APE) von 26,8% ermittelt, wenn die „Test"-Proben T1–T6 (mit
bekannten Ausgangskonzentrationen) ausschließlich zu Veranschaulichungszwecken
als Vergleichsproben C1–C6
behandelt werden. Wie durch die Zeichenerklärung der 4A gezeigt,
wird vorhergesagt, dass die bekannten Ausgangskonzentrationen der
Testproben (d.h. 1.144 und 10.560 Zielkopien) bei den „Vergleichs"-Proben C1–C3 zwischen 904
und 2.406 Zielkopien und bei den Vergleichsproben C4–C6 zwischen
10.323 und 14.858 Zielkopien aufweisen. Basierend auf der Regressionslinie
der 4B wird bei den „Vergleichs"-Proben C1–C6 ein mittlerer
Vorhersagefehler (APE) von 9% festgestellt. Wie durch die Zeichenerklärung der 4B gezeigt, wird
schließlich
vorhergesagt, dass die bekannten Ausgangskonzentrationen der Testproben
bei den Vergleichsproben C1–C3
zwischen 1.042 und 1.875 Zielkopien und bei den Vergleichsproben
C4–C6
zwischen 8.865 und 13.179 Zielkopien aufweisen. Basierend auf der
Regressionslinie der 4C wird bei den „Vergleichs"-Proben C1–C6 ein
mittlerer Vorhersagefehler (APE) von 0,9% festgestellt. Wie durch die
Zeichenerklärung
der 4C gezeigt, wird vorhergesagt, dass die bekannten
Ausgangskonzentrationen der Testproben bei den Vergleichsproben C1–C3 zwischen
1.049 und 1.675 Zielkopien und bei den Vergleichsproben C4–C6 zwischen
8.236 und 12.264 Zielkopien aufweisen. Gemäß dieser Ausführungsform
wird jener Grenzpegel, der den geringsten mittleren Vorhersagefehler
ergibt, dann vorzugsweise zum Abbilden der Schnittpunkte zwischen
dem ausgewählten
Grenzpegel und den geglätteten
unteren Vertrauensgrenzkurven, die den Testproben entsprechen, gemäß den Logarithmen
der Ausgangskonzentrationen der Testproben verwendet. Basierend
auf der APE-Analyse von nur drei potentiellen Fluoreszenzgrenzpegeln
im Bereich FCLL–FCLH sollte
die Regressionslinie RL1,094, die einem
normierten Fluoreszenzgrenzpegel von 1,094 entspricht, beispielsweise
zum Bestimmen der Ausgangskonzentration der Testproben T1–T6 verwendet
werden.
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Unter
Bezugnahme auf 5 ist ein Vergleich zwischen
den beiden obenstehend beschriebenen statistischen Kriterien dargestellt.
Ein Diagramm der Standardabweichung der Anpassung an eine Regressionslinie
im Vergleich zu einem potentiellen Grenzpegel ergibt insbesondere
einen bevorzugten Grenzpegel von 1,103. Ein Diagramm des mittleren
Vorhersagefehlers (APE) im Vergleich zu einem potentiellen Grenzpegel
ergibt einen bevorzugten Grenzpegel von 1,094, was relativ nahe
bei 1,103 liegt. Wie der Fachmann versteht, veranschaulicht 5 die
Abhängigkeit
zweier Maßstäbe der „Güte" der Kalibrierung,
nämlich
der Präzision
(Standardabweichung um die Regressionslinie) und der durchschnittlichen
Verzerrung (mittlerer Vorhersagefehler), von der Auswahl der Grenzpegel.
Somit kann eine vernünftige
Auswahl statistischer Kriterien Grenzpegel ergeben, die ungefähr gleich
sind. Wie durch die große
Anzahl von x-y-Datenpunkten in 5 dargestellt,
können
ferner genauere Schätzungen
der Ausgangsmengen der Nucleinsäuresequenz
in den Testproben festgelegt werden, indem eine größere Anzahl
eng beabstandeter potentieller Grenzpegel verwendet wird.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung umfasst einen Apparat 30 zum Bestimmen
der Mengen von Nucleinsäuresequenzen
in Testproben. Dieser bevorzugte Apparat umfasst Mittel 32,
wie z.B. das zuvor erwähnte
Fluoreszenzmesswerkzeug, zum Messen von Kennwerten der Mengen einer
Nucleinsäuresequenz,
die in zumindest einer Testprobe (die eine unbekannte Ausgangsmenge
der Nucleinsäuresequenz
enthält) und
in einer Mehrzahl von Kalibrierproben (die entsprechende bekannte
Ausgangsmengen der Nucleinsäuresequenz
enthalten) an entsprechenden Messpunkten im Zeitintervall amplifiziert
wird. Der Apparat 30 funktioniert auch computergesteuert.
Insbesondere ist das Messwerkzeug 32 vorzugsweise betriebsfähig an ein
Allzweck- oder anwendungsspezifisches Computersteuergerät 34 gekoppelt.
Das Steuergerät 34 umfasst
vorzugsweise ein Computerprogrammprodukt zum Steuern der Funktion
des Messwerkzeugs 32 und zum Durchführen numerischer Operationen
bezüglich
der obenstehend beschriebenen Schritte. Das Steuergerät 34 kann über eine
Datei 36, Disketteneingabe 38 oder Datenbusleitung 40 Setupdaten
und andere verwandte Daten empfangen. Ebenso sind vorzugsweise ein
Bildschirm 42 und ein Drucker 44 vorgesehen, um
die vom Steuergerät 34 durchgeführten Operationen
visuell darzustellen. Der Fachmann versteht, dass die vom Steuergerät 34 durchgeführten Funktionen gänzlich oder
teilweise als Softwaremodule realisiert werden können, die auf einem Universalrechnersystem
ablaufen. Alternativ kann ein dediziertes Einplatzsystem mit anwendungsspezifischen
integrierten Schaltungen zum Durchführen der obenstehend beschriebenen
Funktionen und Operationen bereitgestellt werden.
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Ein
bevorzugtes Computerprogrammsystem umfasst insbesondere ein computerlesbares
Speichermedium mit computerlesbaren Programmcodemitteln, die in
dem Medium verwirklicht sind. Die bevorzugten computerlesbaren Programmcodemittelumfassen
computerlesbare Programmcodemittel zum Bestimmen – für einen
ersten potentiellen Fluoreszenzgrenzpegel – von ersten Punkten in dem
Zeitintervall, in dem die Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenz,
die in den Kalibrierproben amplifiziert wird, dem ersten Grenzpegel
entsprechen. Vorzugsweise werden Programmcodemittel auch bereitgestellt
zum Bestimmen – für einen
zweiten potentiellen Fluoreszenzgrenzpegel – von zweiten Punkten in dem
Zeitintervall, in dem die Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenz,
die in den Kalibrierproben amplifiziert wird, dem zweiten Grenzpegel entsprechen.
Außerdem
bestimmen die Programmcodemittel bezüglich eines statistischen Kriteriums, wie
z.B. der geringsten Standardabweichung der Anpassung an eine Regressionslinie
oder des geringsten mittleren Vorhersagefehlers bezüglich einer
Regressionslinie, welche von der ersten oder zweiten Mehrzahl von
Punkten im Zeitintervall das statistische Kriterium verglichen mit
den bekannten Mengen der Nucleinsäuresequenz in den Kalibrierproben besser
erfüllt.
Daraufhin wird die Ausgangsmenge der Nucleinsäuresequenz in der Testprobe
bestimmt, und zwar basierend auf jenen der ersten oder zweiten Grenzpunkte,
von denen festgestellt wurde, dass sie das statistische Kriterium
besser erfüllen.
Bevorzugte Programmcodemittel werden auch bereitgestellt, um detailliertere
Versionen der obenstehend beschriebenen Schritte als numerische
Operationen durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Werkzeug bereit, welches
die Mengen von Nucleinsäuresequenzen
in Testproben genauer bestimmen kann, indem die Grenzpegel, bei
denen Messungen der Kennwerte der Mengen der Nucleinsäuresequenzen
in Kalibrierproben ausgewertet werden, genauer bestimmt werden.
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In
den Zeichnungen und in der Beschreibung wurden typische bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung geoffenbart, und trotz der Verwendung spezifischer
Begriffe werden diese nur in einem allgemeinen und beschreibenden
Sinn und nicht zu Einschränkungszwecken
verwendet, wobei der Umfang der Erfindung in den nachfolgenden Ansprüchen dargelegt
ist. Überdies
soll die Terminologie in den Ansprüchen bezüglich Graphs, die Linien und
Kurven an Graphs anpassen und Kurven festlegen, die Verarbeitung
von Daten (z.B. x-y-Daten) und Variablen umfassen, welche im Inneren
einer Speicher enthaltenden Verarbeitungseinheit (z.B. eines Computers) zu
finden sind, und ist, wie der Fachmann versteht, nicht auf die physischen
Tätigkeiten
des Ausdruckens oder Auftragens von Linien, Kurven und Graphs beschränkt.