DE2005543C - Objektträger - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Objektträger aus einer rechteckigen, planparallelen Platte transparenten Materials mit mehreren Vertiefungen für Gewebekulturen.

Die Entdeckung und Identifizierung von Viren und Bakterien mittels der fluoreszierenden Antiköipertechnik ist zwar äußerst zuverlässig, erfordert aber beträchtliche Zeit und Mühen, um die für den Test benötigten Reagenzien und Gewebe vorzubereiten. Solche Tests werden in etwa wie folgt durchgeführt: Zellen von Gewebekulturen der erforderlichen Art und Spezies werden auf eine Kulturfläche oder -gefäß, wie z. B. eine Petrischale, einen Objektträger oder ein Deckglas aufgebracht. Nach einer ausreichenden Inkubationsperiode, in welcher die Zellen auf der Kulturfläche anwachsen, werden die Zellen mit einem bestimmten Virusträger infiziert. Nach einer zweiten Inkubationsperiode, in der sich der Virusträger vervielfacht, wird das Kulturgefäß aus dem Inkubator entnommen, die Zellen werden mit einem geeigneten Fixativ fixiert und dann getrocknet. Diese Zellen dienen dann als Unterlage für den Test mittels der fluoreszierenden Antikörpertechnik, wie er nach dem Stand der Technik allgemein durchgeführt wird. Die Gefäße mit fixierten, infizierten Gewebekulturen werden in einer Vielzahl vorbereitet. Wenn Scrumverdünnungen angewendet werden sollen, muß für jede Verdünnung je eine Kultur in einer Petrischale, einem Objektträger oder einem Deckglas vorbereitet werden. Wenn mehr als eine Serumprobe verwendet we^rden soll, erfordert dies eine Vielzahl von Kulturen. J' Kultur wird dann mit einer Verdünnung des Serum*·· des Patienten oder des Tieres behandelt. Das Serum muß dann 15 bis 30 Minuten in Kontakt mit ώ:τ Kultur vcrbleiben. Diese wird dann in einem geeigneten Verdünnungsmittel gespült, um das überflüssige Serum zu entfernen. Die Kultur wird dann 15 bis 30 Minuten mit einem mit Fluorescein konjugierten homologen Antiserum behandelt. Dieses Antiserum ist to gewöhnlich Gammaglobulin. Jede Kultur wird gespült, um den überflüsFigen, mit Fluorescein konjugierten Stoff zu entfernen, und wird dann getrocknet.

Nach dem Trocknen wird die Kultur mikroskopisch untersucht, und zwar mit einem Fluoreszenz-Mikroskop. Eine positive Diagnose wird durch das Auftreten einer bestimmten Fluoreszenz in der behandelten Kultur angezeigt.

Die Anwendung der oben beschriebenen Fluoreszenztechnik ist gut bekannt. Sie ist beschrieben durch (a) A. H. C'oons, International Rev. Cytol, 5:1-23, 1950; (b) A. H. Coons, In General Cytological Methods, New York Academic Press, 1958, Volume f; (c) C. Liu, Ergebn. Mikrob. Immunforsch , 33/242, 1%(): und (d) Fluorescent Antibody Techniques, Public Health Service Publication No. 729 (1%6), V. S. Oov. Printing Office.

Obwohl die fluoreszierenden Antikörper verwendende Technik viele Vorteile hat, kann sie eine zeit raubende und mühsame Arbeit sein. So erfordert ein Test, bei dem 6 SerumverdUnnungen nötig sind, eine Gesamtzahl von 12 verschiedenen Kulturen in Petri- »chalen, Deckgläsern oder Objektträgern. Jede einzelne muß vorbereitet, behandelt, gespült, getrocknet und geprüft werden.

Demgegenüber ist der crnndungsgemaßc Objektträger durch eine Vielzahl voneinander getrennter Vertiefungen in der Oberfläche der Platte, wobei die Vertiefungen an einer Seite einer Längskante der Platte eine öffnung haben, die sich von der oberen Seite bis zum Boden der Vertiefung erstreckt, gekennzeichnet.

Nach einer hevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Böden der Vertiefungen eben und verlaufen parallel zur Unter-/Oberseke des Objektträgers.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausfühiungsform der Erfindung sind Rippen vorgesehen, die auf der Oberfläche der Platte nach oben vorspringen und einteilig mit der Platte ausgebildet s^: Λ.

Schließlich sind nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung getrennte Reihen von Vertiefungen in der Oberfläche der Platte entlang der Längskanten vorgesehen.

Durch Anwendung der Erfindung sind auf einem einzigen Objektträger alle grundlegenden Materialien voihanden. die benötigt werden, um die fluoreszierende Antikörper-Technik durchzuführen. Durch diese Erfindung kann die zur Durchführung solcher diagnostischer Versuche benötigte Gesamtzeit, inklusive Vorbereitungsarbeit, von 7 bis 14 Tagen auf höchstens 2 Stunden reduziert werden. Mit dem erfindungsgemäßen Objektträger für Gewebeku'.turen mit mehreren Vertiefungen, kann ein vollständiger Test, der 6 oder auch mehr Verdünnungen erfordert, auf einem einzigen Träger durchgeführt werden. Dadurch entfällt das Bearbeiten von einer Vielzahl von Kulturen und die Notwendigkeit einer Individuellen mikroskopischen Untersuchung vieler Kulturen. Dei Ob .ktträger mit vielen Vertiefungen kann in einem mikroskopischen Arbeitsgang geprüft werden.

Jeder in einer Gewebekultur züchtbarc Virusträger kann mit dieser Erfindung verwendet werden. Durch Vorbereitung eines Gestells, °uf dem sich Objektträger mit einer Reihe fixierter, mit einem Virus oder einer Gruppe von Viren infizierter Zellen befinden, steht dem Arzt, dem Laboratorium oder Institut ein rasches und spezielles Mittel zur Anwendung für die Diagnose von Virus-Krankheiten zur Verfügung.

Weitere Einzelheiten der Erfindung sollen an Hand eines Beispiels näher erläutert und beschrieben werden. wobei auf die Zeichnungen Bezug g ..ommcn ist.

Fig. I ist eine perspektivische Ansicht des Objektträgers von oben und von den Seiten;

Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht des Objektträgers der Fig. I von oben und von den Seiten, mit einer zusammenhängenden Schicht virusinfizierter Gewebckulturzellen in jeder Vertiefung, und

Fig. 3 ist eine perspektivische Ansicht des Bodens und der Seiten des Objektträgers von Fig. 1.

Der Objektträger 10 ist eine rechteckige Platte, die aus Einern flachen Stück Glas oder anderem transparenten Material, wie z. B. Kunstharz, z. B. Polystyrol, besteht. Der Objektträger 10 hat zwei lange, parallel zueinander laufende Seiten oder Kanten 12-12 und im rechten Winkel zu den langen Seiten 12Ί2 stehende kurze Seiten oder Kanten 14-14. Jede Seite 12 ist 90 mm lang. Jede kurze Seite 14 hat eine Breite von 25 mm. Eine Längsrippe 16 mit einer Bruits von 5 mm und Querrippen 18 mit einer Breite von 2 mm begrenzen im Verein mit Erhebungen längs der kurzen Seiten 14-14 dazwischenliegende quadratische Vertiefungen 20. Die Oberflächen der Rippen IA und 18 und die Erhebungen an den kurzen Seiten 14-14 liegen alle in der gleichen Ebene und parallel zur Unterseite des Objektträgers 26. Die Dicke des

Objektträgers, gerechnet von den Oberflächen der Rippen bis zur Objektträgeriinterseite 26, beiragt mm. Die Wände umschließen drei Seiten jeder Vertiefung 2(1. Diese Vertiefungen sind 0,5 mm tief, und jede Wand 24 einer Vertiefung hat eine Länge von Hl mm. Die Vertiefungen sind in der Nähe der Kante von oben bis zum Boden der Vertiefungen durchgehend olT_\n. Die Unterseite 26 des Objektträgers 10 ist eben und erstreckt sich parallel zum Roden 22 der Vertiefungen 20. In F i g. 2 enthalt jede der Verliefun- ger, 20 eine fixierte, zusammenhängende virusinfi/.icrte (iewehekultur 28, die an der Bodenfläche 22 der Verliefungen angewachsen ist. Die kurzen Seiten 14-14 bildi-n an jedem Ende des Objektträgers Wände von Kimm Breite für eine Seite der Vertiefungen. Auf dem Objektträger sind für jede Reihe von Vertiefungen die Bezeichnungen A und B und zusätzlich auf den Rippen 16 zwischen den sich gegenüberliegenden Vertiefungen die Nummern 1 bis 6 angebracht, so d;:ß durch Angabe eines Buchstabens und einer Nummer jede Vertiefung bezeichnet werden kann.

Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung weiterhin zu erläutern.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Anwendung des Obiekt-Irligers mit mehreren Vertiefungen für Gewebekulluren gemäß Fig. 1.

(A) Bn einziger Objektträger mit mehreren Vertiefungen, wie er in Fig. 1 gezeigt ist, wird für das zu untersuchende Serum des Patienten vorbereitet. Der Objektträger wird in ein Kulturgcfäß. daß eine Nährlösung für die zu verwendenden Zellen enthält, vollständig eingetaucht. In diesem Falle wurden menschliche diploide Wi-38-Zellip. verwendet. Wi-38-Zellen werden der Nährlösung zugesetzt, die den Objektträger bedeckt. Nach einer stationären Inkubationszeit von 4 bis 5 lagen bei 35 bis 37 C wird die Kultur durch Einimpfung von Adenovirus Typ 3 in den Kulturträger infiziert.

(H) Der mit einem Virus infizierte Objektträger mit mehreren Vertiefungen wird aus der Nährlösung entnommen, 10 Minuten lang mit Aceton fixiert und dann getrocknet. Die Kultur befindet sich auf allen Flächen der Platte. Die Kultur wird von der Platte gewischt, aber nicht vom Boden der Vertiefungen 22, wie bei 28 in Fig. 2 gezeigt. Jetzt enthält jede Vertiefung eine zusammenhängende Schicht fixierter Wi-38-Zcllen. die mit Adenovirus Typ 3 infiziert ist.

(C) Dem Patienten, bei dem der Adenovirus Typ 3 als Krankheitsursache vermutet wird, wird Serum entnommen. Es werden Verdünnungen des Serums des Patienten vorbereitet, und jede Ver tiefung wird mit ungefähr 0,1 ml einer der Verdünnungen bedeckt. Eine Reihe von Vertiefungen, z.B. Reihe A der Fig. 2, die Verdünnungen des .vontrollserums (des normalen Serums) enthält, und eine andere Reihe, z. B. die Reihe B der Fig. 2, die Vertiefungen mit dem Serum des Prlientcti enthält, werden vorbereitet, verdoppelte Verdünnungen im Verhältnis von 1 : 2, 4, 8, 16 und 32 werden vorbereitet.

(D) Die in mehreicr, Vertiefungen befindliche Kultur wird dann für 15 bis 30 Minuten bei 35 bis 37'C in eine Befeuchtungskammer eingeführt. und dann bei pH 7,2 mit einer mit 0,02 molaren phosphatgepulferten Salzlösung gespült, um das überschüssige Serum zu entfernen.

(E) Dann wird- jede Vertiefung mit einem mit Fluorescein markierten konjugierten Anliserum für das im Serum des Patienten entlultcm· Gammaglobulin überschichtet. Dieses markierte konjugierte Anliserum ist im Handel erhältlich. Es wird auf der zusammenhängenden Schicht in einer Befeuchtungskammer 30 Minuten lang bei 35 bis 37 C adsorbiert und wie oben mit dem Phosphatpuffer gespült.

(F) Die in i. chreren Verliefungen befindliche Kultur wird dann in einem Fluoreszenzmikroskop auf das Vorhandensein einer bestimmten Fluoreszenz mikroskopisch untersucht. Im positiven Falle fluoresziert das Präparat grün, im negativen Falle tritt keine Fluoreszenz auf. wie im Falle des normalen Serui.is.

Der obige Test wird mit einem einzigen Objektträger durchgeführt und in einem einzigen Vorgang mikroskopisch beobachtet. Das normale Serum und ddS verdächtige Serum befinden sich Seile an Seite und gestatten üne gleichzeitige Beobachtung.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt einen Test zur Bestimmung des Vorhandenseins des Adeiunirus-Antikörpers im Serum eines Patienten.

Ein Gestcl! mit 8 Objektträgern, wie sie in F i g. 2 gezeigt sind, wird dem Arzt oder Laboratorium übergeben. Auf jedem Objektträger belindet sieh eine Gewebekultur zusammenhängender Zellen, die mit einem anderen Adcnovirus-Typ infiziert ist. welcher. wie in Beispiel 1. Absatz (A) und (B; beschrieben. fixiert ist. In diesem Falle jedoch handelt es sich um den Adenovirus der Typen I. 2, 5. 3. 4. 7. 14 und 21. Der Arzt behandelt jeden Objektträger mil dem verdächtigen menschlichen Serum und mit normalem Serum, wie in Abschnitt (C) des Beispiels I beschrieben. Durch Wiederholung des übrigen Verfahrens des Beispiels 1 kann innerhalb von ungefähr 2 Stunden bestimmt werden, ob einer der unter das Mikroskop gebrachten Adcnosirus-Typen bei der Krankheit des Patienten eine Rolle spielt.

Der erfindungsgemäße, neuartige Objektträger kann anstatt für eine Diagnose von Virus-Antikörpern auch für andere diagnostische Tests mit einem Fluoreszenz-Mikroskop Verwendung linden, z. B. zur Diagnose von Bakterienkrankheiten.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Objektträger aus einer rechteckigen, planparallelen Platte transparenten Materials mit mehreren Vertiefungen für Gewcbekulluren, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von einander getrennter Vertiefunger- (20) in der Oberfläche der Platte, wobei die Vertiefungen an einer Seite einer Längskante (12) der Platte eine Öffnung !iahen, die sich von der oberen Seile bis zum Boden (22) der Vertiefung erstreckt.

2. Objektträger nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die Böden (22) der Vertiefungen (20) eben sind und parallel zur Unter- Ober seite des Objektträgers verlaufen.

3. Objektträger nach Anspruch I oder 2. ge kennzeichnet durch Rippen (16). die auf der

Oberfläche der Platte nach oben vorspringen und einteilig mit der !'latte ausgebildet sind.

4. Objekttiriigcr nach Anspruch I. 2 oder 3, gekennzeichnet durch getrennte Reihen von Vertiefungen in der Oberfläche der Platte entlang der I.iingskantcn (12).

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen