WO2019091939A1 - Vorrichtung zur kultivierung und strahlungsinduzierten abtötung von zellen und verfahren zur untersuchung einer migration und/oder wundheilung - Google Patents

Vorrichtung zur kultivierung und strahlungsinduzierten abtötung von zellen und verfahren zur untersuchung einer migration und/oder wundheilung Download PDF

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WO2019091939A1
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WO
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biological cells
migration
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Joachim Wegener
Carina SCHMITTLEIN
Michael Skiba
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
Universität Regensburg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Definitions

  • a device which is suitable for culturing and radiation-induced killing of living biological cells.
  • the device contains a planar substrate and a functional layer applied to the planar substrate for wounding biological cells.
  • the functional layer contains at least one photosensitizer which is suitable for converting triplet oxygen into singlet oxygen by the action of electromagnetic radiation. This causes biological cells on the functional layer can be killed by irradiation of low-intensity electromagnetic radiation. It can be easily, quickly, gently, flexibly and inexpensively introduced into a cell layer at a locally defined location a wound and wound healing to be studied. Uses of the devices and a method for studying migration and / or wound healing of biological cells are presented.
  • the coordinated migration (migration) of adherent, animal (including human) cells as a group to intact cell-cell connections plays a key role in many physiological processes.
  • This process referred to as "col- lective cell migration,” can be observed not only during developmental processes, such as the rebuilding of organs in embryogenesis, but also in neovascularization, repair of injured tissue layers, or the healing of wounds in the healthy organism, but they also play a crucial role in the invasion and metastasis of malignant tumors, the latter being an example of deregulated pathological cell migration.
  • In vitro methods for studying the migration of animal cells are basically based on the principle that a cell-free region is created or maintained on a culture substrate (e.g., a petri dish). Around this area, the substrate is covered with cells. Cell-free regions can be subsequently created in an existing, continuous cell lawn by removing part of the cell layer mechanically, chemically, optically or electrically. This creates a wound in the cell lawn, which gave this type of procedure the name wound healing procedure.
  • mechanical barriers can also be used to ensure that a certain area of the sub- strates remains inaccessible to the cells and the cells can only settle around this area.
  • the experiment now determines the time it takes for the cells to migrate into the cell-free areas created subsequently by wounding or previously by barriers. The migration speed is calculated from the time required and the distance covered.
  • the various methods can be subdivided into mechanical, chemical, electrical or optical methods based on the principles used to wound the cell lawn.
  • the documentation of wound healing associated with the onset of cell migration is predominantly carried out by time-resolved microscopy and then image analysis.
  • an electrochemical migration process is an exception based on electrical trauma to the cell lawn and electrochemical observation of cell migration (see, for example, US 7,332,313 B2).
  • two approaches can be distinguished in the case of mechanical wounding, firstly targeted wounding of a continuous cell lawn by mechanical scraping of the cells and secondly blocking of a certain area of the culture surface during cell seeding, so that this area initially becomes inaccessible to the cells and in this way also a cell-free area in an otherwise continuous
  • a wound is inserted by means of a pointed object or by detachment of a PDMS layer applied to the culture substrate prior to cell seeding on which cells also grow Cells can migrate into the cell-free wound after wounding (see eg US 6,309,818 Bl).
  • this barrier is removed at a defined point in time, allowing the cells to migrate into the open area from that point onwards.
  • the barriers can be created in the desired form, for example by applying cytocompatible materials such as PDMS. Even liquid barriers such as oils or agarose gels are possible.
  • the migrating cells migrate into a cell-free region that is not covered with killed cells. The absence of dead cells or cell debris in the area of the wound was determined by scraping or
  • a disadvantage of mechanical and chemical wounding is that they do not allow investigation of cell migration into an area covered by dead cells and extracellular material, i. the examination in mechanical and chemical wounding corresponds less to the actual physiological conditions encountered in vivo.
  • the cells are cultured on a substrate which is functionalized with thin film gold electrodes.
  • the cells grow on the electrodes and adjacent areas. If the cell lawn is confluent, the cells on the electrodes are exposed to a lethal voltage or a lethal current dose. The cells in the periphery of the electrodes remain unaffected.
  • the size of the wound is exactly defined by the size of the electrodes. The wounding takes place without contact, because the feeding of the lethal voltage or the lethal current dose is controlled by software.
  • the documentation of the immigration of cells from the periphery is not carried out microscopically in the case of electrical wounding, but by measuring the electrode impedance, since the impedance of the electrode (at a suitable frequency of the alternating current used for measurement) is directly related to the degree of occupancy correlates with the electrodes, so that a microscopic documentation is unnecessary (see, for example, US 7,332,313 B2).
  • a variant of this method uses electrical voltage pulses to avoid population of the electrode in cell seeding.
  • the cells anchor on the culture substrate and form a continuous lawn while the electrode is kept free by the electrical pulses.
  • the start signal for immigration of the peripheral cells is applied to the electrode.
  • the migration of the cells to the electrode becomes quantitatively analyzable by impedance measurements and microscopic documentation becomes obsolete (see, for example, US 8,227,223 B2).
  • the electrical wounding is advantageous above all because of the high reproducibility, the possibility of automation, the highest parallelizability (throughput) and the independence of microscopes.
  • the temperature rise could produce a cellular response (eg, up-regulation of heat-shock proteins) that could positively or negatively affect cell migration.
  • the temperature entry could corrupt the result of the migration process.
  • the initial cost of an IR laser suitable for laser ablation is high, making the laser ablation process less economical.
  • Wound healing may be studied under as physiological conditions as possible, avoiding any influence from the study of interfering factors (e.g., sublethal heat on cells adjacent to an irradiation zone).
  • the object is achieved by the device having the features of claim 1, the method having the features of claim 9 and the use having the features of claim 15.
  • a device for cultivating and for radiation-induced killing of living biological cells comprising
  • the functional layer contains at least one photosensitizer, which is suitable, by the action of electromagnetic radiation (preferably with a wavelength in the range of the resonance wavelength of the photosensitiser) triplet oxygen ( 3 0 2 ) in singlet oxygen ( 1 0 2 ) to convert.
  • the functional layer for wounding biological cells biological cells can grow up (ie the functional layer is also suitable for the cultivation of biological cells).
  • a suspension of living biological cells in a culture medium may be added to the functional layer and incubated at 37 ° C.
  • the photosensitizer in the functional layer converts the triplet oxygen 3 0 2 present in the environment into singlet oxygen 1 0 2 , which because of its toxicity on the Substrate kills growing biological cells locally. Since the cells grow directly on the functional layer, the distance between the cells and the functional layer is small, but sufficient triplet oxygen is still present for conversion to the toxic singlet oxygen. Furthermore, it is ensured that the generated singlet oxygen can reach by diffusion the living cells on the surface of the functional layer.
  • suitable wavelength eg visible light
  • the device according to the invention makes a mechanical manipulation of the biological cells for their killing, which is predominantly regarded as the cause of poor reproducibility, unnecessary.
  • neither parts of a cell layer nor a previously introduced barrier need to be removed by an experimenter. This independence allows a very cost and labor efficient (automated) implementation.
  • the device according to the invention also has the advantage that singlet oxygen 1 0 2 has only a very short half-life, ie it is converted back into the non-toxic triplet oxygen 3 0 2 very rapidly. This causes only those cells that were found in the immediate vicinity of the point of origin of 1 0 2 , be killed. In practice, these are only those cells which directly contact the irradiated point of the functional layer. In other words, the device according to the invention can be used to locally very clearly damage cell populations or individual cells without affecting neighboring cells.
  • a wound produced by the device according to the invention contains cell components (cell debris) and extracellular matrix components. The migrating cells must - similar to the situation in vivo - remove the existing cell body first, before a lateral immigration is possible.
  • Radiation also allows a high precision of miracle generation and also a high flexibility in wound size and wound shape.
  • the similarly precise electrical device and the electrical wounding method can only be adapted with regard to the wound shape by changing the electrode shape, which on the one hand is considerably more complicated and on the other hand significantly limits the accessible wound geometries.
  • Another advantage of the device according to the invention is that the excitation of the photosensitizer for the conversion of 3 0 2 to 1 0 2 already occurs at low radiation intensities.
  • the energy input required for this purpose is significantly lower than, for example, the energy input that is required in the laser ablation of biological cells by an IR laser.
  • a simple optical microscope for the site-selective killing of the cells is already sufficient for the device according to the invention.
  • the device according to the invention does not require expensive IR lasers, it enables the user to carry out a simple and cost-effective investigation of cell migration and / or wound healing.
  • the assay may already be performed using standard equipment from a cell biological laboratory (e.g., a simple fluorescence microscope).
  • the study of cell migration and / or wound healing is less prone to IR radiation related confounders.
  • the heat development in spreads the irradiated area on the adjacent, unirradiated area and affects the cells located there.
  • Such an influence may be a change in the transcriptome and / or proteome of the neighboring living cells (eg an increased production of heat shock proteins), which have an (undesired) influence on the cell migration or on the effect of migration-changing substances can.
  • Such influence is avoided by the device according to the invention.
  • the device may be characterized in that the planar substrate comprises or consists of a material selected from the group consisting of glass, plastic and combinations thereof, the material preferably being selected from the group consisting of ceramic, metal, semiconductor, Glass, polycarbonate, polystyrene, PMMA, PEN, polyesters and combinations thereof.
  • the planar substrate preferably has a round or angular geometry.
  • the sheet substrate preferably has a hydrophilic surface, as it improves the adhesion of biological cells.
  • the substrate is sterilized by plasma treatment and / or hydrophilized. Advantage is an improved suitability for the culture of different adherent biological cells.
  • the planar substrate is transparent to electromagnetic radiation having a wavelength in a range selected from the group consisting of UV range, VIS range, IR range and combinations thereof, preferably in the VIS range.
  • This embodiment is advantageous because it permits irradiation of the electromagnetic radiation from a side facing away from the functional layer (and the living cells) (eg from "below” to the device) This makes it possible to define the point of damage even more precisely, since a Absorption and / or scattering of the irradiated electromagnetic radiation can be excluded by the biological cells and / or by culture medium or buffer medium.
  • the planar substrate for electromagnetic radiation having a wavelength in a range selected from the group of UV radiation Area, VIS area, IR range and combinations thereof, preferably in the VIS range, intransparent.
  • the planar substrate may have one or more walls (s) facing away from the functional layer. These walls can form one or more containers (so-called “wells” or “wells”) on the flat substrate.
  • the wall (s) may or may be monolithic with the planar substrate or connected in a liquid-tight manner to the planar substrate.
  • the connection can be cohesive, non-positive and / or positive.
  • the flat substrate with the walls forms a 6-well plate, 12-well plate, 24-well plate or 96-well plate. The more "wells” the plate has, the more individual examinations of the migration and / or wound healing of biological cells can be carried out simultaneously.A particularly when testing the influence of various active substances on the migration of the cells, a high throughput is a decisive advantage.
  • the functional layer may contain or consist of a material selected from the group consisting of an oxygen-permeable polymer (eg, a polymeric plastic), which material is preferably selected from the group consisting of polystyrene, PMMA, PEDOT, PDMS, and combinations thereof, the material being more preferably polystyrene.
  • the functional layer preferably has a hydrophilic surface, since it supports the adhesion of biological cells. Particularly preferably, the functional layer is sterilized by plasma treatment and / or hydrophilized. The advantage here is an improved suitability for the culture of different adherent biological cells.
  • the functional layer is transparent to electromagnetic radiation having a wavelength in a range selected from the group consisting of UV range, VIS range, IR range and combinations thereof, preferably in the VIS range.
  • This embodiment is advantageous because when the electromagnetic radiation is irradiated from a side facing away from the living cells (eg from "below” to the functional area). layer), the electromagnetic radiation with higher intensity reaches the side of the functional layer, which faces the living cells. This makes it possible to realize the destruction of the biological cells with a lower radiation intensity.
  • both the substrate and the functional layer for visible light are transparent, there is also the advantage that the cells cultivated on the surface of the substrate can be examined with the aid of a microscope with inverse optics and thus also the cell migration after the wounding can be documented. Furthermore, in combination with an automated microscope, a fully automated investigation of a migration and / or wound healing of biological cells is possible, which significantly increases the throughput of such examinations.
  • a microscope as a radiation source, the size and shape of the wound, depending on the cell type, are very flexible over the exposure parameters and over the travel path of the microscope.
  • the wound size can also be fine-tuned by the optics used (lens magnification and / or filters used).
  • the functional layer may have a thickness in the range of 1 to 100 ⁇ m, preferably
  • a functional layer having a thickness in this range means that the device according to the invention can be provided economically without loss of function.
  • the functional layer may be preparable or prepared by a coating process, which is preferably selected from the group consisting of spin coating, knife coating, spray coating and combinations thereof.
  • the thickness of the functional layer can be regulated, for example, by the rotational speed in the spin coating, wherein the functional layer, after complete evaporation of the solvent, contains a polymer matrix (oxygen permeable) in which the photosensitiser is embedded.
  • a mixture of polymer and photosensitizer For example, with the aid of the "spin coating” process (spin coating), it can be applied to a wide variety of flat substrates, so that it is possible to coat surfaces of different sizes with the functional layer.
  • the at least one photosensitizer is suitable for electromagnetic radiation having a wavelength in a range selected from the group consisting of UV range, VIS range, IR range and combinations thereof, preferably with a wavelength in the VIS range to absorb, wherein the at least one photosensitizer is preferably selected from the group consisting of molecules which are adapted to effect an energy transfer from the triplet energy state to the singlet energy state by means of electromagnetic radiation at oxygen.
  • the at least one photosensitizer is particularly preferably selected from the group consisting of luminophores which are suitable for phosphorescence.
  • the photosensitizer selected from the group consisting of photosensitizers having at least one porphyrin structure, photosensitizers having at least one naphthalene structure, photosensitizers having at least one triphenylmethane structure and combinations thereof, where the at least one photosensitizer, in particular platinum (II) 5,10,15,20-tetrakis (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) porphyrin, eosin, rose bengal, naphthalene and / or benzophenone, or consists thereof.
  • the invention further provides a method for investigating migration and / or wound healing of biological cells, comprising the steps
  • the observation of the migration of the living biological cells from outside the subarea into the subarea is advantageously carried out when the action of electromagnetic radiation has been stopped or at least reduced to an intensity at which at least in one area (edge area) of the subarea no biological cells ( more) die off.
  • the electromagnetic radiation used in the method can i) have one or more wavelengths which are in a range selected from the group consisting of UV range, VIS range, IR range and combinations thereof, preferably VIS range, particularly preferred in a range of the resonance wavelength of the photosensitiser, falls or falls; and or
  • ii) have a power in the range of 1 mW to 1 W; and / or iii) act on the subregion for a period of 1 second to 60 seconds; and or
  • iv) are generated via at least one radiation source selected from the group consisting of laser, one or more LED, mercury vapor lamp, metal halide lamp and combinations thereof, optionally together with an optical filter.
  • the living biological cells may be selected from the group consisting of animal cells, plant cells, microorganisms and mixtures thereof, wherein the living biological cells are preferably selected from the group consisting of animal cells (eg from at least one animal tissue), more preferably from the group consisting of animal cancer cells, cardiomyocytes, neuronal cells, liver cells, kidney cells, stem cells, epithelial cells, endothelial cells and combinations thereof.
  • a mask is arranged between the radiation source and the functional layer with the living cells, which mask allows the electromagnetic radiation to pass through within the partial area and absorbs and / or reflects outside the partial area.
  • a mask is advantageous in particular if the planar substrate has a plurality of containers (so-called "wells”) (for example, 96 "wells"), because then a suitable mask can be used over only a single exposure in each of the containers simultaneously kill the biological cells on a defined area. So it does not have to be traversed individually, for example with a laser, each of the containers (eg 96 pieces).
  • the time advantage associated with the use of the mask increases proportionally with the number of "wells" and, above all, makes high-throughput investigations more economical.
  • the portion of the layer of dead biological cells may be limited by an edge of at least 20%, preferably at least 40%, more preferably at least 60%, most preferably at least 80%, especially 100%, of its length adjacent to living biological cells.
  • monitoring involves migration of biological cells
  • a comparative characterization of different cell types preferably a comparison between healthy cells and cancer cells, a comparison of cancer cells with a different metastatic potential, a comparison between epithelial cells from different organs and / or a comparison of different immune cells, optionally in the presence of at least one added active ingredient or without drug addition.
  • the use of the device according to the invention for investigating a migration and / or wound healing of biological cells is proposed, preferably for finding chemical substances (active substances) which influence the migration of biological cells during wound healing, particularly preferably for finding active substances which Mig inhibition of cancer cells and / or finding agents that modulate the migration of immunocompetent cells.
  • FIG. 1 illustrates the functional principle of the device according to the invention.
  • the functional layer 2, which contains at least one photosensitizer, is applied to the planar substrate 1 of the device. Living biological
  • Cells 3 are locally irradiated with electromagnetic radiation 4 irradiated.
  • the locally limited exposure with light matching the absorption band of the photosensitizer leads to the locally limited formation of toxic but short-range singlet oxygen 1 0 2 .
  • This short-range singlet oxygen is cytotoxic and causes a locally very defined dying of located on the functional layer 2 biological cells 3, creating a free space on the functional layer 2 is formed. After the irradiation, it can be observed that the living biological cells migrate to the free space on the functional layer (see migration direction arrow 5).
  • FIG. 2 shows the functionality of the device according to the invention on the basis of a fluorescence microscopic image series.

Abstract

Es wird eine Vorrichtung bereitgestellt, die zur Kultivierung und strahlungsinduzierten Abtötung von lebenden biologischen Zellen geeignet ist. Die Vorrichtung enthält ein flächiges Substrat und eine auf dem flächigen Substrat aufgebrachte Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen. Die Funktionsschicht enthält mindestens einen Fotosensibilisator, der dazu geeignet ist, über Einwirken von elektromagnetischer Strahlung Triplett‐Sauerstoff in Singulett‐Sauerstoff umzuwandeln. Dies bewirkt, dass biologische Zellen auf der Funktionsschicht durch Einstrahlung von gering‐intensiver elektromagnetischer Strahlung abgetötet werden können. Es kann einfach, schnell, schonend, flexibel und kostengünstig an einer lokal definierten Stelle eine Wunde in eine Zellschicht eingebracht und die Wundheilung studiert werden. Verwendungen der Vorrichtungen und ein Verfahren zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen werden vorgestellt.

Description

VORRICHTUNG ZUR KULTIVIERUNG UND STRAHLUNGSINDUZIERTEN
ABTÖTUNG VON ZELLEN UND VERFAHREN ZUR UNTERSUCHUNG EINER MIGRATION UND/ODER WUNDHEILUNG
Es wird eine Vorrichtung bereitgestellt, die zur Kultivierung und strahlungsin- duzierten Abtötung von lebenden biologischen Zellen geeignet ist. Die Vorrichtung enthält ein flächiges Substrat und eine auf dem flächigen Substrat aufgebrachte Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen. Die Funktionsschicht enthält mindestens einen Fotosensibilisator, der dazu geeignet ist, über Einwirken von elektromagnetischer Strahlung Triplett-Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff umzuwandeln. Dies bewirkt, dass biologische Zellen auf der Funktionsschicht durch Einstrahlung von gering-intensiver elektromagnetischer Strahlung abgetötet werden können. Es kann einfach, schnell, schonend, flexibel und kostengünstig an einer lokal definierten Stelle eine Wunde in eine Zellschicht eingebracht und die Wundheilung studiert werden. Verwendungen der Vorrichtungen und ein Verfahren zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen werden vorgestellt. Die koordinierte Migration (Wanderung) von adhärenten, tierischen (auch menschlichen) Zellen als Gruppe unter Erhalt intakter Zell-Zell-Verbindungen spielt in vielen physiologischen Prozessen eine Schlüsselrolle. Dieser als„kol- lektive Zellmigration" bezeichnete Prozess kann nicht nur während Entwicklungsvorgängen, wie z.B. der Neubildung von Organen in der Embryogenese, beobachtet werden, sondern auch bei Gefäßneubildungen, Reparatur von verletzten Gewebsschichten oder der Heilung von Wunden. Migrierende Zellen treten zudem nicht nur im gesunden Organismus auf, sondern sie spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Invasion und Metastasenbildung von malignen Tumoren. Letzteres ist ein Beispiel für eine deregulierte pathologische Zellmigration.
Um ein besseres Verständnis der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen zu erlangen, welche die kollektive Zellmigration steuern und/oder beeinflussen, und um Faktoren zu entdecken, welche die Zellmigration fördern oder hemmen, werden experimentelle Testverfahren benötigt, die es erlauben, die Geschwindigkeit der Zellwanderung quantitativ zu bestimmen.
Experimente dieser Art werden vorzugsweise mit kultivierten Zellen außerhalb eines lebenden Organismus (in vitro) durchgeführt. Dadurch lassen sich potentielle pharmazeutische Wirkstoffe auf eine mögliche Beeinflussung der Zellmigration testen, ohne dazu auf Tierexperimente zurückgreifen zu müssen.
In-vitro-Verfahren zur Untersuchung der Migration tierischer Zellen basieren grundsätzlich auf dem Prinzip, dass auf einem Kultursubstrat (z.B. einer Petrischale) ein zellfreier Bereich geschaffen oder erhalten wird. Um diesen Bereich herum ist das Substrat mit Zellen bewachsen. Zellfreie Bereich können in einem bestehenden, kontinuierlichen Zellrasen nachträglich geschaffen werden, indem ein Teil der Zellschicht mechanisch, chemisch, optisch oder elektrisch entfernt wird. Dadurch entsteht eine Wunde im Zellrasen, was dieser Art von Verfahren den Namen Wundheilungs-Verfahren gab.
Alternativ kann bei der Besiedelung des Kultursubstrates auch durch mechanische Barrieren dafür gesorgt werden, dass ein bestimmter Bereich des Sub- strates für die Zellen unzugänglich bleibt und die Zellen sich nur um diesen Bereich herum ansiedeln können. Im Versuch wird nun die Zeit bestimmt, welche die Zellen brauchen, um in die nachträglich durch Verwundung oder vorausgehend durch Barrieren geschaffenen zellfreien Bereiche einzuwan- dem. Aus der dafür benötigten Zeit und der dabei zurückgelegten Strecke wird die Migrationsgeschwindigkeit berechnet.
Es sind im Stand der Technik verschiedene Arten von In-vitro-Wundheilungs- Verfahren oder In-vitro-Migrations-Verfahren für tierische Zellen bekannt, um die kollektive Wanderung von adhärenten Zellen in 2D zu untersuchen. Allen
Ansätzen gemein ist die Erzeugung eines zellfreien Bereiches - auch Wunde genannt - in einem intakten, das Kultursubstrat bedeckenden Zellrasen sowie die anschließende Dokumentation des kollektiven Einwanderns von Nachbarzellen, um den zellfreien Bereich wieder zu schließen (Wundheilung).
Die verschiedenen Verfahren lassen sich anhand der zur Verwundung des Zellrasens eingesetzten Prinzipien in mechanische, chemische, elektrische oder optische Verfahren unterteilen. Die Dokumentation der mit der einsetzenden Zellmigration einhergehenden Wundheilung erfolgt überwiegend durch zeit- aufgelöste Mikroskopie und anschließend Bildanalyse. In dieser Hinsicht stellt ein elektrochemisches Migrations-Verfahren eine Ausnahme dar, der auf einer elektrischen Verwundung des Zellrasens und einer elektrochemischen Beobachtung der Zellwanderung basiert (siehe z.B. US 7,332,313 B2). Bei den mechanischen Verwundungen sind prinzipiell zwei Vorgehensweise zu unterscheiden, erstens eine gezielte Verwundung eines kontinuierlichen Zellrasens durch mechanisches Abkratzen der Zellen und zweitens eine Blockierung eines bestimmten Bereiches der Kulturoberfläche bei Zellaussaat, so dass dieser Bereich für die Zellen zunächst nicht zugänglich wird und auf diese Weise ebenfalls ein zellfreier Bereich in einem ansonsten kontinuierlichen
Zellrasen entsteht. Bei der sehr häufig eingesetzten Methode des Abkratzen eines Teils der Zellschicht (,,scratch"-Verfahren) wird mit Hilfe eines spitzen Gegenstands oder durch Ablösen einer vor Zellaussaat auf das Kultursubstrat aufgebrachten PDMS Schicht, auf der ebenfalls Zellen wachsen, eine Wunde eingefügt. Die Zellen können nach der Verwundung in die zellfreie Wunde einwandern (siehe z.B. US 6,309,818 Bl). Bei den auf Einbringen einer Barriere basierenden Verfahren wird diese Barriere zu einem definierten Zeitpunkt entfernt, so dass ab diesem Zeitpunkt das Einwandern der Zellen in die freie Fläche möglich wird. Die Barrieren können, z.B. durch Aufbringen von cytokompatiblen Materialien wie PDMS, in gewünschter Form geschaffen werden. Auch flüssige Barrieren wie Öle oder Agarosegele sind möglich. Beiden mechanischen Verfahrens-Varianten gemeinsam ist, dass die wandernden Zellen in einen zellfreien Bereich einwandern, der nicht mit abgetöteten Zellen bedeckt ist. Die Abwesenheit von toten Zellen bzw. Zellresten im Bereich der Wunde wurde durch Abkratzen bzw.
Blockierung der Oberfläche erreicht. In diesem Punkt ist ein Nachteil der mechanischen Verfahren zu sehen, denn sie stellen die Verhältnisse im lebenden Organismus (in vivo) nur unzureichend nach, da die migrierenden Zellen bei der Wundheilung in vivo durch zurückgebliebene Zellreste hindurch migrieren müssen. Die mechanische Verwundung ist die am weitesten verbreitete Technik, was durch die Einfachheit der Durchführung und die Unabhängigkeit von einer aufwändigen Forschungsinfrastruktur bedingt ist. Diese Methode lässt aber im Hinblick auf Reproduzierbarkeit, Wundgeometrie und Automatisierbarkeit viele Anforderung unerfüllt.
Bei der chemischen Verwundung werden durch ein gezieltes, lokales Aufbringen von cytotoxischen Substanzen Zellen in einem ausgewählten Bereich des Zellrasens zur Lyse gebracht. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass ein gezieltes, lokales Aufbringen von IM NaOH-Lösung auf eine Zellschicht mit anschließender Neutralisation eine zellfreie Wundfläche entstehen lässt. Die chemische Verwundung ist wegen der schwierigen Kontrollierbarkeit und der daraus folgenden schlechten Reproduzierbarkeit wenig verbreitet.
Ein Nachteil der mechanischen und der chemischen Verwundung ist, dass sie keine Untersuchung der Zellmigration in eine von toten Zellen und extrazellulärem Material bedeckte Fläche erlauben, d.h. die Untersuchung entspricht bei der mechanischen und der chemischen Verwundung weniger den tatsächlichen in vivo anzutreffenden physiologischen Bedingungen.
Bei der elektrischen Verwundung werden die Zellen auf einem Substrat kultiviert, das mit Dünnfilmelektroden aus Gold funktionalisiert ist. Die Zellen wachsen auf den Elektroden und den angrenzenden Bereichen. Ist der Zellrasen konfluent, werden die Zellen auf den Elektroden einer lethalen Spannung bzw. einer lethalen Stromdosis ausgesetzt. Die Zellen in der Peripherie der Elektroden bleiben unbeeinflusst. Die Größe der Wunde ist durch die Größe der Elektroden exakt definiert. Die Verwundung erfolgt berührungslos, denn die Einspeisung der lethalen Spannung bzw. der lethalen Stromdosis erfolgt softwarekontrolliert. Im Gegensatz zu den meisten anderen Verfahren wird bei der elektrischen Verwundung die Dokumentation der Einwanderung der Zellen aus der Peripherie nicht mikroskopisch durchgeführt, sondern durch Messung der Elektrodenimpedanz, da die Impedanz der Elektrode (bei geeigneter Frequenz des zur Messung eingesetzten Wechselstromes) direkt mit dem Belegungsgrad der Elektroden korreliert, so dass eine mikroskopische Dokumentation unnötig wird (siehe z.B. US 7,332,313 B2).
Eine Variante dieses Verfahrens verwendet elektrische Spannungspulse, um eine Population der Elektrode bei Zellaussaat zu vermeiden. Um die Elektroden herum verankern sich die Zellen auf dem Kultursubstrat und bilden einen kontinuierlichen Rasen, während die Elektrode durch die elektrischen Pulse frei gehalten wird. Durch Abschalten der Pulse wird das Startsignal zum Einwandern der peripheren Zellen auf die Elektrode gegeben. Auch in diesem Fall wird das Einwandern der Zellen auf die Elektrode anhand von Impedanzmessungen quantitativ analysierbar und eine mikroskopische Dokumentation hinfällig (siehe z.B. US 8,227,223 B2). Die elektrische Verwundung ist vor allem wegen der hohen Reproduzierbarkeit, der Automatisierungsmöglichkeit, der höchsten Parallelisierbarkeit (Durchsatz) und der Unabhängigkeit von Mikroskopen vorteilhaft.
Bei der optischen Verwundung wird durch ein lokales Bestrahlen einer Zellschicht mittels IR-Laser lokal eine hohe Wärmeenergie in die Zellschicht ein- gebracht. Die durch den Laser lokal entstehende Wärme bewirkt eine temperaturbedingte Verwundung des Zellrasens. Diese Methode führt zu einheitlichen Wundflächen und wurde bereits mit der Hellfeldmikroskopie zur Dokumentation des Einwanderns der nicht verwundeten Zellen kombiniert und automatisiert. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass IR-Laser mit sehr hohen Strahlungsintensitäten benötigt werden, um den Temperaturanstieg in den zu verwundenden Zellen der Zellschicht zu bewirken. Diese IR-Laser sind kosten- intensiv in der Anschaffung. Ferner kann durch den Temperatureintrag nicht verhindert werden, dass sich der Temperaturanstieg zumindest teilweise auf benachbarte Zellen auswirkt, die unmittelbar an die vom Laser bestrahlte Fläche angrenzen. In diesen Zellen könnte der Temperaturanstieg eine Zellantwort erzeugen (z.B. Hochregulierung von Hitzeschockproteinen), welche die Migration der Zellen positiv oder negativ beeinflussen könnte. Anders ausgedrückt könnte der Temperatureintrag das Ergebnis des Migrationsverfahrens verfälschen. Darüberhinaus sind die Anschaffungskosten für einen zur Laser- ablation geeigneten IR-Laser hoch und machen das Laserablationsverfahren wenig ökonomisch.
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung bereitzustellen, mit der auf einfache, schnelle, schonende, flexible und kostengünstige Art und Weise an lokal definierten Stellen Wunden in eine Zellschicht (Zellrasen) eingebracht werden können und anschließend die
Wundheilung (Zellmigration) unter möglichst physiologischen Bedingungen studiert werden kann, wobei jeder Einfluss von die Untersuchung störender Faktoren (z.B. eine sublethale Hitzeeinwirkung auf Zellen neben einer Bestrahlungszone) vermieden werden sollte.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Vorrichtung mit den Merkmalen von Anspruch 1, das Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 9 und der Verwendung mit den Merkmalen von Anspruch 15.
Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zur Kultivierung und zur strahlungsin- duzierten Abtötung von lebenden biologischen Zellen bereitgestellt, enthaltend
a) ein flächiges Substrat; und
b) eine zumindest bereichsweise auf dem flächigen Substrat aufgebrachte Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen,
dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionsschicht mindestens einen Foto- sensibilisator enthält, der dazu geeignet ist, über Einwirken von elektromagnetischer Strahlung (bevorzugt mit einer Wellenlänge im Bereich der Resonanzwellenlänge des Fotosensibilisators) Triplett-Sauerstoff (302) in Singulett- Sauerstoff (102) umzuwandeln. Auf der Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen können biologische Zellen aufwachsen (d.h. die Funktionsschicht ist auch zur Kultivierung biologischer Zellen geeignet). Für das Aufwachsen kann beispielsweise eine Suspension lebender biologischer Zellen in einem Kulturmedium auf die Funktionsschicht gegeben und bei 37°C inkubiert werden. Bestrahlt man nun die Funktionsschicht mit elektromagnetischer Strahlung geeigneter Wellenlänge (z.B. sichtbares Licht), so wandelt der Fotosensibilisator in der Funktionsschicht den in der Umgebung befindlichen Triplett-Sauerstoff 302 in Singulett- Sauerstoff 102 um, der wegen seiner Toxizität die auf dem Substrat wachsenden biologischen Zellen lokal abtötet. Da die Zellen unmittelbar auf der Funktionsschicht aufwachsen, ist der Abstand zwischen den Zellen und der Funktionsschicht gering, aber dennoch ist ausreichend Triplett-Sauerstoff zur Umsetzung zu dem toxischen Singulett-Sauerstoff vorhanden. Ferner ist sichergestellt, dass der generierte Singulett-Sauerstoff per Diffusion die lebenden Zellen an der Oberfläche der Funktionsschicht erreichen kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung macht eine mechanische Manipulation der biologischen Zellen für deren Abtötung, die überwiegend als die Ursache schlechter Reproduzierbarkeit angesehen wird, unnötig. Es müssen bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung weder Teile einer Zellschicht noch eine zuvor eingeführte Barriere von einem Experimentator entfernt werden. Diese Unabhängigkeit erlaubt eine sehr kosten- und arbeitseffiziente (automatisierte) Durchführung.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist ferner den Vorteil auf, dass Singulett-Sauerstoff 102 eine nur sehr kurze Halbwertszeit aufweist, d.h. er wird sehr schnell in den nicht-toxischen Triplett-Sauerstoff 302 rückverwandelt. Dies bewirkt, dass nur solchen Zellen, die sich in unmittelbarer Nähe der Entstehungsstelle des 102 befunden haben, abgetötet werden. In der Praxis sind dies nur solche Zellen, die unmittelbar die bestrahlte Stelle der Funktionsschicht kontaktieren. Anders ausgedrückt lassen sich über die erfindungsgemäße Vorrichtung lokal sehr definiert Zellpopulationen oder auch Einzelzellen schädigen, ohne dass benachbarte Zellen in Mitleidenschaft gezogen werden. Eine mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzeugte Wunde enthält Zellbestandteile (Zelldebris) und extrazelluläre Matrixbestandteile. Die migrierenden Zellen müssen - analog zur Situation in vivo - die vorhandenen Zellkörper zunächst entfernen, bevor ein laterales Einwandern möglich wird. Diese Situa- tion kommt der physiologischen Situation in vivo sehr nah und auch deutlich näher als es bei den mechanisch bzw. chemisch erzeugten Wunden der Fall ist, da letztere keine extrazelluläre Matrix aufweisen bzw. bezüglich der extrazellulären Matrix völlig Undefiniert sind. Die Wunderzeugungsmöglichkeit durch Bestrahlung mit elektromagnetischer
Strahlung erlaubt zudem eine hohe Präzision der Wunderzeugung und zudem eine hohe Flexibilität bei der Wundgröße und bei der Wundform. Die ähnlich präzise elektrische Vorrichtung und das elektrische Verwundungsverfahren sind dagegen im Hinblick auf die Wundform nur durch einen Wechsel der Elektrodenform anpassbar, was einerseits deutlich aufwändiger ist und andererseits die zugänglichen Wundgeometrien deutlich einschränkt.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist, dass die Anregung des Fotosensibilisators zur Umwandlung von 302 zu 102 bereits bei nied- rigen Strahlungsintensitäten auftritt. Kurz gesagt ist der hierfür nötige Energieeintrag deutlich geringer als beispielsweise der Energieeintrag, der bei der Laserablation von biologischen Zellen durch einen IR-Laser nötig ist. Tatsächlich reicht bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung bereits ein einfaches, optisches Mikroskops für die ortsselektive Abtötung der Zellen.
Da die erfindungsgemäße Vorrichtung ohne teure IR-Laser auskommt, ermöglicht sie für den Anwender eine einfache und kostengünstige Untersuchung der Zellmigration und/oder der Wundheilung. Beispielsweise kann die Untersuchung bereits mithilfe einer Standardausstattung eines zellbiologisch arbei- tenden Labors (z.B. mit einem einfachen Fluoreszenzmikroskop) durchgeführt werden.
Da kein IR-Laser für die Abtötung der Zellen verwendet werden muss, ist die Untersuchung der Zellmigration und/oder Wundheilung zudem weniger anfäl- lig auf IR-Strahlung-bedingte Störfaktoren. Insbesondere wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung vermieden, dass sich die Wärmeentwicklung in dem bestrahlten Bereich auf den benachbarten, unbestrahlten Bereich ausbreitet und die dort befindlichen Zellen beeinflusst. Eine derartige Beeinflussung kann eine Veränderung im Transkriptom und/oder Proteom der benachbarten lebenden Zellen sein (z.B. eine verstärkte Produktion von Hitzeschock- Proteinen), was einen (unerwünschten) Einfluss auf die Zellmigration, bzw. auf die Wirkung von Migrations-verändernden Substanzen, nehmen kann. Ein solcher Einfluss wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung vermieden.
Die Vorrichtung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass das flächige Substrat ein Material enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas, Kunststoff und Kombinationen hiervon, wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Keramik, Metall, Halbleiter, Glas, Polycarbonat, Polystyrol, PMMA, PEN, Polyester und Kombinationen hiervon. Das flächige Substrat weist bevorzugt eine runde oder eine eckige Geometrie auf.
Das flächige Substrat weist bevorzugt eine hydrophile Oberfläche auf, da diese die Adhäsion von biologischen Zellen verbessert. Besonders bevorzugt ist das Substrat über Plasmabehandlung sterilisiert und/oder hydrophilisiert. Vorteil ist eine verbesserte Eignung für die Kultur von verschiedenen adhärenten biologischen Zellen.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist das flächige Substrat transparent für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt im VIS-Bereich. Vorteilhaft ist diese Ausgestaltung deshalb, da sie ein Einstrahlen der elektromagnetischen Strahlung von einer der Funktionsschicht (und den lebenden Zellen) abgewandten Seite (z.B. von„unten" auf die Vorrichtung) erlaubt. Dies ermöglicht es, die Schädigungsstelle noch präzisier zu definieren, da eine Absorption und/oder Streuung der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung durch die biologischen Zellen und/oder durch Kulturmedium bzw. Puffermedium ausgeschlossen werden können.
Alternativ kann das flächige Substrat für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV- Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt im VIS-Bereich, intransparent sein.
Das flächige Substrat kann eine oder mehrere von der Funktionsschicht abge- wandte Wandung(en) aufweisen. Diese Wandungen können eine oder mehrere Behälter (sog.„well" oder„wells") auf dem flächigen Substrat ausbilden. Die Wandung(en) kann oder können monolithisch mit dem flächigen Substrat sein oder mit dem flächigen Substrat flüssigkeitsdicht verbunden sein. Die Verbindung kann stoffschlüssig, kraftschlüssig und/oder formschlüssig sein. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn das flächige Substrat mit den Wandungen eine 6-well-Platte, 12-well-Platte, 24-well-Platte oder 96-well-Platte ausbildet. Je mehr„wells" die Platte aufweist, desto mehr einzelne Untersuchungen der Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen können zeitgleich durchgeführt werden. Insbesondere bei einer Testung eines Einflusses verschiedener Wirkstoffe auf die Migration der Zellen ist ein hoher Durchsatz ein entscheidender Vorteil.
Die Funktionsschicht kann ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoff-durchlässigen Polymer (z.B. ein polymerer Kunststoff), wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, PMMA, PEDOT, PDMS und Kombinationen hiervon, wobei das Material besonders bevorzugt Polystyrol ist. Die Funktionsschicht weist bevorzugt eine hydrophile Oberfläche auf, da diese die Adhäsion von biologischen Zellen unterstützt. Besonders bevorzugt ist die Funktionsschicht über Plasmabehandlung sterilisiert und/oder hydrophilisiert. Vorteil hierbei ist eine verbesserte Eignung für die Kultur von verschiedenen adhärenten biologischen Zellen.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist die Funktionsschicht transparent für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt im VIS-Bereich. Diese Ausgestaltung ist vorteil- haft, da bei einem Einstrahlen der elektromagnetischen Strahlung von einer den lebenden Zellen abgewandten Seite (z.B. von„unten" auf die Funktions- schicht) die elektromagnetische Strahlung mit höherer Intensität bis zur Seite der Funktionsschicht gelangt, die den lebenden Zellen zugewandt ist. Dies ermöglicht es, die Abtötung der biologischen Zellen mit einer geringeren Strahlungsintensität zu realisieren.
Ist sowohl das Substrat als auch die Funktionsschicht für sichtbares Licht transparent ergibt sich zudem der Vorteil, dass sich die auf der Oberfläche des Substrates kultivierten Zellen mit Hilfe eines Mikroskops mit inverser Optik untersuchen lassen und hiermit auch die Zellmigration nach der Verwundung dokumentiert werden kann. In Kombination mit einem automatisierten Mikroskop ist ferner eine komplett automatisierte Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen möglich, was den Durchsatz solcher Untersuchungen maßgeblich erhöht. Im Falle eines Mikroskops als Strahlungsquelle sind die Größe und Form der Wunde abhängig vom Zelltyp sehr flexibel über die Belichtungsparameter und über den Fahrweg der Mikroskop-
Optik (Anpassung der Bestrahlungsfläche) einstellbar. Die Wundgröße kann ferner durch die eingesetzte Optik (Objektivvergrößerung und/oder eingesetzte Filter) feinjustiert werden. Die Funktionsschicht kann eine Dicke im Bereich von 1 bis 100 μιη, bevorzugt
2 bis 60 μιη, besonders bevorzugt 3 bis 40 μιη, ganz besonders bevorzugt 4 bis 20 μιη, insbesondere 5 bis 10 μιη, aufweisen. Je dünner die Funktionsschicht, desto weniger Fotosensibilisator muss eingesetzt werden. Da Fotosensibilisa- toren sehr teuer sein können (z.B. Platin(ll)-5,10,15,20-tetrakis(2,3,4,5,6- pentafluorphenyl)-porphyrin) bedeutet eine Funktionsschicht mit einer Dicke in diesem Bereich, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung ohne Funktionsverlust ökonomischer bereitgestellt werden kann.
Die Funktionsschicht kann über ein Beschichtungsverfahren herstellbar sein oder hergestellt sein, das bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rotationsbeschichtung, Rakelbeschichtung, Sprühbeschichtung und Kombinationen hiervon. Die Dicke der Funktionsschicht kann beispielsweise durch die Drehgeschwindigkeit bei der Rotationsbeschichtung reguliert werden, wobei die Funktionsschicht nach einem vollständigen Verdampfen des Lösungs- mittels eine Polymermatrix (sauerstoffpermeabel) enthält, in die der Fotosensibilisator eingebettet ist. Eine Mischung aus Polymer und Fotosensibilisator kann beispielsweise mit Hilfe des„Spincoating"-Prozesses (Rotationsbeschich- tung) auf verschiedenste flächige Substrate aufgebracht werden, so dass die Beschichtung verschieden großer Flächen mit der Funktionsschicht möglich ist.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist der mindestens eine Fotosensibi- lisator dazu geeignet, elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR- Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt mit einer Wellenlänge im VIS- Bereich, zu absorbieren, wobei der mindestens eine Fotosensibilisator bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Molekülen, die dazu geeignet sind, mithilfe elektromagnetischer Strahlung bei Sauerstoff einen Energietransfer aus dem Triplett-Energiezustand zu dem Singulett-Energiezustand zu bewirken. Besonders bevorzugt ist der mindestens eine Fotosensibilisator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Luminophoren, die zur Phosphoreszenz geeignet sind. Ganz besonders bevorzugt ist der Fotosensibilisator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fotosensibilisatoren mit mindestens einer Porphyrin-Struktur, Fotosensibilisatoren mit mindestens einer Naphthalin-Struktur, Fotosensibilisatoren mit mindestens einer Triphenylmethan-Struktur und Kombinationen hiervon, wobei der mindestens eine Fotosensibilisator insbesondere Platin(ll)-5,10,15,20-tetrakis(2,3,4,5,6- pentafluorphenyl)-porphyrin, Eosin, Bengalrosa, Naphthalin und/oder Benzophenon enthält oder daraus besteht. Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen bereitgestellt, umfassend die Schritte
a) Einwirken von elektromagnetischer Strahlung aus einer Strahlungsquelle auf einen Teilbereich einer Schicht von lebenden biologischen Zellen, die sich auf einer Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen einer
Vorrichtung gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche befindet, sodass die biologischen Zellen in dem Teilbereich absterben; und
b) Beobachten einer Migration von lebenden biologischen Zellen von außerhalb des Teilbereichs in den Teilbereich hinein. Die Beobachtung der Migration der lebenden biologischen Zellen von außerhalb des Teilbereichs in den Teilbereich hinein erfolgt vorteilhafterweise dann, wenn das Einwirken von elektromagnetischer Strahlung gestoppt oder zumindest auf eine Intensität reduziert wurde, bei der zumindest in einem Bereich (Randbereich) des Teilbereichs keine biologischen Zellen (mehr) absterben.
Die in dem Verfahren eingesetzte elektromagnetische Strahlung kann i) eine oder mehrere Wellenlänge(n) aufweisen, die in einen Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt VIS-Bereich, besonders bevorzugt in einen Bereich der Resonanzwellenlänge des Fotosensibilisators, fällt oder fallen; und/oder
ii) eine Leistung im Bereich von 1 mW bis 1 W aufweisen; und/oder iii) für einen Zeitraum von 1 sec bis 60 sec auf den Teilbereich einwirken; und/oder
iv) über mindestens eine Strahlungsquelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Laser, einer oder mehrerer LED, Quecksilberdampflampe, Metallhalid-Lampe und Kombinationen hiervon erzeugt werden, optional zusammen mit einem optischen Filter.
Die lebenden biologischen Zellen können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen, Mikroorganismen und Mischungen hiervon, wobei die lebenden biologischen Zellen bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen (z.B. aus mindestens einem tierischen Gewebe), besonders bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus tierischen Krebszellen, Cardiomyocyten, neuronalen Zellen, Leberzellen, Nierenzellen, Stammzellen, Epithelzellen, Endothelzellen und Kombinationen hiervon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist oder wird zwischen der Strahlungsquelle und der Funktionsschicht mit den lebenden Zellen eine Maske angeordnet, welche die elektromagnetische Strahlung innerhalb des Teilbereichs passieren lässt und außerhalb des Teilbereichs absorbiert und/oder reflektiert. Der Einsatz einer Maske ist insbesondere dann von Vorteil, wenn das flächige Substrat mehrere Behälter (sog.„wells") aufweist (z.B. 96„wells"), denn dann kann über eine geeignete Maske über nur eine einzelne Belichtung in jedem der Behälter gleichzeitig eine Abtötung der biologischen Zellen auf einer definierten Fläche erfolgen. Es muss also nicht beispielsweise mit einem Laser jeder der Behälter (z.B. 96 Stück) einzeln abgefahren werden. Der mit dem Einsatz der Maske verbundene Zeitvorteil steigt proportional mit der Anzahl der„wells" an und macht vor allem Hochdurchsatz-Untersuchungen ökonomischer.
Nach dem Einwirken von elektromagnetischer Strahlung kann der Teilbereich der Schicht abgestorbener biologischer Zellen durch einen Rand begrenzt sein, der auf mindestens 20%, bevorzugt mindestens 40%, besonders bevorzugt mindestens 60%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80%, insbesondere 100%, seiner Länge an lebende biologische Zellen angrenzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Beobachten einer Migra- tion von biologischen Zellen
i) die Zugabe einer Substanz auf die lebenden Zellen, von der ein migrati- onsfördernder oder migrationshemmender Einfluss auf die lebenden biologischen Zellen vermutet wird; und/oder
ii) die Bestimmung einer Geschwindigkeit, mit der die lebenden biologi- sehen Zellen in den Teilbereich migrieren; und/oder
iii) die Bestimmung einer Zeit, bis der gesamte Teilbereich von lebenden biologischen Zellen bedeckt ist; und/oder
iv) eine vergleichende Charakterisierung verschiedener Zelltypen, bevorzugt einen Vergleich zwischen gesunden Zellen und Krebszellen, einen Ver- gleich von Krebszellen mit einem unterschiedlichen metastatischen Potential, einen Vergleich zwischen Epithelzellen aus verschiedenen Organen und/oder einen Vergleich von verschiedenen Immunzellen, optional in Gegenwart mindestens eines zugegebenen Wirkstoffs oder ohne Wirkstoffzugabe.
Darüberhinaus wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen vorgeschlagen, bevorzugt zum Auffinden von chemischen Substanzen (Wirkstoffe), welche die Migration biologischer Zellen bei der Wundheilung beein- flussen, besonders bevorzugt zum Auffinden von Wirkstoffen, welche die Mig- ration von Krebszellen hemmen und/oder zum Auffinden von Wirkstoffen, welche die Migration von immunkompetenten Zellen modulieren.
Anhand der nachfolgenden Figuren soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten spezifischen
Ausgestaltungsformen einschränken zu wollen.
Figur 1 stellt das Funktionsprinzip der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar. Auf dem flächigen Substrat 1 der Vorrichtung ist die Funktionsschicht 2 aufge- bracht, die mindestens einen Fotosensibilisator enthält. Lebende biologische
Zellen 3 werden lokal begrenzt mit elektromagnetischer Strahlung 4 bestrahlt. Die lokal begrenzte Belichtung mit zur Absorptionsbande des Fotosensibilisa- tors passenden Lichts führt zur lokal begrenzten Entstehung von toxischem, aber kurzreichweitigem Singulett-Sauerstoff 102. Dieser kurzreichweitige Singulett-Sauerstoff ist zelltoxisch und bewirkt ein lokal sehr definiertes Absterben der auf der Funktionsschicht 2 befindlichen biologischen Zellen 3, wodurch ein Freiraum auf der Funktionsschicht 2 entsteht. Es kann nach der Bestrahlung beobachtet werden, dass die lebenden biologischen Zellen in den entstandenen Freiraum auf der Funktionsschicht migrieren (siehe Migrations- richtungspfeil 5).
Figur 2 zeigt anhand einer fluoreszenzmikroskopischen Bilderserie die Funktionalität der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Zunächst wurde eine konfluente Zellschicht auf der Funktionsschicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung kultiviert. Durch Bestrahlung mit Laserlicht geeigneter Wellenlänge, fokussiert durch das 10x-Objektiv eines Fluoreszenzmikroskops, wurden die Zellen entlang eines nahezu horizontalen Streifens im Zellrasen durch die gezielte und ortsselektive Freisetzung von 102 abgetötet, wodurch ein Teilbereich 6 der Funktionsschicht entsteht, der abgestorbene Zellen aufweist. Anschließend wurden die Zellen einer etablierten Lebend-Tod-Färbung unterzogen. Der
Funktionstest dokumentiert durch die Lebend-Tod-Kontrastierung die Einführung einer nahezu horizontalen Wunde (siehe Teilbereich 6 der Funktionsschicht mit abgestorbenen Zellen) in einen ansonsten kontinuierlichen Zellrasen (siehe Teilbereich 7 der Funktionsschicht mit lebenden Zellen). Mit zu- nehmender Zeit migrieren die Zellen aus der Peripherie 7 in die neu geschaffene Wunde 6, ersetzen die noch vorhandenen toten Zellen und verschließen die Wunde. Die Aufnahme bei 0 h zeigt die Zellschicht unmittelbar nach der Bestrahlung mit einem VIS-Laser entlang eines horizontalen Streifens. Ebenfalls dargestellt ist die Zellschicht nach 3 Stunden, sechs Stunden, neun Stunden und 24 Stunden Regenerationszeit.
Bezugszeichenliste:
1: flächiges Substrat;
2: Funktionsschicht;
3: biologische Zellen;
4: elektromagnetische Strahlung;
5: Zellmigrationsrichtung;
6: Teilbereich der Funktionsschicht mit abgestorbenen Zellen;
7: Teilbereich der Funktionsschicht mit lebenden Zellen.

Claims

Patentansprüche
Vorrichtung zur Kultivierung und zur strahlungsinduzierten Abtötung von lebenden biologischen Zellen, enthaltend
a) ein flächiges Substrat; und
b) eine zumindest bereichsweise auf dem flächigen Substrat aufgebrachte Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionsschicht mindestens einen Fotosensibilisator enthält, der dazu geeignet ist, über Einwirken von elektromagnetischer Strahlung Triplett-Sauerstoff in Singulett- Sauerstoff umzuwandeln.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das flächige Substrat ein Material enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas, Kunststoff und Kombinationen hiervon, wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Keramik, Metall, Halbleiter, Glas, Polycarbonat, Polystyrol, PMMA , PEN, Polyester und Kombinationen hiervon.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das flächige Substrat
i) transparent ist für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV- Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt im VIS-Bereich; oder
ii) intransparent ist für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV- Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt im VIS-Bereich. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionsschicht ein Material enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoff-durchlässigen Polymer, wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, PMMA, PEDOT, PDMS und Kombinationen hiervon, wobei das Material besonders bevorzugt Polystyrol ist.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionsschicht transparent ist für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt im VIS-Bereich.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionsschicht eine Dicke im Bereich von 1 bis 100 μιη, bevorzugt 2 bis 60 μιη, besonders bevorzugt 3 bis 40 μιη, ganz besonders bevorzugt 4 bis 20 μιη, insbesondere 5 bis 10 μιη, aufweist.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionsschicht über ein Beschichtungsver- fahren herstellbar ist oder hergestellt ist, das bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rotationsbeschichtung, Rakelbeschich- tung, Sprühbeschichtung und Kombinationen hiervon.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Fotosensibilisator dazu geeignet ist, elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt mit einer Wellenlänge im VIS-Bereich, zu absorbieren, wobei der mindestens eine Fotosensibilisator bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Molekülen, die dazu geeignet sind, mithilfe elektromagnetischer Strahlung bei Sauerstoff einen Energietransfer aus dem Triplett- Energiezustand zu dem Singulett-Energiezustand zu bewirken, wobei der mindestens eine Fotosensibilisator besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe der Luminophore, die zur Phosphoreszenz geeignet sind, wobei der der mindestens eine Fotosensibilisator ganz besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fo- tosensibilisatoren mit mindestens einer Porphyrin-Struktur, Fotosensi- bilisatoren mit mindestens einer Naphthalin-Struktur, Fotosensibilisa- toren mit mindestens einer Triphenylmethan-Struktur und Kombinationen hiervon, wobei der mindestens eine Fotosensibilisator insbesondere Platin(ll)-5,10,15,20-tetrakis(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)- porphyrin , Eosin, Bengalrosa, Naphthalin und/oder Benzophenon enthält oder daraus besteht.
Verfahren zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen, umfassend die Schritte
a) Einwirken von elektromagnetischer Strahlung aus einer Strahlungsquelle auf einen Teilbereich einer Schicht von lebenden biologischen Zellen, die sich auf einer Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen einer Vorrichtung gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche befindet, sodass die biologischen Zellen in dem Teilbereich absterben; und
b) Untersuchen einer Migration von lebenden biologischen Zellen von außerhalb des Teilbereichs in den Teilbereich hinein.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Strahlung
i) eine oder mehrere Wellenlänge(n) aufweist, die in einen Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR- Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt VIS-Bereich, besonders bevorzugt in einen Bereich der Resonanzwellenlänge des Fotosensibilisators, fällt oder fallen; und/oder
ii) eine Leistung im Bereich von 1 mW bis 1 W aufweist; und/oder iii) für einen Zeitraum von lsek bis 60 sek auf den Teilbereich einwirkt; und/oder iv) über mindestens eine Strahlungsquelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Laser, einer oder mehrerer LEDs, Quecksilberdampflampe, Metallhalid-Lampe und Kombinationen hiervon erzeugt wird, optional zusammen mit einem optischen Filter.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die lebenden biologischen Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen, Mikroorganismen und Mischungen hiervon, wobei die lebenden biologischen Zellen bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen, besonders bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus tierischen Krebszellen, Cardiomyocyten, neuronalen Zellen, Leberzellen, Nierenzellen, Stammzellen, Epithelzellen, Endothelzellen und Kombinationen hiervon.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Strahlungsquelle und der Funktionsschicht mit den lebenden Zellen eine Maske angeordnet ist oder wird, welche die elektromagnetische Strahlung innerhalb des Teilbereichs passieren lässt und außerhalb des Teilbereichs absorbiert und/oder reflektiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Einwirken von elektromagnetischer Strahlung der Teilbereich der Schicht abgestorbener biologischer Zellen durch einen Rand begrenzt ist, der auf mindestens 20%, bevorzugt mindestens 40%, besonders bevorzugt mindestens 60%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80%, insbesondere 100%, seiner Länge an lebende biologische Zellen angrenzt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Untersuchen einer Migration von biologischen Zellen
i) die Zugabe einer Substanz auf die lebenden Zellen umfasst, von der ein migrationsfördernder oder migrationshemmender Einfluss auf die lebenden biologischen Zellen vermutet wird; und/oder ii) die Bestimmung einer Geschwindigkeit umfasst, mit der die lebenden biologischen Zellen in den Teilbereich migrieren; und/oder iii) die Bestimmung einer Zeit umfasst, bis der gesamte Teilbereich von lebenden biologischen Zellen bedeckt ist; und/oder iv) eine vergleichende Charakterisierung verschiedener Zelltypen umfasst, bevorzugt einen Vergleich zwischen gesunden Zellen und Krebszellen, einen Vergleich von Krebszellen mit einem unterschiedlichen metastatischen Potential, einen Vergleich zwischen Epithelzellen aus verschiedenen Organen und/oder einen Vergleich von verschiedenen Immunzellen, optional in Gegenwart mindestens eines zugegebenen Wirkstoffs oder ohne Wirkstoffzugabe.
Verwendung der Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen, bevorzugt zum Auffinden von Wirkstoffen, welche die Migration biologischer Zellen bei der Wundheilung beeinflussen, besonders bevorzugt zum Auffinden von Wirkstoffen, welche die Migration von Krebszellen hemmen und/oder zum Auffinden von Wirkstoffen, welche die Migration von immunkompetenten Zellen modulieren.
PCT/EP2018/080229 2017-11-10 2018-11-06 Vorrichtung zur kultivierung und strahlungsinduzierten abtötung von zellen und verfahren zur untersuchung einer migration und/oder wundheilung WO2019091939A1 (de)

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US16/762,462 US11578298B2 (en) 2017-11-10 2018-11-06 Device for the cultivation of and radiation-induced killing of cells and method for analyzing a migration and/or healing of a wound

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DE102017220067.7A DE102017220067B4 (de) 2017-11-10 2017-11-10 Vorrichtung zur Kultivierung und strahlungsinduzierten Abtötung von lebenden biologischen Zellen, Verwendungen der Vorrichtung und Verfahren zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen

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