CN117897499A - 用于设计微流控样本、尤其是生物学样本的分区的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于在分区面(101)上的分区(110、120)中对微流控样本、尤其是生物学样本进行分区设计的方法(500)，尤其是用于确定样本中的分析物的浓度。此外，本发明也涉及一种用于检定微流控样本中的分析物的分析方法(600)以及一种用于生产微流控样本的分区的方法(700)。
Description
背景技术
微流控分析系统(所谓的芯片实验室(Lab-on-Chips)，简称LoCs)允许自动化地、可靠地、快速地、紧凑地且经济地处理用于医学诊断的患者样本。通过结合大量用于受控地操纵流体的操作，复杂的分子诊断的测试序列可以在芯片实验室盒(Lab-on-Chip-Kartusche)上进行。
在这种LoC中(特别是在所谓的数字的聚合酶链式反应(简称数字的PCR)时)实施基于分区的定量的测试方法的情况下，其中一项操作在于将样本等分到大量分区中。这些分区例如可以作为腔室或者液滴来实现。在这些分区的每个分区中，特定DNA靶标(DNA-Targets)的终点扩增(Endpunktamplifikation)都是彼此独立进行的，如果在扩增反应开始时在相应的分区中发现了至少一个靶标，则所述终点扩增导致荧光增加。根据显示荧光增加的分区的份额，可以通过利用泊松统计推断出分析样本中的靶标浓度。
在等分过程中，不同的误差源会影响定量检定的准确性。在此，所检查的部分体积的浓度中的波动(所谓的二次抽样误差(Subsampling Error))和由等分过程本身造成的统计学的不准确度(所谓的分区误差(Partitioning Error))占支配地位。这两种机制在文献中都已经有描述(Dube et al.,PLoS ONE 3(8),e2876(2008),10.1371/journal.pone.0002876；Jacobs et al.,BMC Bioinformatics 15,283(2014),https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-283；Bizouarn F.(2014)Introduction to DigitalPCR.In:Biassoni R.,Raso A.(eds)Quantitative Real-Time PCR.Methods inMolecular Biology(Methods and Protocols),vol 1160.Humana Press,New York,NY.https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0733-5_4；Basu,Amar S.(2017):DigitalAssays Part I:Partitioning Statistics and Digital PCR.in SLAS technology 22(4),pp.369–386.DOI:10.1177/2472630317705680)。在此一般性的建议是，通过尽可能多的数量的分区来减小分区误差，以便由此增大分析系统的动态的测量范围。二次抽样误差通常可以忽略不计，并且根据文献，只有当被分析的体积的份额视应用情况而定地低于30％或50％时，二次抽样误差才会发挥显著作用(Jacobs et al.,BMC Bioinformatics15,283(2014),https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-283)。此外，还强调了尽可能多的数量的分区的优点。
发明内容
本发明的优点：
在此背景下，本发明涉及一种用于在分区面上的分区中对微流控样本进行分区设计的方法。特别是，本发明也涉及一种用于对分区中的这种样本或样本的子集进行分区、分配或等分的方法。该方法尤其可用于确定样本中的分析物的浓度，特别是在将核酸片段作为分析物的情况下与数字的PCR结合使用。
因此，样本的分区可以如所描述的那样理解为将样本分配或等分成样本部分，在一种优选的设计方案中，是将样本以样本部分的形式实际放置在分区面上。样本尤其可以是生物学样本，例如包括体液，如血液、尿液、唾液或涂片。除体液外，样本还可以具有其他物质，例如形式为体液与载色剂(如eNATTM或UTMTM)的混合物。分析物也称为靶标，可以是样本中的分子，尤其是核酸片段，例如是病原体或特定体细胞(尤其是肿瘤细胞)的DNA或RNA的一部分。在一种特别的设计方案中，分析物也可以是细胞，特别是单细胞生物或动物的或人类的体细胞，例如单个或多个所谓的循环肿瘤细胞(简称CTC)。因此，如已经提到的那样，根据本发明的方法可以是用于样本中的分析物的基于分区的定量检定方法的一部分或先决条件(例如在借助于数字的PCR的情况下)，其中，在微流控样本的情况下，优选可以使用微流控设备，尤其是芯片实验室系统(Lab-on-Chip-System)来执行这种检定方法。通过根据本发明的方法，可以有利地实现样本的分区，用于以较低的相对误差对样本中的分析物的浓度进行统计学估算。
在一种优选的设计方案中，用于设计分区的方法包括在分区面上对样本进行根据本发明的分区。分区面通常可以是微流控设备的一部分，优选是微流控盒的一部分。例如，分区面可以是微流控设备的腔室中的基板(Substrat)上的表面。
根据该方法的第一步骤，明确分区的几何形状、分区面的形状和样本的总体积。分区面可以例如具有正方形或长方形的形状，并且可选地被限界的壁包围。分区优选可以具有液滴或腔室的形式。在液滴的情况下，所述分区尤其作为乳状液(Emulsion)存在，例如作为油-乳状液中的水基的液滴存在，其中，液滴优选可以通过添加表面活性的物质(所谓的表面活性剂(Surfactants))来被稳定。在腔室的情况下，腔室可以具有圆形的或多角的底面，优选具有六边形的底面。所述腔室在此通过壁彼此分开，其中，所述壁优选被设计成尽可能薄的，以使得挡住的面积尽可能小。优选在腔室的几何形状中考虑所述壁。
在该方法的另一步骤中，确定分区的最小分区尺寸。最小分区尺寸可理解为这样一种尺寸，即，用于分区的大小(尤其是用于分区的体积)的有代表性的且优选明确的值。特别地，在球形或液滴形的分区的情况下，分区尺寸可以是分区的直径，或者在具有多角的(例如正方形或六边形的)底面的腔室中的分区的情况下，分区尺寸可以是腔室的宽度。例如，分区尺寸是两个对置的角之间的距离，优选是分区的最小的中心点距离。由最小分区尺寸隐含地得出具有最小分区尺寸的可布置在分区面上的分区的最大数量。这个最大数量在下文中也称为第一分区数量，并且是分区误差的最小值的量度，因为随着分区数量的增加，样本的被分区的总体积的浓度确定的统计学的不准确度减小。具有尽可能多的分区和相应地小的分区尺寸的分区设计在下文中被简称为最小变体(minimale Variante)。
根据该方法的另一步骤，在下述条件下获取分区的第二分区尺寸并且因此获取第二分区数量：能够将所述总体积的最大可能的份额分区在分区面上，且在该先决条件下，将最大可能的份额分配到所述分区面上的尽可能多的分区上。这具有下述优点：能够分区的总体积越多，则形成的二次抽样误差就越小。不过，为了实现尽可能小的分区误差，分区的数量在此仍应保持尽可能多。该第二分区尺寸在下文中也被称为最大分区尺寸dmax，然而代表了在最大分区总体积的情况下的最小可能的分区尺寸。在最大分区尺寸情况下的分区数量在下文中也被称为第二分区数量Amin。为了区别于最小变体，下文将对分区的设计(其中，尽可能对样本的全部的总体积进行分区，并相应地选择较大的分区尺寸)称为最大变体(maximale Variante)。该步骤尤其也可以在上一步骤之前进行。
在该方法的下一步骤中，在使用围绕最小分区尺寸的第一范围内的分区尺寸时，确定分析物的能测量的浓度的第一不确定度，并且在使用围绕第二分区尺寸的第二范围内的分区尺寸时，确定能测量的浓度的第二不确定度。第一和第二不确定度优选可以是相对的不确定度。通过这些确定有利地获知了，关于浓度的尽可能小的测量误差，是根据最小的变体进行设计更有利还是根据最大的变体进行设计更有利。第一范围优选被如此定义，使得第一范围包括最小分区尺寸(优选作为第一范围的下端)而不包括第二分区尺寸。第二范围优选被如此定义，使得第二范围包括第二分区尺寸(优选作为第二范围的上端)而不包括最小分区尺寸。在一种特别的设计方案中，第一范围和第二范围可以是两个互不重叠的范围，即特别是不相交的范围。
根据所述方法的该步骤的一种特别的改进方案，在使用具有最小分区尺寸的第一分区数量的分区的情况下，确定分析物的可测量浓度的第一不确定度，并且在使用具有第二分区尺寸的第二分区数量的分区的情况下，确定可测量浓度的第二不确定度。优选地，在用于测量分析物的浓度的最大理论范围内的一个值的情况下确定第一不确定度和/或第二不确定度。该最大理论范围从–log(1-1/Amax)/Vpar延伸到–log(1-(Amax-1)/Amax)/Vpar，其中Amax表示第一分区数量，Vpar表示单个分区的容积/体积，并且log表示自然对数。为了生成优选两个大小相等的测量范围，选择该范围在对数刻度上的中心点作为值，其为(log(1-1/Amax)*log(1-(Amax-1)/Amax))^0.5/Vpar。
根据该方法的一种特别的设计方案，如果在预定的浓度值的情况下在用第二范围内的分区尺寸，特别是用第二分区尺寸来设计所述分区时无法测量分析物的浓度，则用第一范围内的分区尺寸，优选用最小分区尺寸来对所述分区进行设计。预定的浓度值优选可以是上述最大理论范围内的一个值，优选是该范围在对数刻度上的上述中心点。
在该方法的下一步骤中，根据第一不确定度与第二不确定度的比较，从第一范围或第二范围中对分区进行设计。这具有以下优点：为了选择分区尺寸并且因此为了分区设计的具体形式，可以合并对不确定度的考虑，以用于后续的浓度测量。特别是，可以在这些获取到的不确定度的基础上来选择最小变体或最大变体。
在该方法的一种特别的设计方案中，如果第一不确定度小于第二不确定度，则用不等于最大分区尺寸的分区尺寸来对所述分区进行设计，并且，如果第一不确定度大于第二不确定度或与该第二不确定度一样大，则以不等于最小分区尺寸的方式来对所述分区进行设计。在该设计方案中，第一范围因此包括除第二/最大分区尺寸之外的所有可实现的分区尺寸，并且第二范围因此包括除最小分区尺寸之外的所有可实现的分区尺寸。
在该方法的另一特别的设计方案中，如果第一不确定度小于第二不确定度，则用第一范围内的分区尺寸来对所述分区进行设计，并且，如果第一不确定度大于第二不确定度或与该第二不确定度一样大，则用第二范围内的分区尺寸来对所述分区进行设计。在此优选地，作为第一范围可以如此地选择一个(可选地相对于该方法的前一步骤修改了的)范围，使得该范围仅包括下述分区尺寸，可测量浓度的与该分区尺寸相关的(优选相对的)不确定度小于在选择第二/最大分区尺寸时可测量浓度的优选相对的不确定度。类似地，作为第二范围，优选可以如此地选择一个(可选地相对于前一步骤修改了的)范围，使得该范围仅包括下述分区尺寸，可测量浓度的与该分区尺寸相关的(优选相对的)不确定度小于在选择最小分区尺寸时可测量浓度的优选相对的不确定度。这具有以下优点：选择最小变体的分区尺寸，在所述最小变体的情况下，相对的不确定度总是小于在选择最大变体时，反之亦然。
在该方法的另一特别的设计方案中，如果第一不确定度小于第二不确定度，则将分区设计为具有最小分区尺寸的第一分区数量的分区，或者，如果第一不确定度大于第二不确定度或与该第二不确定度一样大，则将分区设计为具有第二/最大分区尺寸的第二分区数量的分区。
如上所述，该方法可以是用于检定微流控样本中的分析物的分析方法的一部分。因此，本发明的主题也是这样一种分析方法，其中，根据本发明地将样本分配到分区中，并且其中，针对分析物的存在情况，对至少一个分区进行检查。该分析方法在此优选包括用至少一些分区执行数字的PCR。
此外，本发明的主题也是一种用于生产微流控样本的分区的方法。在此，提供分区面，并且按照根据本发明的设计方法来对样本进行分区。所述生产方法优选可以包括在分区面上生产用于分区的腔室。
附图说明
在附图中示意性地示出了本发明的实施例并且在下面的说明中对其进行更详细的解释。对于在不同附图中示出的且相似地起作用的元件而言使用了相同的参考符号，其中，省去了对这些元件进行重复说明。
其中：
图1示出了用于设计分区的根据本发明的方法的一种实施例的流程图；
图2a、2b示出了以液滴的形式或以填充有样本部分的腔室的形式将样本分区到分区面上的示意图；
图3示出了根据用于分区的所选的分区尺寸来示例性地计算样本中的分析物的不同浓度的相对不确定度的图表；
图4示出了用于检定微流控样本中的分析物的根据本发明的分析方法的一种实施例的流程图；以及
图5示出了微流控样本的分区的根据本发明的生产方法的一种实施例的流程图。
具体实施方式
图1示出了用于设计微流控样本的分区的根据本发明的方法500的一种实施例的流程图500。如上所述，分区在此尤其可以是用于样本中的分析物的基于分区的定量检定方法的一部分或先决条件，其中，在微流控样本的情况下，优选可以使用微流控设备，尤其是芯片实验室系统来执行这种检定方法。例如，下面描述的方法是定量检定在包括体液(例如血液、唾液或涂片)的生物学样本中的病原体或肿瘤细胞的核酸片段的一部分，其中，定量检定通过数字的PCR与样本的根据本发明而设计的分区来进行。
在该方法500的第一步骤510中，确定样本的体积和可用于分区的面(简称分区面)。例如，可分配的体积可以为Vsys＝25微升(μL)，并且分区面可以被设计成边长为L＝10毫米(mm)的正方形。
在第二步骤520(该第二步骤也可以在第一步骤510之前进行)中，明确样本的分配是应当以无中间壁的液滴的形式来进行，还是应当在腔室中来进行。图2a示意性地示出了直径为d的液滴110在宽度为L的分区面101上的布置情况，其中，分区面101例如可以是正方形的或长方形的，并且可以如所示那样地通过壁102来限界。分区面101在此特别是可以布置在微流控的盒的腔室中。图2b在替代的设计方案中示意性地示出了腔室120在分区面101上的布置情况，其中，应当将样本分配到腔室120上。例如，如所示出的那样，腔室120具有宽度为d的六边形的底面121、与腔室深度相对应的壁高D以及在相应两个腔室之间的壁厚w，其中，壁厚w优选选得尽可能小，以便由腔室120的壁122挡住的分区面101的面积尽可能小。在此尤其也可以通过制造技术的要求来限制最小壁厚和最大壁高，以使得腔室120的体积最大化。在选择基于腔室的布置120时，在子步骤521中明确最小壁厚w，例如w＝25微米(μm)，和壁高/腔室深度D，例如D＝380μm。分区面101尤其可以是基板(例如由硅、塑料或两种材料的组合构成的基板)的表面。在具有腔室120的设计方案的情况下，腔室120(尤其是壁122)也可以由硅、塑料或两种材料的组合制成。特别是在含水样本的情况下，分区面101或腔室120的亲水性设计是有利的。
随后，在第三步骤530中，定义最小分区尺寸dmin，其中，该最小分区尺寸dmin的大小也可以由视具体情况而定的上述制造技术的限制和用于分析分区的检测光学器件的分辨率来确定。例如，最小分区尺寸为dmin＝10μm，并且在基于液滴的布置的情况下代表(优选对应于)液滴110的直径d，或在基于腔室的布置的情况下代表两个腔室120的中心点之间的距离，或在基于腔室的布置的情况下在腔室120的底面121为六边形时代表两个对置的角之间的距离d。从该最小分区尺寸dmin出发，在第四步骤540中计算在分区面101上可以放置多少分区，必要时保持最小壁厚w。在所考察的情况下，在基于腔室的方案中，在六边形的布置中的分区有Amax＝101871个，其中，该数量在下文中称为第一分区数量Amax。分区的尺寸可以和腔室120的深度D一起来计算单个分区的容积Vpar，并且在乘以第一分区数量Amax后可计算出具体的总体积Vana。在当前的情况下，该具体的总体积约为Vana＝2.51μL，并且因此仅仅大约是25μL的可分配的总体积Vsys的十分之一。
第一分区数量Amax也定义了用于测量分析物浓度的最大理论范围(以cp/μL作为每微升拷贝的单位)，其范围从–log(1-1/Amax)/Vpar到–log(1-(Amax-1)/Amax)/Vpar，其中，log表示自然对数。为了生成优选两个大小相等的测量范围，根据第五步骤550，该最大测量范围按对数刻度减半。而后所产生的中心点λ为(log(1-1/Amax)*log(1-(Amax-1)/Amax))^0.5/Vpar，并且在本示例中约相当于431cp/μL。替代地，也可以从这个测量范围中选择另一浓度值λ，特别是在有理由在较低或较高浓度下进行优选的测量时。
作为尽可能多的分区的优选的替代方案，如此选择分区的尺寸，使得尽可能将总体积Vsys也进行分区。如果分区面和被分区填满的高度足够大，原则上总是可以将所述总体积Vsys放置在分区面101上，更确切地说，在极限情况下，在仅仅一个唯一的分区内。但是，为了将分区误差保持得也尽可能小，在使用最大可能的体积时，应将所述体积分配到尽可能多的分区中。因此，根据所述方法500的第六步骤560，必须首先找到第二分区尺寸dmax，该第二分区尺寸在给定的条件下使得可分区的并且因此可分析的体积Vana最大化，并且同时意味着尽可能多的分区。该第二分区尺寸也称为最大分区尺寸dmax，然而代表了在最大分区总体积的情况下的最小可能的分区尺寸。在本示例中，在最大可分区的体积Vana为24.999μL时，即实际上总体积Vsys为25μL时，得出dmax为128.52μm。可分区的体积Vana在此被分配到6132个分区中，其中，该数量在下文中被称为第二分区数量Amin。如果第一步骤510和第二步骤520已经完成，则第六步骤560也可以提前进行，特别是在前述步骤之一之前进行或与前述步骤之一并行地进行。
根据该方法的优选的第七步骤570，在使用具有最大分区尺寸dmax的第二分区数量Amax的分区时，获取用于测量分析物浓度的最大理论范围，其中，该范围类似于上述地从–log(1-1/Amin)/Vpar_2延伸到–log(1-(Amin-1)/Amin)/Vpar_2，并且其中，Vpar_2对应于具有分区尺寸dmax的分区的体积。如果上述计算出的中心点λ未落入此范围内，则根据第七步骤570的子步骤571，优选地按照具有最小分区尺寸dmin的第一分区数量Amax来对分区进行设计。如果计算出的中心点λ落入此范围内，则如下地继续执行根据本实施例的方法500。
根据该方法500的第八步骤580，在使用具有最小分区尺寸dmin的第一分区数量Amax的分区时(以下简称为最小变体)，计算分析物的可测量浓度的第一不确定度，并且在使用具有最大分区尺寸dmax的第二分区数量Amin的分区时(以下简称为最大变体)，计算可测量浓度的第二不确定度。
相对的不确定度在此可以优选采用以下方法来确定。
为了计算分区误差，可以使用基于以下概率分布P(C|H)的置信区间的不确定度：
其中，C表示分析的样本体积Vana中的靶标的数量，H表示包含至少一个分析物的分区的数量，A表示可用的分区数量，并且S表示第二类的斯特林数(Stirling-Zahl)。
对于二次抽样误差，可以使用基于以下概率分布P(Ctot|C,p)的置信区间的不确定度：
其中，C表示可分析的样本体积Vana中的靶标的数量，Ctot表示可分区的体积Vsys中的靶标的数量，并且p表示可分析的体积在可分区的体积处所占的份额Vana/Vsys。
如果将两个误差合并，则得出：
由于精确计算该分布持续十分长的时间，因此可以用高斯分布来对其进行近似。在高斯分布的情况下，置信区间可以直接从方差s中计算出来。在95％-置信区间的情况下，所述置信区间为其中μ代表期望值。高斯分布的标准差/>可以从期望值处的概率(即最大概率)中计算得出：
该关系被使用在所述近似中。P(Ctot|H,p)的最大值被设置成等于P(μ)，并且然后计算标准偏差并且从中计算置信区间，所述标准偏差又定义了不准确度。
所述值——在该值的情况下P(Ctot|H,p)变为最大——为：
P(Ctot|H,p)的计算通过下述方式来进行：
这种计算在时间花费方面是有利的。这种近似可以实现定性比较，且定量结果处于不确定度的真实精确值周围约10％的范围内。
在使用这种近似的情况下，对于当前的示例而言，在使用最小变体时得出，在中心点λ处的测量结果σ的第一相对不确定度约为0.0566或5.66％。在使用最大变体时得出，在中心点λ处的第二相对不确定度约为0.0254或2.54％，即小于一半大小的相对不确定度。
根据所述方法500的第九步骤590，现在对这两个相对不确定度进行比较，并且根据该比较来确定分区的设计。特别是，根据这种比较，可以按照最小变体591或按照最大变体592来实现分区，从而优选使得相对不确定度尽可能小。对于变体的具体选择，并且特别是对于用于分区的具体值的选择，多种方法都是有利的，尤其是上文已对其进行了说明。于是，例如可以选择下述设计，该设计在最大理论测量范围的中心提供了较低的不确定度。因此，在本示例中，在正方形的分区面的边长为10mm、处理的体积为25μL、腔室深度/壁高为380μm、最小壁厚为25μm且最小分区尺寸为10μm时，样本被分配到6132个六边形的分区中，所述分区具有128.52μm的分区尺寸。在按照这种分区将样本装入腔室120后，在进行后续的处理或分析(例如作为数字PCR的一部分)之前，可以在一种特别的设计方案中对腔室120涂上(透明的)油。
图3示例性地示出了根据上述近似计算出的相对不确定度σ，在使用腔室120且体积、边长、腔室深度/壁高和壁厚的值相同时，所述相对不确定度依赖于样本中的分析物的不同浓度(分别为每微升10个、50个、100个和500个分析物)的分区尺寸d。如从图3中可以看出的那样，对于在所有计算浓度情况下的这些边界条件，具有大的分区尺寸的设计通常相对误差较小，其中特别是，在浓度较小的情况下，具有尽可能小的分区尺寸的设计是不利的。这是因为在这些情况下，由于在分区尺寸非常小时可分区的体积明显更小，因此二次抽样误差相对于分区误差占支配地位。与之相反，在其他边界条件的情况下，对于某些浓度而言，可以得出，相比于根据最大变体进行的设计，具有小的分区尺寸的设计的相对误差会更小。
根据上述实施例500的一种变型，可分配的总体积Vsys增加到30μL。最小分区尺寸dmin、分区面101的边长L、壁高/腔室深度D和壁厚w保持不变，分别为10μm、10mm、380μm或25μm。在这种情况下，对数测量范围的中心点λ约为431cp/μL。在第二/最大分区尺寸为dmax＝294.65μm时，能够对可分配体积Vsys的最大份额进行分析。在此分区尺寸的情况下，测量范围可达到约338cp/μL的浓度。因此，该测量范围不包括中心点λ，并且因此优选根据第七步骤570的子步骤571，按照最小变体对分区进行设计。
图4示出了根据本发明的分析方法600的一种实施例的流程图。在所述方法600的第一步骤610中，按照用于设计分区的根据本发明的方法，优选可以将样本分配到分区中，例如根据上述关于图1所描述的方法500。随后，在第二步骤620中，针对分析物的存在情况，可以检查至少一个分区，优选尽可能所有的分区，并由此推断出被分配的样本中的分析物的浓度。对浓度的这种确定在此优选通过对数字的PCR的执行来实现，为此，分区形成了基础。
图5示出了根据本发明的生产方法700的一种实施例的流程图。在第一步骤710中，提供分区面。这可以例如通过提供基板来实现，其中，基板的表面形成分区面。分区面或基板在此可以是微流控的盒的一部分，或者可以在生产方法700的过程中被布置或固定在所述盒中。在该方法的第二步骤720中，按照用于设计分区的根据本发明的方法，例如根据上述关于图1所描述的方法500，来对分区进行设计。在此在一种有利的设计方案中，所述生产方法700可以包括在分区面上生产用于分区的腔室。
Claims (11)
1.一种用于在分区面上的分区中对微流控样本、尤其是生物学样本进行分区设计的方法(500)，尤其用于确定样本中的分析物的浓度，该方法包括以下步骤：
·明确(510、520)所述分区(110、120)的几何形状(110、120)、所述分区面(101)的形状和样本的总体积；
·确定(530、540)所述分区(110、120)的最小分区尺寸以及具有最小分区尺寸的能够布置在所述分区面(101)上的分区(110、120)的相应的最大数量作为第一分区数量；
·在下述条件下获取(560)所述分区(110、120)的第二分区尺寸和相应的第二分区数量：能够将所述总体积的最大可能的份额分区在所述分区面(101)上，并且将所述最大可能的份额分配到所述分区面(101)上的尽可能多的分区(110、120)上；
·在使用围绕所述最小分区尺寸的第一范围内的分区尺寸时，确定(580)所述分析物的能测量的浓度的第一不确定度，并且在使用围绕所述第二分区尺寸的第二范围内的分区尺寸时，确定所述能测量的浓度的第二不确定度；
·根据所述第一不确定度与所述第二不确定度的比较(590)，用所述第一范围或所述第二范围内的分区尺寸对分区进行设计(591、592)。
2.根据权利要求1所述的方法(500)，其中，如果所述第一不确定度小于所述第二不确定度，则用不等于所述最大分区尺寸的分区尺寸来对所述分区(110、120)进行设计(591、592)，并且其中，如果所述第一不确定度大于所述第二不确定度或与该第二不确定度一样大，则以不等于所述最小分区尺寸的方式来对所述分区(110、120)进行设计。
3.根据权利要求1或2所述的方法(500)，其中，如果所述第一不确定度小于所述第二不确定度，则用第一范围内的分区尺寸来对所述分区(110、120)进行设计，并且其中，如果所述第一不确定度大于所述第二不确定度或与该第二不确定度一样大，则用第二范围内的分区尺寸来对所述分区(110、120)进行设计。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法(500)，其中，如果所述第一不确定度小于所述第二不确定度，则用最小分区尺寸来对所述分区(110、120)进行设计，并且其中，如果所述第一不确定度大于所述第二不确定度或与该第二不确定度一样大，则用最大分区尺寸来对所述分区(110、120)进行设计。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法(500)，其中，如果在预定的浓度值的情况下在用所述第二范围内的分区尺寸，特别是用所述第二分区尺寸来设计所述分区(110、120)时无法测量所述分析物的浓度，则用所述第一范围内的分区尺寸，特别是用所述最小分区尺寸来对所述分区(110、120)进行设计。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法(500)，其中，在使用具有所述最小分区尺寸的第一分区数量的分区时确定所述第一不确定度，并且在使用具有所述第二分区尺寸的第二分区数量的分区时确定所述第二不确定度。
7.根据权利要求6所述的方法(500)，其中，在用于测量所述分析物的浓度的最大理论范围内的一个值的情况下确定所述第一不确定度和/或所述第二不确定度，特别是其中，该值对应于所述最大理论范围的对数平均值。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法(500)，其中，所述分区(110、120)的几何形状(110、120)考虑到了至少部分限定所述分区(110、120)的壁(122)，该壁具有预定的壁厚和/或壁高。
9.一种用于检定微流控样本中的分析物的分析方法(600)，其中，根据前述权利要求中任一项将样本分配到分区(110、120)中，并且其中，针对所述分析物的存在情况，对至少一个分区(110、120)进行检查。
10.根据权利要求9所述的分析方法(600)，其中，所述分析方法(600)包括用至少一些分区(110、120)执行数字的PCR。
11.一种用于生产微流控样本的分区的方法(700)，其中，提供分区面，并且其中，按照根据权利要求1至8中任一项所述的设计来对样本进行分区。
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