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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zählen von Zellkolonien auf einem
festen Träger.
Zudem wird in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Quantifizierung
einer Zellmigration bereitgestellt.
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Bösartige
Krebserkrankungen stellen in den westlichen Ländern mit einer Inzidenz von
400 pro 100.000 Einwohner die zweithäufigste Todesursache dar. Für den Verlust
der Wachstumskontrolle in Tumorzellen sind einerseits Wirtsfaktoren,
andererseits Umweltfaktoren verantwortlich. Das Zusammenspiel der
beiden führt
zu weiteren genetischen Veränderungen
der Zelle, die sich über
Zwischenstufen schließlich
zu einer jeglicher Wachstumskontrolle entzogenen Krebszelle entwickelt.
Tumorzellen fehlt häufig
die Fähigkeit
zur Kontaktinhibition und zu stabilen Zell-Zell-Verbindungen, sie zeigen erhöhte Zellmotilität sowie
die Fähigkeiten zu
invasivem Wachstum und zur Metastasierung. Die Invasion und die
Metastasierung sind die beiden Vorgänge, die Krebs häufig zu
einer tödlichen
Krankheit machen. Durch invasives Wachstum schädigt der Tumor das ihn umgebende
Gewebe, und durch die Metastasen wird eine Operation des Primärtumors
meist nur unter palliativen Gesichtspunkten sinnvoll. Gemeinsam
ist den beiden Vorgängen,
dass sie auf die Zellmigration, auch Lokomotion genannt, angewiesen
sind.
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Die
Zellmigration ist nicht nur für
das Verständnis
der Pathogenese maligner Erkrankungen wichtig, sie tritt auch bei
der Embryogenese, der Regeneration von Haut und Schleimhäuten, bei
der zellulären
Abwehr und bei diversen anderen Krankheiten, u. a. bei der häufigsten
Todesursache in westlichen Ländern,
den Gefäßerkrankungen,
aber auch bei der Osteoporose und entzündlichen Geschehen auf. Grundsätzlich ist
fast jede Zelle des Körpers
zur Migration befähigt,
Krebszellen zeigen jedoch eine besonders hohe Migrationsbereitschaft.
Sie läuft
prinzipiell in fünf
Schritten ab, die einen kontinuierlichen Zyklus bilden. Zuerst bindet
die Zelle ein migrationsstimulierendes Agens, wodurch sie sich polarisiert.
Dieses Agens kann in verschiedenster Weise wirken: (I) chemokinetisch,
wenn bereits einige wenige Moleküle
diesen Effekt haben, (II) chemotaktisch, wenn ein Gradient eines
löslichen
Agens diesen Effekt hat, oder (III) haptotaktisch, wenn ein unlösliches Agens
als Wegweiser dient. Die stimulierte Zelle polarisiert sich daraufhin
in Richtung des Reizes, indem der intrazelluläre Teil des Rezeptors Phosphoinositol-3-Phosphat
bildet, wodurch Rho-Kinasen, v. a. Rac und CDC42, aktiviert werden,
so dass an dieser Stelle Aktinfilamente polymerisieren. CDC42 ist
der übergeordnete Regulator
der Zellpolarisation, er legt den Ort der Lamellipodienformation
fest und lokalisiert das Mikrotubuli-Organisations-Center, genannt MTOC.
Eine Zelle wechselt eher die Richtung der Migration, anstatt sich
neu zu polarisieren.
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Die
Metastasierung als pathophysiologischer Vorgang ist am Menschen
bislang keiner direkten Beobachtung zugänglich. Daher bedarf es von
vorneherein Hilfsmittel, um sie qualitativ und quantitativ zu beschreiben.
Der Goldstandard ist die histopathologische Beobachtung. Weitere
Information, besonders über
das Aktivitätsniveau
und den metabolischen Status, kann man aus der Zellmorphologie ablesen,
z. B. an Größe und Anfärbbarkeit
des Zellkerns. Es eignen sich auch Tierexperimente, um empirische
Daten über
die Ausbreitungsfähigkeit
einer Tumorentität
zu erlangen. Der für
diese Studien entscheidende Nachteil der histopathologischen und
der tierexperimentellen Methode ist, dass der Einfluss einer einzelnen
Substanz auf die Migration schwer zu untersuchen ist. Dies gilt
besonders für
alle in vivo Studien, in denen das Mikromilieu einer Tumorzelle
von vielen unterschiedlichen Faktoren beeinflusst wird, wie z. B.
von der Vaskularisierung des Tumors. Dieser Nachteil gilt zwar nicht
für die
Beobachtung der Zellmorphologie, allerdings sind hierbei keine dynamischen
Prozesse wie die einzelnen Abschnitte der Metastasierung beobachtbar.
In vitro Versuche haben im Allgemeinen den Vorteil der höheren Reproduzierbarkeit
und der schnelleren Durchführbarkeit,
neben der Tatsache, dass juristische und ethische Bedenken nicht
so stark in den Vordergrund treten wie bei in vivo Ansätzen. Die
Quantifizierung der Zellmigration erfolgt in der Regel durch das
Auszählen
der Zellen im Membranfilter einer 48-Well-Chemotaxiskammer auch
Boyden-Kammer genannt.
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Eine
Kammer besteht aus zwei Acrylplatten, einer Grundplatte und einer
Deckplatte. Zwischen ihnen befinden sich eine druckelastische Silikondichtung
und ein Membranfilter. Die Grundplatte enthält sechs Gewindestifte und
48 Vertiefungen, angeordnet in 4 Reihen und 12 Spalten. Diese Vertiefungen
haben eine zirkuläre
Oberfläche
von 3,17 mm2, ein Volumen von 30 μl und werden
als „Wells” bezeichnet.
Die Deckplatte besitzt passgenaue Bohrungen, durch welche die Gewindestifte
gesteckt werden. Ebenso besitzt sie 48 Bohrungen, die in ihrer Lage
mit den Wells der Grundplatte übereinstimmen.
Analog dazu besitzt die Silikondichtung passende Löcher für die Wells
und Gewindestifte. Zwischen Grundplatte und Silikondichtung liegt
die poröse
Filtermembran aus Polycarbonat. Sie enthält eine Vielzahl von runden
Poren mit einem mittleren Durchmesser von 8 μm, durch die die Zellen aus
den Bohrungen der Deckplatte in die Wells der Grundplatte gelangen
können.
Das kombinierte Volumen einer Bohrung von Deckplatte und Dichtung,
also des oberen Teils der Boyden-Kammer,
fasst 50 μl.
Sechs Muttern werden auf die Gewindestifte geschraubt und ziehen
so die Deckplatte, die Dichtung und den Membranfilter zur Grundplatte.
Ein anschließendes
Färben
der auf dem Filter befindlichen Zellen ermöglicht deren Auszählung. Diese
Auszählung
erfolgt in der Regel manuell und ist mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand
verbunden. Weitere aufwendige Verfahren zur manuellen Auszählung von
Zellkolonien finden sich beispielsweise bei der Zählung von
Kolonien eukaryontischer Zellen, die auf dem Boden von Zellkulturflaschen
wachsen.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein verbessertes
Verfahren zur Auszählung von
Zellkolonien bereit zu stellen. Die Aufgabe wird durch die in den
Ansprüchen
gekennzeichneten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung gelöst.
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Insbesondere
wird erfindungsgemäß ein automatisiertes
Verfahren zum Zählen
von Zellkolonien auf einem festen Träger bereitgestellt, umfassend
die Schritte
- (a) Fotografieren der Zellkolonien
- (b) Optisches Färben
der Zellkerne und
- (c) Automatisiertes Auszählen
der gefärbten
Zellkerne.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung geschieht das Fo tografieren der Zellkolonien
in Schritt (a) des vorstehenden Verfahrens mit einer Digitalkamera.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Zellkerne
schon vor dem Fotografieren angefärbt, beispielsweise durch einen DNA-interkalierenden
Farbstoff wie z. B. DAPI (4',6-Damidino-2-phenylindol)
oder durch die Verwendung von markierten DNA-bindenden Substanzen,
wie z. B. DNA-Sonden.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung geschieht das optische Färben, beipielsweise
Schwärzen
der Zellkerne in Schritt (b) des vorstehenden Verfahrens mit Hilfe
eines Rechners. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung geschieht das automatisierte Auszählen in
Schritt (c) des vorstehenden Verfahrens rechnergestützt.
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Der
Begriff „Zellkolonie” beschreibt
eine einzelne Zelle oder einen Verband von Zellen, der auf einem festen
Träger
lokalisiert ist. Ein Verband umfasst mindestens zwei Zellen. Der
Begriff „Zellen” umfasst
alle eukaryontischen Zeilen. Vorzugsweise handelt es sich bei den
Zellen um Säugerzellen,
mehr bevorzugt um menschliche Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung gehören
die Zellen einer Primärkultur
von Zellen an. Vorzugsweise sind diese Zellen Tumorzellen. In einer
anderen bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung gehören
die Zellen einer etablierten Zellinie an. Vorzugsweise sind diese
Zellen ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus SQ20B-Zellen, HeLa-Zellen und PCI13-Zellen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist für
das Zählen
aller auf einen festen Träger
fixierten Zellkolonien geeignet. Erfindungsgemäß kann der feste Träger jeder
im Stand der Technik bekannte zur Fixierung von Zellkolonien geeignete
Träger
sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung befinden sich die Zellkolonien als Kolonien
adhärenter
Zellen auf dem Boden eines Zellkulturgefäßes, beispielsweise einer Mikrowellplatte
oder einer Zellkulturflasche. Vorzugsweise ist dieser Boden so beschichtet,
dass er das Haften der Zellen begünstigt. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind sich die Zellkolonien auf einem
Filter, vorzugsweise einem Membranfilter, fixiert. In einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Fixierung der Zellkolonien auf
dem Membranfilter durch eine Inkubation der Zellen in einer Boyden- Kammer erreicht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung sind sich die Zellkolonien auf einem Objektträger fixiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird beim Fotografieren der Zellkolonien
eine digitale Kamera, beispielsweise eine Spiegelreflexkamera, so
auf ein Mikroskop montiert, dass man in ihrem Sucher die zu zählenden
Zellkolonien im Strahlengang des Mikroskops erfasst. Wenn die Zellkerne
vor dem Fotografieren mit einem fluoreszierenden Farbstoff angefärbt wurden,
ist das Mikroskop vorzugsweise ein Fluoreszenzmikroskop. Die Kamera
kann beispielsweise direkt über
ein USB-Kabel direkt an einen Rechner angeschlossen sein. Der feste
Träger
mit den fixierten Zellkolonien wird vorzugsweise in die Klammern
auf dem Objekttisch des Mikroskops eingespannt. Dadurch ist seine
relative Lage zum Mikroskop gut reproduzierbar einzustellen. Es
folgt vorzugsweise das Scharfstellen der Objektträger auf
dem Binokular, beispielsweise bei fünffacher Vergrößerung.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird als Nächstes der Kondensur so eingestellt,
dass ein Abschnitt des festen Trägers
in der Mitte des Objekttisches allein im Lichtkegel und an allen
Seiten gleichmäßig beleuchtet
und scharf erscheint. Ist dies erreicht, wird vorzugsweise das Bild
im Sucher des Fotoapparates scharf gestellt. Nun kann in einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ein Weißlichtabgleich
der Kamera und eine Aufnahme eines ersten Probebildes erfolgen.
Vorzugsweise werden die Bilder dahingehend optimiert, dass die Zellkerne
möglichst
stark, das Zytoplasma und die Filterporen möglichst schwach erscheinen.
Ein Abschnitt des festen Trägers
wird vorzugsweise anhand von Markierungen am Sucher der Kamera mittig
platziert. Nun können
einzelne Abschnitte des festen Trägers abfotografiert werden
und die Bilddateien werden vorzugsweise auf dem Rechner gespeichert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird der feste Träger
mit polarisiertem Licht fotografiert. Wenn es sich bei dem festen
Träger
um einen Filter handelt, erscheint der mit doppelbrechendem Material beladene
Filter farbig, die inhaltslosen Filterporen dagegen weiß. Anhand
dieses Verfahrens können
die Positionen der Poren auf dem Filter bestimmt werden und später die
durch sie hervorgerufenen Interferenzen vom bearbeiteten Bild abgezogen
werden.
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Die
Zellkerne können
auf der Fotografie der Zellen mit jedem beliebigen aus dem Stand
der Technik bekannten Verfahren gefärbt werden, beispielsweise
durch das Markieren der Zellkerne per Hand. Wenn die Zellkerne auf
dem Rechner optisch gefärbt
werden, wird bei der Darstellung der Zellkerne auf dem Rechner zunächst ein
geeignetes Bildverarbeitungsprogramm, beispielsweise das Programm
Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, Kalifornien,
USA) gestartet. Dann werden vorzugsweise alle Bilder eines Ordners,
also z. B. der Kontrollgruppe, geöffnet. Dann wird die Farbe
der Zellkerne des aktiven Bildes durch eine beliebige Farbe, beispielsweise
Schwarz, ersetzt, beispielsweise indem die Helligkeit dieser Farbe auf
0 gesetzt wird. Hierbei werden vorzugsweise die Zellkerne gefärbt und
das Zytoplasma in seiner ursprünglichen
Färbung
belassen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung sind nach dem Färben
im wesentlichen nur noch die Zellkerne gefärbt, z. B. schwarz, sowie die
Bildpunkte, auch Pixel genannt, die schon bei der Aufnahme gefärbt, z.
B. schwarz, waren. Hierbei finden sich vorzugsweise diese „echt”-schwarzen
Bildpunkte in wesentlich kleineren Pixelhaufen als die Zellkerne.
Ein Beispiel für
solche optisch schwarz erscheinenden Phänomene sind Lichtaberrationen
an Filterporen. Darauf wird das Bildprogramm so eingestellt, dass
nur die optisch gefärbten
Zellkerne erhalten bleiben und ihre Kanten diskret verschwommen
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird alles Andere
optisch weiß.
Die Bildbearbeitungsbefehle werden vorzugsweise aufgezeichnet. Auf
diese Weise können
alle aufgezeichneten Befehle bei dem nächsten Bild ausgeführt werden,
so dass Zeit gespart werden kann. Vorzugsweise können, wenn bei einer Reihe
von Bildern, beispielsweise bei fünf Bildern in Folge kein Befehl
des Protokolls mehr geändert
werden muss, weil das Ergebnis den Anforderungen entspricht, die
restlichen Bilder ohne Vergrößerung bearbeitet werden.
Durch diese Automatisierung wird die Bearbeitungsgeschwindigkeit
wesentlich erhöht
und die Fehlerquote gesenkt.
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Das
automatisierte Auszählen
der Zellkerne erfolgt vorzugsweise rechnergestützt. Zur verbesserten Automatisierung
des Auszählen
kann wird in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ein einem geeigneten Rechnerprogramm, beispielsweise ImageJ
1.31v (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA), ein so
genanntes Makro geschrieben. Mit Hilfe des Rechners wird in einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung aus dem nur optisch zweifarbigen, z.
B. schwarz-weißen, Bild
ein faktisch zweifarbiges Bild, beispielsweise ein faktisch zweifarbiges
8-Bit-Bild, gemacht. Dadurch werden die Bildpunkte von den verschiedenen
dunklen Graustufen auf schwarz oder weiß festgelegt. Mit Hilfe eines
weiteren Befehls werden vorzugsweise die Zellkernhaufen getrennt.
Dabei wird beispielsweise an errechneten Verjüngungen schwarzer Figuren Trennlinien
eingefügt.
Daraufhin werden die Zellkerne mit Hilfe des Rechners gezählt. Die
Zählergebnisse
werden beispielsweise in einer Tabelle angezeigt, die für die weitere Verarbeitung
mit einem zur rechnergestützen
Analyse der Daten geeigneten Programm, beispielsweise Excel (Excel
2002, Microsoft Corporation, USA), geeignet ist. Mit Hilfe des zur
rechnergestützen
Analyse geeigneten Programms wird aus den gezählten Werten ein Balkendiagramm
erstellt. Das Balkendiagramm bildet auf der Ordinate die Häufigkeit,
auf der Abszisse die Größe der zusammenhängenden
Pixel eines gezählten
Pixelhaufens ab. Der Startpunkt der Abszisse lässt sich vorzugsweise auf einem
Feld individuell für
jedes Diagramm neu einstellen. Typischerweise ergibt sich nach Eingabe
der Daten eine Häufigkeitsverteilung,
die zwei leicht konfluierenden Gauß-Kurven ähnelt. Dieses Phänomen erklärt sich
dadurch, dass es zwei getrennte Populationen von Pixelansammlungen
gibt: die echtschwarzen Punkte des Wells als kleine, die Zellkerne
als große Pixelansammlungen.
Dadurch bilden die irrelevanten Pixelhaufen die weiter links gelegene,
die Zellkerne die weiter rechts gelegene Gauß-Kurve. Jetzt wird der Startpunkt
des Balkendiagramms auf das Minimum zwischen den beiden Kurven eingestellt.
Das verbliebene Zählergebnis
wird in dem Ergebnisfeld angezeigt.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung schließt sich an das automatisierte
Auszählen
der gefärbten
Zellkerne eine statistische Analyse der Auszählung an. Die statistische Analyse
der gesammelten Daten erfolgt mit einem dazu geeigneten Programm,
beispielsweise Origin 7G SR1 (Origin-Lab Corpororation, One Roundhouse Plaza,
01060 Northampton, Massachusets USA). Zur Beschreibung der Daten
dienen beispielsweise Mittelwert, Standardabweichung, Median, 5%-
und 95%-Perzentile. Vorzugsweise wird das 95%-Konfidenzintervall angegeben. Um Häufigkeitsverteilungen
zu vergleichen, werden die Daten vorzugsweise in Boxplots zusammengefasst
und in einem Diagramm dargestellt. Ein Punkt in einer Grafik steht
so beispielsweise für
den Mittelwert von mindestens vier Wells. Um die statistische Signifikanz
von Unterschieden zwischen Datenkollektiven nachzuweisen, kann zusätzlich in
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung der t-Test durchgeführt werden.
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Zudem
wird in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Quantifizierung
von Zellmigration bereitgestellt, umfassend die Schritte
- (a) Aussäen
von Zellen auf einen Membranfilter einer Boyden-Kammer,
- (b) Inkubieren der Zellen,
- (c) Entnahme des Membranfilters,
- (d) Anfärben
der Zellkolonien,
- (e) Zählen
von Zellkolonien mit dem vorstehenden erfindungsgemäßen automatisierten
Verfahren zum Zählen
von Zellkolonien.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Quantifizierung von Zellmigration ist für die Quantifizierung aller eukaryontischer
Zellen geeignet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
sind die Zellen Tumorzellen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird, um möglichst viele der Zellen, die
auf den Membranfilter sedimentierten, zur Migration zu stimulieren,
dieser mit Kollagen, beispielsweise Kollagen I, beschichtet. In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung mit 1 bis 2 mg/ml Kollagen,
besonders bevorzugt 1,49 mg/ml, auf den Membranfilter pipettiert
und durch Bewegen des Membranfilters gleichmäßig verteilt. Die Menge an
Lösung
wird so gewählt,
dass der Membranfilter mit der Lösung
vollständig
benetzt ist. Dies ist beispielsweise eine Menge von Kollagen 130 μl Kollagen
für einen
Membranfilter mit einer Oberfläche
von ungefähr
20 cm2, dadurch gelangen im Mittel 9,75 μg Kollagen
auf jeden Quadratzentimeter Membranfilteroberfläche.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann zur verbesserten Orientierung die
linke vordere Ecke des Membranfilters mit einer Schere abgetrennt
werden.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird, wenn unbeschichtete Membranfilter
nicht genügend
Haftung der zu untersuchenden Zellen an dem Membranfilter zulassen,
die Membranfilter an der Zielseite mit Gelatine beschichtet, um
die migrierten Zellen hier zu fixieren. Dies geschieht beispielsweise
durch Lösung
der Gelatine (0,1 mg/ml) für
eine Stunde bei 60°C
in 0,02 M Essigsäure und
Lagerung dieser Lösung
in 10 ml Aliquots bei –20°C.
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Wenn
der Membranfilter mit Gelatine beschichtet wird, wird der Membranfilter
mit der Zielseite zuunterst auf die Gelatinelösung gelegt und für beispielsweise
30 Minuten bei 37°C
in einem Brutschrank inkubiert. Danach kühlen die Membranfilter beispielsweise
bei Raumtemperatur für
30 Minuten ab, wobei die Gelatine am Membranfilter haften bleibt.
Anschließend
wird der Membranfilter bei Raumtemperatur in PBS (Phosphate Buffered
Saline) gelegt, beispielsweise nacheinander zweimal mit der Unterseite
für je
15 Minuten, ohne die Oberseite zu benetzen. Dies dient der Neutralisation
der sauren Valenzen der Gelatine. Das Trocknen des Membranfilters
erfolgt bei Raumtemperatur beispielsweise für mindestens 60 Minuten.
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Das
Aussäen
der Zellen in die Boyden-Kammer kann nach jedem im Stand der Technik
bekannten Verfahren erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden für die Boyden-Kammer Zellen
verwendet, die eine ausreichende Zelldichte erreicht haben, beispielsweise
Zellen, die drei Tage vor Versuchsbeginn mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 Kulturflaschenboden
eingesät
worden waren. Die Bedingungen für
das Lösen
der Zellen für
die Vesuchsvorbereitung hängen
vom jeweiligen Zelltyp ab und sind dem auf dem vorliegenden Gebiet
tätigen
Fachmann bekannt. Beispielsweise werden nach dem Dekantieren der
Nährlösung die
Zellen in Flaschen mit EDTA-Lösung
gewaschen und mit einer ausreichenden Menge, beispielsweise 2 ml,
Trypsin im Brutschrank bei 37°C
inkubiert. Die Kontrolle über
das Lösen
der Zellen vom Flaschenboden kann am Mikroskop erfolgen. Das Ablösen der
Zellen kann beispielsweise durch die Zugabe von Medium mittels des
darin enthaltenen Kälberserums
gestoppt werden, sodass die Zellen durch Auf- und Abziehen in der
Pipette seggregiert werden können,
bis eine homogene Suspension entsteht. Diese Zellsuspension kann,
wenn gewünscht,
auch noch zentrifugiert werden, wozu die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt und
beispielsweise bei 20°C
und 1600 U/min über
8 Minuten zentrifugiert wird. Es schließt sich das Dekantieren des Überstandes
an. Vor dem Aussäen
der Zellen können
die erhaltenen Zellpellets mit Nährlösung resuspendiert
werden und ihre Konzentration im Zellanalysator bestimmt werden. Durch
Zugabe von Nährmedium
kann eine gewünschte
Konzentration von Zellen, beispielsweise von 2,5 × 104 Zellen/ml eingestellt werden. Der Arbeitsgang
endet mit dem Einfüllen
der die gewünschte
Anzahl an Zellen enthaltenden Zellsuspension, beispielsweise von
50 μl Zellsuspension.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung befinden sich nach dem Aussäen der Zellen im Mittel 10.000
bis 15.000, besonders bevorzugt 12.500 Zellen in einer Bohrung der
Deckplatte.
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Das
Befüllen
der Boyden-Kammer kann nach jedem im Stand der Technik bekannten
Verfahren erfolgen. Beim Ansetzen eines Versuches wird vorzugsweise
als Erstes die Grundplatte mit Medium bestückt. Im Anschluss daran erfolgt
das Auflegen des beschichteten Membranfilters. Wenn der Membranfilter
mit Gelatine beschichtet ist, wird der Membranfilter so aufgelegt,
dass die mit Gelatine beschichtete Seite nach unten zeigt.
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Nach
dem Auflegen der Silikondichtung wird die Deckplatte des Systems
aufgelegt. Bevorzugt geschieht dies unter manuellem Druck, bis die
sechs Muttern in der Reihenfolge nach Herstellerangabe fingerfest zugedreht
sind. Die Zellsuspension musste gerade und tief in die jeweilige
Bohrung einpipettiert werden, ohne jedoch die Filtermembran zu berühren. In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Zellsuspension unmittelbar zuvor
durch Auf- und Abpipettieren homogenisiert und die Pipettenspitze
tief und aufrecht in der Bohrung gehalten. Jede Bohrung wird mit
vorzugsweise 25 bis 75 μl,
besonders bevorzugt mit 50 μl
Zellsuspension gefüllt.
Wenn aufgrund des Versuchsaufbaus die erste und letzte Reihe aufgrund
der späteren
Verarbeitungsweise des Membranfilters nicht auswertbar ist, werden
diese nicht mit Zellen befüllt.
Schließlich
wurden die Boyden-Kammern
in den Brutschrank gestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Zellzahl, Laktatgehalt der Wells,
fehlerhafte Wells, Zelllinie, Uhrzeit, Datum und/oder Besonderheiten
dokumentiert.
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Die
Zellen werden je nach Versuchsziel unterschiedlich lang im Brutschrank
inkubiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen
für 3 bis
72 Stunden, mehr bevorzugt 6 bis 48 Stunden, mehr bevorzugt 8 bis
24 Stunden und am meisten bevorzugt 10 bis 16 Stunden im Brutschrank
inkubiert.
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Für die Weiterverarbeitung
des Membranfilters werden die Kammern nach einer definierten Zeit
den Brutschränken
entnommen, um den Inhalt der Bohrungen zu dekantieren. Anschließend werden
vorzugsweise die Schrauben gelöst,
die Deckplatte abgehoben und in destilliertes Wasser gelegt, um
ein Antrocknen der Medien zu vermeiden.
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Wenn
der Membranfilter mit Kollagen beschichtet ist, schließt sich
das Benetzen der Kollagenseite des Membranfilters mit PBS an. Vorzugsweise
werden die nicht migrierten Zellen von der Startseite, besonders
bevorzugt mittels einer feststehenden Gummilippe, gelöst. In einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird nach dem Trocknen der Membranfilter
mit der Zielseite nach oben dieser Vorgang wiederholt, besonders
bevorzugt bis zu viermal.
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Der
nächste
Arbeitsschritt besteht in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung im Fixieren der Zellen auf dem Membranfilter. Dafür wird der
Membranfilter, beispielsweise für
eine Minute, in Methanol getaucht und anschließend mit der Zielseite nach
oben getrocknet, beispielsweise für 15 Minuten.
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Das
Färben
des Membranfilters kann mit jedem im Stand der Technik bekannten
und geeigneten Verfahren zum Färben
von Membranfiltern geschehen. Beispielsweise kann der Membranfilter
mit einer Hemacolorfärbung
für Blutausstriche
gefärbt
werden. Diese färbt
das Zytoplasma violett und die Kerne rot an. Nach den vom Hersteller
der Färbemittel
vorgeschriebenen Färbe-
und Entfärbeschritten
wird der Membranfilter mit der zellbehafteten Seite nach oben getrocknet.
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Bei
der Fixierung des Membranfilters auf dem Objektträger kann
es aufgrund der Größe der Objektträger notwendig
sein, den Membranfilter, beispielsweise in der Mit te zu durchtrennen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird durch Einschneiden der Kanten des Membranfilterfragments
mit einer Schere eine Faltenbildung des Membranfilters verhindert.
Je nach Arbeitsweise des verwendeten Mikroskops kann es notwendig
sein zunächst
ein Tropfen Immersionsöl
auf die Mitte des Fragments zu geben und ein Deckgläschen aufzubringen.
Dabei entstandene Blasen werden mit der Pinzette durch das Deckgläschen zur
Seite gedrückt.
Anschließend
kann das Objekt mit Nagellack versiegelt werden. Danach werden eventuell
vorhandene Zellkolonien auf dem Membranfilter mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
gezählt.
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Mit
Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
können
Tumorzellen wirksam charakterisiert und/oder selektioniert werden.
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Das
Auszählen
von Zellkolonien wird durch das erfindungsgemäße neue automatisierte Verfahren
zur automatisierten Auswertung anstelle des üblichen mikroskopischen Auszählens hinsichtlich
Reproduzierbarkeit, Geschwindigkeit und statistischer Aussagekraft
wesentlich verbessert. Es ist zu beachten, dass der Zeitgewinn an
Größe gewinnt,
je mehr feste Träger
mit Zellkolonien gleichzeitig ausgewertet werden. Dabei ist lediglich
das Design der Studie begrenzend. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist es also möglich,
alle festen Träger
mit Zellkolonien einer Studie in einem Arbeitsgang zu bearbeiten.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,
dass man zur Auswertung nicht die ganze Zeit über in das Licht des Mikroskops
sehen muss und das Auge auf entspannter Leseweite beispielsweise
einen Monitor akkomodiert. Die Reproduzierbarkeit der Zählergebnisse
der einzelnen Abschnitte des festen Trägers wird durch das erfindungsgemäße Verfahren,
beispielsweise durch die unverrückbare
Lage des festen Trägers
auf dem Objekttisch und durch die Möglichkeit der Automatisierung
der folgenden Verfahrensschritte erhöht. Die Gesichtsfelder der
manuellen Methode werden hingegen nur durch orientierende Angaben
zu ihrer Lage erstellt und sind dadurch schwer reproduzierbar. Es
wird gewährleistet,
dass die Anzahl der Zellkolonien wiedergegeben wird, auch wenn die
Zellen der Zellkolonien zwei oder mehr Zellkerne enthalten können, da
diese binukleären
Zellen sowohl in der Kontroll- als auch in der Prüfgruppe
vorkommen, so dass sich ein eventuell entstehender Fehler wieder
weitgehend mi nimiert bzw. relativiert.
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Im
Folgenden wird die Erfindung anhand lediglich Ausführungsbeispiele
zeigender Zeichnungen näher erläutert. Der
Begriff „Well” ist mit
dem Begriff „Vertiefung
eines Zellkulturgefäßes” gleichzusetzen.
Es zeigen:
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1 Rückseite
(Ankunftseite) einer gefärbten
Filtermembran (400fache Vergrößerung).
Die Zellkerne der gewanderten Zellen sind blau gefärbt. Jedes
Well bildet sich typischerweise kreisrund auf dem Membranfilter
ab. Hier sind der untere und der obere Pol abgeschnitten. Dies entspricht
dem bei dem automatisierten Verfahren ausgewertetem Bildausschnitt.
Die Kreise 1–7
zeigen die bei der manuellen Auszählung verwendeten Bildausschnitte
(Schema).
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2 Das
unbearbeitete Bild eines Wells (nach der Aufnahme mit der Nikon
D 100).
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3 Das
Bild nach der Verarbeitung z. B. in Photoshop. Die Zellkerne erscheinen
als schwarze, zum Teil zusammenhängende
Punkte, da ihre Farbe durch schwarz ersetzt wurde. Die Ränder der
Punkte sind nach dem Befehl „gerissene
Kanten” unscharf.
Die nicht schwarzen Bildpunkte werden dabei weiß gefärbt.
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4A Bildausschnitt
nach dem Befehl „gerissene
Kanten” in
Photoshop; B Bildausschnitt nach dem Befehl „Threshold” in ImageJ; C Bildausschnitt
nach dem Befehl „Watershed” in ImageJ
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5 Relative
Zellzahl ((%)/Fläche)
bei zunehmender Laktatkonzentration, normiert auf unbehandelte Zellen.
Jedes farbige Symbol entspricht einem Versuchswert, jedes Quadrat
dem zugehörigen
Mittelwert ± Standardabweichung
(Die Linien über
und unter dem Quadrat entsprechen der Standardabweichung). Unter Laktateinfluss
ist die Migrationsrate jeder Konzentrationsstufe signifikant höher als
bei unbehandelten Zellen (p < 0,05).
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6A und
B Relative Zellzahl ((%)/Fläche)
bei zunehmender Laktatkonzentration, normiert auf unbehandelte Zellen
(= 100%). Jedes farbige Symbol entspricht einem Versuchswert, jedes
Quadrat dem zugehörigen
Mittelwert ± Standardabweichung.
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Unter
Laktateinfluss ist die Migrationsrate jeder Konzentrationsstufe
signifikant höher
als bei unbehandelten Zellen (p < 0,05). 6A zeigt
die Werte der PCI13-Zellen, 6B die
der SQ20B-Zellen.
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7A und
B Absolute Zahlen der migrierten Zellen ohne Behandlung (Kontrolle)
und unter dem Einfluss von 40 mM Laktat. Vergleich zweier Auswertemethoden. 7A:
Zählergebnisse
der Rechnergestützen Auswertung:
2105 (± 271)
Zellen ohne Laktat und 2907 (± 403)
Zellen mit 40 mM Laktat, entsprechend einer Zunahme von 34%. 7B:
Zählergebnisse
der manuellen Auswertung: 665 (± 69) Zellen (0 mM Laktat)
und 854 (± 112)
Zellen (40 mM Laktat); entsprechend einer Zunahme von 38%.
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8A und
B Reproduzierbarkeit der Auswertemethoden. Die Werte der ersten
Auszählung
wurden gegen die Werte der zweiten Auszählung desselben Wells aufgetragen.
Die Diagonale stellt die Winkelhalbierende dar. Je näher die
Punkte an der Winkelhalbierenden zu liegen kommen, desto mehr stimmen
die Zählungen überein.
Genaue Zahlenwerte sind in Tabelle 2 angegeben.
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden
Beispiele näher
erläutert.
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Beispiel 1: Zellkultur
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Zelllinien
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SQ20B-Zellen
stammen aus einem Larynxtumor im Stadium T2N0 nach erfolgloser Strahlentherapie. Weitere
Migrationsversuche wurden mit PCI13-Zellen durchgeführt. Diese
Zelllinie entstammt einem Plattenepithelkarzinom des Kopf/Halsbereiches.
Als Standard für
den Western-Blot wurden Zellen der Linie HeLa verwendet, welche
ebenfalls aus einem Plattenepithelkarzinom der Kopf-/Halsregion
entnommen und kultiviert wurden.
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Zellkulturbedingungen
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Die
Kultivierung der Zelllinien erfolgte in Kulturflaschen (z. B. Gewebekulturflaschen steril,
75 cm2, mit Filter), Boyden-Kaminern und
Kulturplatten in wasserdampfgesättigter
atmosphärischer
Luft mit Zusatz von 5% CO2 bei 37°C in einem
Brutschrank. Die Kultivierung aller Zellen erfolgte mit Advanced
DMEM/F12 Medium unter Zusatz von 10% Cosmic Calf Serum. Außerdem wurde
dem Medium 1% L-Glutamat zugesetzt. Die Zellen K-I-SQ20B erhielten
zusätzlich
dazu in der Zeit der ersten zwei Passagen 100 IU/ml Penicillin und
100 μg/ml
Streptomycin. Das Passagieren der Zellen von einer Zellkulturflasche
in die nächste
erfolgte durch Waschung mit 37°C
warmer EDTA-Lösung
(372,24 g EDTA, 1 l Aqua dest., mit 5 M NaOH auf pH = 8,0 titriert)
und anschließendem
Lösen mit
Trypsin im Brutschrank. Die Zellen wurden mittels Pipette suspendiert
und 1 ml der Suspension in eine mit 9 ml Medium vorbereitete Zellkulturflasche
gefüllt.
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Handhabung von Dauerkulturen
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Das
Anlegen von Dauerkulturen diente dem Sichern von Zellen mit niedriger
Passagezahl oder mit besonderen Eigenschaften, wie z. B. einer besonderen
Migrationsfähigkeit.
Der nächste
Arbeitsgang bestand in einem gründlichen,
aber atraumatischen Vermischen in einem 2 ml fassendem Dauerkulturgefäß mit 0,9
ml Zellsuspension in den Konzentrationen 2 – 4 × 106 Zellen/ml
unter Zusatz von 0,1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Der nächste Schritt
bestand im Lagern der Zellen zunächst
für 8 Stunden
bei –20°C, dann für weitere
8 Stunden bei –70°C. Schließlich wurden
sie bei –180°C in flüssigem Stickstoff
in einem dafür
vorgesehenem Behälter
gelagert. Das Auftauen der Zellen stellte den Anspruch, die Zellen
möglichst
zügig vom
Dimethylsulfoxid zu trennen, da das DMSO oberhalb von 4°C zytotoxisch
wirkt. Zu diesem Zweck wurde die Zellsuspension mit 15 ml Medium
aufgenommen und bei 20°C
mit 1600 U/min für
8 Minuten zentrifugiert. Der Arbeitsprozess endete mit dem Resuspendieren
der Zellen mit 10 ml Medium und dem Weiteren Bebrüten in eine
Kulturflasche.
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Herstellung der laktathaltigen Nährlösungen
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Um
den akuten Einfluss von Laktat auf die Zellmigration untersuchen
zu können,
wurden Medien benötigt,
die sich, abgesehen vom Laktatgehalt, nicht von dem Medium unter
Kontrollbedingungen unterschieden. Um den bereits bekannten Effekt
des pH-Wertes auf die Zellwanderung auszulöschen, wurden alle Untersuchungen
in Medien mit einem pH-Wert von 7,35 (± 0,03) durchgeführt. Eine
1 M Laktatlösung wurde
mit 1 M NaOH auf den pH = 7,35 titriert. (Diese diente dem Anreichern
von Nährmediumslösungen auf
die Laktatkonzentrationen von 10 mM, 20 mM, 30 mM oder 40 mM Laktat,
wobei diese Laktatmedien für
jeden Versuch frisch angesetzt wurden.
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Beispiel 2: Quantitative Messung der Zellmigration
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Membranfilterpräparation
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Um
möglichst
viele der Zellen, die auf den Membranfilter sedimentierten, zur
Migration zu stimulieren, wurde dieser mit Kollagen I beschichtet.
Dazu mussten mit einer Pipette insgesamt 130 μl Kollagen I Lösung (1,49
mg Kollagen I/ml) auf den Membranfilter pipettiert und durch Bewegen
des Membranfilters gleichmäßig verteilt
werden. Die Zubereitung der Kollagen I Stammlösung (9,9 mg Kollagen I/ml)
erfolgte durch Lösen
von 50 mg Kollagen I Lyophilisat zusammen mit 50 μl 1 M Salzsäure und
5 ml 60% EtOH im Ultraschall unter leichter Wärmezufuhr für 30 Sekunden. Die Lagerung
erfolgte bei –20°C. Für die Kollagen
I Gebrauchslösung
wurden 1 ml Stammlösung
mit 5,66 ml 60% EtOH für
5 Minuten geschüttelt.
Dieser Schritt endete mit der Lagerung bei 4°C. Ein Membranfilter hat die
Oberfläche
von 20 cm2, dadurch gelangten im Mittel
9,75 μg
Kollagen I auf jeden Quadratzentimeter Membranfilteroberfläche. Da
unbeschichtete Membranfilter trotz PVP-Beschichtung nicht genügend Haftung
der Krebszellen an dem Membranfilter zuließen, wurden die Membranfilter
an der Zielseite mit Gelatine beschichtet. Dies geschah durch Lösung der
Gelatine (0,1 mg/ml) für
eine Stunde bei 60°C in
0,02 M Essigsäure
und Lagerung dieser Lösung
in 10 ml Aliquots bei –20°C. Zur eigenen
Orientierung wurde stets die linke vordere Ecke des Membranfilters
mit einer Schere abgetrennt. Der Membranfilter wurde nun vorsichtig
mit der Zielseite zuunterst auf die Gelatinelösung gelegt und für 30 Minuten
bei 37°C
in einem Brutschrank inkubiert. War die Oberseite des Membranfilters
benetzt, konnte man den Membranfilter nicht mehr verwenden. Danach
kühlten
die Membranfilter bei Raumtemperatur 30 Minuten ab, wobei die Gelatine
am Membranfilter haften blieb. Anschließend wurde der Membranfilter
nacheinander zweimal mit der Unterseite für je 15 Minuten bei Raumtemperatur
in PBS gelegt, ohne die Oberseite zu benetzen, da sonst die Gefahr bestanden
hätte,
das Kollagen abzuwaschen. Dies diente der Neutralisation der sauren
Valenzen der Gelatine. Nun folgte das Trocknen des Membranfilters
Nachdem dieser vorsichtig mit zwei Pinzetten aus der Petrischale entnommen
wurde, musste er um 180° gedreht
werden, so dass die unbeschichtete Seite unten lag. So lagerte er
für mindestens
60 Minuten bei Raumtemperatur.
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Zubereiten der Zellsuspension
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Für eine reproduzierbare
Versuchsdurchführung
war es wichtig, Zellen einzusetzen, die möglichst gleiche Ausgangsbedingungen
lieferten. Deshalb wurden nur Zellen für die Boyden-Kammer verwendet,
die drei Tage vor Versuchsbeginn in der Dichte 1 × 104 Zellen/cm2 Kulturflaschenboden
eingesät
worden waren. Am Tag des Versuches war der erste Arbeitsschritt
das Dekantieren der Nährlösung. Anschließend wurden
die Zellen in den Flaschen mit EDTA-Lösung gewaschen und mit 2 ml
Trypsin im Brutschrank bei 37°C
inkubiert. Die Kontrolle über
das Lösen
der Zellen vom Flaschenboden erfolgte am Mikroskop. Die Zugabe von
8 ml Medium mittels des darin enthaltenen Cosmic Calf Serums stoppte
die Trypsinreaktion, sodass die Zellen durch Auf- und Abziehen in
der Pipette seggregiert werden konnten, bis eine homogene Suspension
entstand. Diese Zellsuspension wurde nun in ein Zentrifugenröhrchen überführt und
bei 20°C
und 1600 U/min über
8 Minuten zentrifugiert. Es schloss sich das Dekantieren des Überstandes
an. Die Zellpellets wurden mit Nährlösung resuspendiert
und ihre Konzentration im Zellanalysator bestimmt. Durch Zugabe
von Nährmedium
konnte eine Konzentration von 2,5 × 104 Zellen/ml
eingestellt werden. Bei den Zellsuspensionen, die eine definierte
Konzentration Laktat enthalten sollten, wurde das Volumen des später zugesetzten
Laktats vom Volumen des zugesetzten Mediums abgezogen. Wenn benötigt, wurde
das gepufferte Laktat als Letztes hinzugegeben, um eine vorübergehend
hohe Laktatkonzentration mit einer entsprechend hohen Osmolarität zu vermeiden.
Es schloss sich bei allen Zellsuspensionen die Überprüfung der eingestellten Konzentration
von 2,5 × 104 Zellen/ml an. Der Arbeitsgang endete mit
dem Einfüllen
von 50 μl
Zellsuspension, also im Mittel 12 500 Zellen, in eine Bohrung der
Deckplatte.
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Ansetzen eines Versuches
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Als
Erstes wurde die Grundplatte bestückt. Um systematische Fehler
an diesem Punkt auszuschließen,
wurde zufällig
ausgewählt,
mit welchem Medium, dem Kon trollmedium oder dem laktathaltigen Medium, begonnen
wurde. Dafür
musste die Pipettenspitze in das Well tief eingeführt werden
und das Medium schnell entleert werden, um etwaige Lufteinschlüsse zu vermeiden.
Als Unterlage für
die Grundplatte diente eine schwarze Schaumstoffmatte, die das Erkennen
von Luftblasen erleichterte. Im Anschluss daran erfolgte das Auflegen
des beschichteten Membranfilters. Dieser wurde zwischen zwei Pinzetten
gespannt und gewendet, so dass die mit Gelatine beschichtete Seite
nach unten zeigte. Dabei berührte
der mittlere Teil des Membranfilters zuerst die Grundplatte der
Boyden-Kammer, so dass er sich anschließend zur Seite abrollte. Es
war darauf zu achten, dass die abgeschnittene Ecke vorne links zu
liegen kam und dass keine Blasen in die Wells eingeschlossen wurden.
Die nächste
Aufgabe bestand im Auflegen der Silikondichtung in der Weise, dass auch
hier die vom Hersteller abgeschnittene Ecke links unten zu liegen
kam. Nun konnte man die Deckplatte des Systems auflegen. Dies geschah
unter manuellem Druck, bis die sechs Muttern in der Reihenfolge
nach Herstellerangabe fingerfest zugedreht waren. Wenn man den Druck
nicht permanent aufrechterhielt, strömte Luft unter den Membranfilter
und die betroffenen Wells waren nicht verwertbar. Die Zellsuspension
musste gerade und tief in die jeweilige Bohrung einpipettiert werden,
ohne jedoch die Filtermembran zu berühren. Die besten Ergebnisse
wurden erzielt wenn die Zellsuspension unmittelbar zuvor durch Auf-
und Abpipettieren homogenisiert wurde und die Pipettenspitze tief
und aufrecht in der Bohrung gehalten wurde. Jede Bohrung wurde mit
50 μl Zellsuspension
gefüllt,
abgesehen von der ersten und letzten Reihe, da diese aufgrund der
späteren
Verarbeitungsweise des Membranfilters nicht auswertbar waren. Schließlich wurden
die Boyden-Kammern in den Brutschrank gestellt. Es wurden spätestens
jetzt Zellzahl, Laktatgehalt der Wells, fehlerhafte Wells, Zelllinie,
Uhrzeit, Datum sowie Besonderheiten dokumentiert.
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Weiterverarbeitung des Membranfilters
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Die
Kammern wurden nach definierter Zeit den Brutschränken entnommen,
um den Inhalt der Bohrungen zu dekantieren. Die Schrauben wurden
gelöst,
die Deckplatte abgehoben und in destilliertes Wasser gelegt, um
ein Antrocknen der Medien zu vermeiden. Nachdem der Membranfilter
vorsichtig von der Silikondichtung gelöst und in zwei Filterklemmen
eingespannt waren, wurden auch alle übrigen Teile der Boyden-Kammer in
destilliertes Wasser gelegt. Es schloss sich das Benetzen der Kolla genseite
des Membranfilters mit PBS und das Lösen der nicht migrierten Zellen
von der Startseite mittels einer feststehenden Gummilippe an. Die
Gummilippe wurde mit Watte gereinigt, worauf sich der Vorgang dreimal
wiederholte. Nach einer Pause von 20 Minuten, in der der Membranfilter
mit der Zielseite nach oben trocknete, wurde dieser Vorgang viermal
wiederholt. Der nächste
Arbeitsschritt bestand im Fixieren der Zellen auf dem Membranfilter.
Dafür wurde
der Membranfilter für
eine Minute in Methanol getaucht und anschließend mit der Zielseite nach
oben 15 Minuten getrocknet.
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Färben
des Membranfilters
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Die
Membranfilter wurden mit der Hemacolorfärbung für Blutausstriche gefärbt. Sie
färbt das
Zytoplasma violett und die Kerne rot an. Das manuelle Auszählen erfolgte
durch Eintauchen der Membranfilter für 3 Sekunden in die rote (z.
B. Hemacolor II, Fa. Merck, Darmstadt) und 7 Sekunden in die violette
(z. B. Hemacolor III, Fa. Merck, Darmstadt) Färbelösung. Für die automatisierte Methode
wurde er dagegen 7 Sekunden in die rote und 3 Sekunden in die violette
Färbelösung überführt, um
die Kerne deutlicher zu färben.
Dafür bestand
der erste Arbeitsgang im Klemmen des Membranfilters zwischen eine
große
und eine kleine Filterklemme und im einmaligen Eintauchen des Membranfilters
in die Lösung
für jede
vorgeschriebene Sekunde. Die kleine Filterklemme diente dabei als
Gewicht, damit der Membranfilter untertauchte, während er an der großen Filterklemme
noch festgeklemmt war. Nach und vor jedem Gebrauch wurde Hemacolor
III durch einen mit destilliertem Wasser angefeuchteten Papierfilter.
Das Entfärben
der Membranfilter erfolgte nacheinander in drei Petrischalen mit
Puffer nach Weise (z. B. pH = 7,2 Hemacolor Auflöstabletten, Fa. Merck, Darmstadt).
Der letzte Arbeitsgang bestand im Platzieren der Membranfilter auf
einem trockenen Papiertuch mit der zellbehafteten Seiten nach oben,
so dass die Membranfilter trocknen konnten.
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Fixierung des Membranfilters auf dem Objektträger
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Aufgrund
der Größe der Objektträger war
zunächst
das Durchtrennen der Membranfilter in der Mitte vonnöten, bevor
die Hälften
auf zwei beschriftete Objektträger
gelegt werden konnten. Dabei musste man die räumliche Anordnung insbesondere
der Hälfte
ohne die abgeschnittene Ecke beachten, da durch Drehung oder Wendung eine
falsche Zuordnung der abgebildeten Wells die Folge wäre. Das
Einschneiden der Kanten des Membranfilterfragments mit einer Schere
diente dem Zweck, der Faltenbildung vorzubeugen. Dafür musste
man zunächst
ein Tropfen Immersionsöl
auf die Mitte des Fragments geben und ein Deckgläschen aufbringen. Entstandene
Blasen wurden mit der Pinzette durch das Deckgläschen zur Seite gedrückt. Nach
einer Lagerzeit von 15 Minuten, in der sich kleine Bläschen zum
Rand bewegten und eröffneten,
konnte das Objekt mit Nagellack versiegelt werden.
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Reinigung der Boyden-Kammer
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Um
die Kammer zu reinigen wurden 5 g Terg-a-zyme in 500 ml destilliertem
Wasser bei maximal 60°C gelöst. Nach
dem Abspülen
der Kammer mit Aqua dest. begann die Immersion in die warme Enzymlösung und die
Abdeckung mit Aluminiumfolie. Die Inkubationszeit betrug 5 Stunden.
Anschließend
wurde die Kammer mehrmals mit Aqua dest. ausgiebig gespült und luftgetrocknet.
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Auswertung der Versuche
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(a) Manuelles Verfahren
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Die
Auswertung der Membranfilter fand unter ein Lichtmikroskop bei 400facher
Vergrößerung statt. Von
jedem Well wurden sieben Gesichtsfelder ausgewertet, wobei von den
angeschnittenen Zellkörpern
nur die an der linken Grenze liegenden ausgewertet wurden (1).
Sechs Gesichtsfelder wurden im Uhrzeigersinn angeordnet, das siebte
lag auf dem Mittelpunkt des Wells. Auf diese Weise konnten 17,5%
der Fläche eines
Wells ausgezählt
werden.
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(b) Automatisiertes Verfahren
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Das
automatisierte Verfahren bestand aus drei getrennten Arbeitsschritten.
Im ersten wurden die Wells des Membranfilters abfotografiert, im
zweiten Schritt die Bilder bearbeitet, im dritten aus den Bildern
Daten gesammelt. Das Auszählen
aller ausgewerteten Membranfilter erfolgte mit dem automatisierten
Verfahren.
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(i) Fotografieren des Membranfilters
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Das
Mikroskop hat sowohl einen Strahlengang für das Binokular als auch alternativ
für einen
Kameraanschluss. Der Strahlengang ließ sich manuell durch Betätigen ei nes
Ziehhebels umstellen, veränderte
dabei jedoch minimal seinen Scharfpunkt, so dass man die Schärfe des
Bildes nach jedem Umstellen des Strahlenganges korrigieren musste.
Auf den Kameraanschluss wurde die Fotokamera montiert. Die Kamera
war eine Spiegelreflexkamera, so dass man in ihrem Sucher stets
das vorliegende Bild sah. Sie war über ein USB-Kabel direkt an
ein Rechner angeschlossen. Wurde die Kamera angeschaltet, öffnete sich
automatisch das Programm „Nikon
Capture Control”.
Die Helligkeit der Mikroskopleuchte ließ sich auf einer Skala von
0 bis 12 an einem Drehschalter einstellen. Ein Zoom wurde nicht
benutzt. Der Objektträger
mit dem Membranfilterfragment wurde in die Klammern auf dem Objekttisch
des Mikroskops eingespannt. Dadurch war seine relative Lage zum
Mikroskop gut reproduzierbar einzustellen. Es folgte das Scharfstellen
der Objektträger
auf dem Binokular bei fünffacher
Vergrößerung.
Als Nächstes
wurde der Kondensor so eingestellt, dass ein Well in der Mitte des
Objekttisches allein im Lichtkegel und an allen Seiten gleichmäßig beleuchtet
und scharf erschien. War dies erreicht, musste das Bild im Sucher
des Fotoapparates scharf gestellt werden. Nun erfolgten ein Weißlichtabgleich
der Kamera und eine Aufnahme eines ersten Probebildes. Man konnte
die Beschaffenheit des Bildes durch die Belichtungszeit und die
Helligkeit des Mikroskoplichtes beeinflussen. Diese beiden Parameter
wurden für
jeden Membranfilter neu eingestellt, variierten aber nur wenig um
die folgenden Werte: Helligkeit = 4, Belichtungszeit = 1/500 Sekunde.
Die Bilder wurden dahingehend optimiert, dass die Zellkerne möglichst
stark, das Zytoplasma und die Membranfilterporen möglichst
schwach erschienen (2). Ein Well wurde anhand von
Markierungen am Sucher der Kamera mittig platziert. Nun konnten
die Wells abfotografiert werden und die Bilddateien in einen spezifisch
benannten Ordner auf dem Rechner gespeichert werden. Per USB-Stick
wurden die Bilder auf einen Rechner mit höherer Rechenleistung transportiert.
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(ii) Darstellung der Zellkerne auf dem
Rechner
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Hier
wurde als erstes das Programm Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems
Incorporated, San Jose, Kalifornien, USA) gestartet und alle Bilder
eines Ordners, also z. B. der Kontrollgruppe, geöffnet. Dann wurde die Farbe
der Zellkerne des aktiven Bildes über den Befehl „Bild – Einstellen – Farbe
ersetzen” durch
Schwarz ersetzt, indem die Helligkeit dieser Farbe auf 0 gesetzt
wurde. Dabei bestand die Herausforderung bei der hier angewandten
Färbemethode,
die Zellkerne zu schwärzen
und das Zytoplasma in seiner ursprünglichen Färbung zu belassen. Die Vordergrundfarbe
wurde als Schwarz definiert über
den Befehl „Vordergrundfarbe
einstellen” im
Werkzeug-Fenster
(„Fenster – Werkzeugleiste
einblenden – Vordergrundfarbe
einstellen”)
von Photoshop. Nun waren nur noch die Zellkerne schwarz sowie die
Bildpunkte, auch Pixel genannt, die schon bei der Aufnahme schwarz
waren. Diese „echt”-schwarzen
Bildpunkte fanden sich jedoch in wesentlich kleineren Pixelhaufen
als die Zellkerne. Ein Beispiel für solche optisch schwarz erscheinenden
Phänomene
sind Lichtaberrationen an Membranfilterporen. Der nächste Befehl, „Filter – Zeichenfilter – Gerissene
Kanten” wurde
mit den Einstellungen Farbverhältnis
= 15, Glättung
= 12, Kontrast = 15 ausgeführt.
Dadurch blieben nur die optisch schwarzen Zellkerne erhalten, ihre
Kanten wurden diskret verschwommen, alles Andere wurde optisch weiß (s. 3).
Um Speicherplatz auf der Festplatte zu sparen und als Voraussetzung
für die
weiteren Verarbeitungsschritte wurde das Bild nun zum Schwarz-Weiß-Bild konvertiert
mit Hilfe des Befehls „Bild – Modus – Graustufen”. Der Befehl „Datei – speichern” diente
dem Speichern des bearbeiteten Bildes, mit dem Befehl „Datei – Schließen” wurde
das Bild geschlossen. Diese Befehle wurden mit dem Befehl „Aufzeichnung
beginnen” des
Reiters „Aktionen” im Fenster „Protokoll” („Fenster – Protokoll
einblenden”)
aufgezeichnet. Nach dem letzten Befehl wurde hier der Befehl „Aufzeichnung
beenden” ausgeführt. Wenn
man nun den Befehl „Auswahl ausführen” in Gang
setzte, wurden alle aufgezeichneten Befehle bei dem nächsten Bild
ausgeführt.
Man musste bei den ersten Bildern über die Zoomschiene des Fensters „Navigator” („Fenster – Navigator
einblenden”) mit
Hilfe der Vergrößerung mehrere
Bildausschnitte überprüfen. Wenn
bei 5 Bildern in Folge kein Befehl des Protokolls mehr geändert werden
musste, weil das Ergebnis gut genug war, konnten die restlichen
Bilder ohne Vergrößerung mit
dem Befehl „Auswahl
ausführen” bearbeitet
werden. Durch diese Automatisierung wurde die Bearbeitungsgeschwindigkeit
wesentlich erhöht.
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(iii) Automatisiertes Auszählen der
Zellkerne
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Nun
konnte Photoshop geschlossen werden, und die Programme ImageJ 1.31v
(Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA) und Excel (Excel
2002, Microsoft Corporation, USA) wurden geöffnet. In ImageJ wurde ein
so genanntes Makro geschrieben. Damit konnte auch hier eine Befehlsreihe
durch einen Befehl aufgeru fen werden. Dazu muss man zunächst den
Befehl „Plugins – Macros – Record” ausführen und
dem Makro einen Namen geben. In diesem Fall erhielt es den Namen „Resmini-Verfahren.txt”. Nun führt man
die Befehle aus, die man nach Öffnen
der Datei mit dem Bild durchführen
will. Dann klickt man auf die Worte „Create Macro”. Vor der
ersten Benutzung des Makros nach dem Öffnen von ImageJ musste man
nun den Befehl „Plugins – Macros – Install – Resmini-Verfahren.txt” durchführen. Für den Rest
des Tages stand dieser Befehl nun unter „Plugins – Macros – Resmini-Verfahren” zur Verfügung. Die Befehle von „Resmini-Verahren.txt” waren
im Einzelnen: „Process – Binary – Treshhold” um aus
dem nur optisch schwarz-weißen
Bild ein faktisch zweifarbiges 8-Bit-Bild zu machen. Dadurch werden
die Bildpunkte, wie im Vergleich der 4A und 4B zu
sehen ist, von den verschieden dunklen Graustufen auf schwarz oder
weiß festgelegt.
Der Befehl „Process – Binary – Watershed” diente
dem Trennen von Zellkernhaufen (4C). Dabei
werden an errechneten Verjüngungen
schwarzer Figuren Trennlinien eingefügt. Es folgt der Befehl „Analyze – Analyze
particles” in
den vom Programm automatisch vorgegebenen Parametern, um die Zellkerne
zu zählen.
Dabei musste man die Optionen „Display
Results” und „Clear
Results Table” anklicken,
alle anderen Optionen mussten ausgeschaltet sein. Die Zählergebnisse
wurden in einer Excel-kompatiblen Tabelle angezeigt. Der Tabelleninhalt
wurde über einen
Rechtsklick mit dem Befehl „Copy
All” kopiert
und in eine Spalte einer Excel-Tabelle eingefügt, die auch als Eingabebereich
für ein
Balkendiagramm diente. Das Balkendiagramm bildete auf der Ordinate
die Häufigkeit,
auf der Abszisse die Größe der zusammenhängenden
Pixel eines gezählten
Pixelhaufens ab. Der Startpunkt der Abszisse lies sich auf einem
Feld individuell für
jedes Diagramm neu einstellen. Typischerweise ergab sich nach Eingabe
der Daten eine Häufigkeitsverteilung,
die zwei leicht konfluierenden Gauß-Kurven ähnelte. Dieses Phänomen erklärte sich
dadurch, dass es zwei getrennte Populationen von Pixelansammlungen gibt:
die echt-schwarzen Punkte des Wells als kleine, die Zellkerne als
große
Pixelansammlungen. Dadurch bildeten die irrelevanten Pixelhaufen
die weiter links gelegene, die Zellkerne die weiter rechts gelegene Gauß-Kurve.
Jetzt wurde der Startpunkt des Balkendiagramms auf das Minimum zwischen
den beiden Kurven eingestellt. Das verbliebene Zählergebnis wurde in dem Ergebnisfeld
angezeigt. Es wurde eine weitere Excel-Datei mit dem Namen der Filternummer
erstellt und der Zahlenwert wurde mit Zuordnung des Wells zu Zelllinie
und Laktatgehalt festgehalten.
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(iv) Statistische Analyse und Darstellung
der Daten
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Alle
statistischen Daten wurden mit Hilfe des Rechnerprogramms Excel
gesammelt. Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit Origin
7G SR1 (OriginLab Corpororation, One Roundhouse Plaza, 01060 Northampton,
Massachusets USA). Zur Beschreibung der Daten dienten immer Mittelwert,
Standardabweichung, Median, 5%- und
95%-Perzentile. Zum Teil wird das 95%-Konfidenzintervall angegeben
Um Häufigkeitsverteilungen
zu vergleichen, wurden die Daten in Boxplots zusammengefasst und
in einem Diagramm dargestellt. Ein Punkt in einer Grafik steht für den Mittelwert
von mindestens vier Wells. Um die statistische Signifikanz von Unterschieden
zwischen Datenkollektiven nachzuweisen wurde der t-Test durchgeführt.
-
Beispiel 3: Die Migration von SQ20B-Zellen
und PCI13-Zellen unter Laktateinfluss
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Die
Ergebnisse der Migrationsversuche an SQ20B-Zellen und PCI13-Zellen
unter Laktateinfluss sind in 5 dargestellt.
Die Werte der laktatfreien Kontrollgruppe (0) wurden dabei für die Proben
jeweils als hundert gesetzt. Die Vergleichswerte der laktathaltigen
(10–40)
Gruppen orientieren sich an einer Kontrollgruppe desselben Versuches.
Die absoluten Zahlenwerte sind in Tabelle 1 zu finden. Die Abbildung
zeigt, dass die Krebszellen bei Zugabe von 10, 20, 30 und 40 mM
Laktat im Zeitraum von 10 bis 16 Stunden stärker migrieren als ohne Zusatz
von Laktat. Die gewonnenen Daten lassen zudem die Aussage zu, dass
für die
genannten Konzentrationen eine positive Korrelation zwischen Laktatkonzentration
und Migrationsrate besteht, also dass mit steigender Laktatkonzentration
mehr Zellen migrieren.
-
Eine
vergleichende Analyse der
6A und
6B ergibt, dass SQ20B-Zellen schon auf
geringere Mengen Laktat mit einer stärkeren Migration reagieren,
eine Erhöhung
der Laktatkonzentration über
20 mM dagegen keine weitere Steigerung der Migrationsrate erwarten
lässt.
Im Gegensatz dazu steigt die Migrationsrate der PCI13-Zellen mit steigender
Laktatkonzentration bis 40 mM weiter an. In allen gemessenen Konzentrationsbereichen
stieg die Migrationsrate der Zellen nach Zugabe von Laktat zum Nährmedium
gegenüber
der laktatfreien Kontrollgruppe statistisch signifikant zum Signifikanzniveau
p = 0,05 an. Tabelle 1: Migrierte SQ20B-Zellen als
Funktion der Laktatkonzentration in Nährmedium. Angegeben ist die mittlere
relative Zellzahl/Fläche ± Standardabweichung,
bezogen auf Kontrollbedingungen.
| Laktatkonzentration
(mM) | Relative
Zellzahl/Fläche
(%) (Mw ± Sd) |
| 0 | 100 |
| 10 | 128 ± 13 |
| 20 | 140 ± 27 |
| 30 | 153 ± 21 |
| 40 | 156 ± 14 |
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Beispiel 4: Optimierung des Versuchsprotokolls
der Boyden-Kammer
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Modifikationen in der Färbemethode
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Das
etablierte Färbeprotokoll
sah eine Färbezeit
von 3 Sekunden für
die rote (z. B. Hemacolor II, Fa. Merck, Darmstadt) und 7 Sekunden
für die
violette (z. B. Hemacolor III, Fa. Merck, Darmstadt) Färbelösung vor.
Durch diese Färbung
wurden die Zellkerne rot, das Zytoplasma dunkelviolett gefärbt. Weder
für das
manuelle Verfahren noch für
das automatisierte ist aber das Zytoplasma von Bedeutung. In beiden
Fällen
werden die Zellkerne als Korrelat der migrierten Zellen ausgezählt. Durch
Verlängerung
der Färbezeit
in Hemacolor II auf 7 Sekunden färbten
sich die Kerne in einem kräftigeren
Rot. Die kürzere
Verweildauer in Hemacolor III führte
zu einem optischen Abblassen des Zytoplasmas. Dadurch wurde der
Kontrast zwischen Kernen und optischer Umgebung erhöht, wodurch
die Zellkerne prominenter wurden (2). Ein
völliger
Verzicht die Hemacolor-III-Färbung
führte
zu einer sehr unzureichenden Färbung
der Zellkerne, weshalb der Aufarbeitungsschritt prinzipiell beibehalten
wurde.
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Das Fotografieren der Wells
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Durch
das Fotografieren wird der Bereich des Wells, der ausgezählt wird,
von maximal 17,5% bei der manuellen Auswertung auf ca. 80% bei der
automatisierten Aus wertung erhöht
(1). Dafür
müssen
die Wells mittig platziert werden. Dies gelingt durch Markierungen,
die am Sucher der Kamera angebracht sind.
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Das
automatisierte Verfahren im direkten Vergleich zum manuellen Verfahren
Um zunächst
zu belegen, dass das etablierte manuelle Auszählverfahren und das neu entwickelte
automatisierte Verfahren zu vergleichbaren Ergebnissen führen, wurden
4 Wells einer laktatbehandelten Zellgruppe und 4 Wells einer Kontrollgruppe
mit beiden Verfahren ausgewertet. Da beide Verfahren unterschiedlich
große
Bereiche eines Wells auswerten, ist die registrierte Zahl gewanderter
Zellen sehr unterschiedlich (
7A,
7B).
Es wurde daher geprüft,
welche relativen, laktatinduzierten Veränderungen beide Verfahren erfassten
(
7A,
7B). Auch hier wurden nur Wells
desselben Membranfilters untereinander verglichen, so dass verbundene
Stichproben vorliegen. Das manuelle Verfahren liefert eine relative
Migrationssteigerung durch Laktat von 38%, das automatisierte Verfahren
ergab einen entsprechenden Anstieg von 34%. Damit wurde gezeigt,
dass das manuelle Verfahren und das automatisierte Verfahren zu
vergleichbaren Ergebnissen bei der Auswertung der Membranfilter
führen.
Der Variationskoeffizient, d. h. das Verhältnis von Standardabweichung
zum Mittelwert, ist beim automatisierten Verfahren jedoch deutlich
kleiner. Zur Beurteilung der Reproduzierbarkeit beider Verfahren wurden
dieselben 4 Wells der Kontrollgruppe im Abstand von mehreren Wochen
zur ersten Zählung
nochmals ausgewertet. Für
das manuelle Verfahren wurden die Gesichtsfelder anhand des gleichen
Protokolls ausgesucht und ausgezählt,
für das
automatisierte Verfahren wurden die Wells neu fotografiert, am Rechner
gefärbt und
die Zählbereiche
neu ausgewählt.
Bei der manuellen Methode beträgt
der Variationskoeffizient 10,7% gegenüber 4,5% bei der automatisierten
Methode (Tabelle 2). Anhand dieser Zahlen lässt sich eine erhöhte Reproduzierbarkeit
der mit Hilfe des Rechners gewonnenen Daten erkennen. Bei einer
Fallzahl von 4 ergab sich ein Korrelations-Koeffizient von 0,94
für die
Auszählung
des Rechners gegenüber
0,85 für
die Auszählung
der Gesichtsfelder. Der Korrelationskoeffizient ist eine statistische
Größe, die
den Grad der Übereinstimmung
der beiden Zählungen
widerspiegelt (
8A,
8B). Je
näher er
an 1 ist, desto höher
korrelieren die Werte. Auch diese Zahlen stellen dar, dass die Ergebnisse
der automatisierten Auszählung
besser reproduzierbar sind als die des manuellen Verfahrens. Dies
beruht im Wesentlichen auf einer größeren Anzahl ausgezählter Objekte. Tabelle 2: Statistische Auswertung zweier
Registrierungsmethoden. Dieselben Versuchsgruppen wurden zweimal
ausgezählt. „Wert 1”: Ergebnis
der ersten Auszählung, „Wert 2”: Ergebnis
der zweiten Auszählung, „VK (%)” = Variationskoeffizient
in% als Betrag.
| Methode | | Rechner | Auge |
| Einzelwerte | | Wert
1 | Wert
2 | VK
(%) | Wert
1 | Wert
2 | VK
(%) |
| | | 2443 | 2662 | 8,58 | 733 | 904 | 20,89 |
| | | 2187 | 2127 | 2,78 | 713 | 741 | 3,85 |
| | | 1820 | 1933 | 6,02 | 627 | 569 | 9,70 |
| | | 1971 | 1984 | 0,66 | 587 | 637 | 8,17 |
| Mittelwert | | 2105,3 | 2176,5 | 4,5 | 665,0 | 712,8 | 10,7 |
| Standard-Abweichung | | 270,9 | 333,9 | 3,5 | 69,4 | 145,8 | 7,3 |
| Korrelations-Koeffizient | | | 0,9405 | | | 0,8475 | |