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GESTELL FUR EIN MIKROANALYSENSYSTEM
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GESTELL FÜR EIN MIKROANALYSENSYSTEM Durch die vorliegende ErSindung
wurde das von STÖCKER angegebene Analysengerät weiterentwickelt (Europ. Patentblatt
1980/23, Nr. 0 018 435). Mit der dort beschriebenen Methode werden eine oder mehrere
flüssige Proben zwischen zwei in einem Gestell 101 liegenden ebenen Platten gleichzeitig
nebeneinander untersucht. Auf beiden Platten (Oberplatte 302, Unterplatte 303c)
befinden sich hydrophile Reaktionsfelder 304, die von einer wasserabstoßenden Schicht
umgeben sind. Die Reaktionsfelder beider Platten liegen deckungsgleich übereinander,
und das Gestell verhindert es, daß sie seitlich gegeneinander verschoben werden.
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Man bringt beispielsweise auf die Reaktionsfelder der Oberplatte in
Wasser gelöstes Reagens und auf die Reaktionsfelder der Unterplatte in Wasser gelöste
Probe. Dann legt man, mit den Tropfen zueinander, die Unterplatte auf den Boden
105 und die Oberplatte auf die vier Federn 108 des Gestells. Die Oberplatte wird
nach unten gedrückt und der Abstand der beiden Platten soweit verringert, daß die
sich gegenüberliegenden Tropfen miteinander verschmelzen. Dadurch werden die einzelnen
Reaktionen gleichzeitig gestartet. Die Reaktionsfelder beider Platten halten die
Reaktionsgemische von oben und unten fest. Die in den Tropfen gelösten Substanzen
können durch rhythmisches Verändern des Plattenabstandes wirkungsvoll gemischt werden.
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Es kommt entscheidend darauf an, daß man den kleinsten und den größten
Parallelabstand beider Platten voneinander genau einstellen kann. Der kleinste Abstand
wird im Gestell 101 durch den Boden 105 und durch die Abstandhalter 106 bestimmt:
Der Boden stützt die Unterplatte oder einen zwischen Boden und Unterplatte gelegten
Distanzrahmen 109 von allen vier Seiten her ab, und die Oberplatte kann nicht weiter
nach unten gedrückt werden, als es die Abstandhalter zulassen. Die Tropfen haben
dann ihren größten Durchmesser: 113. Wenn der Boden, der Distanzrahmen oder die
beiden Platten
ungenau verarbeitet oder verzogen sind, oder wenn
die Abstandhalter nicht weit genug über den Boden ragen, dann können sich die beiden
Platten zu nahe kommen, und einander benachbarte Tropfen laufen zusammen. Je geringer
der Sollabstand zwischen Oberplatte und Unterplatte ist, umso eher führen auch schon
kleine Ungenauigkeiten zu einem Verschmelzen der Tropfen.
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Läßt man die Oberplatte los, dann wird sie von den vier Federn nach
oben gegen einen Sperrahmen 112 gedrückt, und der größte Plattenabstand stellt sich
ein. Zwischen Oberplatte und Sperrahmen kann auch noch eine Eisenplatte 110 zum
Mischen mit einem rhythmisch anziehenden Magneten vorgesehen werden oder ein weiterer
Distanzrahmen 111.
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Die Tropfenhöhe 114 wird jetzt durch den Abstand der Oberkante der
Nut 107 zur Oberkante des Bodens bestimmt, sowie durch die Stärken der Unterplatte,
der Oberplatte, der Eisenplatte, des Distanzrahmens und des Sperrahmens. Sind diese
Teile ungenau ausgebildet, dann weicht die Tropfenhöhe vom Sollwert ab. Das kann
zu falschen Analysenergebnissen führen, wenn die Konzentration der Reaktionsprodukte
in den Tropfen durch ein photometrisches Verfahren gemessen wird, z. B. mit einem
Mikroskop-Photometer.
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Leider kann der Plattenabstand zum Photometrieren nicht wesentlich
über drei Millimeter gesteigert werden, weil dann die Tropfen auseinanderreißen.
Eine geringe Abweichung der Meßstrecke vom Sollwert führt laher bei der Plattenmethode
zu einem größeren absoluten Fehler als bei Analysenmethoden, die zur Schwächung
des Lichtstrahls über eine Meßstrecke von zehn Millimetern verfügen. Es ist dementsprechend
notwendig, den maximalen Plattenabstand und damit die Tropfenhöhe durch das Gestell
genau festzulegen.
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Im übrigen kann man auch mit einem ungenau ausgebildeten Gestell genaue
Ergebnisse erhalten, wenn man Abstandhalter unmittelbar zwischen die Platten bringt
oder die Reaktionsfelder durch erhabene Bestandteile der Platten auseinanderhält
(z. B. 303d in Abb. 2), oder wenn man die Tropfenhöhe für jede einzelne Analyse
mißt: durch eine optische Einrichtung,
durch ein Ultraschallverfahren
oder durch zu photometrierende Standardlösungen intern (im selben Tropfen) oder
extern (in einem Tropfen neben dem Reaktionsgemisch).
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Ein bestimmter Plattenabstand kann beim Gestell 101 nur durch großen
technischen Aufwand genau eingestellt werden: 1. Der feste Plattenabstand wird durch
zu viele Faktoren bedingt: a) Parallelität des Bodens 105, b) Stärke und c) Parallelität
des unteren Distanzrahmens 109, d) Stärke und e) Parallelität der Unterplatte 303c,
f) Höhe der Abstandhalter 106, g) Stärke und h) Parallelität der Oberplatte 302,
i) Stärke und j) Parallelität der Eisenplatte 110, k). Stärke und 1) Parallelität
des oberen Distanzrahmens 111, m) Stärke und n) Parallelität des Sperrahmens 112,
o)-Parallelität der Oberkante der Nut 107.
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2. Die Unterplatte wird auf dem rundumlaufenden Boden 105 eher ungenau
aufliegen als auf zwei sich gegenüberliegenden Leisten.
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3. Die Nut 107 für den Sperrahmen ist an drei Seiten angebracht, und
nicht nur an zwei, sich gegenüberliegenden Seiten. Die durch die Nut bedingte maximal
erreichbare Genauigkeit ergibt sich aus der am ungenauesten angebrachten Nut jeder
Seite.
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4. Von jeder der vier Seiten des Gestells wird Genauigkeit gefordert.
Am einfachsten wäre es, jede Seite getrennt von den anderen anzufertigen. Beim Zusammensetzen
können sich dann aber Abweichungen ergeben. Ein Gußverfahren brächte nicht die erforderliche
Genauigkeit. Das Gestell aus einem Stück anzufertigen wäre umständlich, und Form
und Funktion des Gestells würden beeinträchtigt (z. B. Lufteintritt an den Ecken,
mit der Folge, daß die Tropfen in den Ecken innerhalb weniger Stunden antrocknen).
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Es besteht ein weiterer Nachteil: Die Unterplatte liegt im Gestell
101 frei auf dem Boden und kann nach oben abgehoben werden, z. B. wenn man von unten
an sie stößt. Bei einem attenabstand unter 0,2 Millimeter kann es auch vorkommen,
daß
Adhäsionskräfte zwischen Reaktionsgemisch und Platten die Unterplatte an der Oberplatte
festhalten. Dabei können sich die Tropfen soweit ausdehnen, daß einander benachbarte
Tropfen verschmelzen.
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Im übrigen bietet die oben genannte Offenlegungsschrift keine Möglichkeit
daß in einem Gestell mehrere kleine Ob:iektträger nebeneinander inkubiert werden
können, wie es beispielsweise für Immunfluoreszenztests wünschenswert ist.
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In der vorliegenden Erfindung werden zwei verbesserte Gestelle 201
und 301 beschrieben, mit denen man den kleinsten und den größten Plattenabstand
genauer einhalten kann und die viel einfacher herzustellen und handzuhaben sind.
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Bei den Ausführungsformen 201b und 301 ist die Gefahr ausgeschaltet.
daß sich die beiden Platten zu nahe kommen.
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Mit Hilfe von Zusatzvorrichtungen (502a, 503a) können anstelle der
Platten mehrere kleine Objektträger verwendet werden.
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Der wichtigste Beitrag zur gesteigerten Präzision besteht darin, daß
die Höhen der Oberplatte und der Unterplatte durch nur zwei Profilleisten 315 und
316 bestimmt werden.
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Diese liegen sich gegenüber und begrenzen beide Platten zusammen.
mit den Banden 317 und 318 nach den Seiten (Abb. 7).
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Auf die Distanzrahmen wird verzichtet, und die Eisenplatte wird in
eine Position gebracht, in der sie den exakten Plattenabstand nicht beeinflussen
kann; sie kann jetzt auch ganz weggelassen werden.
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Es bestehen mehrere Möglichkeiten, auch ohne Distanzrahmen in ein
und demselben Gestell unterschiedliche Tropfenhöhen einzustellen. Am einfachsten
ist es, verschieden starke Unterplatten zu verwenden. Man kann auch in ein Stufengestell
verschieden lange, gleichstarke Unterplatten einlegen, die dann unterschiedlich
weit von der Oberplatte entfernt sind (Gestell 201a, Abb. 4). Die Unterplatte liegt
aber nur lose auf und kann sich der Oberplatte zu weit nähern: durch ein Versehen
oder durch Adhäsionskräfte. Das wird durch ein Gestell 201b mit seitlichen Andruckfedern
224 verhindert,
oder auch durch eine Konstruktion, bei der die Platten
durch die Vorsprünge 307a, b der Profilleisten 315, 316 sicher voneinander getrennt
sind (Gestell 301, Abb. 5 bis Abb. 8): Die von unten her eingelegte Unterplatte
303a, b oder c wird durch seitliche Andruckfedern 324 gegen die Profilkanten 305a
und b gepreßt, sie läßt sich nicht nach oben abheben. Die Oberplatte 302 wird eingelegt
und nach unten gedrückt, von Hand oder von einer magnetisch angezogenen Eisenplatte
310. Sie wird durch die Profilkanten 306a und b zurückgehalten, und der kleinstmögliche
Plattenabstand stellt sich ein. Die Tropfen werden flach: 313. Läßt man die Oberplatte
los (hohe Tropfen, 314), dann wird sie durch Distanzfedern 308 nach oben gedrückt
und auf der einen Seite des Gestells von der Profilkante 312a begrenzt, auf der
anderen Seite von den ebenen Druckflächen 322 des Feder-Verschlußbügels 319, die
sich von oben federnd gegen die Profilkante 312b schmiegen. Auf dieser Seite des
Gestells wird dadurch die Höhe der Oberplatte in dieser Lage indirekt durch die
Profilkante 312b bestimmt.
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Im Vergleich zum Gestell 101 werden beim Gestell 301 der kleinste
und der größte feste Plattenabstand nur noch beeinflußt durch a) Stärke und b) Parallelität
der die Profilkanten 305a und 306a bzw. 305b und 306b bildenden Vorsprünge 307a,
b der Profilleisten 315 und 316, c) Stärke und d) Parallelität der Unterplatte im
Bereich der Reaktionsfelder und an den höhenbestimmenden beiden Enden, e) Stärke
und f) Parallelität der Oberplatte, g) Höhe und h) Parallelität der Profilkanten
312a und b.
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Die Profilleisten 315 und 316 lassen sich vergleichsweise einfach
herstellen. Sie können mit nahezu beliebiger Genauigkeit gefräst und geschliffen
werden. Die festen Plattenabstände hängen daher beim Gestell 301 nur noch ab von
der parallelen Anordnung der beiden Profilleisten 315 und 316 zueinander und von
Stärke und Parallelität der Oberplatte und der Unterplatte.
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Eine geringfügig verzogene Unterplatte wird sogar wieder
ebenmäßig,
wenn sie etwas elastisch ist, weil sie durch die seitlichen Andruckfedern 324 gegen
die Profilkanten 305a und b gepreßt wird.
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Die für die jeweilige Analyse gewünschte Tropfenhöhe wird beim Gestell
301 durch die Stärke der Unterplatte vorgegeben, z. B. 303a, b oder c.
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Die Abb. 7 zeigt die Profilleisten 315, 316, die Banden 317, 318 und
den Feder-Verschlußbügel 319 vor der Endmontage des Gestells 301. Die vorzugsweise
aus Aluminium bestehenden Teile werden im Bereich der schraffiert dargestellten
Flächen beispielsweise zusammengeklebt, verlötet oder verschraubt.
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Der Feder-Verschlußbügel wird am einen Ende 320 über ein Scharnier
325 an der Bande 317 befestigt, am anderen Ende 321 trägt er eine Rastung, die,
zusammen mit einem Kugelschnäpper 323 der Bande 318, seine Stellung sichert, wenn
er die Oberplatte einschließt. Die Druckflächen 322 des Feder-Verschlußbügels halten
die von den Distanzfedern 308 nach oben gedrückte Oberplatte genau in Höhe der Profilkanten
312b zurück.
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In Abb. 8 sind Querschnitte der Profilleisten 315 und 316 dargestellt,
links im Bereich einer die Oberplatte nach oben drückenden Distanzfeder 308, rechts
im Bereich einer seitlichen Andruckfeder 324, die die Unterplatte nach oben preßt.
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Abb. 9 zeigt einen Rahmen 401, mit dem das Mikroskopieren einer Oberplatte
302 erleichtert wird: Die Oberplatte wird in den Rahmen gelegt und ein Deckglas
gleicher Länge und Breite darüber. Beide verrutschen nicht gegeneinander.
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Kleine Mengen Eindeckflüssigkeit (gegebenenfalls zwischen Oberplatte
und Deckglas) oder Immersionsöl werden vom Rahmen zurückgehalten und gelangen nicht
auf den Kreuztisch des Mikroskops, wo sie das Verschieben der Platte erschweren
könnten.
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Für manche Analysen möchte man nicht eine große Oberplatte 302, sondern
einen oder mehrere kleine hydrophil-hydrophob beschichtete ObJektträger 502b verwenden.
Dazu könnte man mehrere Objektträger auf eine normale Oberplatte kleben. In Abb.
10 a und b ist eine Zusatzvorrichtung dargestellt, die es
ermöglicht,
daß ObJektträger auch lose eingelegt werden können: Anstelle einer Oberplatte wird
ein oberer Objektträgerhalter 502a in das Gestell 301 gelegt. Er bietet vier Objektträgern
502b Platz. Die dazugehörige Unterplatte (unterer Objektträgerhalter 503a) trägt
erhabene Flächen 503b, z. B. aufgeklebte Ob3ektträger, die in die Aussparungen 502c
des oberen Objektträgerhalters ragen. Mit dieser Modifikation der Oberplatte und
der Unterplatte kommt man auch ohne ein Gestell 301 aus, wenn die Reaktionsgemische
während der Analyse nicht gemischt werden müssen.
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Einige Beispiele sollen die Funktionsweise des Gerätes der vorliegenden
Erfindung erläutern und zeigen, daß es für eine Vielzahl unterschiedlichster Analysen
geeignet ist.
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Der Rationalisierungsvorteil, den das Gerät für die Analytik bringt,
wird vervielfacht, wenn Proben und Reagenzien mit mehrkanaligen Transfer- oder Dispensierpipetten
dosiert werden, z. B. nach STÖCKER (Europ. Patentanm. Nr. 80105031.1).
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1. Bestimmung der Glucose-Konzentration einer Vielzahl von FlUssiskeitsSroben
in einem Weltraumlaboratorium: Durchmesser der Reaktionsfelder 4 mm, Tropfenhöhe
2 - 3 mm.
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Die Reaktionsfelder der im Gestell 301 liegenden Unterplatte 303c
werden mit je 10 /ul Reagentienlösung versehen, die Reaktionsfelder der Oberplatte
302 mit je 10 /ul einer Probe enthaltenden Lösung. Beim Auftragen muß die Auslaßöffnung
des Dosiergerätes die Reaktionsfelder berühren, die Tropfen bleiben dann an ihnen
hängen. Die Oberplatte wird, mit den Tropfen nach unten, ins Gestell gelegt. Wenn
man sie hinunterdrückt, verschmelzen die sich gegenüberliegenden Tropfen, wodurch
die Reaktionen gleichzeitig gestartet werden. Die Proben können durch rhythmisches
Verändern des Plattenabstandes mit den Reagentien gemischt werden, etwa durch einen
Elektromagneten, der die Eisenplatte 310 anzieht und losläßt. Dadurch wird die für
viele andere Analysemethoden wichtige Fehlerquelle einer von Probe zu Probe ungleichmäßigen
Konvektion und Diffusion
ausgeschaltet, und die Reaktionen laufen
schneller ab, weil sich Diffusionsgradienten nicht aufbauen können. Die Konzentration
des gebildeten Reaktionsproduktes wird photometrisch gemessen, z. B. die NADH-Konzentration
bei R der Hexokinase-Methode (Gluco-quantR der Firma Boehringer, Mannheim, Deutschland).
Als Meßgerät eignet sich ein Mikroskop-Photometer, das mit Hilfe eines automatisch
betriebenen Objektführers und eines Rechners die einzelnen Analysen mehrmals nacheinander
messen kann. Dadurch ist man in der Lage, die für die Bestimmung der Glucose-Konzentration
allgemein übliche Endpunktmessung durch die genauere kinetische Messung zu ersetzen.
Richtigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse lassen sich weiter steigern, wenn
die Analysen in einer Wärmekammer bei konstanter Temperatur durchgeführt werden.
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Die Plattenmethode eignet sich für Analysen in Weltraumlabors, einmal,
weil sie nur sehr geringe Mengen an Proben und Reagentien verbraucht, zum anderen,
weil sie im Gegensatz zur Analytik im Reagensglas ohne die Schwerkraft auskommt:
Die Adhäsionskraft reicht aus, um die Flüssigkeit an ihrem Platz zu halten.
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2. Gleichzeitige reflexionsphotometrische Messung der HSmo£lobin-Konzentration
einer Vielzahl von Harnproben mit an eine feste OberflEche gebundenen Reagentien-Durchmesser
der Reaktionsfelder 1 mm, Tropfenhöhe 1 - 2 mm.
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In das Gestell 301 wird eine Unterplatte 303b gelegt. Ihre nach oben
weisenden Reaktionsfelder sind mit einer festen Reagensschicht für den Hämoglobin-Nachweis
versehen, die so beschaffen ist, wie beispielsweise die Reagensschicht des SangurR-Teststreifens
der Firma Boehringer, Mannheim, Deutschland. Auf jedes Reaktionsfeld der Oberplatte
302 werden 2 /ul Harn pipettiert. Die Oberplatte wird, mit den Tropfen nach unten,
ins Gestell gelegt und vorUbergehend hinuntergedrückt. Dadurch kommen die Tropfen
mit der Reagensschicht der Unterplatte in Berührung. Die Konzentration des gebildeten
Produktes wird reflexionsphotometrisch
gemessen, z. B. durch ein
Mikroskop-Photometer, während beide Platten noch im Gestell liegen, oder es wird
nur die Unterplatte photometriert, nachdem die Probenflüssigkeit durch ein saugfähiges
Papier entfernt wurde.
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5. Nachweis der (Oktanol-löslichen) Koproporphvrine im Harn durch
ein vereinfachtes Extraktionsverfahren: Chemisches Prinzip: Aus essigsaurem Harn
lassen sich Koproporphyrine mit Oktanol extrahieren. Dem Oktanol werden sie wieder
durch Salzsäure entzogen.
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Für diese Untersuchung werden die Reaktionsfelder der Oberplatte
und der Unterplatte paarweise angeordnet.
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Auf das eine Reaktionsfeld der Unterplatte wird die mit Essigsäure
versetzte Harnprobe pipettiert, auf 4as andere 5 %ige Salzsäure. Die beiden gegenüberzulegenden
Reaktionsfelder der Oberplatte werden mit Oktanol betropft. Die Platten werden ins
Gestell gelegt, und die Oberplatte wird nach unten gedrUckt. Die Harnprobe und die
Salzsäure bleiben voneinander getrennt und bilden Flüssigkeitssäulen zwischen den
sich gegenüberliegenden Reaktionsfeldern der beiden Platten aus. Es wurde aber soviel
Oktanol zugegeben, daß eine Oktanolbrücke zwischen den nebeneinanderliegenden Flüssigkeitssäulen
entsteht. Während durch rhythmische Änderung des Plattenabstandes eine starke Konvektion
erzeugt wird, wandern die Koproporphyrine aus der Harnprobe über die Oktanolbrücke
in die Salzsäure, worin sie durch ultraviolettes Licht photometrisch nachgewiesen
werden können.
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Dieses einfache Verfahren ersetzt eine sehr aufwendige Untersuchungsmethode.
Aus organischen Lösungsmitteln lassen sich umgekehrt auch hydrophile Stoffe extrahieren,
wenn die Platten entsprechend beschichtet werden (Reaktionsfelder hydrophob, Umgebung
hydrophil).
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4. Gleichzeitige Bestimmung der Konzentration eines Antigens in einer
Vielzahl von Serumproben durch Laser-Nephelometrie: Durchmesser der Reaktionsfelder
4 mm, Tropfenhöhe 2 - 3 mm.
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Jedes Reaktionsfeld der im Gestell 301 liegenden Unterplatte 303c
wird mit 10 /ul einer Reagentienlösung betropft, die Antikörper gegen das zu bestimmende
Antigen enthält.
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Die Reaktionsfelder der Oberplatte 302 werden mit je 10 /ul Probenlösung
versehen. Die Oberplatte wird in das Gestell gelegt, nach unten gedrückt und dadurch
die Reaktion gestartet. Nephelometrie durch ein mit einer Laser-Lichtquelle ausgerüstetes
Mikroskop-Nephelometer. Besondere Vorteile des Verfahrens im Vergleich zu herkömmlichen
Nephelometrie-Methoden: Die Reaktionen werden gleichzeitig gestartet und nahezu
gleichzeitig gemessen. Die Reaktionspartner können während der Analysen gemischt
werden.
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Die Endpunkt-Methode kann leicht durch ein kinetisches Verfahren
ersetzt werden.
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5. Gleichzeitige~Unt~r~uchung vieler S~rumSroben nach Antikörpern
durch einen Immunfluoreszenztest: Durchmesser der Reaktionsfelder 6 mm, Tropfenhöhe
0,2 mm.
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Die Reaktionsfelder einer Oberplatte 302 werden mit Zellen oder mit
Gefrierschnitten beschichtet (z. B. Hühnererythrocyten oder Rattenniere zum Nachweis
von Antikörpern gegen Zellkerne). Auf die Reaktionsfelder der im Gestell 301 liegenden
Unterplatte 303a werden je 10 /ul Probenlösung pipettiert. Die Oberplatte wird darübergelegt,
ganz nach unten gedrückt und durch zwei Keile 326 in dieser Position festgehalten.
Die in einigen Proben vorhandenen Antikörper binden sich an die entsprechenden Strukturen
der Zellen oder der Gewebeschnitte. Nach einer bestimmten Zeit wird die Oberplatte
abgenommen und die Probenflüssigkeit von ihr abgespült. Dann wird sie in ein Pufferlösung
enthaltendes Gefäß gestellt und gewaschen.
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Für den zweiten Inkubationsschritt werden auf jedes Reaktionsfeld
einer frischen Unterplatte je 5 /ul Reaktionslösung (Fluoreszein-markierter Anti-Antikörper)
getropft, und die Reaktionsfelder der Oberplatte werden mit der Reaktionslsung inkubiert.
Danach wird die Oberplatte nochmals in Pufferlösung gewaschen und dann in einen
Rahmen
401 (Abb. 9) mit der Schichtseite nach oben gelegt.
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Darüber kommt ein Deckglas gleicher Länge und Breite, das ebenfalls
eine der Oberplatte entsprechende hydrophilhydrophobe Beschichtung aufweisen kann,
mit 5 /ul Eindeckmedium auf jedem Reaktionsfeld (Phosphat-gepuffertes Glycerin).
Beurteilung der Reaktionen unter dem Fluoreszenzmikroskop.
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Die Ergebnisse solcher Immunfluoreszenztests, bei denen auf einem
Objektträger gleichzeitig mehrere Analysen ablaufen, können dadurch verfälscht werden,
daß beim Spülen Probenflüssigkeit von einem zum benachbarten ReaktionsSeld läuft.
Diese Fehlerquelle läßt sich mit der vorliegenden Methode dadurch leicht ausschalten,
daß die einzelnen Gewebeschnitte nach der Inkubation mit der Probenlösung mehrmals
nacheinander im Gestell diskret'mit je 40 /ul frischer Pufferlösung gespült werden
(Unterplatte 303c, Tropfenabstand 2 - 3 mm).
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Durch dieses Vorgehen wird auch der Proteingehalt der Probenlösung
soweit herabgesetzt, daß beim darauffolgenden Waschen der Oberplatten im Gefäß mit
der Pufferlösung die hydrophobe Beschichtung nicht durch die darüberlaufende Flüssigkeit
hydrophilisiert wird. Würde man nach Verlust der hydrophoben Wirkung im jetzt folgenden
zweiten Inkubationsschritt die Reagenslösung auf die Reaktionsfelder der Oberplatte
tropfen, dann bliebe die Lösung nicht auf den Reaktionsfeldern, sondern verteilte
sich auf der ganzen Oberplatte. Deshalb muß bei den üblichen Immunfluoreszenztests
die Oberfläche der Objektträger zwischen den Reaktionsfeldern abgetrocknet werden,
damit sich die hydrophobe Wirkung zumindest teilweise wieder einstellt.
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Das Trocknen ist zeitraubend, und es entstehen oft erhebliche Artefakte,
weil die Schnitte dabei eintrocknen und dadurch verderben können. Beim vorliegenden
Verfahren ist dieser Schritt überflüssig: Auch wenn die ganze Oberplatte zwischen
den Reaktionsfeldern von einem Flüssigkeitsfilm überzogen wäre, käme es zu keiner
mit der hier durchgeführten
Immunfluoreszenzmethode nachweisbaren
Diffusion gelöster Stoffe von einer Analyse zur anderen, weil die Zellen oder die
Gewebe schnitte von oben in die Reaktionslösung tauchen, die von den Reaktionsfeldern
der Unterplatte fest an ihrem Platz gehalten wird. Die sich ausbildenden Flüssigkeitssäulen
erzeugen einen hydrostatischen Unterdruck im Bereich des Flüssigkeitsfilms der Oberplatte,
der dadurch so dünn wird, daß eine den Test störende Diffusion zwischen benachbarten
Analysen nicht auftreten kann.
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6. Mikrobiologische Schnelldiagnostik: Mit dem Analysengerät dieser
Erfindung kann eine Bakterienart innerhalb weniger Minuten aus einer einzigen Kolonie
durch ein biochemisches Verfahren klassifiziert werden.
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Das wird deshalb möglich, weil die Plattenmethode für die dazu erforderlichen
vielen einzelnen Reaktionen jeweils nur sehr kleine Probenmengen verbraucht.
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Es gibt mehrere Wege: a) Die fermentativen Leistungen einer Bakterienart
werden in einer unten Reihe" geprüft. Auf die Reaktionsfelder der einen Platte werden
verschiedene mit Indikatoren kombinierte Substrate gebracht, auf die gegenüberliegenden
Felder der anderen Platte wird eine Suspension der zu untersuchenden Bakterien verteilt.
Die beiden Platten werden in einem Gestell 301 übereinandergelegt.
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Dabei kommen die Bakterien in Berührung mit den Substraten. Für die
Untersuchung anaerober Bakterien kommt das Gestell mit den Platten in einen dafür
gebrauchsüblichen Behälter. Der Farbumschlag der Indikatoren erfolgt schon nach
wenigen Stunden, weil die Diffusionsstrecken sehr kurz sind und weil die Bakterien
eine nur geringe Substratmenge umzusetzen haben.
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b) Die Bakterien werden durch ein histochemisches Verfahren nachgewiesen.
Sie werden an die Reaktionsfelder der einen Platte gebunden, z. B. durch Polylysin,
und mit verschiedenen, in der Histochemie üblichen Reagentien
für
den Enzym- und Substratnachweis in Geweben inkubiert. Photometrie der einzelnen
Zellen (kinetische Methode oder Endpunktmessung) oder mikroskopische Beurteilung
durch einen Mikrobiologen.
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c) Die Enzyme und andere biochemische oder chemische Bausteine der
suspendierten Bakterien werden freigesetzt und ihre Aktivität oder Konzentration
durch bekannte kinetische oder Endpunkt-Meßverfahren bestimmt.
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Auf die Reaktionsfelder der einen Platte werden die beispielsweise
durch Ultraschall lysierten Bakterien gebracht, auf die der anderen Platte die entsprechenden
Reagentien. Photometrie vgl. Beispiel 1.
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ABBILDUNGEN 1. Oberplatte 302.
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2. Unterplatte 303 für Analysen mit a) 0,2 - 1,2 mm hohen Tropfen,
b) 1,0 - 2,0 mm hohen Tropfen, c) 2,0 - 3,0 mm hohen Tropfen.
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3. Gestell der OS 0 018 435, Europ. Patentblatt 1980/23 (Gestell 101):
a) uebersicht, b) Anordnung der Platten und Rahmen.
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4. Stufengestell 201 für Analysen mit unterschiedlicher Tropfenhöhe:
1,0 - 2,0 mm und 2,0 - 3,0 mm: a) mit freiliegender Unterplatte, b) mit durch Federn
fixierter Unterplatte.
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5. Gestell 301 mit fixierter Unterplatte 303b, Tropfenhöhe 1,00 -
2,00 mm.
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6. Gestell 301 mit fixierter Unterplatte 303a, Tropfenhöhe 0,20 -
1,20 mm.
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7. Gestell 301 vor der Endmontage.
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8. Querschnitt durch die Profilleisten 315 und 316 des Gestells 301:
links im Bereich einer Distanzfeder 308 für die Oberplatte, rechts im Bereich einer
seitlichen Andruckfeder 324 für die Unterplatte.
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9. Rahmen 401 zum Mikroskopieren der Oberplatten 302.
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10. Zusatzvorrichtung zur Verwendung mehrerer Objektträger anstelle
einer Oberplatte 302 im Gestell 301: Halterung 502a für vier Objektträger, ein Objektträger
502b, Unterplatte 503a; a) perspektivisch dargestellt, b) im Detail gezeichnet.
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