JP2023524463A - デジタルポリメラーゼ連鎖反応における反応体積偏差を検出するための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）における反応体積偏差を検出するための方法、およびｄＰＣＲを用いて試料中の目的の核酸の量または濃度を決定するための方法に関する。この方法は、カーネル関数による畳み込みを使用して光学画像を分析し、各パーティションには、畳み込み閾値と比較される畳み込み値が割り当てられる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月３０日に出願された米国特許出願第６３／０１８１８３号の利益および優先権を主張する。参照される出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

開示の分野
本開示は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）における反応体積偏差を検出するための方法、および反応体積偏差を説明する試料中の目的の核酸の量または濃度を決定するためのｄＰＣＲ方法に関する。

背景
多くの生物学的、生化学的、診断または治療目的のために、試料中の核酸の量または濃度を精密かつ正確に決定することが必要である。デジタルＰＣＲは、核酸の絶対定量および稀な対立遺伝子検出のための従来のリアルタイム定量的ＰＣＲの代替方法を提供する。デジタルＰＣＲは、核酸の試料を多くの個々の並行ＰＣＲ反応に分割することによって機能し、これらの反応の一部は標的分子を含有し（正）、他は含有しない（負）。ＰＣＲ分析に続いて、負反応の割合を使用して、試料中の標的分子の数の絶対数を生成する。リアルタイムＰＣＲに勝るｄＰＣＲの重要な利点の１つは、その優れた定量精度である。定量化は正のパーティション（または反応体積）の正確なカウント、および理論的パーティション体積の知識のみを必要とするため、この利点はｄＰＣＲの固有の特性に依存する（カウント数はＰＣＲ効率にあまり感受性を示すものではない）。定量化基準は不要である。これにより、標準自体によって引き起こされる潜在的な定量誤差が排除される。

先行技術は、誤った正または負のカウントを特定し、液滴ベースのアッセイにおいてシグナルを較正または正規化する方法を提供する（米国特許出願公開第２０１３／０３０２７９２号）。この正規化は、正カウントと負カウントとの間の分離を改善するはずである。したがって、正規化は、偽正または偽負のカウントのリスクを低減する。最終的な目標は、核酸について得られたシグナルを補正することによって、核酸濃度の決定の精度および正確性を改善することである。

しかしながら、従来技術の方法は、ｄＰＣＲパーティション内の真の体積が予想または意図されたものとは異なる状況に起因するＰＣＲの誤差を考慮していない。したがって、反応体積偏差を考慮するｄＰＣＲによって目的の核酸を定量化する方法が必要とされている。

概要
本開示は、ｄＰＣＲアッセイにおける反応体積偏差を検出するための方法であって、ｄＰＣＲアッセイが、パーティションのアレイにおける目的の核酸の量または濃度を定量化するために使用される、方法を提供する。本方法は、以下の工程：
（ａ）カーネル関数による畳み込みを使用してアレイ内の（ｘ、ｙ）座標を横切る光シグナルを結合する工程であって、各パーティションに畳み込み値が割り当てられる、光シグナルを結合する工程；および
（ｂ）各パーティションの畳み込み値を畳み込み閾値と比較することによって、有効なパーティションおよび空のパーティションを特定する工程
を含む。

さらに、本方法はまた、（ｃ）工程（ｂ）で収集されたデータを、クラスタリング操作および形態学的画像処理操作を含む１つ以上の追加の工程に供する工程を含み得る。そのような形態学的画像処理操作は、拡張および／または浸食を含んでいてもよく、クラスタリングは、有効なおよび／または空のトリミングを含んでいてもよい。

本開示はまた、試料中の目的の核酸の量または濃度を決定する方法であって、以下の工程：（ａ）目的の核酸を含有すると思われる試料を提供する工程；（ｂ）パーティションのアレイを含むｄＰＣＲプレート内の試料を用いてｄＰＣＲを実施する工程；（ｃ）パーティションのアレイの１つ以上の有効なパーティションを特定する工程；（ｄ）目的の核酸の量または濃度を、有効なパーティション体積当たりの工程（ｂ）で決定された核酸の数として計算する工程を含む、方法を考慮する。さらに、本方法はまた、工程（ｃ）で特定された１つ以上の有効なパーティション内の目的の核酸のコピー数Ｎ_ｃを決定することと、Ｎ_ｃを有効なパーティション体積で割ることとを含み得る。

特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の方法の工程を実行するように適合された実験機器、ならびに実験機器に方法の工程を実行させる命令を含むコンピュータプログラム製品、および本明細書に記載のコンピュータプログラム製品を格納したコンピュータ可読媒体を提供する。

図１Ａ～１Ｂは、ｄＰＣＲアッセイにおいて反応体積偏差を検出するための本明細書に記載の方法を概略的に示す。図１Ａは、核酸増幅後にｄＰＣＲプレートを分析するために使用される方法を示し、図１Ｂは、ｄＰＣＲプレートの調製から本明細書に記載される方法を使用する分析までの完全な方法を示す。 図１Ａ～１Ｂは、ｄＰＣＲアッセイにおいて反応体積偏差を検出するための本明細書に記載の方法を概略的に示す。図１Ａは、核酸増幅後にｄＰＣＲプレートを分析するために使用される方法を示し、図１Ｂは、ｄＰＣＲプレートの調製から本明細書に記載される方法を使用する分析までの完全な方法を示す。 図２は、本明細書に記載の実験機器の概略図である。

詳細な説明
上記で詳述したように、核酸の量または濃度を確実に決定する方法は、いくつかの産業用途、例えば医学分野において特に関連性がある。そのような用途は、試料、例えば患者または製品から得られた試料中の核酸の量または濃度の正確かつ精密な決定を必要とし得る。これは、例えば、疾患の重症度の診断、環境技術において、または例えば汚染または不純物を定義するために製品の品質を決定する手段として、関心があるかもしれない。

デジタルＰＣＲは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物を含む核酸を直接定量化し、任意にクローン増幅するために使用することができる従来のポリメラーゼ連鎖反応法のバイオテクノロジー精製である。ｄＰＣＲと従来のＰＣＲ（例えばｑＰＣＲ）の主な違いは、核酸量の測定方法にあり、前者はＰＣＲよりも正確および精密な方法であるが、また、経験の浅いユーザの手でエラーが発生しやすい。ｄＰＣＲのより小さいダイナミックレンジは、試料の希釈を必要とし得る。ｄＰＣＲも試料内で単一の反応を実行するが、試料は多数のパーティションに分離され、反応は各パーティションで個別に実行される。この分離により、核酸量のより信頼性の高い収集および高感度の測定が可能になる。さらに、この方法は、精密な定量化を可能にする。

ｄＰＣＲデバイスおよび方法の詳細な説明は、例えば、米国特許出願公開第２００８０１６０５２５号、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９６，９２３６－９２４１、１９９９年８月；ＭｃＣａｕｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；２２０：２９７－３０６；Ｍａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．２０１９；１１（１２）：７２０９－７２２２；；米国特許第１０，５６４，１０２号；米国特許出願公開第２０１８００４５６４１号；欧州特許第３２９９４７１号；米国特許出願公開第２０１８０１４７５７４号；および米国特許出願公開第２０１８００８７０９０号に見出すことができる。これらの刊行物のそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

具体的な一実施形態において、ｄＰＣＲ試料は、試料内の個々の核酸分子がアレイ内の多くの別個の領域内に局在化および濃縮されるように、複数のパーティション（あるいは反応体積またはウェルとも呼ばれる）を含むアレイ内で分離または分配される。試料の分配により、各パーティション内の標的分子カウントが１つの一貫したポアソン分布に従うと仮定することによって核酸の数を推定することが可能になる。ＰＣＲ増幅後、各パーティションを負または正反応として特定する（それぞれ「０」または「１以上」の分子）。標的分子は、正および負のパーティションの数をカウントし、次いで、最尤推定値を使用して基礎となるポアソン分布を推定することによって定量化され得る。従来の定量的ＰＣＲでは、定量化結果はＰＣＲプロセスの増幅効率に依存し得る。しかしながら、ｄＰＣＲは、初期試料量を決定するための増幅サイクルの数に依存せず、標的核酸を定量化するための不確実な指数データへの依存を排除し、したがって絶対的な定量を提供する。

試料がアレイ内で分配されるため、分配プロセスは、部分的に充填されたまたは充填されていないパーティション、すなわち反応体積偏差をもたらし得るものであり、部分的に充填されたまたは充填されていないパーティションは、あるいは空または充填空と呼ばれる。空からの蛍光シグナルは、標的分子を低い量で含むかまたは含まない他の方法で充填されたパーティションから観察されるシグナルと区別することが困難な場合がある。さらに、明るいスポットが空のパーティションで観察される場合があり、これは、充填されたパーティションからの正のシグナルと間違えられる場合がある。

これらの問題は、図１Ａに概略的に示されている本開示の方法を使用して対処することができる。簡潔には、全てのチャネルにわたってシグナルが一貫して低い場合、ｄＰＣＲプレートの領域を分析することによって、シグナルデータにおいて空を特定および区別することができる。これらの低シグナル領域の分析には、以下：
ａ）カーネル関数による畳み込みを使用してアレイ内の（ｘ、ｙ）座標を横切る光シグナルを結合して、各パーティション内に畳み込み値を割り当てられることによる特徴計算１０１；
ｂ）各パーティションの畳み込み値を畳み込み閾値と比較することによって、有効なパーティションおよび空のパーティションを特定すること１０２；
ｃ）任意に、工程（ｂ）で収集されたデータをクラスタリング操作および形態学的画像処理操作を含む１つ以上の追加の工程に供することを含む追加のクリーンアップ工程１０３
を含む。

方法の各工程は、例示的なｄＰＣＲプレートを特に参照して、以下により詳細に説明され、図１Ｂに示される。

簡潔には、特定の実施形態において、ｄＰＣＲプレートは、標準的なマイクロウェルプレート（ＳＢＳフォーマット、図には示されていない）のフォーマット内の１～８個の反応混合物（試料）を含み得る。ｄＰＣＲプレート内の１～８個の試料位置の各々は、入口ポート、例えばプレートの位置Ａ１、位置Ａ１と位置Ａ１２との間の微細構造化部分、および位置Ａ１２の出口ポートからなっていてもよい。ある体積の流体試料が各入口ポートに添加されると、各入口に分配流体が添加される。これは、単一または８チャネルピペットを使用して手動で、または自動分配ステーションを使用して行うことができる。分離または分配流体は、反応混合物に対して不混和性かつ非反応性である疎水性液体、例えば長鎖フッ素化炭化水素またはシリコンオイルである。反応混合物を含有する個々のパーティションの分離（または分配）は、受動的に、または入口ポートに過圧を加えることによって、または出口ポートに負圧を加えることによって行うことができる。モニターセンサを使用して、分離が完了したとき、すなわち分離流体が出口ポートに到達したときにプロセスが停止することを保証することができる。試料調製工程を図１Ｂ、１０４に示す。

分配後、ｄＰＣＲプレートを熱サイクルプロセス１０５に供し、続いて画像分析を行ってアレイ内の個々のパーティションに関連する蛍光シグナルを検出する。予備画像解析工程からのシグナルデータが収集される１０６。表１は、本明細書に記載の方法で使用されるデータ入力を要約している：

反応体積偏差を検出する最初の工程は、特徴計算１０７である。特徴計算の目的は、空のパーティションと有効なパーティションとの間の分離をより明らかにするようにシグナルを結合することである。シグナルは、最初にチャネル間で結合され、次に（ｘ、ｙ）座標に基づいてカーネルを用いて畳み込まれる。シグナルは、画像を精緻化または「平滑化」するためにカーネルで畳み込まれる。一実施形態において、チャネルを個別に畳み込むことができ、またはチャネルの全てにわたる正規化シグナルの合計を畳み込むことができる。

特定の実施形態において、パーティションが１つだけではなく全てのチャネルで薄暗い場合を強調するために、シグナルが合計される。全てのパーティションが等しく寄与することを保証するために、シグナル値は各チャネル内で正規化される。一実施形態において、正シグナルのかなりの部分を有するそれらのチャネルのみが計算に使用される。チャネルは、ｕｓｅＣｈａｎｎｅｌフラグ、すなわち、Ｆｌａｇ_{パーティション}＝１（有効）によって使用するために選択される。シグナルの合計は以下のように計算される：
シグナルチャネル＝蛍光（チャネル）_{パーティション}

畳み込みは、薄暗い領域と薄暗いパーティションとを区別するために使用される。畳み込みはいくつかの工程を含み、まず、距離およびカーネル関数が確立される。標準Ｌ２距離およびカスタム指数カーネルを使用することができる。

表記のために、ｚは所与のパーティションの（ｘ、ｙ）座標を表し、ｚの畳み込みは以下によって表される：

なお、｛ｉｓＶａｌｉｄＰａｒｔｉｔｉｏｎ（ｚ’）＾Ｄｉｓｔ（ｚ、ｚ’）＜＝半径｝が空集合である場合、この値は明確に定義されていない。その場合、結果は不可能なデフォルト値、例えば－１に設定される。一般的に、この方法の焦点は、有効なパーティションの畳み込みにあるため、このような無効なデフォルト値の使用は許容可能である。

空のパーティションと有効なパーティションとを最初に区別するために、畳み込み値に対して閾値が設定される、１０８。畳み込み値が閾値未満のパーティションは空としてマークされ、畳み込み値が閾値を超えるパーティションは有効のままである。閾値を決定するために使用される方法は、プレートの充填部分を表すものを選択するためにｄＰＣＲプレート内の候補参照領域を分析し、次いでその領域内の畳み込み値に基づいて閾値を設定することを含む。

ｄＰＣＲプレート上に描くことができる多くの潜在的な参照領域がある。全ての潜在的な参照領域を分析するのは遅いため、サブセット、この例では６つの参照領域が選択される。候補参照領域の理想的な数は、プレートのサイズおよびパーティション密度に応じて異なり得る。６つの領域が、例示を目的として代表的なｄＰＣＲプレートにおいて使用される：（ｍａｘｘおよびｍａｘｙはパーティションの最大ｘ、およびｙ座標である）

０≦ｉ＜４については、

ｉ＝０の場合、ｙ上の下側境界は、プレートの入口に位置する領域の使用を回避するために０から１１に移動されることに留意されたい。最後の２つの参照領域は、垂直ではなく水平である。

ｉ＝０．１については、

各参照領域について、有効な畳み込みの平均がその領域について計算される（値はデフォルト－１に等しくない）。２番目に平均畳み込みが高い領域を参照とする。この特定の実施形態において、特定の画像アーチファクトがいくつかの領域で畳み込みを増幅する可能性があるという事実のために、第１の最高点の代わりに第２の最高点が選択される。第２の明るい領域は、これらの問題を有する可能性は低いが、完全に充填されたパーティションを含む可能性が非常に高い。

閾値を設定するために、充填されたパーティションの畳み込みのための予想される偏差が決定される。最初に、絶対偏差の中央値（ＭＡＤ）が使用される：

デフォルトの畳み込み値は、この式から除外され、以下の標準的な閾値をもたらす：

次に、代替閾値の必要性が評価される。標準的な閾値は、ＭＡＤが非常に小さい場合、例えばラムダが非常に高いまたは非常に低い場合には適切でない可能性がある。ラムダが非常に低いときに利用可能な、可能な救済手段は限られているが、ラムダが非常に高いときに適切な閾値を回復するために単純な解決策を使用することができる。この場合、平均（ｒｅｆ）が高Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを上回り、かつＭＡＤ（ｒｅｆ）が低Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを下回る場合、代替の閾値が使用される。

閾値が設定されている場合、畳み込み値が閾値未満である場合、パーティションは空として分類され、畳み込み値が閾値を満たすかまたは超える場合、パーティションは有効であると見なされる１０９。

シグナルがノイズが多い場合、および／または有効なパーティションが薄暗い場合、または空のパーティションが実質的にシグナルを含む場合、最終クリーンアップ工程を使用することが望ましい場合がある。クリーンアップ工程は、以下の工程、すなわち、空のトリミング１１０、拡張１１１、および有効トリミング１１２のうちの１つ以上を含むことができる。

（ｉ）空のトリミング
空は、パス連結性を使用したクラスタリングによってトリミングすることができる。簡潔には、所与のパーティションの隣接関係は、そのパーティションと壁を共有するパーティションを含む。例えば、デバイス内のパーティションの形状が正方形、長方形、または六角形である場合、所与のパーティションの隣接するパーティションは、そのパーティションと壁を共有する、それぞれ４つまたは６つのパーティションである。この例において、１つのパーティションで開始し、その隣接パーティションのうちの１つに移動し、次いでその新しいパーティションの隣接パーティションのうちの１つに移動すること等によって、１つのパーティションを次のパーティションに接続する経路を作ることができる。空のパーティションのみを通過する２つのパーティション間の経路が存在する場合、２つの空の区画は経路接続される。全てが互いに経路接続されたパーティションのグループを作成することによって、経路接続によって空のパーティションをクラスター化することができる。ＶｏｉｄＮｏｉｓｅ未満のサイズを有する小さすぎるクラスターは、有効として再分類される。

（ｉｉ）拡張
誤った空が除去された後、残りの空は、いかなる境界空隙も確実に除去されるように拡張される。拡張は、任意の適切なブラシ、例えば半径ｃｌｅａｎｕｐＲａｄｉｕｓを有する「菱形」ブラシを使用して行うことができ、すなわち、座標ｚを有する任意の有効なパーティションの場合、

を有する空のパーティションｚ’が存在する場合に限り、パーティションは空として再分類される。

（ｉｉｉ）有効トリミング
最後の工程では、小さい群を除去することによって有効なパーティションがトリミングされる。この工程は、有効なパーティションのためではなく、空のトリミングのために本明細書に記載されるように実行される。最初に、有効なパーティションは、経路接続性によってクラスター化され、次いで、ｇｏｏｄＮｏｉｓｅ未満のサイズを有するクラスターは、有効として再分類される。

空が適切に特定されると、それらのパーティションのフラグは空に変更される。

アルゴリズムの出力を表２に要約する：

本明細書に記載の方法を使用して空のパーティションが特定されると、ｄＰＣＲシステムは、空のパーティションから収集されたシグナルデータを無視して、アレイ内の有効なパーティション内の目的の核酸の量または濃度を定量化することができる。特定の実施形態において、１つ以上の有効なパーティション中の目的の核酸の濃度は、有効なパーティション体積当たりの核酸分子の数として計算される。

したがって、濃度は、標的分子カウント（コピー数としても知られる）Ｎ_ｃをサンプリングされた液体体積で割ることによって計算され得る。コピー数Ｎ_ｃは、以下のように導出される：最初に、ｄＰＣＲシステムは、どの有効なパーティションが標的分子について正および負であるかを特定し、それぞれについて合計を導出する。

一例として、２０００個の負および８０００個の正の有効なパーティションを有するｄＰＣＲプレートでは、最尤推定値を使用して、ポアソン分布λの基礎となるパラメータを計算する。パーティションが負である確率の推定値は、以下のように計算することができる：
Ｐ（負）＝負の数／合計数
例えば、上記の例示的なｄＰＣＲプレートでは、
Ｐ（負）＝２０００／（２０００＋８０００）＝０．２。

Ｘがパーティション内の分子の数をモデル化するポアソン確率変数である場合、
Ｐ（負）＝Ｐ（Ｘ＝０）＝ｅｘｐ（－λ）
は、ポアソン分布の唯一のパラメータであるλを推定するために使用される。この理論的根拠を例示的なｄＰＣＲプレートに適用する：
ｅｘｐ（－λ）＝Ｐ（負）＝０．２、すなわち、λ＝－ｌｏｇ（０．２）＝１．６１（円形）である。

λは、ポアソン分布の期待値または平均値でもあるため、重要な値である。換言すれば、λは、ポアソン推定に基づく１パーティション当たりの標的分子の平均数である。λ推定値は、Ｎ_ｃを決定するために使用される：

Ｎ_ｃ＝充填されたパーティションのλ＊数。

充填されたパーティションの数は、非空パーティションの数：有効＋空ではない無効である。例示的なｄＰＣＲプレートでは、無効であり空ではない１０００個の追加のパーティションを仮定すると、充填されたパーティションの数＝２０００＋８０００＋１０００＝１１０００であり、コピー数はＮ_ｃ＝１．６１＊１１０００＝１７７１０である。

濃度計算は、追加の補正係数を含む。試料がｄＰＣＲで使用する前に処理されている、例えば希釈されている場合、分析された試料中の目的の核酸の量または濃度を得るために、処理および希釈工程を計算に含めるべきである。したがって、例示的なｄＰＣＲプレートでは、１つのパーティションの体積が１ｍＬであり、試料がｄＰＣＲの前に１／１０の濃度に希釈されると仮定すると、増幅前の濃度は以下の通りである：
Ｎ_ｃ／（パーティション体積＊充填されたパーティションの数）＝１７７１０／（１１０００＊０．００１Ｌ）＝１６１０コピー／リットル。

したがって、希釈前には、１０×１６１０＝１６１００コピー／リットルである。

本明細書に記載の方法は、ｄＰＣＲ分析を使用して試料中の核酸の量または濃度を決定するために使用される。本文脈における試料は、検出または測定および定量化される１つ以上の核酸を含有すると思われる物質の量である。本明細書で使用される場合、この用語は、検体（例えば、生検または医学検体）、細胞または組織培養物、血液、血清、血漿、針吸引物、尿、精液（ｓｅｍｅｎ）、精液（ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、精漿、前立腺液、排泄物、涙、唾液、汗、生検、腹水、脳脊髄液、胸水、羊水、腹膜液、間質液、痰、乳、リンパ、気管支および他の洗浄液試料、または組織抽出試料を含むが、これらに限定されない。試料の供給源は、新鮮な、凍結された、かつ／または保存された臓器または組織試料または生検または吸引物からのような固体組織または対象の妊娠もしくは発生の任意の時点に由来する細胞であり得る。試料は、保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質等の自然界で試料の供給源と天然に混合されない化合物を含有し得る。

上に詳述したように、試料は目的の核酸を含有し、その量または濃度は本開示の方法で決定される。核酸は、全ての既知の形態の生命にとって不可欠なバイオポリマーである。したがって、核酸は、特定の生物の指標として使用され得るが、例えば突然変異または天然に存在するバリアントの場合にも、疾患の指標として使用され得る。目的の核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物からなる群から選択されてもよく、または任意の他の種類の核酸である。核酸は、非核酸成分を含み得る。天然に存在していてもよく、化学合成されていてもよく、または生物工学的に操作されていてもよい。具体的には、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物からなる群から選択される。

核酸は、微生物（病原体など）を示している場合があり、感染等の疾患の診断に有用であり得る。感染は、細菌、ウイルス、真菌、および寄生生物または他の核酸含有物体によって引き起こされ得る。病原体は、外因性（環境もしくは動物の供給源または他の人から得られる）または内因性（通常の細菌叢由来）であり得る。試料は、徴候および症状に基づいて選択されてもよく、疾患過程を表すべきであり、抗菌剤の投与前に収集されるべきである。未処理の試料中の核酸の量は、疾患の重症度を示し得る。

あるいは、核酸は、遺伝的障害を示し得る。遺伝的障害は、ゲノムの１つ以上の異常によって引き起こされる遺伝的問題、特に出生時から存在する状態（先天性）である。ほとんどの遺伝的障害は非常に稀であり、数千または数百万人に１人が罹患する。遺伝的障害は遺伝性であってもなくてもよく、すなわち親の遺伝子から伝えられる。非遺伝的遺伝障害では、欠陥は、ＤＮＡの新しい変異または変化によって引き起こされ得る。そのような場合、欠陥は、生殖系列において生じる場合にのみ遺伝可能である。癌のいくつかの形態などの同じ疾患は、一部の人々においては遺伝性の遺伝的状態によって、他の人々においては新しい変異によって、かつさらに他の人々においては主に環境的原因によって引き起こされ得る。明らかに、変異を有する核酸の量は、疾患状態を示し得る。

特定の実施形態において、試料は、母体の核酸源および胎児の核酸源（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む妊娠中の哺乳動物から採取された生物学的流体である。この具体的な実施形態において、胎児異数性に起因する染色体量を、母体試料由来の核酸を使用して検出することができる。特定の染色体由来の核酸の頻度の経験的決定に加えて、母体試料中の胎児核酸の割合はまた、リスク計算に関して統計的に有意である変動のレベルに影響を及ぼすため、染色体量に基づいて胎児異数性のリスクを決定するのに有用である。１つ以上の胎児染色体における異数性のリスクを計算する際にそのような情報を利用することにより、試料間の生物学的差異を反映するより精密な結果が可能になる。胎児の割合は染色体量の予想される統計的存在に関する重要な情報を提供するため、母体試料中の胎児ＤＮＡの割合はリスク計算の一部として使用される。予想される統計的存在からの変動は、胎児異数性、特に特定の染色体の胎児トリソミーまたはモノソミーを示し得る。

本開示の方法では、核酸の量または濃度が決定される。物質の量は、標準的に定義された量である。国際単位系（ＳＩ）は、アボガドロ定数の逆数を比例定数（モル単位）として、存在する基本的実体の数に比例する物質の量を定義する。物質量のＳＩ単位はモルである。モルは、１２ｇの同位体炭素－１２中に原子が存在するのと同数の元素を含む物質の量として定義される。したがって、試料の物質量は、試料質量を物質のモル質量で割ったものとして計算される。本文脈において、「量」は、通常、目的の核酸配列のコピー数を指す。

ｄＰＣＲでは、パーティションは、マイクロアレイまたはナノアレイの小型化されたチャンバ、マイクロ流体デバイスのチャンバ、マイクロウェルまたはナノセル、チップ上、キャピラリ内、核酸結合面上またはビーズ上、特にマイクロアレイまたはチップ上であってもよい。本明細書に記載の方法は、ＦｌｕｉｄｉｇｍのマイクロウェルチップベースのＢｉｏＭａｒｋ（登録商標）ｄＰＣＲ等の市販のデジタルＰＣＲプラットフォーム、およびＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのホールベースのＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ ｆｌｅｘ ｄＰＣＲおよび３Ｄ ｄＰＣＲを含むがこれらに限定されないアレイベースのシステムでの使用に特に適している。マイクロ流体チップベースのｄＰＣＲは、パネル当たり最大数百のパーティションを有することができる。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ ｄＰＣＲは、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）プレート上でデジタルＰＣＲ分析を実行し、これはサブアレイ当たり６４個のパーティションおよび合計４８個のサブアレイを含み、アレイあたり合計３０７２個のパーティションに等しい。

典型的には、より多くのパーティションを使用することによって、精度、より重要なことにはｄＰＣＲによる決定の精度を向上させることができる。約１００～２００、２００～３００、３００～４００、７００以上のパーティションを使用することができ、これらはＰＣＲによって問題の量または濃度を決定するために使用される。特定の実施形態において、ｄＰＣＲは、少なくとも１００個のパーティション、特に少なくとも１，０００個のパーティション、特に少なくとも５，０００個のパーティションで同一に実行される。特定の実施形態において、ｄＰＣＲは、少なくとも１０，０００個のパーティション、特に少なくとも５０，０００個のパーティション、特に少なくとも１００，０００個のパーティションで同一に実行される。

例えば、ｄＰＣＲは、少なくとも１００～１００，０００のパーティション、例えば少なくとも１，０００～１００，０００の反応部位、または少なくとも１０，０００～１００，０００の反応部位を有する配列で同様に行われる。

本明細書に記載の方法は、デジタル核酸増幅反応を行うように構成された実験機器またはシステムで行われる。本明細書で使用される場合、「核酸増幅反応」という用語は、ポリメラーゼによる温度依存性反応の反復サイクルを含む、標的ＤＮＡセグメント（分析物）の単一コピーまたは数コピーをＤＮＡセグメントの検出可能な量のコピーに増幅するために分子生物学で使用される方法または反応に関する。各サイクルは、少なくとも変性相（例えば、９５℃で３０秒間）、アニーリング相（例えば、６５℃で３０秒間）、および伸長相（例えば、７２℃で２分間）を含み得る。ｄＰＣＲプレートは、試料ホルダを異なる相の所定の温度に加熱かつ／または冷却するために熱電素子と熱的に接触してもよい。典型的には、核酸増幅反応は２０～４０回の反復サイクルからなり、ｄＰＣＲプレート内の反応体積から放射された光のシグナル強度は、核酸増幅反応が完了した後に検出器によって測定される。測定されたシグナル光強度に基づいて、試料中の核酸の存在を決定することができる。

核酸増幅反応を行うための実験機器は当技術分野で周知であり、以下の構成要素の１つ以上を含むことができる（代表的な実験機器２００が図２に概略的に示されている）：
ｉ．試料および／または試薬をｄＰＣＲプレート２０２にピペットで入れるためのピペットデバイスを含む、実験機器または別個のシステムの構成要素であってもよく、試料をｄＰＣＲプレート内のアレイ２０３内の１つ以上の反応体積に分配するためのサンプル調製モジュール２０１；
ｉｉ．実験機器内のｄＰＣＲプレートをあるモジュールから他のモジュールに輸送するｄＰＣＲプレート支持体／ハンドリングモジュール２０４と；
ｉｉｉ．前記増幅反応中に前記ｄＰＣＲプレートを加熱かつ／または冷却するための熱電素子を含む熱サイクリングモジュール２０５；
ｉｖ．前記ｄＰＣＲプレート（またはそのサブセクション）に向かって光を放射するように構成された光源と、ｄＰＣＲプレート（またはそのサブセクション）から放射された光のシグナル光強度を測定するように構成された光検出器とを含む検出モジュール２０６；および
ｖ．制御デバイス２０７、例えば、試料分析工程が実験機器によって実行されるように実験機器およびその構成要素を制御するように構成された、プロセッサ２０８を含む任意の物理的または仮想的処理デバイス。

試料調製モジュールは、実験機器のハウジング内に収容されていてもよく、または実験機器ハウジング内に収容されていない別個の独立デバイスであってもよい。試料調製モジュールが別個のデバイスである実施形態において、試料調製モジュール内でｄＰＣＲプレートが調製され、次いで、プレートは、実験機器内のｄＰＣＲプレート支持体／ハンドリングモジュール２０４に（自動的にまたは手動で）輸送される。

任意に、制御デバイスは、特定の試料でどの工程を実行する必要があるかに関する情報をデータ管理ユニットから受信し得る。制御デバイスのプロセッサは、例えば、実験機器の動作を実行するための命令を含むコンピュータ可読プログラムを実行するように適合されたプログラマブルロジックコントローラとして具現化されてもよい。１つの操作は、本明細書中に記載されるように、ｄＰＣＲシステムにおける反応体積偏差を検出するための方法を行うことである。

上述の実験機器の構成要素のうちの１つ以上は、例えば、米国特許出願第２００８０１６０５２５号；米国特許第１０，５６４，１０２号；米国特許出願公開第２０１８００４５６４１号；欧州特許第３２９９４７１号；米国特許出願公開第２０１８０１４７５７４号；米国特許出願公開第２０１８００８７０９０号に示されている。これらの刊行物のそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

さらに、本開示は、本方法の工程を本明細書に記載の実験機器に実行させて、本明細書に記載のｄＰＣＲプレートにおける反応体積偏差を検出させるための命令を含むコンピュータプログラム製品を企図している。さらに、本開示はまた、本方法の工程を本明細書に記載の実験機器に実行させて、本明細書に記載の反応体積偏差を検出させるための命令を含むコンピュータプログラム製品を格納したコンピュータ可読媒体を提供する。

本明細書に記載の主題および動作の実施形態は、デジタル電子回路、または本明細書に開示される構造およびそれらの構造的均等物を含むコンピュータソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェア、またはそれらの１つ以上の組み合わせで実装されることができる。本明細書に記載の主題の実施形態は、１つ以上のコンピュータプログラム、すなわち、データ処理装置による実行のために、またはデータ処理装置の動作を制御するためにコンピュータ記憶媒体上にコード化されたコンピュータプログラム命令の１つまたは複数のモジュールとして実装されることができる。モジュールは、１または複数のプロセッサによって実行される論理を含むことができる。本明細書で使用される「ロジック」は、プロセッサの動作に影響を与えるために適用されることができる命令シグナルおよび／またはデータの形態を有する任意の情報を指す。ソフトウェアはロジックの一例である。

コンピュータ記憶媒体は、コンピュータ可読記憶デバイス、コンピュータ可読記憶基板、ランダムまたはシリアルアクセスメモリアレイまたはデバイス、あるいはそれらの１つ以上の組み合わせであっても、またはそれらに含まれてもよい。さらに、コンピュータ記憶媒体は伝搬シグナルではないが、コンピュータ記憶媒体は、人工的に生成された伝搬シグナルに符号化されたコンピュータプログラム命令のソースまたは宛先とすることができる。コンピュータ記憶媒体はまた、１つ以上の別個の物理的コンポーネントまたは媒体（例えば、複数のＣＤ、ディスク、または他の記憶デバイス）とすることができるか、またはそれらに含まれることができる。本明細書に記載されている動作は、１つ以上のコンピュータ可読記憶デバイスに記憶されているか、または他のソースから受信されたデータに対してデータ処理装置によって実行される動作として実装されることができる。

「プログラムされたプロセッサ」という用語は、データを処理するためのあらゆる種類の装置、デバイス、およびマシンを包含し、例えば、プログラム可能なマイクロプロセッサ、コンピュータ、チップ上のシステム、または前述の複数のもの、またはそれらの組み合わせを含む。装置は、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）などの特別な目的のロジック回路を含むことができる。装置はまた、ハードウェアに加えて、当該コンピュータプログラムの実行環境を作成するコード、例えば、プロセッサファームウェア、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、クロスプラットフォームランタイム環境、仮想マシン、またはそれらの１つ以上の組み合わせを構成するコードを含むことができる。装置および実行環境は、ウェブサービス、分散コンピューティング、グリッドコンピューティングインフラストラクチャなど、様々な異なるコンピューティングモデルインフラストラクチャを実現することができる。

コンピュータプログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、スクリプト、またはコードとも呼ばれる）は、コンパイルまたは解釈された言語、宣言言語または手続き型言語を含む、あらゆる形式のプログラミング言語で記述されることができ、スタンドアロンプログラムとして、またはモジュール、コンポーネント、サブルーチン、オブジェクト、またはコンピューティング環境での使用に適したその他のユニットとして含む、あらゆる形式で展開されることができる。コンピュータプログラムは、ファイルシステム内のファイルに対応することができるが、対応する必要はない。プログラムは、他のプログラムまたはデータを保持するファイルの一部（例えば、マークアップ言語ドキュメントに保存された１つ以上のスクリプト）、当該プログラム専用の単一ファイル、または複数の調整されたファイル（例えば、１つ以上のモジュール、サブプログラム、またはコードの一部を記憶するファイル）に記憶されることができる。コンピュータプログラムは、１台のコンピュータ、または１つのサイトに配置されているか、複数のサイトに分散され、通信ネットワークによって相互接続されている複数のコンピュータで実行されるように展開されることができる。

本明細書に記載のプロセスおよびロジックフローは、１つ以上のコンピュータプログラムを実行する１つ以上のプログラム可能なプロセッサによって実行され、入力データを操作して出力を生成することによってアクションを実行することができる。プロセスおよびロジックフローは、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）などの特殊用途のロジック回路によって実行されることもでき、装置は、それらとして実装されることもできる。

コンピュータプログラムの実行に適したプロセッサは、例として、汎用および特殊目的の双方のマイクロプロセッサ、および任意の種類のデジタルコンピュータの任意の１つ以上のプロセッサを含む。一般的に、プロセッサは、読み取り専用メモリまたはランダムアクセスメモリ、あるいはその双方から命令とデータを受信する。コンピュータの本質的な要素は、命令に従ってアクションを実行するためのプロセッサと、命令およびデータを記憶するための１つ以上のメモリデバイスである。一般的に、コンピュータはまた、データを記憶するための１つ以上の大容量記憶デバイス、例えば、磁気ディスク、光磁気ディスク、または光ディスクを含むか、またはデータを受信するか、データを転送するか、またはその双方に動作可能に結合される。しかしながら、コンピュータは、そのようなデバイスを必要とするわけではない。コンピュータプログラムの命令およびデータを記憶するのに適した装置は、例として半導体メモリデバイス、例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、およびフラッシュメモリデバイスを含む、全ての形態の不揮発性メモリ、メディアおよびメモリ装置、磁気ディスク、例えば、内蔵ハードディスクまたはリムーバブルディスク、光磁気ディスク、およびＣＤ－ＲＯＭおよびＤＶＤ－ＲＯＭディスクを含む。プロセッサおよびメモリは、特別な目的のロジック回路によって補完され、またはこれに組み込まれることができる。

本明細書に記載される主題の実施形態は、例えば、データサーバとしてのバックエンドコンポーネントを含むか、またはアプリケーションサーバなどのミドルウェアコンポーネントを含むか、または、例えば、ユーザがこの明細書に記載されている主題の実装と対話することができるグラフィカルユーザインタフェースまたはＷｅｂブラウザを有するクライアントコンピュータなどのフロントエンドコンポーネント、または１つ以上のそのようなバックエンド、ミドルウェア、またはフロントエンドコンポーネントの任意の組み合わせを含むコンピューティングシステムに実装されることができる。システムのコンポーネントは、デジタルデータ通信の任意の形式または媒体、例えば通信ネットワークによって相互接続されることができる。通信ネットワークの例は、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）およびワイドエリアネットワーク（「ＷＡＮ」）、ネットワーク間（例えば、インターネット）、およびピアツーピアネットワーク（例えば、アドホックピア－ピアツーピアネットワーク）を含む。

コンピューティングシステムは、任意の数のクライアントおよびサーバを含むことができる。クライアントおよびサーバは、通常、互いにリモートであり、通常、通信ネットワークを介して相互作用する。クライアントおよびサーバの関係は、それぞれのコンピュータ上で実行され且つクライアント－サーバの関係を互いに有するコンピュータプログラムによって発生する。いくつかの実施形態では、サーバは、（例えば、データを表示し、クライアントデバイスと対話するユーザからのユーザ入力を受信する目的で）データ（例えば、ＨＴＭＬページ）をクライアントデバイスに送信する。クライアントデバイスで生成されたデータ（例えば、ユーザの操作の結果）は、サーバにおいてクライアントデバイスから受信されることができる。

他に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的および科学的用語および任意の頭字語は、本開示の分野の当業者により共通して理解されている意味と同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ出版、１９９４年（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．出版、１９９４年（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．出版、１９９５年（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）に見出すことができる。

本開示は、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されないが、これはこれらが変動し得るためである。本明細書に記載の方法および物質と類似または同等の任意の方法および物質を本開示の実施に使用することができるが、特定の方法および材料を本明細書に記載する。さらに、本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態のみについて記載する目的のためのものであり、本開示の範囲を限定することを意図しない。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他を明確に指さない限り、複数についての言及を含む。同様に、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」および「包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」は、端を含めないというよりもむしろ、端を含めると解釈される。同様に、「または」という単語は、文脈が別途明確に指示しない限り、「および」を含むことを意図している。「複数」という用語は、２つ以上を指す。

前述の説明は、本開示の様々な実施形態を例示することを意図している。したがって、説明された特定の改変は、本開示の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。本開示の範囲から逸脱することなく、様々な同等物、変更、および修正を行うことができることは当業者には明らかであり、したがって、そのような同等の実施形態が本明細書に含まれることが理解されるべきである。

様々な刊行物が本明細書に引用されており、その開示はその全体が参照により組み込まれる。

Claims (21)

1. デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）アッセイにおける反応体積偏差を検出するための方法であって、前記ｄＰＣＲアッセイが、パーティションのアレイにおける目的の核酸の量または濃度を定量化することを含み、前記方法が、
   （ａ）カーネル関数による畳み込みを使用して前記アレイ内の（ｘ、ｙ）座標を横切る光シグナルを結合することであって、各パーティションに畳み込み値が割り当てられる、光シグナルを結合すること；および
   （ｂ）各パーティションの前記畳み込み値を畳み込み閾値と比較することによって、有効なパーティションおよび空のパーティションを特定すること；および任意に
   （ｃ）工程（ｂ）で収集されたデータを、クラスタリング操作および形態学的画像処理操作を含む１つ以上の追加の工程に供すること
   を含む、方法。
2. 工程（ｂ）で収集されたデータを、拡張、侵食、およびそれらの組合せを含む形態学的画像処理操作に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ｂ）で収集されたデータを、有効なトリミングおよび／または空のトリミングを含むクラスタリングに供することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 空のパーティションが、前記畳み込み閾値を下回る畳み込み値を有し、有効なパーティションが、前記畳み込み閾値を上回る畳み込み値を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記アレイが複数のチャネルを含み、工程（ａ）が、前記複数のチャネルのうちのどの１つまたは複数のチャネルを前記方法で使用するかを、ｕｓｅＣｈａｎｎｅｌフラグ
   

   

   によって決定することをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 工程（ａ）が、
   

   

   を含む距離関数のカーネル関数を適用することをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. ｚが第１のパーティションの（ｘ、ｙ）座標のセットを表し、ｚの畳み込みが、
   

   

   である、請求項６に記載の方法。
8. 

   が空集合である場合、前記空集合の出力が畳み込みの範囲外のデフォルト値に設定される、請求項７に記載の方法。
9. 前記畳み込み閾値が、前記アレイの選択された参照領域内の畳み込み値のセットに基づく、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記選択された参照領域が、垂直参照領域ｉ、水平参照領域ｊ、およびそれらの組み合わせから選択され、ｍａｘ ｘおよびｍａｘ ｙが、前記垂直参照領域および／または水平参照領域におけるパーティションの最大ｘおよびｙ座標であり、
    （ａ）前記垂直参照領域ｉが、
    

    

    によって表され；
    （ｂ）前記水平参照領域ｊが、
    

    

    によって表され、かつ、
    それぞれの垂直参照領域および／または水平参照領域ごとに、前記垂直参照領域および／または水平参照領域の有効な畳み込み値の平均を計算することと、２番目に高い平均畳み込み値を有する垂直参照領域および／または水平参照領域を前記選択された参照領域として特定することとをさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 

    として表される絶対偏差の中央値（ＭＡＤ）を計算して、デフォルト畳み込み値を除外し、標準閾値：
    

    

    を得ることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 平均（ｒｅｆ）が高ＣｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎＴｈｒｅｓｈｏｌｄを上回り、かつＭＡＤ（ｒｅｆ）が低ＶａｒｉａｎｃｅＴｈｒｅｓｈｏｌｄを下回る場合に、代替閾値を使用することをさらに含み、前記代替閾値が、
    

    

    であり、
    閾値ＡｄｊｕｓｔｍｅｎｔＦｒａｃが、前記代替閾値として使用される平均の割合である、請求項１１に記載の方法。
13. クラスタリングが、（ａ）連続した経路によって全てが互いに対で接続された前記アレイ内のパーティションをグループ化することであって、前記グループ化がクラスターである、前記アレイ内のパーティションをグループ化することと、（ｂ）空のノイズ閾値未満のサイズを有する１つ以上のクラスターを特定することと、（ｃ）工程（ｂ）で特定されたクラスターを有効として指定することとを含む経路接続性を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 境界空を除去するための拡張をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 座標ｚを有する有効なパーティションについて、
    

    

    を有する空のパーティションｚ’が存在する場合、前記有効なパーティションが空のパーティションとして指定される、請求項１４に記載の方法。
16. クラスタリングが、（ａ）連続した経路によって全てが互いに対で接続された前記アレイ内のパーティションをグループ化することであって、前記グループ化がクラスターである、前記アレイ内のパーティションをグループ化することと、（ｂ）有効なノイズ閾値未満のサイズを有する１つ以上のクラスターを特定することと、（ｃ）工程（ｂ）で特定されたクラスターを空と指定することとを含む経路接続性を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 空と特定されたパーティションをフラグ化することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 試料中の目的の核酸の量または濃度を決定するための方法であって、（ａ）前記目的の核酸を含有すると思われる試料を提供する工程；（ｂ）パーティションのアレイを含むｄＰＣＲプレート内の前記試料を用いてｄＰＣＲを実施する工程；（ｃ）前記パーティションのアレイの１つ以上の有効なパーティションを特定する工程；（ｄ）前記目的の核酸の量または濃度を、有効なパーティション体積当たりの工程（ｂ）で決定された核酸の数として計算する工程を含む、方法。
19. 工程（ｃ）で特定された前記１つ以上の有効なパーティション中の目的の核酸のコピー数Ｎ_ｃを決定することと、Ｎ_ｃを前記有効なパーティション体積で割ることとをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法の工程を実行するように適合された実験機器。
21. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法の工程を実験機器に実行させるための命令を含む、コンピュータプログラム製品。

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