DE2005543A1

DE2005543A1 - Obj ektivträger

Info

Publication number: DE2005543A1
Application number: DE19702005543
Authority: DE
Inventors: Don Phillip; Sorrentino James Vincent; Stroudsburg Pa. Metzgar (V.St.A.). P A611
Original assignee: Richardson Merrell Inc
Current assignee: Richardson Vicks Inc
Priority date: 1969-02-10
Filing date: 1970-02-06
Publication date: 1970-08-27
Also published as: ES376407A1; BR6915183D0; BE745667A; FR2033318A1; FR2033318B1; NL7001767A; DE7004220U; GB1248193A; US3572892A

Description

DR. ING. E. HOFFMANN · DIPL. ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN

PATENTANWÄLTE

D-BOOO MÖNCHEN 81 · ARABELLASTRASSE 4 · TELEFON (0811) 911087 2005543

Richardson-Merrell Inc., New York, N.Y./USA Objektivträger

Die Erfindung betrifft einen Objektivträger mit mehreren Vertiefungen für Gewebekulturen. Insbesondere betrifft sie einen Objektivträger für Gewebekulturen mit mehreren Vertiefungen, auf denen sich fixierte, zusammenhängende, virusinfizierte Zellen von Gewebekulturen befinden, die für eine rasche Diagnose von Viruskrankheiten mittels der floureszierenden Antikörpertechnik verwendet werden können.

Die Entdeckung und Identifizierung von Viren und Bakterien mittels der fluoreszierenden Antikörpertechnik ist zwar äußerst zuverlässig, erfordert aber beträchtliche Zeit und Mühen, um die für den Test benötigten Reagenzien und Gewebe vorzubereiten. Solche Tests werden in etwa wie folgt durchgeführt: Zellen von Gewebekulturen der erforderlichen Art und

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Spezies werden auf eine Kulturfläche oder -gefäß, wie z.B. eine Petrischale, einen Objektivträger oder -deckstreifen aufgebracht. Nach einer ausreichenden Inkubationsperiode, in welcher die Zellen auf der Kulturfläcne anwachsen, werden die Zellen mit einem bestimmten Virusträger infiziert. Nach einer zweiten Inkubationsperiode, in der sicn der Virusträger vervielfältigt, wird das Kulturgefäß aus dem Inkubator entnommen, die Zellen werden mit einem geeigneten Fixativ fixiert und dann getrocknet. Diese Zellen dienen dann als Unterlage für den Test mittels der fluoreszierenden Antikörpertechnik, wie er nach dem Stand der Technik allgemein durchgeführt wird. Die Gefäß mit fixierten, infizierten Gewebekulturen werden in einer Vielzahl vorbereitet. Wenn Serumverdünnungen verwendet werden sollen, muß für jede Verdünnung je eine Kultur in einer Petrischale, einem Objektivträger oder einem Deckstreifen vorbereitet werden. Wenn mehr als eine Serumprobe verwendet werden soll, erfordert dies eine Vielzahl von Kulturen. Jede Kultur wird dann mit einer Verdünnung des Serums des Patienten oder des Tieres behandelt. Das Serum muß dann 15 bis 50 Minuten in Kontakt mit der Kultur verbleiben. Diese wird dann in einem geeigneten Verdünnungsmittel gespült, um das überflüssige Serum zu entfernen. Die Kultur wird dann 15 bis 30 Minuten mit einem mit Fluoreszin konjugierten homologen Antiserum behandelt. Dieses Antiserum ist gewöhnlich Gammaglobulin. Jede Kultur wird gespült, um den überflüssigen, mit Fluoreszin konjugierten Stoff zu entfernen, und wird dann getrocknet.

Nach dem Trocknen wird die Kultur mikroskopisch untersucht, und zwar mit einem Fluoreszenz-Mikroskop. Eine positive Diagnose wird durch das Auftreten einer bestimmten Fluoreszenz in der behandelten Kultur angezeigt.

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Die Anwendung der oben beschriebenen Fluoreszenztechnik ist gut bekannt. Sie ist beschrieben durch (a) Coons, A.H., International Rev. Cytol,5:1-23, 1956; (b) Coons, A.H., In General Cytological Methods, New York Academic Press, 1958, Volume I; (c) Liu, C, Ergebn, Mikrob. Immunforsch.33;242, I960; und (d) Fluorescent Antibody Techniques, Public Health Serive Publication No. 729 (i960) U.S. Gov. Printing Office.

Obwohl die fluoreszierende Antikörper verwendende Technik viele Vorteile hat, kann sie eine zeitraubende und mühsame Arbeit sein. So erfordert ein Test, bei dem υ Serumverdünnungen nötig sind, eine Gesamtzahl von 12 verschiedenen Kulturen in Petr!schalen, Mikrokopdeckstreifen oder Objektivträgern. Jede einzelne muß vorbereitet, behandelt, gespült, getrocknet und geprüft werden.

Der erfindungsgemäße Objektivträger für Gewebekulturen mit mehreren Vertiefungen besteat aus einer transparenten ebenen Platte mit Vertiefungen auf der oberen Fläche. Die die einzelnen Vertiefungen begrenzenden Wände bestehen aus einer öffnung, die sich vom oberen Rand der Vertiefung bis zu ihrem Boden ninzieht, und zwar in der Nähe einer Kante der Platte, um das Abfließen der Flüssigkeiten von letzterer zu vereinfachen. Die Bodenfläcne der Platte ist im wesentlichen eben und vorzugsweise ist auch die Bodenfläcne der Vertiefungen eben und erstreckt sich im wesentlichen parallel zur Plattenunterseite.

Durch Anwendung der Erfindung sind auf einem einzigen Objektivträger alle grundlegenden Materialien vorhanden, die benötigt werden, um die Technik der fluoreszierenden Antikörper durchzuführen. Durch diese Erfindung kann die zur Durchführung

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solcher diagnostischer Versuche benötigte Gesamtzeit, incl. Vorbereitungsarbeit, von 7 bis 14 Tagen auf höchstens 2 Stunden reduziert werden. Mit dem erfindungsgemäßen Objektivträger für Gewebekulturen mit mehreren Vertiefungen, kann ein vollständiger Test, der 6 oder auch mehr Verdünnungen erfordert, auf einem einzigen Träger durchgeführt werden. Dadurch entfällt das Bearbeiten von einer Vielzahl von Kulturen und die Notwendigkeit einer individuellen mikroskopischen Untersuchung vieler Kulturen. Der Objektivträger mit vielen Vertiefungen kann in einem mikroskopischen Arbeitsgang geprüft wer-

Jeder in einer Gewebekultur züchtbare Virusträger kann mit dieser Erfindung verwendet werden. Durch Vorbereitung eines Gestells, auf dem sich Objektivträger mit einer Reihe fixierter, mit einem Virus oder einer Gruppe von Viren infizierter Zellen befinden, steht dem Arzt, dem Laboratorium oder Institut ein rasches und spezielles Mittel zur Anwendung für die Diagnose von Virus-Krankheiten zur Verfügung.

Weitere Einzelheiten der Erfindung sollen anhand eines Beispiel näher erläutert und beschrieben werden, wobei auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen ist.

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht des Trägers von oben und von den Seiten;

Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht des Trägers der Fig.l von oben und von den Seiten, mit einer zusammenhängenden Schicht virusinfizierter Gewebekulturzellen in jeder Vertiefung, und

Fig. 3 ist eine perspektivische Ansicht des Bodens und der Seiten des Trägers von Fig. 1.

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Der Objektivträger IO ist eine rechteckige Platte, die aus einem flachen Stück Glas oder anderem transparenten Material, wie z.B. Kunstharz, z.B. Polystyrol, besteht. Der Träger 10 hat zwei lange, parallel zueinander laufende Seiten oder Kanten 12-12 und im rechten Winkel zu den langen Seiten 12-12 stehende kurze Seiten oder Kanten 14-14. Jede Seite 12 ist 90 mm lang. Jede kurze Seite 14 hat eine Breite von 25 mm. Eine Längsrippe 16 mit einer Breite von 5 mm und Querrippen 18 mit einer Breite von 2 mm begrenzen im Verein mit Erhebungen längs der kurzen Seiten 14-14 dazwischenliegende quadratische Vertiefungen 20. Die Oberflächen der Rippen 16 und 18 und die Erhebungen an den kurzen Seiten 14-14 liegen alle in der gleichen Ebene und parallel zur Unterseite des Trägers 26. Die Dicke des Trägers, gerechnet von den Oberflächen der Rippen bis zur Trägerunterseite 26, beträgt 1 mm. Die Wände umschließen drei Seiten jeder Vertiefung 20. Diese Vertiefungen sind 0,5 mm tief, und jede Wand 24 einer Vertiefung hat eine Länge von 10 mm. Die Vertiefungen sind in der Nähe der Kante 12 von oben bis zum Boden der Vertiefungen durchgehend offen. Die Unterseite 26 des Objektivträgers 10 ist eben und erstreckt sich parallel zum Boden 22 der Vertiefungen 20. In Fig. 2 enthält jede der Vertiefungen 20 eine fixierte, zusammenhängende virusinfizierte Gewebekultur 28, die an der Bodenfläche 22 der Vertiefungen angewachsen ist. Die kurzen Seiten 14-14 bilden an jedem Ende des Trägers Wände von 10 mm Breite für eine Seite der Vertiefungen. Auf dem Träger sind für jede Reihe von Vertiefungen die Bezeichnungen A und B und zusätzlich auf den Rippen 16 zwischen den sich gegenüberliegenden Vertiefungen die Nummern 1 bis 6 angebracht, so daß durch Angabe eines Buchstabens und einer Nummer jede Vertiefung bezeichnet werden kann.

Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung weiterhin zu erläutern.

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Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Anwendung des Objektivträger mit mehreren Vertiefungen für Gewebekulturen gemäß Pig. 1.

(A) Ein einziger Objektivträger mit mehreren Vertiefungen, wie er in Pig. 1 gezeigt ist, wird für das zu untersuchende Serum des Patienten vorbereitet. Der Träger wird in ein Kulturgefäß, das eine Nährlösung für die zu verwendenden Zellen enthält, vollständig eingetaucht. In diesem Falle wurden menschliche diploide W-38-Zellen verwendet. Wi-38-Zellen werden auf dem Träger aufgebracht, der den Objektivträger bedeckt. Nach einer stationären Inkubationszeit von 4 bis 5 Tagen bei 35°C bis 37°C wird die in mehreren Vertiefungen befindliche Kultur durch Einimpfung des Adenovirus Typ 1 in den Kulturträger infiziert.

(B) Der mit einem Virus infizierte Objektivträger mit mehreren Vertiefungen wird aus der Nährlösung entnommen, 10 Minuten lang mit Aceton fixiert und dann getrocknet.Die Kultur wird auf allen Flächen der Platte befestigt. Die Kultur wird von der Platte gewischt, aber nicht vom Boden der Vertiefungen 22, wie bei 28 in Fig. 2 gezeigt. Jetzt enthält jede Vertiefung eine zusammenhängende Schicht fixierter Wi-38-Zellen, die mit dem Adenovirus Typ 3 infiziert sind.

(C) Dem zu heilenden Patienten, bei dem der Adenovirus Typ 3 als Krankheitsursache vermutet wird, wird Serum entnommen. Es werden Verdünnungen des Serums des Patien ten vorbereitet, und jede Vertiefung wird mit ungefähr 0,1 ml einer der Verdünnungen bedeckt. Eine Reihe von Vertiefungen, z.B. Reihe A der Fig. 2, die Verdünnungen des Kontrollserums (des normalen Serums) erüiält, und

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eine andere Reihe, z.B. die Reihe B der Fig. 2, die Vertiefungen mit dem Serum des Patienten enthält, werden vorbereitet, verdoppelte Verdünnungen im Verhältnis von 1 : 2, 4, 8, 16 und 32 werden vorbereitet.

(D) Die in mehreren Vertiefungen befindliche Kultur wird dann für 15 bis 30 Minuten bei 35 bis 37⁰C in eine Befeuchtungskammer eingeführt, und dann bei pH 7,2 mit einer mit 0,02 molaren phosphatgepufferten Salzlösung gespült, um das überschüssige Serum zu entfernen.

(E) Dann wird jede Vertiefung mit einem mit Floureszein markierten konjui'gerten Antiserum für das im Serum des Patienten enthaltene Gammaglobulin überschichtet. Dieses markierte konjugierte Antiserum ist im Handel erhältlich. Es wird auf der zusammenhängenden Schicht in einer Befeuchtungskammer 30 Minuten lang bei 35 bis 37⁰C adsorbiert und wie oben mit dem Phosphatpuffer gespült.

(F) Die in mehreren Vertiefungen befindliche Kultur wird dann in einem Fluoreszenzmikroskop auf das Vorhandensein einer bestimmten Fluoreszenz mikroskopisch untersucht. Im positiven Falle fluoresziert das Präparat grün, im negativen Falle tritt keine Fluoreszenz auf, wie im Falle des normalen Serums.

Der obige Test wird mit einem einzigen Träger durchgeführt und in einem einzigen Vorgang mikroskopisch beobachtet. Das normale Sirum und das verdächtigte Serum befinden sich Seite an Seite und gestatten eine gleichzeitige Beobachtung.

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- 8 - Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt einen Test zur Bestimmung des Vorhandenseins des Adenovirus-Antikörpers im Serum eines Patienten.

Ein Gestell mit 8 Trägern, wie sie in Fig. 2 gezeigt sind, wird dem Arzt oder Laboratorium übergeben. Auf jedem Träger befindet sich eine Gewebekultur zusammenhängender Zellen, die mit einem anderen Adenovirus-Typ infiziert ist, welcher, wie k in Beispiel 1 Absatz (A) und(B) beschrieben, fixiert ist. In diesem Falle jedoch handelt es sich um den Adenovirus der Typen 1, 2, 5, J), k, 7, 14 und 21. Der Arzt behandelt jeden Träger mit verdächtigem menschlichen Serum und mit normalen Serum, wie in Paragraph (C) des Beispiels 1 beschrieben. Durch Wiederholung des übrigen Verfahrens des Beispiels 1 kann innerhalb von ungefähr 2 Stunden bestimmt werden, ob einer der unter das Mikroskop gebrachten Adenovirus-Typen bei der Krankheit des Patienten eine Rolle spielt.

Der erfindungsgemäße, neuartige Träger kann anstatt für eine Diagnose von Virus-Antikörpern auch für andere diagnostische Tests mit einem fluoreszenzempfindlichen Mikroskop Ver- ^ wendung finden, wie z.B. zur Diagnose von Bakterienkrankheiten.

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Claims

Patentansprüche

Q/. Objektivträger mit mehreren Vertiefungen für Gewebekulturen, bestehend aus einer ebenen Platte transparenten Materials, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von Vertiefungen (20) auf der Oberfläche der Platte, die an einer Seite in der Nähe einer Kante der Platte eine öffnung haben, die sich von der oberen Seite bis zum Boden der Vertiefung erstreckt, und durch eine ebene, gegenüber den Vertiefungen liegende Unterseite (26) der Platte.

2. Objektivträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Böden (22) der Vertiefungen (20) eben sind und in einer parallel zur Unterseite (26) des Trägers laufenden Ebene liegen.

5. Objektivträger nach Anspruch 1 oder 2, gekennzei chn e t durch Rippen (16), die auf der Oberfläche der Platte nach oben vorspringen und einteilig mit der Platte ausgebildet sind, und die die voneinander abgesetzten Vertiefungen (20) begrenzen, und einen größeren Bereich der Vertiefungen umschließen.

4. Objektivträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte rechteckig ist, und daß getrennte Reihen von Vertiefungen auf der Oberfläche der Platte in der Nähe der langen Seiten der Platte ausgebildet sind.

5. Objektivträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß an der Bodenfläche der Vertiefungen fixierte, zusammenhängende Schichten von virusinfizierten Zellen befestigt sind.

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