EP4363607A1 - Verfahren zur auslegung einer partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen probe - Google Patents

Verfahren zur auslegung einer partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen probe

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Publication number
EP4363607A1
EP4363607A1 EP22732972.9A EP22732972A EP4363607A1 EP 4363607 A1 EP4363607 A1 EP 4363607A1 EP 22732972 A EP22732972 A EP 22732972A EP 4363607 A1 EP4363607 A1 EP 4363607A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
partition
partitions
uncertainty
measure
sample
Prior art date
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Pending
Application number
EP22732972.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Manuel Loskyll
Daniel Sebastian Podbiel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP4363607A1 publication Critical patent/EP4363607A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B01L3/502792—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics for moving individual droplets on a plate, e.g. by locally altering surface tension
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0893—Geometry, shape and general structure having a very large number of wells, microfabricated wells

Definitions

  • Microfluidic analysis systems allow automated, reliable, fast, compact and cost-effective processing of patient samples for medical diagnostics.
  • complex molecular diagnostic test sequences can be carried out on a lab-on-chip cartridge.
  • each of these partitions an end point amplification of the specific DNA target takes place independently of one another, which results in an increase in fluorescence if at least one target was located in the respective partition at the beginning of the amplification reaction.
  • the target concentration in the analyzed sample can be deduced by using Poisson statistics.
  • the general recommendation is to reduce the partitioning error by using the largest possible number of partitions in order to increase the dynamic measuring range of the analysis system.
  • the subsampling error is generally negligible and, according to the literature, only plays a significant role if the proportion of the volume analyzed is below 30% or 50%, depending on the application (Jacobs et al., BMC Bioinformatics 15, 283 (2014), https https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-283).
  • the advantage of the highest possible number of partitions is emphasized.
  • the invention relates to a method for designing a partitioning of a microfluidic sample into partitions on a partition surface.
  • the invention also relates to a method for partitioning, dividing or aliquoting such a sample into partitions or subsets of the sample.
  • the method can be used in particular for determining a concentration of an analyte in the sample, in particular in combination with a digital PCR in the case of nucleic acid sections as analytes.
  • a partitioning of a sample can thus be understood as a division or aliquoting of a sample into sample parts, in a preferred embodiment an actual placement of the sample in the form of sample parts on the partition area.
  • the sample can in particular be a biological sample, for example comprising a body fluid such as blood, urine, sputum or a smear.
  • the sample can also contain other substances, for example in the form of a mixture of the body fluid with a transport medium such as eNATTM or UTMTM.
  • the analyte, also called target can be a molecule in the sample, in particular a nucleic acid segment, for example part of a DNA or RNA of a pathogen or a specific body cell, in particular a tumor cell.
  • the analyte can also be cells, in particular protozoa or animal or human body cells, for example one or more of what are known as circulating tumor cells (CTC for short).
  • CTC circulating tumor cells
  • the method according to the invention can thus be part of or a prerequisite for a partition-based quantitative detection method for analytes in the sample, for example with the aid of a digital PCR, with such a detection method being used in the case of microfluidic samples preferably with a microfluidic device, in particular a lab-on-chip system, can be carried out.
  • a partitioning of the sample can advantageously be implemented for a statistical estimation of a concentration of the analyte in the sample with a low relative error.
  • the method for designing a partitioning comprises a partitioning of the sample on the partition area according to the invention.
  • the partition surface can generally be part of a microfluidic device, preferably part of a microfluidic cartridge.
  • the partition surface can be a surface on a substrate in a chamber of the microfluidic device.
  • a geometric shape of the partitions, a shape of the partition area and a total volume of the sample are defined.
  • the partition area can, for example, have a square or rectangular shape and optionally be surrounded by a delimiting wall.
  • the partitions can preferably be in the form of droplets or chambers. In the case of the droplets, these are present in particular as an emulsion, for example as water-based droplets in an oil emulsion, it being possible for the droplets to be stabilized preferably by adding surface-active substances, so-called surfactants.
  • the chambers can have a round or angular base, preferably a hexagonal base.
  • the chambers are separated from one another by walls, the walls preferably being made as thin as possible in order to block as little surface as possible. The walls are preferably taken into account in the geometric shape of the chambers.
  • a minimum partition measure of the partitions is determined.
  • a minimum partition size is a size, that is to say a representative and preferably unique value, for the size of the partition, in particular for the volume of the partition.
  • the partition dimension can be the diameter of the partition in the case of a spherical or teardrop-shaped partition or the width of the chamber in the case of partitioning into chambers with an angular, for example square or hexagonal, base area.
  • the partition dimension is the distance between two opposite corners, preferably the minimum center distance of the partitions.
  • a maximum number of partitions with a minimum partition size that can be arranged on the partition area results implicitly from the minimum partition size.
  • This maximum number is also referred to below as the first number of partitions and is a measure of a minimum value of the partitioning error because the statistical inaccuracy of the concentration determination of the entire partitioned volume of the sample decreases with an increasing number of partitions.
  • a partitioning design with as many partitions as possible and a correspondingly small partition size is referred to below as a minimal variant.
  • a second partition measure of the partitions and thus a second number of partitions is determined under the condition that a maximum possible proportion of the total volume can be partitioned on the partition area and under this condition the maximum possible proportion on as many partitions as possible on the Partition area is divided.
  • This second partition size is also referred to below as the maximum partition size d max and, however, represents the smallest possible partition size given the maximum partitioned total volume.
  • the number of partitions at the maximum partition size is also referred to below as the second designated.
  • a design of a partitioning in which the complete total volume of the sample is partitioned as far as possible and a correspondingly larger partition size is selected, is referred to as the maximum variant in the following as a distinction from the minimum variant.
  • this step can also be carried out before the previous step.
  • a first uncertainty of a measurable concentration of the analyte is determined when using a partition measure from a first range around the minimum partition measure and a second uncertainty of the measurable concentration is determined Using a partition measure from a second range around the second partition measure.
  • the first and second uncertainties can preferably be relative uncertainties. These determinations advantageously determine whether a design according to the minimum or maximum variant is better with regard to the smallest possible measurement error of the concentration.
  • the first range is preferably defined such that the first range includes the minimum partition metric, preferably as the lower end of the first range, and does not include the second partition metric.
  • the second range is preferably defined such that the second range includes the second partition measure, preferably as the upper end of the second range, and does not include the minimum partition measure.
  • the first area and the second area can be two mutually non-overlapping areas, ie in particular disjunctive areas.
  • the first uncertainty of a measurable concentration of the analyte is determined when using the first partition number of partitions with the minimum partition measure and the second uncertainty of the measurable concentration is determined when using the second partition number of partitions with the second partition measure.
  • the first uncertainty and/or the second uncertainty are determined at a value from the maximum theoretical range for a measurement of the concentration of the analyte. This maximum theoretical range is from -log(11 /A max )/V par to -log(1-( A max -1)/A max )/V par, where A max is the first partition number, V par is the capacity/volume of a single partition and log denotes the natural logarithm.
  • the center point of this range on a logarithmic scale is selected as the value, which is at (log(ll/A max ) * log(l-( A max -l)/A max )) A 0.5 /V Par lies.
  • the partitions are designed with a partition measure from the first range, preferably with the minimum partition measure, if a measurement of a concentration of the analyte at a predetermined concentration value is carried out when the Partitions with a partition size from the second range, in particular with the second partition size, is not possible.
  • the predetermined concentration value can preferably be a value from the maximum theoretical range described above, preferably around the midpoint of this range on a logarithmic scale, described above.
  • the partitions are designed from the first area or from the second area depending on a comparison of the first uncertainty with the second uncertainty.
  • the minimum variant or maximum variant can be selected on the basis of these ascertained uncertainties.
  • the partitions are designed with a partition measure not equal to the maximum partition measure if the first uncertainty is less than the second uncertainty, and the partitions are designed not equal to the minimum partition measure if the first uncertainty is greater than or equal to the second uncertainty is big.
  • the first area thus includes all feasible partition dimensions with the exception of the second/maximum partition dimension and the second area thus includes all feasible partition dimensions with the exception of the minimum partition dimension.
  • the partitions are designed with a partition measure from the first range if the first uncertainty is smaller than the second uncertainty, and the partitions are designed with a partition measure from the second range if the first uncertainty is greater than the second uncertainty or equal.
  • a range (optionally modified compared to the previous step of the method) can preferably be selected as the first range in such a way that the range only includes partition dimensions whose associated, preferably relative, uncertainty of the measurable concentration is smaller than the preferably relative uncertainty of the measurable concentration Choice of second/maximum partition measure.
  • a range (optionally modified compared to the previous step) can preferably be selected as the second range in such a way that the range only includes partition dimensions whose associated, preferably relative, uncertainty of the measurable concentration is smaller than the preferably relative uncertainty of the measurable concentration when selecting the minimum partition size.
  • the partitions are designed as a first partition number of partitions with the minimum partition measure if the first uncertainty is smaller than the second uncertainty, or as a second partition number of partitions with the second/maximum partition measure if the first uncertainty is greater than or equal to the second uncertainty.
  • the method can be part of an analysis method for detecting an analyte in a microfluidic sample.
  • the subject matter of the invention is therefore also such an analysis method, in which the sample is divided into partitions according to the invention and in which at least one partition is examined for the presence of the analyte.
  • the analysis method preferably includes carrying out a digital PCR with at least some of the partitions.
  • the subject matter of the invention is also a method for producing a partitioning of a microfluidic sample.
  • a partition area is provided and the sample is partitioned according to the design method according to the invention.
  • the manufacturing method may preferably include manufacturing compartments for partitioning on the partition surface.
  • FIG. 1 shows a flowchart of an exemplary embodiment of the method according to the invention for designing a partitioning
  • FIGS. 2a, 2b show a schematic representation of a partitioning of a sample onto a partition surface in the form of droplets or in the form of chambers filled with sample parts
  • FIG. 4 shows a flowchart of an exemplary embodiment of the analysis method according to the invention for detecting an analyte in a microfluidic sample
  • FIG. 5 shows a flow chart of an exemplary embodiment of the manufacturing method according to the invention for a partitioning of a microfluidic sample.
  • FIG. 1 shows a flowchart 500 of an exemplary embodiment of the method 500 according to the invention for designing a partitioning of a microfluidic sample.
  • the partitioning can in particular be part or a prerequisite of a partition-based quantitative detection method for analytes in the sample, with such a detection method for microfluidic samples preferably having a microfluidic device, in particular a lab-on-chip system, can be performed.
  • the method described below is part of a quantitative detection of nucleic acid segments of pathogens or tumor cells in a biological sample comprising a body fluid (e.g. blood, sputum or a smear), the quantitative detection using a digital PCR with the partitioning of the sample designed according to the invention he follows.
  • a body fluid e.g. blood, sputum or a smear
  • a first step 510 of the method 500 the volume of the sample and an area available for the partitioning, partition area for short, are determined.
  • FIG. 2a schematically shows an arrangement of droplets 110 with a diameter d on a partition surface 101 with a width L, the partition surface 101 being able to be, for example, square or rectangular and delimited by a wall 102 as illustrated.
  • the partition surface 101 can be arranged in particular in a chamber of a microfluidic cartridge.
  • FIG. 1a schematically shows an arrangement of droplets 110 with a diameter d on a partition surface 101 with a width L, the partition surface 101 being able to be, for example, square or rectangular and delimited by a wall 102 as illustrated.
  • the partition surface 101 can be arranged in particular in a chamber of a microfluidic cartridge.
  • the chambers 120 have, for example, as shown, a hexagonal base area 121 with a width d, a wall height D, which corresponds to a chamber depth, and a wall thickness w between each two chambers, with the wall thickness w preferably being selected as small as possible in order to minimize the area of the partition surface 101 by walls 122 of chambers 120 to block.
  • a minimum wall thickness and maximum wall height for maximizing the volume of the chambers 120 can also be limited, in particular, by manufacturing requirements.
  • the partition area 101 can in particular be a surface of a substrate, for example a substrate made of silicon, plastic or a combination of both materials.
  • the chambers 120 in particular the walls 122, can also be made of silicon, plastic or a combination of both materials.
  • a hydrophilic configuration of the partition surface 101 or of the chambers 120 is advantageous.
  • a minimum partition size d m/n is defined, with a size of this minimum partition size d m/n being determined by manufacturing limitations, also mentioned above depending on the individual case, and a resolution of a detection optics to be used for the analysis of the partitions can.
  • a fourth step 540 it is calculated how many partitions can be accommodated on the partition area 101, possibly while maintaining the minimum wall thickness w.
  • the first partition number A max also defines the maximum theoretical range for a measurement of the concentration of the analyte (with cp/pL as units of copies per microliter), which is from -log(II /A max )/V par to -log(l- ( A max - 1)/A max )/V par , where log denotes the natural logarithm.
  • log denotes the natural logarithm.
  • according to one fifth step 550 halves this maximum measurement range on a logarithmic scale.
  • the resulting center point l is then at (log(ll /A max ) * log(l-( A max -l)/A max )) A 0.5/V par and in this example corresponds to about 431 cp/pL.
  • concentration value l from this measurement range can also be selected, particularly if there are reasons for preferring measurement at lower or higher concentrations.
  • a preferred alternative to as many partitions as possible is to choose the dimensions of the partitions in such a way that the entire volume ⁇ Z sys is also partitioned. If the partition area and a height that is filled by the partitions are large enough, it is basically always possible to accommodate the entire volume ⁇ Z sys on the partition area 101, and in extreme cases in just a single partition. However, in order to keep the partitioning error as low as possible, when using the maximum possible volume, the volume should be divided into as many partitions as possible. Therefore, according to the sixth step 560 of the method 500, a second partition measure d max must first be found, which under the given conditions maximizes the partitionable and thus analyzable volume V ana and at the same time implies as many partitions as possible.
  • This second partition size is also referred to as the maximum partition size d max and, however, represents the smallest possible partition size given the maximum partitioned total volume.
  • d max is 128.52 pm with a maximum partitionable volume V ana of 24.999 pL, i.e. practically the entire volume ⁇ Z sys of 25 pL.
  • the partitionable volume V ana is divided into 6132 partitions, this number being referred to below as the second partition number A mm .
  • the sixth step 560 can also be carried out earlier, in particular before or in parallel with one of the preceding steps, provided that the first step 510 and the second step 520 have taken place.
  • the maximum theoretical range for a measurement of the concentration of the analyte is determined when using the second partition number A mm of partitions with the maximum partition size d max , this range being analogous to above from -log(ll/ A min )lVp ar _2 extends to -log(l-( A min -1)/ A min )/Vp ar _2 and where V par _2 corresponds to the volume of a partition with partition size d max .
  • the partitioning is preferably designed according to the first number of partitions A max with a minimum partition measure d m/n . If the calculated center point I falls within this range, the method 500 according to this embodiment continues as follows.
  • a first uncertainty of a measurable concentration of the analyte when using the first partition number A max of partitions with a minimum partition measure d m/n (hereinafter referred to as minimum variant) and a second uncertainty of the measurable concentration calculated using the second number of partitions A m/n of partitions with maximum partition size d max (referred to below as maximum variant for short).
  • the relative uncertainties can preferably be determined using the following approach.
  • An uncertainty based on the confidence interval of the following probability distribution P ⁇ C ⁇ H) can be used to calculate the partitioning error: where C is the number of targets in the analyzed sample volume V ana , H is the number of partitions containing at least one analyte, A is the available number of partitions, and S is the Stirling number of the second kind.
  • C, p) can be used: where C stands for the number of targets in the analyzable sample volume V ana , C tot for the number of targets in the partitionable volume ⁇ Z sys and p for the fraction of the analyzable volume in the partitionable volume V ana /V sys .
  • the confidence interval can be calculated directly from the variance s. In the case of a 95% confidence interval, this is m ⁇ 1.96 Vs, where m represents the expected value.
  • the standard deviation s of a Gaussian distribution can be calculated from the probability at the expected value, i.e. the maximum probability:
  • P ⁇ C tot ⁇ H, p) is calculated via: This calculation is advantageous in terms of the time required. This approximation allows for a qualitative comparison and the quantitative results are within about 10% of the true, exact value of the uncertainty.
  • the first relative uncertainty of the measurement result s at the center point l when using the minimum variant of about 0.0566 or 5.66% results.
  • the second relative uncertainty at midpoint l is about 0.0254 or 2.54%, i.e. less than half the relative uncertainty
  • a ninth step 590 of the method 500 the two relative uncertainties are now compared and an interpretation of the partitioning is determined as a function of this comparison.
  • a partitioning according to the minimum variant 591 or according to the maximum variant 592 can be implemented, so that the relative uncertainty is preferably as low as possible.
  • several approaches are advantageous, which were explained above in particular.
  • that interpretation can then be selected which provides the lower uncertainty in the middle of the maximum theoretical measuring range.
  • the sample is distributed into 6132 hexagonal partitions with the partition measure of 128.52 pm.
  • the chambers 120 can be covered with (transparent) oil in a particular embodiment before subsequent processing or analysis, for example as part of a digital PCR, takes place.
  • FIG. 3 shows, by way of example, relative uncertainties s calculated according to the approach described above as a function of the partition measure d for various concentrations of the analyte in the sample (10, 50, 100 and 500 analytes per microliter, respectively) when using chambers 120 and the same values for volume, edge length, chamber depth/wall height and wall thickness.
  • a design with large partition dimensions is usually associated with a lower relative error, with a design with the smallest possible partition dimension being disadvantageous, especially in the case of low concentrations. This is due to the fact that in these cases the subsampling error dominates over the partitioning error due to the significantly smaller partitionable volume with a very small partition size.
  • smaller relative errors for designs with a small partition size compared to designs according to the maximum variant can also result for certain concentrations.
  • the total dividable volume ⁇ Z sys is increased to 30 pl_.
  • the minimum partition dimension d mm , the edge length L of the partition surface 101, the wall height/chamber depth D and the wall thickness w remain unchanged at 10 pm, 10 mm, 380 pm and 25 pm, respectively.
  • the center l of the logarithmic measuring range is around 431 cp/pL.
  • FIG. 4 shows a flow chart of an exemplary embodiment of the analysis method 600 according to the invention.
  • a sample can preferably be divided into partitions according to the method according to the invention for designing a partitioning, for example according to the method 500 described above for FIG in a second step 620 at least one partition, preferably all partitions as far as possible, are examined for the presence of the analyte and a conclusion is drawn from this as to a concentration of the analyte in the divided sample.
  • This determination of Concentration is preferably carried out by carrying out a digital PCR, for which the partitions form the basis.
  • FIG. 5 shows a flowchart of an exemplary embodiment of the production method 700 according to the invention.
  • a partition area is provided. This can be done, for example, by providing a substrate, with a surface of the substrate forming the partition area.
  • the partition surface or the substrate can be part of a microfluidic cartridge or can be arranged or fixed in the cartridge in the course of the manufacturing method 700 .
  • the partitioning is designed according to the method according to the invention for designing a partitioning, for example according to the method 500 described above for FIG

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren (500) zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen Probe in Partitionen (110, 120) auf einer Partitionsfläche (101), insbesondere für eine Bestimmung einer Konzentration eines Analyten in der Probe. Ferner betrifft die Erfindung ein Analyseverfahren (600) zum Nachweis eines Analyten in einer mikrofluidischen Probe und ein Verfahren (700) zur Herstellung einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen Probe
Stand der Technik
Mikrofluidische Analysesysteme (sog. Lab-on-Chips, kurz LoCs) erlauben ein automatisiertes, zuverlässiges, schnelles, kompaktes und kostengünstiges Prozessieren von Patientenproben für die medizinische Diagnostik. Durch die Kombination einer Vielzahl von Operationen für die kontrollierte Manipulation von Fluiden können komplexe molekulardiagnostische Testabläufe auf einer Lab-on- Chip- Kartusche durchgeführt werden.
Im Falle der Implementierung einer auf Partitionen basierenden quantitativen Testmethode, insbesondere bei einer sogenannten digitalen Polymerase- Kettenreaktion (kurz digitalen PCR) in ein solches LoC besteht eine dieser Operationen in der Aliquotierung der Probe in eine Vielzahl von Partitionen.
Diese können beispielsweise als Kammern oder Tropfen realisiert werden. Innerhalb jeder dieser Partitionen findet unabhängig voneinander eine Endpunktamplifikation des spezifischen DNA-Targets statt, welche, falls sich zu Beginn der Amplifikationsreaktion mindestens ein Target in der jeweiligen Partition befunden hat, in einem Fluoreszenzanstieg resultiert. Ausgehend vom Anteil der Partitionen, die einen Fluoreszenzanstieg zeigen, kann durch Ausnutzung der Poisson-Statistik auf die Target- Konzentration in der analysierten Probe geschlossen werden.
Während des Aliquotierungsprozesses beeinflussen verschiedene Fehlerquellen die Genauigkeit des quantitativen Nachweises. Dabei dominieren die Schwankungen in der Konzentration des untersuchten Teilvolumens (sogenannter Subsampling Error) und die statistische Ungenauigkeit durch den Aliquotierungsprozess an sich (sogenannter Partitioning Error). Beide dieser Mechanismen sind bereits in der Literatur beschrieben (Dube et al., PLoS ONE 3 (8), e2876 (2008), 10.1371/journal.pone.0002876; Jacobs et al., BMC Bioinformatics 15, 283 (2014), https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-283;
Bizouarn F. (2014) Introduction to Digital PCR. In: Biassoni R., Raso A. (eds) Quantitative Real-Time PCR. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 1160. Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978- l-4939-0733-5_4; Basu, Amar S. (2017): Digital Assays Part I: Partitioning Statistics and Digital PCR. in SLAS technology 22 (4), pp. 369-386. DOI:
10.1177/2472630317705680). Dabei lautet die generelle Empfehlung, den Partitioning Error durch eine möglichst große Anzahl an Partitionen zu verringern um dadurch den dynamischen Messbereich des Analysesystems zu vergrößern. Der Subsampling Error sei in der Regel zu vernachlässigen und spiele laut Literatur erst eine signifikante Rolle, wenn der Anteil des analysierten Volumens je nach Anwendungsfall unter 30 % beziehungsweise 50 % liegt (Jacobs et al., BMC Bioinformatics 15, 283 (2014), https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-283). Außerdem wird der Vorteil einer möglichst hohen Anzahl an Partitionen betont.
Offenbarung der Erfindung Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe in Partitionen auf einer Partitionsfläche. Insbesondere betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Partitionierung, Aufteilung oder Aliquotierung einer solchen Probe in Partitionen oder Teilmengen der Probe. Das Verfahren kann insbesondere für eine Bestimmung einer Konzentration eines Analyten in der Probe verwendet werden, insbesondere in Kombination mit einer digitalen PCR im Falle von Nukleinsäureabschnitten als Analyten.
Unter einer Partitionierung einer Probe kann somit wie beschrieben eine Aufteilung oder Aliquotierung einer Probe in Probenteile verstanden werden, in bevorzugter Ausgestaltung eine tatsächliche Platzierung der Probe in Form von Probenteilen auf der Partitionsfläche. Bei der Probe kann es sich insbesondere um eine biologische Probe handeln, beispielsweise umfassend eine Körperflüssigkeit wie Blut, Urin, Sputum oder ein Abstrich. Die Probe kann neben der Körperflüssigkeit noch weitere Substanzen aufweisen, beispielsweise in Form einer Vermischung der Körperflüssigkeit mit einem Transportmedium wie eNAT™ oder UTM™. Bei dem Analyten, auch Target genannt, kann es sich um ein Molekül in der Probe handeln, insbesondere um einen Nukleinsäureabschnitt, beispielsweise einen Teil einer DNA oder RNA eines Krankheitserregers oder einer bestimmten Körperzelle, insbesondere einer Tumorzelle. Bei dem Analyten kann es sich in besonderer Ausgestaltung auch um Zellen handeln, insbesondere Einzeller oder tierische oder menschliche Körperzellen, beispielsweise einzelne oder mehrere von sogenannten zirkulierenden Tumorzellen (kurz CTC). Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit wie bereits erwähnt Teil oder Voraussetzung einer partitionsbasierten quantitativen Nachweismethode für Analyten in der Probe sein, beispielsweise unter Zuhilfenahme einer digitalen PCR, wobei solch eine Nachweismethode bei mikrofluidischen Proben vorzugsweise mit einer mikrofluidischen Vorrichtung, insbesondere einem Lab-on-Chip-System, durchgeführt werden kann. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafterweise eine Partitionierung der Probe für eine statistische Abschätzung einer Konzentration des Analyten in der Probe mit geringem relativem Fehler realisiert werden.
In bevorzugter Ausgestaltung umfasst das Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung eine erfindungsgemäße Partitionierung der Probe auf der Partitionsfläche. Die Partitionsfläche kann allgemein Teil einer mikrofluidischen Vorrichtung sein kann, vorzugsweise Teil einer mikrofluidischen Kartusche. Beispielsweise kann die Partitionsfläche eine Oberfläche auf einem Substrat in einer Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung sein.
Gemäß einem ersten Schritt des Verfahrens erfolgt eine Festlegung einer geometrischen Form der Partitionen, einer Form der Partitionsfläche und eines Gesamtvolumens der Probe. Die Partitionsfläche kann beispielsweise eine quadratische oder rechteckige Form aufweisen und optional von einer begrenzenden Wand umgeben sein. Die Partitionen können vorzugsweise die Form von Tröpfchen oder von Kammern haben. Im Falle der Tröpfchen liegen diese insbesondere als Emulsion vor, beispielsweise als wasserbasierte Tröpfchen in einer Öl- Emulsion, wobei die Tröpfchen bevorzugt durch Zugabe von oberflächenaktiven Substanzen, sogenannten Surfactants, stabilisiert werden können. Im Falle von Kammern können die Kammern eine runde oder eckige Grundfläche aufweisen, vorzugsweise eine hexagonale Grundfläche. Die Kammern sind dabei durch Wände voneinander getrennt, wobei die Wände vorzugsweise möglichst dünn ausgestaltet werden, um möglichst wenig Fläche zu blockieren. Vorzugsweise werden die Wände in der geometrischen Form der Kammern berücksichtigt.
In einem weiteren Schritt des Verfahrens erfolgt eine Bestimmung eines minimalen Partitionsmaßes der Partitionen. Unter einem minimalen Partitionsmaß ist ein Maß, also ein repräsentativer und vorzugsweise eindeutiger Wert für die Größe der Partition, insbesondere für das Volumen der Partition, zu verstehen. Insbesondere kann es sich bei dem Partitionsmaß um den Durchmesser der Partition bei einer kugel- oder tropfenförmigen Partition handeln oder um eine Breite der Kammer bei einer Partitionierung in Kammern mit eckiger, beispielsweise quadratischer oder hexagonaler Grundfläche. Beispielsweise ist das Partitionsmaß der Abstand zwischen zwei gegenüberliegenden Ecken, vorzugsweise der minimale Mittelpunktsabstand der Partitionen. Aus dem minimalen Partitionsmaß ergibt sich implizit eine maximale Anzahl von auf der Partitionsfläche anordenbaren Partitionen mit minimalem Partitionsmaß. Diese maximale Anzahl wird im Folgenden auch als erste Partitionsanzahl bezeichnet und ist ein Maß für einen minimalen Wert des Partitioning Errors, denn mit steigender Anzahl an Partitionen verringert sich eine statistische Ungenauigkeit der Konzentrationsbestimmung des gesamten partitionierten Volumens der Probe. Eine Auslegung einer Partitionierung mit möglichst vielen Partitionen und entsprechend kleinem Partitionsmaß wird im Weiteren kurz als minimale Variante bezeichnet.
Gemäß einem weiteren Schritt des Verfahrens erfolgt eine Ermittlung eines zweiten Partitionsmaßes der Partitionen und damit einer zweiten Partitionsanzahl unter der Bedingung, dass ein maximal möglicher Anteil des Gesamtvolumens auf der Partitionsfläche partitioniert werden kann und unter dieser Voraussetzung der maximal mögliche Anteil auf möglichst viele Partitionen auf der Partitionsfläche aufgeteilt wird. Dies hat den Vorteil, dass je mehr von dem Gesamtvolumen partitioniert werden kann, desto geringer fällt der Subsampling Error aus. Dabei soll aber dennoch die Anzahl der Partitionen möglichst groß gehalten werden, um einen möglichst geringen Partitioning Error zu realisieren. Dieses zweite Partitionsmaß wird im Folgenden auch als maximales Partitionsmaß dmax bezeichnet und repräsentiert jedoch das kleinstmögliche Partitionsmaß bei maximal partitioniertem Gesamtvolumen. Die Anzahl der Partitionen bei maximalem Partitionsmaß wird im Folgenden auch als zweite bezeichnet. Eine Auslegung einer Partitionierung, wobei möglichst das vollständige Gesamtvolumen der Probe partitioniert und entsprechend ein größeres Partitionsmaß gewählt wird, wird im Weiteren als Abgrenzung zur minimalen Variante als maximale Variante bezeichnet. Dieser Schritt kann insbesondere auch vor dem vorherigen Schritt erfolgen.
In einem nächsten Schritt des Verfahrens erfolgt eine Bestimmung einer ersten Unsicherheit einer messbaren Konzentration des Analyten bei Verwendung eines Partitionsmaßes aus einem ersten Bereich um das minimale Partitionsmaß und eine Bestimmung einer zweiten Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Verwendung eines Partitionsmaßes aus einem zweiten Bereich um das zweite Partitionsmaß. Bei der ersten und bei der zweiten Unsicherheit kann es sich vorzugsweise um relative Unsicherheiten handeln. Durch diese Bestimmungen wird vorteilhafterweise ermittelt, ob eine Auslegung gemäß der minimalen oder maximalen Variante bezüglich eines möglichst geringen Messfehlers der Konzentration besser ist. Der erste Bereich ist vorzugsweise derart definiert, dass der erste Bereich das minimale Partitionsmaß umfasst, vorzugsweise als unteres Ende des ersten Bereichs, und das zweite Partitionsmaß nicht umfasst. Der zweite Bereich ist vorzugsweise derart definiert, dass der zweite Bereich das zweite Partitionsmaß umfasst, vorzugsweise als oberes Ende des zweiten Bereichs, und das minimale Partitionsmaß nicht umfasst. In besonderer Ausgestaltung kann es sich bei dem ersten Bereich und dem zweiten Bereich um zwei gegenseitig nicht überlappende Bereiche handeln, also insbesondere um disjunkte Bereiche.
Gemäß einer besonderen Weiterbildung dieses Schrittes des Verfahrens wird die erste Unsicherheit einer messbaren Konzentration des Analyten bei Verwendung der ersten Partitionsanzahl von Partitionen mit dem minimalen Partitionsmaß bestimmt und die zweite Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Verwendung der zweiten Partitionsanzahl von Partitionen mit dem zweiten Partitionsmaß bestimmt. Vorzugsweise werden die erste Unsicherheit und/oder die zweite Unsicherheit bei einem Wert aus dem maximalen theoretischen Bereich für eine Messung der Konzentration des Analyten bestimmt. Dieser maximale theoretische Bereich erstreckt sich von -log(l-l /Amax)/Vpar bis -log(l-( Amax-1)/Amax)/Vpar, wobei Amax die erste Partitionsanzahl, Vpar das Fassungsvermögen/Volumen einer einzelnen Partition und log den natürlichen Logarithmus bezeichnet. Um vorzugsweise zwei gleich große Messbereiche zu generieren, wird als Wert der Mittelpunkt dieses Bereichs auf einer logarithmischen Skala gewählt, welcher bei (log(l-l/Amax) * log(l-( Amax- l)/Amax))A0.5/VPar liegt.
Gemäß einer besonderen Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt eine Auslegung der Partitionen mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich, vorzugsweise mit dem minimalen Partitionsmaß, wenn eine Messung einer Konzentration des Analyten bei einem vorgegebenen Konzentrationswert bei einer Auslegung der Partitionen mit einem Partitionsmaß aus dem zweiten Bereich, insbesondere mit dem zweiten Partitionsmaß, nicht möglich ist. Bei dem vorgegebenen Konzentrationswert kann es sich vorzugsweise um eine Wert aus dem oben beschriebenen maximalen theoretischen Bereich handeln, bevorzugt um den oben beschriebenen Mittelpunkt dieses Bereichs auf einer logarithmischen Skala.
In einem nächsten Schritt des Verfahrens erfolgt eine Auslegung der Partitionen aus dem ersten Bereich oder aus dem zweiten Bereich abhängig von einem Vergleich der ersten Unsicherheit mit der zweiten Unsicherheit. Dies hat den Vorteil, dass für die Wahl des Partitionsmaßes und somit für die konkrete Form der Auslegung der Partitionen eine Berücksichtigung von Unsicherheiten für eine nachfolgende Konzentrationsmessung miteinbezogen werden kann.
Insbesondere kann eine Wahl der minimalen Variante oder maximalen Variante auf Basis dieser ermittelten Unsicherheiten erfolgen.
In besonderer Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt eine Auslegung der Partitionen mit einem Partitionsmaß ungleich dem maximalen Partitionsmaß, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und eine Auslegung der Partitionen ungleich dem minimalem Partitionsmaß, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist. In dieser Ausgestaltung umfasst der erste Bereich somit alle realisierbaren Partitionsmaße mit Ausnahme des zweiten/maximalen Partitionsmaßes und umfasst der zweite Bereich somit alle realisierbaren Partitionsmaße mit Ausnahme des minimalen Partitionsmaßes.
In einer weiteren besonderen Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt eine Auslegung mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und eine Auslegung der Partitionen mit einem Partitionsmaß aus dem zweiten Bereich, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist. Als erster Bereich kann hierbei bevorzugt ein (optional gegenüber dem vorigen Schritt des Verfahrens abgewandelter) Bereich derart gewählt werden, dass der Bereich nur Partitionsmaße umfasst, deren zugehörige, vorzugsweise relative, Unsicherheit der messbaren Konzentration kleiner ist als die vorzugsweise relative Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Wahl des zweiten/maximalen Partitionsmaßes. Analog kann als zweiter Bereich bevorzugt ein (optional gegenüber dem vorigen Schritt abgewandelter) Bereich derart gewählt werden, dass der Bereich nur Partitionsmaße umfasst, deren zugehörige, vorzugsweise relative, Unsicherheit der messbaren Konzentration kleiner ist als die vorzugsweise relative Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Wahl des minimalen Partitionsmaßes. Dies hat den Vorteil, dass ein Partitionsmaß der minimalen Variante gewählt wird, bei welcher die relative Unsicherheit stets kleiner als bei Wahl der maximalen Variante ist und umgekehrt.
In einer weiteren besonderen Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt die Auslegung der Partitionen als erste Partitionsanzahl von Partitionen mit dem minimalen Partitionsmaß, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, oder als zweite Partitionsanzahl von Partitionen mit dem zweiten/maximalen Partitionsmaß, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist.
Wie oben ausgeführt, kann das Verfahren Teil eines Analyseverfahren zum Nachweis eines Analyten in einer mikrofluidischen Probe sein. Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein solches Analyseverfahren, wobei die Probe erfindungsgemäß in Partitionen aufgeteilt wird und wobei zumindest eine Partition auf das Vorhandensein des Analyten untersucht wird. Das Analyseverfahren umfasst dabei vorzugsweise eine Durchführung einer digitalen PCR mit zumindest einigen der Partitionen.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe. Dabei wird eine Partitionsfläche bereitgestellt und eine Partitionierung der Probe nach dem erfindungsgemäßen Auslegungsverfahren durchgeführt. Das Herstellungsverfahren kann vorzugsweise eine Herstellung von Kammern für die Partitionierung auf der Partitionsfläche umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen
Figur 1 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Auslegung einer Partitionierung,
Figuren 2a, 2b eine schematische Darstellung einer Partitionierung einer Probe auf eine Partitionsfläche in Form von Tröpfchen beziehungsweise in Form von mit Probenteilen gefüllten Kammern,
Figur 3 Diagramme mit beispielhaften Berechnungen von relativen
Unsicherheiten unterschiedlicher Konzentrationen eines Analyten in der Probe in Abhängigkeit eines gewählten Partitionsmaßes für die Partitionen,
Figur 4 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens zum Nachweis eines Analyten in einer mikrofluidischen Probe und
Figur 5 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe.
Ausführungsformen der Erfindung
Figur 1 zeigt ein Ablaufdiagramm 500 eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen Probe. Die Partitionierung kann dabei wie oben beschrieben insbesondere Teil oder Voraussetzung einer partitionsbasierten quantitativen Nachweismethode für Analyten in der Probe sein, wobei solch eine Nachweismethode bei mikrofluidischen Proben vorzugsweise mit einer mikrofluidischen Vorrichtung, insbesondere einem Lab-on-Chip-System, durchgeführt werden kann. Beispielsweise ist das im Folgenden beschriebene Verfahren Teil eines quantitativen Nachweises von Nukleinsäureabschnitten von Krankheitserregern oder Tumorzellen in einer biologischen Probe umfassend eine Körperflüssigkeit (zum Beispiel Blut, Sputum oder ein Abstrich), wobei der quantitative Nachweis über eine digitale PCR mit der erfindungsgemäß ausgelegten Partitionierung der Probe erfolgt.
In einem ersten Schritt 510 des Verfahrens 500 werden das Volumen der Probe und eine für die Partitionierung zur Verfügung stehende Fläche, kurz Partitionsfläche, bestimmt. Beispielhaft könnte das aufteilbare Volumen \Zsys = 25 Mikroliter (m/_) betragen und die Partitionsfläche quadratisch mit einer Kantenlänge von L = 10 Millimeter (mm) ausgestaltet sein.
Im zweiten Schritt 520, welcher auch vor dem ersten Schritt 510 erfolgen kann, wird festgelegt, ob die Aufteilung der Probe in Form von Tröpfchen ohne Zwischenwände oder in Kammern erfolgen soll. Figur 2a zeigt schematisch eine Anordnung von Tröpfchen 110 mit Durchmesser d auf einer Partitionsfläche 101 mit einer Breite L, wobei die Partitionsfläche 101 beispielsweise quadratisch oder rechteckig und wie dargestellt durch eine Wand 102 begrenzt sein kann. Die Partitionsfläche 101 kann dabei insbesondere in einer Kammer einer mikrofluidischen Kartusche angeordnet sein. Figur 2b zeigt in alternativer Ausgestaltung schematisch eine Anordnung von Kammern 120 auf der Partitionsfläche 101, wobei die Probe auf die Kammern 120 aufgeteilt werden soll. Die Kammern 120 haben beispielsweise wie dargestellt eine hexagonale Grundfläche 121 mit einer Breite d, einer Wandhöhe D, welche einer Kammertiefe entspricht, und einer Wanddicke w zwischen jeweils zwei Kammern, wobei die Wanddicke w vorzugsweise möglichst klein gewählt wird, um möglichst wenig Fläche der Partitionsfläche 101 durch Wände 122 der Kammern 120 zu blockieren. Eine minimale Wanddicke und maximale Wandhöhe zur Maximierung des Volumens der Kammern 120 können dabei insbesondere auch durch fertigungstechnische Erfordernisse beschränkt sein.
Bei Wahl der kammerbasierten Anordnung 120 erfolgen in einem Unterschritt 521 eine Festlegung der minimalen Wanddicke w, beispielsweise w = 25 Mikrometer {ym), und der Wandhöhe/Kammertiefe D , beispielsweise D = 380 mhi. Die Partitionsfläche 101 kann insbesondere eine Oberfläche eines Substrats sein, beispielsweise eines Substrats aus Silizium, Kunststoff oder einer Kombination beider Materialien. Im Falle der Ausgestaltung mit Kammern 120 können die Kammern 120, insbesondere die Wände 122, ebenfalls aus Silizium, Kunststoff oder einer Kombination beider Materialien gefertigt sein. Insbesondere im Falle einer wässrigen Probe ist eine hydrophile Ausgestaltung der Partitionsfläche 101 beziehungsweise der Kammern 120 vorteilhaft.
Anschließend wird in einem dritten Schritt 530 ein minimales Partitionsmaß dm/n definiert, wobei eine Größe dieses minimalen Partitionsmaßes dm/n durch, je nach Einzelfall auch obengenannte, fertigungstechnische Limitierungen und einer Auflösung einer für die Analyse der Partitionen zu verwendenden Detektionsoptik bestimmt sein können. Beispielsweise beträgt des minimale Partitionsmaß dm/n = 10 pm und repräsentiert den, vorzugsweise entspricht dem Durchmesser d der Tröpfchen 110 im Falle der tröpfchenbasierten Anordnung beziehungsweise den Abstand zwischen den Mittelpunkten zweier Kammern 120 oder den Abstand d zweier gegenüberliegender Ecken bei einer hexagonalen Grundfläche 121 der Kammern 120 im Falle der kammerbasierten Anordnung. Ausgehend von diesem minimalen Partitionsmaß dm/n wird in einem vierten Schritt 540 berechnet, wie viele Partitionen auf der Partitionsfläche 101, gegebenenfalls unter Einhaltung der minimalen Wanddicke w, untergebracht werden können. Im betrachteten Fall wären dies bei einem kammerbasierten Ansatz Amax = 101871 Partitionen in hexagonaler Anordnung, wobei diese Zahl im Folgenden als erste Partitionsanzahl Amax bezeichnet wird. Aus den Maßen der Partitionen lassen sich zusammen mit der Tiefe D der Kammern 120 das Fassungsvermögen einer einzelnen Partition Vpar und nach Multiplikation mit der ersten Partitionsanzahl Amax das gesamte fassbare Volumen Vana berechnen. Dieses beträgt im vorliegenden Fall etwa Vana = 2,51 pL und ist damit nur etwa ein Zehntel des insgesamt aufteilbaren Volumens \Zsysvon 25 pL.
Die erste Partitionsanzahl Amax definiert auch den maximalen theoretischen Bereich für eine Messung der Konzentration des Analyten (mit cp/pL als Einheit für Kopien pro Mikroliter), welcher von -log(l-l /Amax)/Vpar bis -log(l-( Amax- 1)/Amax)/Vpar reicht, wobei log den natürlichen Logarithmus bezeichnet. Um vorzugsweise zwei gleich große Messbereiche zu generieren, wird gemäß einem fünften Schritt 550 dieser maximale Messbereich auf einer logarithmischen Skala halbiert. Der resultierende Mittelpunkt l liegt dann bei (log(l-l /Amax) * log(l-( Amax-l)/Amax))A0.5/Vpar und entspricht in diesem Beispiel etwa 431 cp/pL.
Alternativ kann auch ein anderer Konzentrationswert l aus diesem Messbereich ausgewählt werden, insbesondere wenn es Gründe für eine bevorzugte Messung bei geringeren bzw. höheren Konzentrationen gibt.
Eine bevorzugte Alternative zu möglichst vielen Partitionen ist, die Maße der Partitionen so zu wählen, dass möglichst das gesamte Volumen \Zsysauch partitioniert wird. Sofern die Partitionsfläche und eine Höhe, welche von den Partitionen ausgefüllt wird, groß genug sind, ist es grundsätzlich immer möglich, das gesamte Volumen \Zsys auf der Partitionsfläche 101 unterzubringen und zwar im Grenzfall in nur einer einzigen Partition. Um jedoch auch den Partitioning Error möglichst gering zu halten, soll bei einer Verwendung des maximal möglichen Volumens das Volumen in möglichst viele Partitionen aufgeteilt werden. Also muss gemäß dem sechsten Schritt 560 des Verfahrens 500 zunächst ein zweites Partitionsmaß dmaxgefunden werden, welches unter den gegebenen Bedingungen das partitionierbare und damit analysierbare Volumen Vana maximiert und gleichzeitig möglichst viele Partitionen impliziert. Dieses zweite Partitionsmaß wird auch als maximales Partitionsmaß dmax bezeichnet und repräsentiert jedoch das kleinstmögliche Partitionsmaß bei maximal partitioniertem Gesamtvolumen. Im dargestellten Beispiel ergibt sich dmax zu 128,52 pm bei einem maximal partitionierbaren Volumen Vana von 24,999 pL, also praktisch dem gesamten Volumen \Zsys von 25 pL. Dabei wird das partitionierbare Volumen Vana in 6132 Partitionen aufgeteilt, wobei diese Anzahl im Folgenden als zweite Partitionsanzahl Amm bezeichnet wird. Der sechste Schritt 560 kann auch früher durchgeführt werden, insbesondere vor oder parallel zu einem der vorhergehenden Schritte, sofern der erste Schritt 510 und der zweite Schritt 520 erfolgt sind.
Gemäß einem vorzugsweise siebten Schritt 570 des Verfahrens wird der maximale theoretische Bereich für eine Messung der Konzentration des Analyten bei einer Verwendung der zweiten Partitionsanzahl Amm von Partitionen mit maximalem Partitionsmaß dmax ermittelt, wobei sich dieser Bereich analog zu oben von -log(l-l/ Amin)lVpar_2 bis -log(l-( Amin -1)/ Amin)/Vpar_2 erstreckt und wobei Vpar_2 das Volumen einer Partition mit Partitionsmaß dmax entspricht. Wenn der oben berechnete Mittelpunkt l nicht in diesen Bereich fällt, erfolgt gemäß einem Unterschritt 571 des siebten Schritts 570 vorzugsweise eine Auslegung der Partitionierung gemäß der ersten Partitionsanzahl Amax mit minimalem Partitionsmaß dm/n. Wenn der berechnete Mittelpunkt l in diesen Bereich fällt, wird das Verfahren 500 gemäß diesem Ausführungsbeispiel wie folgt fortgesetzt.
Gemäß einem achten Schritt 580 des Verfahrens 500 werden eine erste Unsicherheit einer messbaren Konzentration des Analyten bei Verwendung der der ersten Partitionsanzahl Amax von Partitionen mit minimalem Partitionsmaß dm/n (im Weiteren kurz als minimale Variante bezeichnet) und eine zweite Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Verwendung der zweiten Partitionsanzahl Am/n von Partitionen mit maximalem Partitionsmaß dmax (im Weiteren kurz als maximale Variante bezeichnet) berechnet.
Die relativen Unsicherheiten können dabei vorzugsweise mit folgendem Ansatz bestimmt werden.
Zur Berechnung des Partitioning Error kann eine Unsicherheit basierend auf dem Konfidenzintervall folgender Wahrscheinlichkeitsverteilung P{C\H) verwendet werden: wobei C für die Anzahl der Targets im analysierten Probenvolumen Vana, H für die Anzahl der Partitionen, die mindestens einen Analyten enthalten, A für die verfügbare Anzahl an Partitionen und S für die Stirling-Zahl zweiter Art steht.
Für den Subsampling Error kann eine Unsicherheit basierend auf dem Konfidenzintervall folgender Wahrscheinlichkeitsverteilung P(Ctot|C, p) verwendet werden: wobei C für die Anzahl der Targets im analysierbaren Probenvolumen Vana, Ctot für die Anzahl der Targets im partitionierbaren Volumen \Zsys und p für den Anteil des analysierbaren Volumens am partitionierbaren Volumen Vana/V sys steht.
Wenn beide Fehler kombiniert werden, ergibt sich:
Da eine exakte Berechnung dieser Verteilung sehr lange dauert, kann sie durch eine Gauß-Verteilung genähert werden. Bei einer Gauß-Verteilung kann das Konfidenzintervall direkt aus der Varianz s berechnet werden. Im Falle eines 95 %-Konfidenzintervalls beträgt dieses m ± 1,96 Vs, wobei m den Erwartungswert repräsentiert. Die Standardabweichung s einer Gauß- Verteilung lässt sich aus der Wahrscheinlichkeit am Erwartungswert, also der maximalen Wahrscheinlichkeit, berechnen:
Dieser Zusammenhang wird in der Näherung verwendet. Der Maximalwert von P{Ctot\H, p) wird gleich R(m) gesetzt und dann die Standardabweichung und daraus das Konfidenzintervall berechnet, welche wiederum die Ungenauigkeit definiert.
Der Wert, bei dem P{Ctot\ , p) maximal wird, liegt bei
Die Berechnung von P{Ctot\H, p) erfolgt über: Diese Berechnung ist hinsichtlich des Zeitaufwandes vorteilhaft. Diese Näherung ermöglicht einen qualitativen Vergleich und die quantitativen Ergebnisse liegen im Bereich von etwa 10 % um den wahren, exakten Wert der Unsicherheit.
Unter Verwendung dieser Annährung ergibt sich für das vorliegende Beispiel die erste relative Unsicherheit des Messergebnisses s beim Mittelpunkt l bei Anwendung der minimalen Variante von etwa 0,0566 oder 5,66 %. Bei Anwendung der maximalen Variante ergibt sich die zweite relative Unsicherheit beim Mittelpunkt l zu etwa 0,0254 oder 2,54 %, also eine weniger als halb so große relative Unsicherheit
Gemäß einem neunten Schritt 590 des Verfahrens 500 werden nun die beiden relativen Unsicherheiten verglichen und abhängig von diesem Vergleich eine Auslegung der Partitionierung bestimmt. Insbesondere kann abhängig von diesem Vergleich eine Partitionierung gemäß der minimalen Variante 591 oder gemäß der maximalen Variante 592 realisiert werden, sodass bevorzugt die relative Unsicherheit möglichst gering ist. Für die konkrete Wahl der Variante und insbesondere für die Wahl eines konkreten Werts für die Partition sind mehrere Ansätze vorteilhaft, welche insbesondere oben ausgeführt wurden.
Beispielsweise kann dann diejenige Auslegung gewählt werden, welche die geringere Unsicherheit in der Mitte des maximalen theoretischen Messbereichs liefert. In diesem Beispiel erfolgt somit bei einer quadratischen Partitionsfläche von 10 mm Kantenlänge, einem prozessierten Volumen von 25 pl_, einer Kammertiefe/Wandhöhe von 380 pm, einer minimalen Wanddicke von 25 pm und minimalen Partitionsmaß von 10 pm eine Verteilung aus der Probe in 6132 hexagonale Partitionen mit dem Partitionsmaß von 128,52 pm. Nach der Befüllung der Kammern 120 mit der Probe gemäß dieser Partitionierung kann in besonderer Ausgestaltung eine Überschichtung der Kammern 120 mit (transparentem) Öl erfolgen, bevor eine nachfolgende Verarbeitung oder Analyse, beispielsweise als Teil einer digitalen PCR, erfolgt.
Figur 3 zeigt beispielhaft gemäß der oben beschriebenen Annäherung berechnete relative Unsicherheiten s in Abhängigkeit vom Partitionsmaß dfür verschiedene Konzentrationen des Analyten in der Probe (10, 50, 100 und 500 Analyten pro Mikroliter respektive) bei Verwendung von Kammern 120 und denselben Werten für Volumen, Kantenlänge, Kammertiefe/Wandhöhe und Wanddicke. Wie aus Figur 3 ersichtlich, ist für diese Randbedingungen bei allen berechneten Konzentrationen eine Auslegung mit großen Partitionsmaßen mit meist geringerem relativen Fehler verbunden, wobei vor allem bei geringen Konzentrationen eine Auslegung mit möglichst geringem Partitionsmaß unvorteilhaft ist. Dies liegt daran, dass in diesen Fällen der Subsampling Error gegenüber dem Partitioning Error aufgrund des deutlich kleineren partitionierbaren Volumens bei sehr kleinem Partitionsmaß dominiert. Bei anderen Randbedingungen können sich für bestimmte Konzentrationen hingegen auch kleinere relative Fehler für Auslegungen mit kleinem Partitionsmaß gegenüber Auslegungen gemäß der maximalen Variante ergeben.
Gemäß einer Abänderung des oben beschriebenen Ausführungsbeispiels 500 wird das gesamte aufteilbare Volumen \Zsys auf 30 pl_ erhöht. Das minimale Partitionsmaß dmm, die Kantenlänge L der Partitionsfläche 101, die Wandhöhe/Kammertiefe D und die Wanddicke w bleiben ungeändert bei 10 pm, 10 mm, 380 pm bzw. 25 pm. Der Mittelpunkt l des logarithmischen Messbereichs liegt in diesem Fall bei etwa 431 cp/pL. Der größte Anteil des aufteilbaren Volumens \Zsys kann bei einem zweiten/maximalen Partitionsmaß von dmax = 294,65 pm analysiert werden. Bei diesem Partitionsmaß reicht der Messbereich bis zu einer Konzentration von ca. 338 cp/pL. Demnach umfasst dieser Messbereich nicht den Mittelpunkt l und damit würde vorzugsweise gemäß Unterschritt 571 des siebten Schritts 570 eine Auslegung der Partitionierung entsprechend der minimalen Variante erfolgen.
Figur 4 zeigt ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens 600. In einem ersten Schritt 610 des Verfahrens 600 kann vorzugsweise eine Probe gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung in Partitionen aufgeteilt werden, beispielsweise gemäß dem oben zur Figur 1 beschriebenen Verfahren 500. Anschließend können in einem zweiten Schritt 620 zumindest eine Partition, bevorzugt möglichst alle Partitionen, auf das Vorhandensein des Analyten untersucht werden und daraus auf eine Konzentration des Analyten in der aufgeteilten Probe rückgeschlossen werden. Diese Bestimmung der Konzentration erfolgt dabei bevorzugt über die Durchführung einer digitalen PCR, wozu die Partitionen die Grundlage bilden.
Figur 5 zeigt ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens 700. In einem ersten Schritt 710 wird eine Partitionsfläche bereitgestellt. Dies kann beispielsweise durch eine Bereitstellung eines Substrats erfolgen, wobei eine Oberfläche des Substrats die Partitionsfläche bildet. Die Partitionsfläche beziehungsweise das Substrat können dabei Teil einer mikrofluidischen Kartusche sein oder im Zuge des Herstellungsverfahrens 700 in der Kartusche angeordnet oder fixiert werden. In einem zweiten Schritt 720 des Verfahrens erfolgt eine Auslegung der Partitionierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung, beispielsweise gemäß dem oben zur Figur 1 beschriebenen Verfahren 500. Das Herstellungsverfahren 700 kann dabei in vorteilhafter Ausgestaltung eine Herstellung von Kammern für die Partitionierung auf der
Partitionsfläche umfassen.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren (500) zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen Probe in Partitionen auf einer Partitionsfläche, insbesondere für eine Bestimmung einer Konzentration eines Analyten in der Probe, umfassend die Schritte
• Festlegung (510, 520) einer geometrischen Form (110, 120) der Partitionen (110, 120), einer Form der Partitionsfläche (101) und eines Gesamtvolumens der Probe
• Bestimmung (530, 540) eines minimalen Partitionsmaßes der Partitionen (110, 120) und einer korrespondierenden maximalen Anzahl von auf der Partitionsfläche (101) anordenbaren Partitionen (110, 120) mit minimalem Partitionsmaß als erste Partitionsanzahl.
• Ermittlung (560) eines zweiten Partitionsmaßes der Partitionen (110, 120) und einer korrespondierenden zweiten Partitionsanzahl unter der Bedingung, dass ein maximal möglicher Anteil des Gesamtvolumens auf der Partitionsfläche (101) partitioniert werden kann und der maximal mögliche Anteil auf möglichst viele Partitionen (110, 120) auf der Partitionsfläche (101) aufgeteilt wird.
• Bestimmung (580) einer ersten Unsicherheit einer messbaren Konzentration des Analyten bei Verwendung eines Partitionsmaßes aus einem ersten Bereich um das minimale Partitionsmaß und Bestimmung einer zweiten Unsicherheit der messbaren Konzentration bei Verwendung eines Partitionsmaßes aus einem zweiten Bereich um das zweite Partitionsmaß.
• Auslegung (591, 592) der Partitionen mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich oder aus dem zweiten Bereich abhängig von einem Vergleich (590) der ersten Unsicherheit mit der zweiten Unsicherheit.
2. Verfahren (500) nach Anspruch 1, wobei eine Auslegung (591, 592) der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß ungleich dem maximalen Partitionsmaß erfolgt, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) ungleich dem minimalem Partitionsmaß erfolgt, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist.
3. Verfahren (500) nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich erfolgt, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß aus dem zweiten Bereich erfolgt, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist.
4. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit minimalem Partitionsmaß erfolgt, wenn die erste Unsicherheit kleiner als die zweite Unsicherheit ist, und wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit maximalem Partitionsmaß erfolgt, wenn die erste Unsicherheit größer als die zweite Unsicherheit oder gleich groß ist.
5. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Auslegung der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß aus dem ersten Bereich erfolgt, insbesondere mit dem minimalen Partitionsmaß, wenn eine Messung einer Konzentration des Analyten bei einem vorgegebenen Konzentrationswert bei einer Auslegung der Partitionen (110, 120) mit einem Partitionsmaß aus dem zweiten Bereich, insbesondere mit dem zweiten Partitionsmaß, nicht möglich ist.
6. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Unsicherheit bei Verwendung der ersten Partitionsanzahl von Partitionen mit dem minimalen Partitionsmaß bestimmt und die zweite Unsicherheit bei Verwendung der zweiten Partitionsanzahl von Partitionen mit dem zweiten Partitionsmaß bestimmt werden.
7. Verfahren (500) nach Anspruch 6, wobei die erste Unsicherheit und/oder die zweite Unsicherheit bei einem Wert aus dem maximalen theoretischen Bereich für eine Messung der Konzentration des Analyten bestimmt werden, insbesondere wobei der Wert dem logarithmischen Mittelwert des maximalen theoretischen Bereichs entspricht.
8. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die geometrische Form (110, 120) der Partitionen (110, 120) eine die Partitionen (110,
120) zumindest teilweise begrenzende Wand (122) mit einer vorgegebenen Wanddicke und/oder Wandhöhe berücksichtigt.
9. Analyseverfahren (600) zum Nachweis eines Analyten in einer mikrofluidischen Probe, wobei die Probe gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche in Partitionen (110, 120) aufgeteilt wird und wobei zumindest eine Partition (110, 120) auf das Vorhandensein des Analyten untersucht wird.
10. Analyseverfahren (600) nach Anspruch 9, wobei das Analyseverfahren (600) eine Durchführung einer digitalen PCR mit zumindest einigen der Partitionen (110,
120) umfasst.
11. Verfahren (700) zur Herstellung einer Partitionierung einer mikrofluidischen
Probe, wobei eine Partitionsfläche bereitgestellt wird und wobei die Partitionierung der Probe gemäß einer Auslegung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erfolgt.
EP22732972.9A 2021-06-29 2022-06-03 Verfahren zur auslegung einer partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen probe Pending EP4363607A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

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DE102021206717.4A DE102021206717A1 (de) 2021-06-29 2021-06-29 Verfahren zur Auslegung einer Partitionierung einer mikrofluidischen, insbesondere biologischen Probe
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