DE102021206717A1

DE102021206717A1 - Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen Probe

Info

Publication number: DE102021206717A1
Application number: DE102021206717.4A
Authority: DE
Inventors: Daniel Sebastian Podbiel; Manuel Loskyll
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2022-12-29
Also published as: WO2023274662A1; EP4363607A1; CN117897499A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren (500) zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen Probe in Partitionen (110, 120) auf einer Partitionsfläche (101), insbesondere für eine Bestimmung einer Konzentration eines Analyten in der Probe. Ferner betrifft die Erfindung ein Analyseverfahren (600) zum Nachweis eines Analyten in einer mikrofluidischen Probe und ein Verfahren (700) zur Herstellung einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe.

Description

Stand der Technik
Mikrofluidische Analysesysteme (sog. Lab-on-Chips, kurz LoCs) erlauben ein automatisiertes, zuverlässiges, schnelles, kompaktes und kostengünstiges Prozessieren von Patientenproben für die medizinische Diagnostik. Durch die Kombination einer Vielzahl von Operationen für die kontrollierte Manipulation von Fluiden können komplexe molekulardiagnostische Testabläufe auf einer Lab-on-Chip-Kartusche durchgeführt werden.
Im Falle der Implementierung einer auf Partitionen basierenden quantitativen Testmethode, insbesondere bei einer sogenannten digitalen Polymerase-Kettenreaktion (kurz digitalen PCR) in ein solches LoC besteht eine dieser Operationen in der Aliquotierung der Probe in eine Vielzahl von Partitionen. Diese können beispielsweise als Kammern oder Tropfen realisiert werden. Innerhalb jeder dieser Partitionen findet unabhängig voneinander eine Endpunktamplifikation des spezifischen DNA-Targets statt, welche, falls sich zu Beginn der Amplifikationsreaktion mindestens ein Target in der jeweiligen Partition befunden hat, in einem Fluoreszenzanstieg resultiert. Ausgehend vom Anteil der Partitionen, die einen Fluoreszenzanstieg zeigen, kann durch Ausnutzung der Poisson-Statistik auf die Target-Konzentration in der analysierten Probe geschlossen werden.
Während des Aliquotierungsprozesses beeinflussen verschiedene Fehlerquellen die Genauigkeit des quantitativen Nachweises. Dabei dominieren die Schwankungen in der Konzentration des untersuchten Teilvolumens (sogenannter Subsampling Error) und die statistische Ungenauigkeit durch den Aliquotierungsprozess an sich (sogenannter Partitioning Error). Beide dieser Mechanismen sind bereits in der Literatur beschrieben (Dube et al., PLoS ONE 3 (8), e2876 (2008), 10.1371/journal.pone.0002876; Jacobs et al., BMC Bioinformatics 15, 283 (2014), https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-283; Bizouarn F. (2014) Introduction to Digital PCR. In: Biassoni R., Raso A. (eds) Quantitative Real-Time PCR. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 1160. Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0733-5_4; Basu, Amar S. (2017): Digital Assays Part I: Partitioning Statistics and Digital PCR. in SLAS technology 22 (4), pp. 369-386. DOI: 10.1177/2472630317705680). Dabei lautet die generelle Empfehlung, den Partitioning Error durch eine möglichst große Anzahl an Partitionen zu verringern um dadurch den dynamischen Messbereich des Analysesystems zu vergrößern. Der Subsampling Error sei in der Regel zu vernachlässigen und spiele laut Literatur erst eine signifikante Rolle, wenn der Anteil des analysierten Volumens je nach Anwendungsfall unter 30 % beziehungsweise 50 % liegt (Jacobs et al., BMC Bioinformatics 15, 283 (2014), https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-283). Außerdem wird der Vorteil einer möglichst hohen Anzahl an Partitionen betont.
Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe in Partitionen auf einer Partitionsfläche. Insbesondere betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Partitionierung, Aufteilung oder Aliquotierung einer solchen Probe in Partitionen oder Teilmengen der Probe. Das Verfahren kann insbesondere für eine Bestimmung einer Konzentration eines Analyten in der Probe verwendet werden, insbesondere in Kombination mit einer digitalen PCR im Falle von Nukleinsäureabschnitten als Analyten.
Unter einer Partitionierung einer Probe kann somit wie beschrieben eine Aufteilung oder Aliquotierung einer Probe in Probenteile verstanden werden, in bevorzugter Ausgestaltung eine tatsächliche Platzierung der Probe in Form von Probenteilen auf der Partitionsfläche. Bei der Probe kann es sich insbesondere um eine biologische Probe handeln, beispielsweise umfassend eine Körperflüssigkeit wie Blut, Urin, Sputum oder ein Abstrich. Die Probe kann neben der Körperflüssigkeit noch weitere Substanzen aufweisen, beispielsweise in Form einer Vermischung der Körperflüssigkeit mit einem Transportmedium wie eNAT™ oder UTM™. Bei dem Analyten, auch Target genannt, kann es sich um ein Molekül in der Probe handeln, insbesondere um einen Nukleinsäureabschnitt, beispielsweise einen Teil einer DNA oder RNA eines Krankheitserregers oder einer bestimmten Körperzelle, insbesondere einer Tumorzelle. Bei dem Analyten kann es sich in besonderer Ausgestaltung auch um Zellen handeln, insbesondere Einzeller oder tierische oder menschliche Körperzellen, beispielsweise einzelne oder mehrere von sogenannten zirkulierenden Tumorzellen (kurz CTC). Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit wie bereits erwähnt Teil oder Voraussetzung einer partitionsbasierten quantitativen Nachweismethode für Analyten in der Probe sein, beispielsweise unter Zuhilfenahme einer digitalen PCR, wobei solch eine Nachweismethode bei mikrofluidischen Proben vorzugsweise mit einer mikrofluidischen Vorrichtung, insbesondere einem Lab-on-Chip-System, durchgeführt werden kann. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafterweise eine Partitionierung der Probe für eine statistische Abschätzung einer Konzentration des Analyten in der Probe mit geringem relativem Fehler realisiert werden.
In bevorzugter Ausgestaltung umfasst das Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung eine erfindungsgemäße Partitionierung der Probe auf der Partitionsfläche. Die Partitionsfläche kann allgemein Teil einer mikrofluidischen Vorrichtung sein kann, vorzugsweise Teil einer mikrofluidischen Kartusche. Beispielsweise kann die Partitionsfläche eine Oberfläche auf einem Substrat in einer Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung sein.
Gemäß einem ersten Schritt des Verfahrens erfolgt eine Festlegung einer geometrischen Form der Partitionen, einer Form der Partitionsfläche und eines Gesamtvolumens der Probe. Die Partitionsfläche kann beispielsweise eine quadratische oder rechteckige Form aufweisen und optional von einer begrenzenden Wand umgeben sein. Die Partitionen können vorzugsweise die Form von Tröpfchen oder von Kammern haben. Im Falle der Tröpfchen liegen diese insbesondere als Emulsion vor, beispielsweise als wasserbasierte Tröpfchen in einer Öl-Emulsion, wobei die Tröpfchen bevorzugt durch Zugabe von oberflächenaktiven Substanzen, sogenannten Surfactants, stabilisiert werden können. Im Falle von Kammern können die Kammern eine runde oder eckige Grundfläche aufweisen, vorzugsweise eine hexagonale Grundfläche. Die Kammern sind dabei durch Wände voneinander getrennt, wobei die Wände vorzugsweise möglichst dünn ausgestaltet werden, um möglichst wenig Fläche zu blockieren. Vorzugsweise werden die Wände in der geometrischen Form der Kammern berücksichtigt.
In einem weiteren Schritt des Verfahrens erfolgt eine Bestimmung eines minimalen Partitionsmaßes der Partitionen. Unter einem minimalen Partitionsmaß ist ein Maß, also ein repräsentativer und vorzugsweise eindeutiger Wert für die Größe der Partition, insbesondere für das Volumen der Partition, zu verstehen. Insbesondere kann es sich bei dem Partitionsmaß um den Durchmesser der Partition bei einer kugel- oder tropfenförmigen Partition handeln oder um eine Breite der Kammer bei einer Partitionierung in Kammern mit eckiger, beispielsweise quadratischer oder hexagonaler Grundfläche.
Beispielsweise ist das Partitionsmaß der Abstand zwischen zwei gegenüberliegenden Ecken, vorzugsweise der minimale Mittelpunktsabstand der Partitionen. Aus dem minimalen Partitionsmaß ergibt sich implizit eine maximale Anzahl von auf der Partitionsfläche anordenbaren Partitionen mit minimalem Partitionsmaß. Diese maximale Anzahl wird im Folgenden auch als erste Partitionsanzahl bezeichnet und ist ein Maß für einen minimalen Wert des Partitioning Errors, denn mit steigender Anzahl an Partitionen verringert sich eine statistische Ungenauigkeit der Konzentrationsbestimmung des gesamten partitionierten Volumens der Probe. Eine Auslegung einer Partitionierung mit möglichst vielen Partitionen und entsprechend kleinem Partitionsmaß wird im Weiteren kurz als minimale Variante bezeichnet.
Gemäß einem weiteren Schritt des Verfahrens erfolgt eine Ermittlung eines zweiten Partitionsmaßes der Partitionen und damit einer zweiten Partitionsanzahl unter der Bedingung, dass ein maximal möglicher Anteil des Gesamtvolumens auf der Partitionsfläche partitioniert werden kann und unter dieser Voraussetzung der maximal mögliche Anteil auf möglichst viele Partitionen auf der Partitionsfläche aufgeteilt wird. Dies hat den Vorteil, dass je mehr von dem Gesamtvolumen partitioniert werden kann, desto geringer fällt der Subsampling Error aus. Dabei soll aber dennoch die Anzahl der Partitionen möglichst groß gehalten werden, um einen möglichst geringen Partitioning Error zu realisieren. Dieses zweite Partitionsmaß wird im Folgenden auch als maximales Partitionsmaß d_max bezeichnet und repräsentiert jedoch das kleinstmögliche Partitionsmaß bei maximal partitioniertem Gesamtvolumen. Die Anzahl der Partitionen bei maximalem Partitionsmaß wird im Folgenden auch als zweite Partitionsanzahl A_min bezeichnet. Eine Auslegung einer Partitionierung, wobei möglichst das vollständige Gesamtvolumen der Probe partitioniert und entsprechend ein größeres Partitionsmaß gewählt wird, wird im Weiteren als Abgrenzung zur minimalen Variante als maximale Variante bezeichnet. Dieser Schritt kann insbesondere auch vor dem vorherigen Schritt erfolgen.
In einem nächsten Schritt des Verfahrens erfolgt eine Bestimmung einer ersten Unsicherheit einer messbaren Konzentration des Analyten bei Verwendung eines Partitionsmaßes aus einem ersten Bereich um das minimale Partitionsmaß und eine Bestimmung einer zweiten Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Verwendung eines Partitionsmaßes aus einem zweiten Bereich um das zweite Partitionsmaß. Bei der ersten und bei der zweiten Unsicherheit kann es sich vorzugsweise um relative Unsicherheiten handeln. Durch diese Bestimmungen wird vorteilhafterweise ermittelt, ob eine Auslegung gemäß der minimalen oder maximalen Variante bezüglich eines möglichst geringen Messfehlers der Konzentration besser ist. Der erste Bereich ist vorzugsweise derart definiert, dass der erste Bereich das minimale Partitionsmaß umfasst, vorzugsweise als unteres Ende des ersten Bereichs, und das zweite Partitionsmaß nicht umfasst. Der zweite Bereich ist vorzugsweise derart definiert, dass der zweite Bereich das zweite Partitionsmaß umfasst, vorzugsweise als oberes Ende des zweiten Bereichs, und das minimale Partitionsmaß nicht umfasst. In besonderer Ausgestaltung kann es sich bei dem ersten Bereich und dem zweiten Bereich um zwei gegenseitig nicht überlappende Bereiche handeln, also insbesondere um disjunkte Bereiche.
Gemäß einer besonderen Weiterbildung dieses Schrittes des Verfahrens wird die erste Unsicherheit einer messbaren Konzentration des Analyten bei Verwendung der ersten Partitionsanzahl von Partitionen mit dem minimalen Partitionsmaß bestimmt und die zweite Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Verwendung der zweiten Partitionsanzahl von Partitionen mit dem zweiten Partitionsmaß bestimmt. Vorzugsweise werden die erste Unsicherheit und/oder die zweite Unsicherheit bei einem Wert aus dem maximalen theoretischen Bereich für eine Messung der Konzentration des Analyten bestimmt. Dieser maximale theoretische Bereich erstreckt sich von -log(1-1/A_max)/V_Par bis -log(1-( A_max-1//A_max)/V_par, wobei A_max die erste Partitionsanzahl, V_par das Fassungsvermögen/Volumen einer einzelnen Partition und log den natürlichen Logarithmus bezeichnet. Um vorzugsweise zwei gleich große Messbereiche zu generieren, wird als Wert der Mittelpunkt dieses Bereichs auf einer logarithmischen Skala gewählt, welcher bei (log(1-1/A_max) * log(1-(A_max-1)/A_max)^0.5/V_par liegt.
Gemäß einer besonderen Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt eine Auslegung der Partitionen mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich, vorzugsweise mit dem minimalen Partitionsmaß, wenn eine Messung einer Konzentration des Analyten bei einem vorgegebenen Konzentrationswert bei einer Auslegung der Partitionen mit einem Partitionsmaß aus dem zweiten Bereich, insbesondere mit dem zweiten Partitionsmaß, nicht möglich ist. Bei dem vorgegebenen Konzentrationswert kann es sich vorzugsweise um eine Wert aus dem oben beschriebenen maximalen theoretischen Bereich handeln, bevorzugt um den oben beschriebenen Mittelpunkt dieses Bereichs auf einer logarithmischen Skala.
In einem nächsten Schritt des Verfahrens erfolgt eine Auslegung der Partitionen aus dem ersten Bereich oder aus dem zweiten Bereich abhängig von einem Vergleich der ersten Unsicherheit mit der zweiten Unsicherheit. Dies hat den Vorteil, dass für die Wahl des Partitionsmaßes und somit für die konkrete Form der Auslegung der Partitionen eine Berücksichtigung von Unsicherheiten für eine nachfolgende Konzentrationsmessung miteinbezogen werden kann. Insbesondere kann eine Wahl der minimalen Variante oder maximalen Variante auf Basis dieser ermittelten Unsicherheiten erfolgen.
In besonderer Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt eine Auslegung der Partitionen mit einem Partitionsmaß ungleich dem maximalen Partitionsmaß, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und eine Auslegung der Partitionen ungleich dem minimalem Partitionsmaß, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist. In dieser Ausgestaltung umfasst der erste Bereich somit alle realisierbaren Partitionsmaße mit Ausnahme des zweiten/maximalen Partitionsmaßes und umfasst der zweite Bereich somit alle realisierbaren Partitionsmaße mit Ausnahme des minimalen Partitionsmaßes.
In einer weiteren besonderen Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt eine Auslegung mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und eine Auslegung der Partitionen mit einem Partitionsmaß aus dem zweiten Bereich, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist. Als erster Bereich kann hierbei bevorzugt ein (optional gegenüber dem vorigen Schritt des Verfahrens abgewandelter) Bereich derart gewählt werden, dass der Bereich nur Partitionsmaße umfasst, deren zugehörige, vorzugsweise relative, Unsicherheit der messbaren Konzentration kleiner ist als die vorzugsweise relative Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Wahl des zweiten/maximalen Partitionsmaßes. Analog kann als zweiter Bereich bevorzugt ein (optional gegenüber dem vorigen Schritt abgewandelter) Bereich derart gewählt werden, dass der Bereich nur Partitionsmaße umfasst, deren zugehörige, vorzugsweise relative, Unsicherheit der messbaren Konzentration kleiner ist als die vorzugsweise relative Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Wahl des minimalen Partitionsmaßes. Dies hat den Vorteil, dass ein Partitionsmaß der minimalen Variante gewählt wird, bei welcher die relative Unsicherheit stets kleiner als bei Wahl der maximalen Variante ist und umgekehrt.
In einer weiteren besonderen Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt die Auslegung der Partitionen als erste Partitionsanzahl von Partitionen mit dem minimalen Partitionsmaß, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, oder als zweite Partitionsanzahl von Partitionen mit dem zweiten/maximalen Partitionsmaß, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist.
Wie oben ausgeführt, kann das Verfahren Teil eines Analyseverfahren zum Nachweis eines Analyten in einer mikrofluidischen Probe sein. Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein solches Analyseverfahren, wobei die Probe erfindungsgemäß in Partitionen aufgeteilt wird und wobei zumindest eine Partition auf das Vorhandensein des Analyten untersucht wird. Das Analyseverfahren umfasst dabei vorzugsweise eine Durchführung einer digitalen PCR mit zumindest einigen der Partitionen.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe. Dabei wird eine Partitionsfläche bereitgestellt und eine Partitionierung der Probe nach dem erfindungsgemäßen Auslegungsverfahren durchgeführt. Das Herstellungsverfahren kann vorzugsweise eine Herstellung von Kammern für die Partitionierung auf der Partitionsfläche umfassen.
Figurenliste
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen

1 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Auslegung einer Partitionierung,
2a, 2b eine schematische Darstellung einer Partitionierung einer Probe auf eine Partitionsfläche in Form von Tröpfchen beziehungsweise in Form von mit Probenteilen gefüllten Kammern,
3 Diagramme mit beispielhaften Berechnungen von relativen Unsicherheiten unterschiedlicher Konzentrationen eines Analyten in der Probe in Abhängigkeit eines gewählten Partitionsmaßes für die Partitionen,
4 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens zum Nachweis eines Analyten in einer mikrofluidischen Probe und
5 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe.

Ausführungsformen der Erfindung
1 zeigt ein Ablaufdiagramm 500 eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe. Die Partitionierung kann dabei wie oben beschrieben insbesondere Teil oder Voraussetzung einer partitionsbasierten quantitativen Nachweismethode für Analyten in der Probe sein, wobei solch eine Nachweismethode bei mikrofluidischen Proben vorzugsweise mit einer mikrofluidischen Vorrichtung, insbesondere einem Lab-on-Chip-System, durchgeführt werden kann. Beispielsweise ist das im Folgenden beschriebene Verfahren Teil eines quantitativen Nachweises von Nukleinsäureabschnitten von Krankheitserregern oder Tumorzellen in einer biologischen Probe umfassend eine Körperflüssigkeit (zum Beispiel Blut, Sputum oder ein Abstrich), wobei der quantitative Nachweis über eine digitale PCR mit der erfindungsgemäß ausgelegten Partitionierung der Probe erfolgt.
In einem ersten Schritt 510 des Verfahrens 500 werden das Volumen der Probe und eine für die Partitionierung zur Verfügung stehende Fläche, kurz Partitionsfläche, bestimmt. Beispielhaft könnte das aufteilbare Volumen V_sys = 25 Mikroliter (µL) betragen und die Partitionsfläche quadratisch mit einer Kantenlänge von L = 10 Millimeter (mm) ausgestaltet sein.
Im zweiten Schritt 520, welcher auch vor dem ersten Schritt 510 erfolgen kann, wird festgelegt, ob die Aufteilung der Probe in Form von Tröpfchen ohne Zwischenwände oder in Kammern erfolgen soll. 2a zeigt schematisch eine Anordnung von Tröpfchen 110 mit Durchmesser d auf einer Partitionsfläche 101 mit einer Breite L, wobei die Partitionsfläche 101 beispielsweise quadratisch oder rechteckig und wie dargestellt durch eine Wand 102 begrenzt sein kann. Die Partitionsfläche 101 kann dabei insbesondere in einer Kammer einer mikrofluidischen Kartusche angeordnet sein. 2b zeigt in alternativer Ausgestaltung schematisch eine Anordnung von Kammern 120 auf der Partitionsfläche 101, wobei die Probe auf die Kammern 120 aufgeteilt werden soll. Die Kammern 120 haben beispielsweise wie dargestellt eine hexagonale Grundfläche 121 mit einer Breite d, einer Wandhöhe D, welche einer Kammertiefe entspricht, und einer Wanddicke w zwischen jeweils zwei Kammern, wobei die Wanddicke w vorzugsweise möglichst klein gewählt wird, um möglichst wenig Fläche der Partitionsfläche 101 durch Wände 122 der Kammern 120 zu blockieren. Eine minimale Wanddicke und maximale Wandhöhe zur Maximierung des Volumens der Kammern 120 können dabei insbesondere auch durch fertigungstechnische Erfordernisse beschränkt sein. Bei Wahl der kammerbasierten Anordnung 120 erfolgen in einem Unterschritt 521 eine Festlegung der minimalen Wanddicke w, beispielsweise w = 25 Mikrometer (pm), und der Wandhöhe/Kammertiefe D , beispielsweise D = 380 µm. Die Partitionsfläche 101 kann insbesondere eine Oberfläche eines Substrats sein, beispielsweise eines Substrats aus Silizium, Kunststoff oder einer Kombination beider Materialien. Im Falle der Ausgestaltung mit Kammern 120 können die Kammern 120, insbesondere die Wände 122, ebenfalls aus Silizium, Kunststoff oder einer Kombination beider Materialien gefertigt sein. Insbesondere im Falle einer wässrigen Probe ist eine hydrophile Ausgestaltung der Partitionsfläche 101 beziehungsweise der Kammern 120 vorteilhaft.
Anschließend wird in einem dritten Schritt 530 ein minimales Partitionsmaß d_min definiert, wobei eine Größe dieses minimalen Partitionsmaßes d_min durch, je nach Einzelfall auch obengenannte, fertigungstechnische Limitierungen und einer Auflösung einer für die Analyse der Partitionen zu verwendenden Detektionsoptik bestimmt sein können. Beispielsweise beträgt des minimale Partitionsmaß d_min = 10 µm und repräsentiert den, vorzugsweise entspricht dem Durchmesser d der Tröpfchen 110 im Falle der tröpfchenbasierten Anordnung beziehungsweise den Abstand zwischen den Mittelpunkten zweier Kammern 120 oder den Abstand d zweier gegenüberliegender Ecken bei einer hexagonalen Grundfläche 121 der Kammern 120 im Falle der kammerbasierten Anordnung. Ausgehend von diesem minimalen Partitionsmaß d_min wird in einem vierten Schritt 540 berechnet, wie viele Partitionen auf der Partitionsfläche 101, gegebenenfalls unter Einhaltung der minimalen Wanddicke w, untergebracht werden können. Im betrachteten Fall wären dies bei einem kammerbasierten Ansatz A_max = 101871 Partitionen in hexagonaler Anordnung, wobei diese Zahl im Folgenden als erste Partitionsanzahl A_max bezeichnet wird. Aus den Maßen der Partitionen lassen sich zusammen mit der Tiefe D der Kammern 120 das Fassungsvermögen einer einzelnen Partition V_par und nach Multiplikation mit der ersten Partitionsanzahl A_max das gesamte fassbare Volumen V_ana berechnen. Dieses beträgt im vorliegenden Fall etwa V_ana = 2,51 µL und ist damit nur etwa ein Zehntel des insgesamt aufteilbaren Volumens V_sys von 25 µL.
Die erste Partitionsanzahl A_max definiert auch den maximalen theoretischen Bereich für eine Messung der Konzentration des Analyten (mit cp/pL als Einheit für Kopien pro Mikroliter), welcher von -log(1-1/A_max)/V_Par bis -log(1-(A_max-1)/A_max)/V_par reicht, wobei log den natürlichen Logarithmus bezeichnet. Um vorzugsweise zwei gleich große Messbereiche zu generieren, wird gemäß einem fünften Schritt 550 dieser maximale Messbereich auf einer logarithmischen Skala halbiert. Der resultierende Mittelpunkt λ liegt dann bei (log(1-1/A_max) * log(1-( A_max-1)/A_max))^0.5/V_par und entspricht in diesem Beispiel etwa 431 cp/µL. Alternativ kann auch ein anderer Konzentrationswert λ aus diesem Messbereich ausgewählt werden, insbesondere wenn es Gründe für eine bevorzugte Messung bei geringeren bzw. höheren Konzentrationen gibt.
Eine bevorzugte Alternative zu möglichst vielen Partitionen ist, die Maße der Partitionen so zu wählen, dass möglichst das gesamte Volumen V_sys auch partitioniert wird. Sofern die Partitionsfläche und eine Höhe, welche von den Partitionen ausgefüllt wird, groß genug sind, ist es grundsätzlich immer möglich, das gesamte Volumen V_sys auf der Partitionsfläche 101 unterzubringen und zwar im Grenzfall in nur einer einzigen Partition. Um jedoch auch den Partitioning Error möglichst gering zu halten, soll bei einer Verwendung des maximal möglichen Volumens das Volumen in möglichst viele Partitionen aufgeteilt werden. Also muss gemäß dem sechsten Schritt 560 des Verfahrens 500 zunächst ein zweites Partitionsmaß d_max gefunden werden, welches unter den gegebenen Bedingungen das partitionierbare und damit analysierbare Volumen V_ana maximiert und gleichzeitig möglichst viele Partitionen impliziert. Dieses zweite Partitionsmaß wird auch als maximales Partitionsmaß d_max bezeichnet und repräsentiert jedoch das kleinstmögliche Partitionsmaß bei maximal partitioniertem Gesamtvolumen. Im dargestellten Beispiel ergibt sich d_max zu 128,52 µm bei einem maximal partitionierbaren Volumen V_ana von 24,999 µL, also praktisch dem gesamten Volumen V_sys von 25 µL. Dabei wird das partitionierbare Volumen V_ana in 6132 Partitionen aufgeteilt, wobei diese Anzahl im Folgenden als zweite Partitionsanzahl A_min bezeichnet wird. Der sechste Schritt 560 kann auch früher durchgeführt werden, insbesondere vor oder parallel zu einem der vorhergehenden Schritte, sofern der erste Schritt 510 und der zweite Schritt 520 erfolgt sind.
Gemäß einem vorzugsweise siebten Schritt 570 des Verfahrens wird der maximale theoretische Bereich für eine Messung der Konzentration des Analyten bei einer Verwendung der zweiten Partitionsanzahl A_min von Partitionen mit maximalem Partitionsmaß d_max ermittelt, wobei sich dieser Bereich analog zu oben von -log(1-1/A_min)/V_{par_2} bis -log(1-(A_min -1)/A_min)/V_{par_2} erstreckt und wobei V_{par_2} das Volumen einer Partition mit Partitionsmaß d_max entspricht. Wenn der oben berechnete Mittelpunkt λ nicht in diesen Bereich fällt, erfolgt gemäß einem Unterschritt 571 des siebten Schritts 570 vorzugsweise eine Auslegung der Partitionierung gemäß der ersten Partitionsanzahl A_max mit minimalem Partitionsmaß d_min. Wenn der berechnete Mittelpunkt λ in diesen Bereich fällt, wird das Verfahren 500 gemäß diesem Ausführungsbeispiel wie folgt fortgesetzt.
Gemäß einem achten Schritt 580 des Verfahrens 500 werden eine erste Unsicherheit einer messbaren Konzentration des Analyten bei Verwendung der der ersten Partitionsanzahl A_max von Partitionen mit minimalem Partitionsmaß d_min (im Weiteren kurz als minimale Variante bezeichnet) und eine zweite Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Verwendung der zweiten Partitionsanzahl A_min von Partitionen mit maximalem Partitionsmaß d_max (im Weiteren kurz als maximale Variante bezeichnet) berechnet.
Die relativen Unsicherheiten können dabei vorzugsweise mit folgendem Ansatz bestimmt werden.
Zur Berechnung des Partitioning Error kann eine Unsicherheit basierend auf dem Konfidenzintervall folgender Wahrscheinlichkeitsverteilung P(C|H) verwendet werden: $P (C | H) = \frac{(A - 1)!}{(A - A - 1)!} \cdot \frac{S_{C, H}}{A^{C}}$
wobei C für die Anzahl der Targets im analysierten Probenvolumen V_ana, H für die Anzahl der Partitionen, die mindestens einen Analyten enthalten, A für die verfügbare Anzahl an Partitionen und S für die Stirling-Zahl zweiter Art steht.
Für den Subsampling Error kann eine Unsicherheit basierend auf dem Konfidenzintervall folgender Wahrscheinlichkeitsverteilung P(C_tot|C,p) verwendet werden: $P (C_{t o t} | C, p) = (\begin{matrix} C_{t o t} \\ C \end{matrix}) \cdot p^{C + 1} \cdot {(1 - p)}^{C_{t o t} - C}$
wobei C für die Anzahl der Targets im analysierbaren Probenvolumen V_ana, C_tot für die Anzahl der Targets im partitionierbaren Volumen V_sys und p für den Anteil des analysierbaren Volumens am partitionierbaren Volumen V_ana/V_sys steht.
Wenn beide Fehler kombiniert werden, ergibt sich: $P (C_{t o t} | H, p) = \sum_{C = H}^{C_{t o t}} P (C_{t o t} | C, p) \cdot P (C | H)$
Da eine exakte Berechnung dieser Verteilung sehr lange dauert, kann sie durch eine Gauß-Verteilung genähert werden. Bei einer Gauß-Verteilung kann das Konfidenzintervall direkt aus der Varianz s berechnet werden. Im Falle eines 95 %-Konfidenzintervalls beträgt dieses $μ \pm 1,96 \cdot \sqrt{s},$
wobei µ den Erwartungswert repräsentiert. Die Standardabweichung $\sqrt{s}$
einer Gauß-Verteilung lässt sich aus der Wahrscheinlichkeit am Erwartungswert, also der maximalen Wahrscheinlichkeit, berechnen: $\sqrt{s} = \frac{1}{\sqrt{2 π} \cdot P (μ)}$
Dieser Zusammenhang wird in der Näherung verwendet. Der Maximalwert von P(C_tot|H,p) wird gleich P(µ) gesetzt und dann die Standardabweichung und daraus das Konfidenzintervall berechnet, welche wiederum die Ungenauigkeit definiert.
Der Wert, bei dem P(C_tot|H,p) maximal wird, liegt bei ${\hat{C}}_{t o t} = ⌊ - log (1 - \frac{H}{N}) \cdot \frac{N}{p} ⌋$
Die Berechnung von P(C_tot|H,p) erfolgt über: $P ({\hat{C}}_{t o t} | H, p) = \frac{(N - 1)!}{(N - H - 1)!} \sum_{C = H}^{{\hat{C}}_{t o t}} \frac{S_{C, H}}{N^{C}} \cdot (\begin{matrix} {\hat{C}}_{t o t} \\ C \end{matrix}) \cdot p^{C + 1} \cdot {(1 - p)}^{{\hat{C}}_{t o t} - C}$
Diese Berechnung ist hinsichtlich des Zeitaufwandes vorteilhaft. Diese Näherung ermöglicht einen qualitativen Vergleich und die quantitativen Ergebnisse liegen im Bereich von etwa 10 % um den wahren, exakten Wert der Unsicherheit.
Unter Verwendung dieser Annährung ergibt sich für das vorliegende Beispiel die erste relative Unsicherheit des Messergebnisses σ beim Mittelpunkt λ bei Anwendung der minimalen Variante von etwa 0,0566 oder 5,66 %. Bei Anwendung der maximalen Variante ergibt sich die zweite relative Unsicherheit beim Mittelpunkt λ zu etwa 0,0254 oder 2,54 %, also eine weniger als halb so große relative Unsicherheit
Gemäß einem neunten Schritt 590 des Verfahrens 500 werden nun die beiden relativen Unsicherheiten verglichen und abhängig von diesem Vergleich eine Auslegung der Partitionierung bestimmt. Insbesondere kann abhängig von diesem Vergleich eine Partitionierung gemäß der minimalen Variante 591 oder gemäß der maximalen Variante 592 realisiert werden, sodass bevorzugt die relative Unsicherheit möglichst gering ist. Für die konkrete Wahl der Variante und insbesondere für die Wahl eines konkreten Werts für die Partition sind mehrere Ansätze vorteilhaft, welche insbesondere oben ausgeführt wurden. Beispielsweise kann dann diejenige Auslegung gewählt werden, welche die geringere Unsicherheit in der Mitte des maximalen theoretischen Messbereichs liefert. In diesem Beispiel erfolgt somit bei einer quadratischen Partitionsfläche von 10 mm Kantenlänge, einem prozessierten Volumen von 25 µL, einer Kammertiefe/Wandhöhe von 380 µm, einer minimalen Wanddicke von 25 µm und minimalen Partitionsmaß von 10 µm eine Verteilung aus der Probe in 6132 hexagonale Partitionen mit dem Partitionsmaß von 128,52 µm. Nach der Befüllung der Kammern 120 mit der Probe gemäß dieser Partitionierung kann in besonderer Ausgestaltung eine Überschichtung der Kammern 120 mit (transparentem) Öl erfolgen, bevor eine nachfolgende Verarbeitung oder Analyse, beispielsweise als Teil einer digitalen PCR, erfolgt.
3 zeigt beispielhaft gemäß der oben beschriebenen Annäherung berechnete relative Unsicherheiten σ in Abhängigkeit vom Partitionsmaß d für verschiedene Konzentrationen des Analyten in der Probe (10, 50, 100 und 500 Analyten pro Mikroliter respektive) bei Verwendung von Kammern 120 und denselben Werten für Volumen, Kantenlänge, Kammertiefe/Wandhöhe und Wanddicke. Wie aus 3 ersichtlich, ist für diese Randbedingungen bei allen berechneten Konzentrationen eine Auslegung mit großen Partitionsmaßen mit meist geringerem relativen Fehler verbunden, wobei vor allem bei geringen Konzentrationen eine Auslegung mit möglichst geringem Partitionsmaß unvorteilhaft ist. Dies liegt daran, dass in diesen Fällen der Subsampling Error gegenüber dem Partitioning Error aufgrund des deutlich kleineren partitionierbaren Volumens bei sehr kleinem Partitionsmaß dominiert. Bei anderen Randbedingungen können sich für bestimmte Konzentrationen hingegen auch kleinere relative Fehler für Auslegungen mit kleinem Partitionsmaß gegenüber Auslegungen gemäß der maximalen Variante ergeben.
Gemäß einer Abänderung des oben beschriebenen Ausführungsbeispiels 500 wird das gesamte aufteilbare Volumen V_sys auf 30 µL erhöht. Das minimale Partitionsmaß d_min, die Kantenlänge L der Partitionsfläche 101, die Wandhöhe/Kammertiefe D und die Wanddicke w bleiben ungeändert bei 10 µm, 10 mm, 380 µm bzw. 25 µm. Der Mittelpunkt λ des logarithmischen Messbereichs liegt in diesem Fall bei etwa 431 cp/µL. Der größte Anteil des aufteilbaren Volumens V_sys kann bei einem zweiten/maximalen Partitionsmaß von d_max = 294,65 µm analysiert werden. Bei diesem Partitionsmaß reicht der Messbereich bis zu einer Konzentration von ca. 338 cp/µL. Demnach umfasst dieser Messbereich nicht den Mittelpunkt λ und damit würde vorzugsweise gemäß Unterschritt 571 des siebten Schritts 570 eine Auslegung der Partitionierung entsprechend der minimalen Variante erfolgen.
4 zeigt ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens 600. In einem ersten Schritt 610 des Verfahrens 600 kann vorzugsweise eine Probe gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung in Partitionen aufgeteilt werden, beispielsweise gemäß dem oben zur 1 beschriebenen Verfahren 500. Anschließend können in einem zweiten Schritt 620 zumindest eine Partition, bevorzugt möglichst alle Partitionen, auf das Vorhandensein des Analyten untersucht werden und daraus auf eine Konzentration des Analyten in der aufgeteilten Probe rückgeschlossen werden. Diese Bestimmung der Konzentration erfolgt dabei bevorzugt über die Durchführung einer digitalen PCR, wozu die Partitionen die Grundlage bilden.
5 zeigt ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens 700. In einem ersten Schritt 710 wird eine Partitionsfläche bereitgestellt. Dies kann beispielsweise durch eine Bereitstellung eines Substrats erfolgen, wobei eine Oberfläche des Substrats die Partitionsfläche bildet. Die Partitionsfläche beziehungsweise das Substrat können dabei Teil einer mikrofluidischen Kartusche sein oder im Zuge des Herstellungsverfahrens 700 in der Kartusche angeordnet oder fixiert werden. In einem zweiten Schritt 720 des Verfahrens erfolgt eine Auslegung der Partitionierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung, beispielsweise gemäß dem oben zur 1 beschriebenen Verfahren 500. Das Herstellungsverfahren 700 kann dabei in vorteilhafter Ausgestaltung eine Herstellung von Kammern für die Partitionierung auf der Partitionsfläche umfassen.

Claims

Verfahren (500) zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen Probe in Partitionen auf einer Partitionsfläche, insbesondere für eine Bestimmung einer Konzentration eines Analyten in der Probe, umfassend die Schritte • Festlegung (510, 520) einer geometrischen Form (110, 120) der Partitionen (110, 120), einer Form der Partitionsfläche (101) und eines Gesamtvolumens der Probe • Bestimmung (530, 540) eines minimalen Partitionsmaßes der Partitionen (110, 120) und einer korrespondierenden maximalen Anzahl von auf der Partitionsfläche (101) anordenbaren Partitionen (110, 120) mit minimalem Partitionsmaß als erste Partitionsanzahl. • Ermittlung (560) eines zweiten Partitionsmaßes der Partitionen (110, 120) und einer korrespondierenden zweiten Partitionsanzahl unter der Bedingung, dass ein maximal möglicher Anteil des Gesamtvolumens auf der Partitionsfläche (101) partitioniert werden kann und der maximal mögliche Anteil auf möglichst viele Partitionen (110, 120) auf der Partitionsfläche (101) aufgeteilt wird. • Bestimmung (580) einer ersten Unsicherheit einer messbaren Konzentration des Analyten bei Verwendung eines Partitionsmaßes aus einem ersten Bereich um das minimale Partitionsmaß und Bestimmung einer zweiten Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Verwendung eines Partitionsmaßes aus einem zweiten Bereich um das zweite Partitionsmaß. • Auslegung (591, 592) der Partitionen mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich oder aus dem zweiten Bereich abhängig von einem Vergleich (590) der ersten Unsicherheit mit der zweiten Unsicherheit.
Verfahren (500) nach Anspruch 1, wobei eine Auslegung (591, 592) der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß ungleich dem maximalen Partitionsmaß erfolgt, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) ungleich dem minimalem Partitionsmaß erfolgt, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist.
Verfahren (500) nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich erfolgt, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß aus dem zweiten Bereich erfolgt, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist.
Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit minimalem Partitionsmaß erfolgt, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit maximalem Partitionsmaß erfolgt, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist.
Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich erfolgt, insbesondere mit dem minimalen Partitionsmaß, wenn eine Messung einer Konzentration des Analyten bei einem vorgegebenen Konzentrationswert bei einer Auslegung der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß aus dem zweiten Bereich, insbesondere mit dem zweiten Partitionsmaß, nicht möglich ist.
Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Unsicherheit bei Verwendung der ersten Partitionsanzahl von Partitionen mit dem minimalen Partitionsmaß bestimmt und die zweite Unsicherheit bei Verwendung der zweiten Partitionsanzahl von Partitionen mit dem zweiten Partitionsmaß bestimmt werden.
Verfahren (500) nach Anspruch 6, wobei die erste Unsicherheit und/oder die zweite Unsicherheit bei einem Wert aus dem maximalen theoretischen Bereich für eine Messung der Konzentration des Analyten bestimmt werden, insbesondere wobei der Wert dem logarithmischen Mittelwert des maximalen theoretischen Bereichs entspricht.
Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die geometrische Form (110, 120) der Partitionen (110, 120) eine die Partitionen (110, 120) zumindest teilweise begrenzende Wand (122) mit einer vorgegebenen Wanddicke und/oder Wandhöhe berücksichtigt.
Analyseverfahren (600) zum Nachweis eines Analyten in einer mikrofluidischen Probe, wobei die Probe gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche in Partitionen (110, 120) aufgeteilt wird und wobei zumindest eine Partition (110, 120) auf das Vorhandensein des Analyten untersucht wird.
Analyseverfahren (600) nach Anspruch 9, wobei das Analyseverfahren (600) eine Durchführung einer digitalen PCR mit zumindest einigen der Partitionen (110, 120) umfasst.
Verfahren (700) zur Herstellung einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe, wobei eine Partitionsfläche bereitgestellt wird und wobei die Partitionierung der Probe gemäß einer Auslegung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erfolgt.