-
Es wird eine Vorrichtung bereitgestellt, die zur Kultivierung und strahlungsinduzierten Abtötung von lebenden biologischen Zellen geeignet ist. Die Vorrichtung enthält ein flächiges Substrat und eine auf dem flächigen Substrat aufgebrachte Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen. Die Funktionsschicht enthält mindestens einen Fotosensibilisator, der dazu geeignet ist, über Einwirken von elektromagnetischer Strahlung Triplett-Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff umzuwandeln. Dies bewirkt, dass biologische Zellen auf der Funktionsschicht durch Einstrahlung von gering-intensiver elektromagnetischer Strahlung abgetötet werden können. Es kann einfach, schnell, schonend, flexibel und kostengünstig an einer lokal definierten Stelle eine Wunde in eine Zellschicht eingebracht und die Wundheilung studiert werden. Verwendungen der Vorrichtungen und ein Verfahren zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen werden vorgestellt.
-
Die koordinierte Migration (Wanderung) von adhärenten, tierischen (auch menschlichen) Zellen als Gruppe unter Erhalt intakter Zell-Zell-Verbindungen spielt in vielen physiologischen Prozessen eine Schlüsselrolle. Dieser als „kollektive Zellmigration“ bezeichnete Prozess kann nicht nur während Entwicklungsvorgängen, wie z.B. der Neubildung von Organen in der Embryogenese, beobachtet werden, sondern auch bei Gefäßneubildungen, Reparatur von verletzten Gewebsschichten oder der Heilung von Wunden. Migrierende Zellen treten zudem nicht nur im gesunden Organismus auf, sondern sie spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Invasion und Metastasenbildung von malignen Tumoren. Letzteres ist ein Beispiel für eine deregulierte pathologische Zellmigration.
-
Um ein besseres Verständnis der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen zu erlangen, welche die kollektive Zellmigration steuern und/oder beeinflussen, und um Faktoren zu entdecken, welche die Zellmigration fördern oder hemmen, werden experimentelle Testverfahren benötigt, die es erlauben, die Geschwindigkeit der Zellwanderung quantitativ zu bestimmen.
-
Experimente dieser Art werden vorzugsweise mit kultivierten Zellen außerhalb eines lebenden Organismus (in vitro) durchgeführt. Dadurch lassen sich potentielle pharmazeutische Wirkstoffe auf eine mögliche Beeinflussung der Zellmigration testen, ohne dazu auf Tierexperimente zurückgreifen zu müssen.
-
In-vitro-Verfahren zur Untersuchung der Migration tierischer Zellen basieren grundsätzlich auf dem Prinzip, dass auf einem Kultursubstrat (z.B. einer Petrischale) ein zellfreier Bereich geschaffen oder erhalten wird. Um diesen Bereich herum ist das Substrat mit Zellen bewachsen. Zellfreie Bereich können in einem bestehenden, kontinuierlichen Zellrasen nachträglich geschaffen werden, indem ein Teil der Zellschicht mechanisch, chemisch, optisch oder elektrisch entfernt wird. Dadurch entsteht eine Wunde im Zellrasen, was dieser Art von Verfahren den Namen Wundheilungs-Verfahren gab.
-
Alternativ kann bei der Besiedelung des Kultursubstrates auch durch mechanische Barrieren dafür gesorgt werden, dass ein bestimmter Bereich des Substrates für die Zellen unzugänglich bleibt und die Zellen sich nur um diesen Bereich herum ansiedeln können. Im Versuch wird nun die Zeit bestimmt, welche die Zellen brauchen, um in die nachträglich durch Verwundung oder vorausgehend durch Barrieren geschaffenen zellfreien Bereiche einzuwandern. Aus der dafür benötigten Zeit und der dabei zurückgelegten Strecke wird die Migrationsgeschwindigkeit berechnet.
-
Es sind im Stand der Technik verschiedene Arten von In-vitro-Wundheilungs-Verfahren oder In-vitro-Migrations-Verfahren für tierische Zellen bekannt, um die kollektive Wanderung von adhärenten Zellen in 2D zu untersuchen. Allen Ansätzen gemein ist die Erzeugung eines zellfreien Bereiches - auch Wunde genannt - in einem intakten, das Kultursubstrat bedeckenden Zellrasen sowie die anschließende Dokumentation des kollektiven Einwanderns von Nachbarzellen, um den zellfreien Bereich wieder zu schließen (Wundheilung).
-
Die verschiedenen Verfahren lassen sich anhand der zur Verwundung des Zellrasens eingesetzten Prinzipien in mechanische, chemische, elektrische oder optische Verfahren unterteilen. Die Dokumentation der mit der einsetzenden Zellmigration einhergehenden Wundheilung erfolgt überwiegend durch zeitaufgelöste Mikroskopie und anschließend Bildanalyse. In dieser Hinsicht stellt ein elektrochemisches Migrations-Verfahren eine Ausnahme dar, der auf einer elektrischen Verwundung des Zellrasens und einer elektrochemischen Beobachtung der Zellwanderung basiert (siehe z.B.
US 7,332,313 B2 ).
-
Bei den mechanischen Verwundungen sind prinzipiell zwei Vorgehensweise zu unterscheiden, erstens eine gezielte Verwundung eines kontinuierlichen Zellrasens durch mechanisches Abkratzen der Zellen und zweitens eine Blockierung eines bestimmten Bereiches der Kulturoberfläche bei Zellaussaat, so dass dieser Bereich für die Zellen zunächst nicht zugänglich wird und auf diese Weise ebenfalls ein zellfreier Bereich in einem ansonsten kontinuierlichen Zellrasen entsteht. Bei der sehr häufig eingesetzten Methode des Abkratzen eines Teils der Zellschicht („scratch“-Verfahren) wird mit Hilfe eines spitzen Gegenstands oder durch Ablösen einer vor Zellaussaat auf das Kultursubstrat aufgebrachten PDMS Schicht, auf der ebenfalls Zellen wachsen, eine Wunde eingefügt. Die Zellen können nach der Verwundung in die zellfreie Wunde einwandern (siehe z.B.
US 6,309,818 B1 ).
-
Bei den auf Einbringen einer Barriere basierenden Verfahren wird diese Barriere zu einem definierten Zeitpunkt entfernt, so dass ab diesem Zeitpunkt das Einwandern der Zellen in die freie Fläche möglich wird. Die Barrieren können, z.B. durch Aufbringen von cytokompatiblen Materialien wie PDMS, in gewünschter Form geschaffen werden. Auch flüssige Barrieren wie Öle oder Agarosegele sind möglich. Beiden mechanischen Verfahrens-Varianten gemeinsam ist, dass die wandernden Zellen in einen zellfreien Bereich einwandern, der nicht mit abgetöteten Zellen bedeckt ist. Die Abwesenheit von toten Zellen bzw. Zellresten im Bereich der Wunde wurde durch Abkratzen bzw. Blockierung der Oberfläche erreicht. In diesem Punkt ist ein Nachteil der mechanischen Verfahren zu sehen, denn sie stellen die Verhältnisse im lebenden Organismus (in vivo) nur unzureichend nach, da die migrierenden Zellen bei der Wundheilung in vivo durch zurückgebliebene Zellreste hindurch migrieren müssen. Die mechanische Verwundung ist die am weitesten verbreitete Technik, was durch die Einfachheit der Durchführung und die Unabhängigkeit von einer aufwändigen Forschungsinfrastruktur bedingt ist. Diese Methode lässt aber im Hinblick auf Reproduzierbarkeit, Wundgeometrie und Automatisierbarkeit viele Anforderung unerfüllt.
-
Bei der chemischen Verwundung werden durch ein gezieltes, lokales Aufbringen von cytotoxischen Substanzen Zellen in einem ausgewählten Bereich des Zellrasens zur Lyse gebracht. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass ein gezieltes, lokales Aufbringen von 1M NaOH-Lösung auf eine Zellschicht mit anschließender Neutralisation eine zellfreie Wundfläche entstehen lässt. Die chemische Verwundung ist wegen der schwierigen Kontrollierbarkeit und der daraus folgenden schlechten Reproduzierbarkeit wenig verbreitet.
-
Ein Nachteil der mechanischen und der chemischen Verwundung ist, dass sie keine Untersuchung der Zellmigration in eine von toten Zellen und extrazellulärem Material bedeckte Fläche erlauben, d.h. die Untersuchung entspricht bei der mechanischen und der chemischen Verwundung weniger den tatsächlichen in vivo anzutreffenden physiologischen Bedingungen.
-
Bei der elektrischen Verwundung werden die Zellen auf einem Substrat kultiviert, das mit Dünnfilmelektroden aus Gold funktionalisiert ist. Die Zellen wachsen auf den Elektroden und den angrenzenden Bereichen. Ist der Zellrasen konfluent, werden die Zellen auf den Elektroden einer lethalen Spannung bzw. einer lethalen Stromdosis ausgesetzt. Die Zellen in der Peripherie der Elektroden bleiben unbeeinflusst. Die Größe der Wunde ist durch die Größe der Elektroden exakt definiert. Die Verwundung erfolgt berührungslos, denn die Einspeisung der lethalen Spannung bzw. der lethalen Stromdosis erfolgt softwarekontrolliert. Im Gegensatz zu den meisten anderen Verfahren wird bei der elektrischen Verwundung die Dokumentation der Einwanderung der Zellen aus der Peripherie nicht mikroskopisch durchgeführt, sondern durch Messung der Elektrodenimpedanz, da die Impedanz der Elektrode (bei geeigneter Frequenz des zur Messung eingesetzten Wechselstromes) direkt mit dem Belegungsgrad der Elektroden korreliert, so dass eine mikroskopische Dokumentation unnötig wird (siehe z.B.
US 7,332,313 B2 ).
-
Eine Variante dieses Verfahrens verwendet elektrische Spannungspulse, um eine Population der Elektrode bei Zellaussaat zu vermeiden. Um die Elektroden herum verankern sich die Zellen auf dem Kultursubstrat und bilden einen kontinuierlichen Rasen, während die Elektrode durch die elektrischen Pulse frei gehalten wird. Durch Abschalten der Pulse wird das Startsignal zum Einwandern der peripheren Zellen auf die Elektrode gegeben. Auch in diesem Fall wird das Einwandern der Zellen auf die Elektrode anhand von Impedanzmessungen quantitativ analysierbar und eine mikroskopische Dokumentation hinfällig (siehe z.B.
US 8,227,223 B2 ). Die elektrische Verwundung ist vor allem wegen der hohen Reproduzierbarkeit, der Automatisierungsmöglichkeit, der höchsten Parallelisierbarkeit (Durchsatz) und der Unabhängigkeit von Mikroskopen vorteilhaft.
-
Bei der optischen Verwundung wird durch ein lokales Bestrahlen einer Zellschicht mittels IR-Laser lokal eine hohe Wärmeenergie in die Zellschicht eingebracht. Die durch den Laser lokal entstehende Wärme bewirkt eine temperaturbedingte Verwundung des Zellrasens. Diese Methode führt zu einheitlichen Wundflächen und wurde bereits mit der Hellfeldmikroskopie zur Dokumentation des Einwanderns der nicht verwundeten Zellen kombiniert und automatisiert. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass IR-Laser mit sehr hohen Strahlungsintensitäten benötigt werden, um den Temperaturanstieg in den zu verwundenden Zellen der Zellschicht zu bewirken. Diese IR-Laser sind kostenintensiv in der Anschaffung. Ferner kann durch den Temperatureintrag nicht verhindert werden, dass sich der Temperaturanstieg zumindest teilweise auf benachbarte Zellen auswirkt, die unmittelbar an die vom Laser bestrahlte Fläche angrenzen. In diesen Zellen könnte der Temperaturanstieg eine Zellantwort erzeugen (z.B. Hochregulierung von Hitzeschockproteinen), welche die Migration der Zellen positiv oder negativ beeinflussen könnte. Anders ausgedrückt könnte der Temperatureintrag das Ergebnis des MigrationsVerfahrens verfälschen. Darüberhinaus sind die Anschaffungskosten für einen zur Laserablation geeigneten IR-Laser hoch und machen das Laserablationsverfahren wenig ökonomisch.
-
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung bereitzustellen, mit der auf einfache, schnelle, schonende, flexible und kostengünstige Art und Weise an lokal definierten Stellen Wunden in eine Zellschicht (Zellrasen) eingebracht werden können und anschließend die Wundheilung (Zellmigration) unter möglichst physiologischen Bedingungen studiert werden kann, wobei jeder Einfluss von die Untersuchung störender Faktoren (z.B. eine sublethale Hitzeeinwirkung auf Zellen neben einer Bestrahlungszone) vermieden werden sollte.
-
Die Aufgabe wird gelöst durch die Vorrichtung mit den Merkmalen von Anspruch 1, das Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 9 und der Verwendung mit den Merkmalen von Anspruch 15.
-
Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zur Kultivierung und zur strahlungsinduzierten Abtötung von lebenden biologischen Zellen bereitgestellt, enthaltend
- a) ein flächiges Substrat; und
- b) eine zumindest bereichsweise auf dem flächigen Substrat aufgebrachte Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen,
dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionsschicht mindestens einen Fotosensibilisator enthält, der dazu geeignet ist, über Einwirken von elektromagnetischer Strahlung (bevorzugt mit einer Wellenlänge im Bereich der Resonanzwellenlänge des Fotosensibilisators) Triplett-Sauerstoff (3O2) in Singulett-Sauerstoff (1O2) umzuwandeln.
-
Auf der Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen können biologische Zellen aufwachsen (d.h. die Funktionsschicht ist auch zur Kultivierung biologischer Zellen geeignet). Für das Aufwachsen kann beispielsweise eine Suspension lebender biologischer Zellen in einem Kulturmedium auf die Funktionsschicht gegeben und bei 37°C inkubiert werden. Bestrahlt man nun die Funktionsschicht mit elektromagnetischer Strahlung geeigneter Wellenlänge (z.B. sichtbares Licht), so wandelt der Fotosensibilisator in der Funktionsschicht den in der Umgebung befindlichen Triplett-Sauerstoff 3O2 in Singulett-Sauerstoff 1O2 um, der wegen seiner Toxizität die auf dem Substrat wachsenden biologischen Zellen lokal abtötet. Da die Zellen unmittelbar auf der Funktionsschicht aufwachsen, ist der Abstand zwischen den Zellen und der Funktionsschicht gering, aber dennoch ist ausreichend Triplett-Sauerstoff zur Umsetzung zu dem toxischen Singulett-Sauerstoff vorhanden. Ferner ist sichergestellt, dass der generierte Singulett-Sauerstoff per Diffusion die lebenden Zellen an der Oberfläche der Funktionsschicht erreichen kann.
-
Die erfindungsgemäße Vorrichtung macht eine mechanische Manipulation der biologischen Zellen für deren Abtötung, die überwiegend als die Ursache schlechter Reproduzierbarkeit angesehen wird, unnötig. Es müssen bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung weder Teile einer Zellschicht noch eine zuvor eingeführte Barriere von einem Experimentator entfernt werden. Diese Unabhängigkeit erlaubt eine sehr kosten- und arbeitseffiziente (automatisierte) Durchführung.
-
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist ferner den Vorteil auf, dass Singulett-Sauerstoff 1O2 eine nur sehr kurze Halbwertszeit aufweist, d.h. er wird sehr schnell in den nicht-toxischen Triplett-Sauerstoff 3O2 rückverwandelt. Dies bewirkt, dass nur solchen Zellen, die sich in unmittelbarer Nähe der Entstehungsstelle des 1O2 befunden haben, abgetötet werden. In der Praxis sind dies nur solche Zellen, die unmittelbar die bestrahlte Stelle der Funktionsschicht kontaktieren. Anders ausgedrückt lassen sich über die erfindungsgemäße Vorrichtung lokal sehr definiert Zellpopulationen oder auch Einzelzellen schädigen, ohne dass benachbarte Zellen in Mitleidenschaft gezogen werden.
-
Eine mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzeugte Wunde enthält Zellbestandteile (Zelldebris) und extrazelluläre Matrixbestandteile. Die migrierenden Zellen müssen - analog zur Situation in vivo - die vorhandenen Zellkörper zunächst entfernen, bevor ein laterales Einwandern möglich wird. Diese Situation kommt der physiologischen Situation in vivo sehr nah und auch deutlich näher als es bei den mechanisch bzw. chemisch erzeugten Wunden der Fall ist, da letztere keine extrazelluläre Matrix aufweisen bzw. bezüglich der extrazellulären Matrix völlig undefiniert sind.
-
Die Wunderzeugungsmöglichkeit durch Bestrahlung mit elektromagnetischer Strahlung erlaubt zudem eine hohe Präzision der Wunderzeugung und zudem eine hohe Flexibilität bei der Wundgröße und bei der Wundform. Die ähnlich präzise elektrische Vorrichtung und das elektrische Verwundungsverfahren sind dagegen im Hinblick auf die Wundform nur durch einen Wechsel der Elektrodenform anpassbar, was einerseits deutlich aufwändiger ist und andererseits die zugänglichen Wundgeometrien deutlich einschränkt.
-
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist, dass die Anregung des Fotosensibilisators zur Umwandlung von 3O2 zu 1O2 bereits bei niedrigen Strahlungsintensitäten auftritt. Kurz gesagt ist der hierfür nötige Energieeintrag deutlich geringer als beispielsweise der Energieeintrag, der bei der Laserablation von biologischen Zellen durch einen IR-Laser nötig ist. Tatsächlich reicht bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung bereits ein einfaches, optisches Mikroskops für die ortsselektive Abtötung der Zellen.
-
Da die erfindungsgemäße Vorrichtung ohne teure IR-Laser auskommt, ermöglicht sie für den Anwender eine einfache und kostengünstige Untersuchung der Zellmigration und/oder der Wundheilung. Beispielsweise kann die Untersuchung bereits mithilfe einer Standardausstattung eines zellbiologisch arbeitenden Labors (z.B. mit einem einfachen Fluoreszenzmikroskop) durchgeführt werden.
-
Da kein IR-Laser für die Abtötung der Zellen verwendet werden muss, ist die Untersuchung der Zellmigration und/oder Wundheilung zudem weniger anfällig auf IR-Strahlung-bedingte Störfaktoren. Insbesondere wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung vermieden, dass sich die Wärmeentwicklung in dem bestrahlten Bereich auf den benachbarten, unbestrahlten Bereich ausbreitet und die dort befindlichen Zellen beeinflusst. Eine derartige Beeinflussung kann eine Veränderung im Transkriptom und/oder Proteom der benachbarten lebenden Zellen sein (z.B. eine verstärkte Produktion von HitzeschockProteinen), was einen (unerwünschten) Einfluss auf die Zellmigration, bzw. auf die Wirkung von Migrations-verändernden Substanzen, nehmen kann. Ein solcher Einfluss wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung vermieden.
-
Die Vorrichtung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass das flächige Substrat ein Material enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas, Kunststoff und Kombinationen hiervon, wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Keramik, Metall, Halbleiter, Glas, Polycarbonat, Polystyrol, PMMA, PEN, Polyester und Kombinationen hiervon. Das flächige Substrat weist bevorzugt eine runde oder eine eckige Geometrie auf.
-
Das flächige Substrat weist bevorzugt eine hydrophile Oberfläche auf, da diese die Adhäsion von biologischen Zellen verbessert. Besonders bevorzugt ist das Substrat über Plasmabehandlung sterilisiert und/oder hydrophilisiert. Vorteil ist eine verbesserte Eignung für die Kultur von verschiedenen adhärenten biologischen Zellen.
-
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist das flächige Substrat transparent für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt im VIS-Bereich. Vorteilhaft ist diese Ausgestaltung deshalb, da sie ein Einstrahlen der elektromagnetischen Strahlung von einer der Funktionsschicht (und den lebenden Zellen) abgewandten Seite (z.B. von „unten“ auf die Vorrichtung) erlaubt. Dies ermöglicht es, die Schädigungsstelle noch präzisier zu definieren, da eine Absorption und/oder Streuung der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung durch die biologischen Zellen und/oder durch Kulturmedium bzw. Puffermedium ausgeschlossen werden können.
-
Alternativ kann das flächige Substrat für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt im VIS-Bereich, intransparent sein.
-
Das flächige Substrat kann eine oder mehrere von der Funktionsschicht abgewandte Wandung(en) aufweisen. Diese Wandungen können eine oder mehrere Behälter (sog. „well“ oder „wells“) auf dem flächigen Substrat ausbilden. Die Wandung(en) kann oder können monolithisch mit dem flächigen Substrat sein oder mit dem flächigen Substrat flüssigkeitsdicht verbunden sein. Die Verbindung kann stoffschlüssig, kraftschlüssig und/oder formschlüssig sein. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn das flächige Substrat mit den Wandungen eine 6-well-Platte, 12-well-Platte, 24-well-Platte oder 96-well-Platte ausbildet. Je mehr „wells“ die Platte aufweist, desto mehr einzelne Untersuchungen der Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen können zeitgleich durchgeführt werden. Insbesondere bei einer Testung eines Einflusses verschiedener Wirkstoffe auf die Migration der Zellen ist ein hoher Durchsatz ein entscheidender Vorteil.
-
Die Funktionsschicht kann ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoff-durchlässigen Polymer (z.B. ein polymerer Kunststoff), wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, PMMA, PEDOT, PDMS und Kombinationen hiervon, wobei das Material besonders bevorzugt Polystyrol ist.
-
Die Funktionsschicht weist bevorzugt eine hydrophile Oberfläche auf, da diese die Adhäsion von biologischen Zellen unterstützt. Besonders bevorzugt ist die Funktionsschicht über Plasmabehandlung sterilisiert und/oder hydrophilisiert. Vorteil hierbei ist eine verbesserte Eignung für die Kultur von verschiedenen adhärenten biologischen Zellen.
-
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist die Funktionsschicht transparent für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt im VIS-Bereich. Diese Ausgestaltung ist vorteilhaft, da bei einem Einstrahlen der elektromagnetischen Strahlung von einer den lebenden Zellen abgewandten Seite (z.B. von „unten“ auf die Funktionsschicht) die elektromagnetische Strahlung mit höherer Intensität bis zur Seite der Funktionsschicht gelangt, die den lebenden Zellen zugewandt ist. Dies ermöglicht es, die Abtötung der biologischen Zellen mit einer geringeren Strahlungsintensität zu realisieren.
-
Ist sowohl das Substrat als auch die Funktionsschicht für sichtbares Licht transparent ergibt sich zudem der Vorteil, dass sich die auf der Oberfläche des Substrates kultivierten Zellen mit Hilfe eines Mikroskops mit inverser Optik untersuchen lassen und hiermit auch die Zellmigration nach der Verwundung dokumentiert werden kann. In Kombination mit einem automatisierten Mikroskop ist ferner eine komplett automatisierte Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen möglich, was den Durchsatz solcher Untersuchungen maßgeblich erhöht. Im Falle eines Mikroskops als Strahlungsquelle sind die Größe und Form der Wunde abhängig vom Zelltyp sehr flexibel über die Belichtungsparameter und über den Fahrweg der Mikroskop-Optik (Anpassung der Bestrahlungsfläche) einstellbar. Die Wundgröße kann ferner durch die eingesetzte Optik (Objektivvergrößerung und/oder eingesetzte Filter) feinjustiert werden.
-
Die Funktionsschicht kann eine Dicke im Bereich von 1 bis 100 µm, bevorzugt 2 bis 60 µlm, besonders bevorzugt 3 bis 40 µm, ganz besonders bevorzugt 4 bis 20 µlm, insbesondere 5 bis 10 µm, aufweisen. Je dünner die Funktionsschicht, desto weniger Fotosensibilisator muss eingesetzt werden. Da Fotosensibilisatoren sehr teuer sein können (z.B. Platin(II)-5,10,15,20-tetrakis(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin) bedeutet eine Funktionsschicht mit einer Dicke in diesem Bereich, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung ohne Funktionsverlust ökonomischer bereitgestellt werden kann.
-
Die Funktionsschicht kann über ein Beschichtungsverfahren herstellbar sein oder hergestellt sein, das bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rotationsbeschichtung, Rakelbeschichtung, Sprühbeschichtung und Kombinationen hiervon. Die Dicke der Funktionsschicht kann beispielsweise durch die Drehgeschwindigkeit bei der Rotationsbeschichtung reguliert werden, wobei die Funktionsschicht nach einem vollständigen Verdampfen des Lösungsmittels eine Polymermatrix (sauerstoffpermeabel) enthält, in die der Fotosensibilisator eingebettet ist. Eine Mischung aus Polymer und Fotosensibilisator kann beispielsweise mit Hilfe des „Spincoating“-Prozesses (Rotationsbeschichtung) auf verschiedenste flächige Substrate aufgebracht werden, so dass die Beschichtung verschieden großer Flächen mit der Funktionsschicht möglich ist.
-
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist der mindestens eine Fotosensibilisator dazu geeignet, elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt mit einer Wellenlänge im VIS-Bereich, zu absorbieren, wobei der mindestens eine Fotosensibilisator bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Molekülen, die dazu geeignet sind, mithilfe elektromagnetischer Strahlung bei Sauerstoff einen Energietransfer aus dem Triplett-Energiezustand zu dem Singulett-Energiezustand zu bewirken. Besonders bevorzugt ist der mindestens eine Fotosensibilisator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Luminophoren, die zur Phosphoreszenz geeignet sind. Ganz besonders bevorzugt ist der Fotosensibilisator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fotosensibilisatoren mit mindestens einer Porphyrin-Struktur, Fotosensibilisatoren mit mindestens einer Naphthalin-Struktur, Fotosensibilisatoren mit mindestens einer Triphenylmethan-Struktur und Kombinationen hiervon, wobei der mindestens eine Fotosensibilisator insbesondere Platin(II)-5,10,15,20-tetrakis(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin, Eosin, Bengalrosa, Naphthalin und/oder Benzophenon enthält oder daraus besteht.
-
Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen bereitgestellt, umfassend die Schritte
- a) Einwirken von elektromagnetischer Strahlung aus einer Strahlungsquelle auf einen Teilbereich einer Schicht von lebenden biologischen Zellen, die sich auf einer Funktionsschicht zur Verwundung biologischer Zellen einer Vorrichtung gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche befindet, sodass die biologischen Zellen in dem Teilbereich absterben; und
- b) Beobachten einer Migration von lebenden biologischen Zellen von außerhalb des Teilbereichs in den Teilbereich hinein.
-
Die Beobachtung der Migration der lebenden biologischen Zellen von außerhalb des Teilbereichs in den Teilbereich hinein erfolgt vorteilhafterweise dann, wenn das Einwirken von elektromagnetischer Strahlung gestoppt oder zumindest auf eine Intensität reduziert wurde, bei der zumindest in einem Bereich (Randbereich) des Teilbereichs keine biologischen Zellen (mehr) absterben.
-
Die in dem Verfahren eingesetzte elektromagnetische Strahlung kann
- i) eine oder mehrere Wellenlänge(n) aufweisen, die in einen Bereich ausgewählt aus der Gruppe aus UV-Bereich, VIS-Bereich, IR-Bereich und Kombinationen hiervon, bevorzugt VIS-Bereich, besonders bevorzugt in einen Bereich der Resonanzwellenlänge des Fotosensibilisators, fällt oder fallen; und/oder
- ii) eine Leistung im Bereich von 1 mW bis 1 W aufweisen; und/oder
- iii) für einen Zeitraum von 1 sec bis 60 sec auf den Teilbereich einwirken; und/oder
- iv) über mindestens eine Strahlungsquelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Laser, einer oder mehrerer LED, Quecksilberdampflampe, Metallhalid-Lampe und Kombinationen hiervon erzeugt werden, optional zusammen mit einem optischen Filter.
-
Die lebenden biologischen Zellen können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen, Mikroorganismen und Mischungen hiervon, wobei die lebenden biologischen Zellen bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen (z.B. aus mindestens einem tierischen Gewebe), besonders bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus tierischen Krebszellen, Cardiomyocyten, neuronalen Zellen, Leberzellen, Nierenzellen, Stammzellen, Epithelzellen, Endothelzellen und Kombinationen hiervon.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform ist oder wird zwischen der Strahlungsquelle und der Funktionsschicht mit den lebenden Zellen eine Maske angeordnet, welche die elektromagnetische Strahlung innerhalb des Teilbereichs passieren lässt und außerhalb des Teilbereichs absorbiert und/oder reflektiert. Der Einsatz einer Maske ist insbesondere dann von Vorteil, wenn das flächige Substrat mehrere Behälter (sog. „wells“) aufweist (z.B. 96 „wells“), denn dann kann über eine geeignete Maske über nur eine einzelne Belichtung in jedem der Behälter gleichzeitig eine Abtötung der biologischen Zellen auf einer definierten Fläche erfolgen. Es muss also nicht beispielsweise mit einem Laser jeder der Behälter (z.B. 96 Stück) einzeln abgefahren werden. Der mit dem Einsatz der Maske verbundene Zeitvorteil steigt proportional mit der Anzahl der „wells“ an und macht vor allem Hochdurchsatz-Untersuchungen ökonomischer.
-
Nach dem Einwirken von elektromagnetischer Strahlung kann der Teilbereich der Schicht abgestorbener biologischer Zellen durch einen Rand begrenzt sein, der auf mindestens 20%, bevorzugt mindestens 40%, besonders bevorzugt mindestens 60%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80%, insbesondere 100%, seiner Länge an lebende biologische Zellen angrenzt.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Beobachten einer Migration von biologischen Zellen
- i) die Zugabe einer Substanz auf die lebenden Zellen, von der ein migrationsfördernder oder migrationshemmender Einfluss auf die lebenden biologischen Zellen vermutet wird; und/oder
- ii) die Bestimmung einer Geschwindigkeit, mit der die lebenden biologischen Zellen in den Teilbereich migrieren; und/oder
- iii) die Bestimmung einer Zeit, bis der gesamte Teilbereich von lebenden biologischen Zellen bedeckt ist; und/oder
- iv) eine vergleichende Charakterisierung verschiedener Zelltypen, bevorzugt einen Vergleich zwischen gesunden Zellen und Krebszellen, einen Vergleich von Krebszellen mit einem unterschiedlichen metastatischen Potential, einen Vergleich zwischen Epithelzellen aus verschiedenen Organen und/oder einen Vergleich von verschiedenen Immunzellen, optional in Gegenwart mindestens eines zugegebenen Wirkstoffs oder ohne Wirkstoffzugabe.
-
Darüberhinaus wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Untersuchung einer Migration und/oder Wundheilung biologischer Zellen vorgeschlagen, bevorzugt zum Auffinden von chemischen Substanzen (Wirkstoffe), welche die Migration biologischer Zellen bei der Wundheilung beeinflussen, besonders bevorzugt zum Auffinden von Wirkstoffen, welche die Migration von Krebszellen hemmen und/oder zum Auffinden von Wirkstoffen, welche die Migration von immunkompetenten Zellen modulieren.
-
Anhand der nachfolgenden Figuren soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten spezifischen Ausgestaltungsformen einschränken zu wollen.
-
1 stellt das Funktionsprinzip der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar. Auf dem flächigen Substrat 1 der Vorrichtung ist die Funktionsschicht 2 aufgebracht, die mindestens einen Fotosensibilisator enthält. Lebende biologische Zellen 3 werden lokal begrenzt mit elektromagnetischer Strahlung 4 bestrahlt. Die lokal begrenzte Belichtung mit zur Absorptionsbande des Fotosensibilisators passenden Lichts führt zur lokal begrenzten Entstehung von toxischem, aber kurzreichweitigem Singulett-Sauerstoff 1O2. Dieser kurzreichweitige Singulett-Sauerstoff ist zelltoxisch und bewirkt ein lokal sehr definiertes Absterben der auf der Funktionsschicht 2 befindlichen biologischen Zellen 3, wodurch ein Freiraum auf der Funktionsschicht 2 entsteht. Es kann nach der Bestrahlung beobachtet werden, dass die lebenden biologischen Zellen in den entstandenen Freiraum auf der Funktionsschicht migrieren (siehe Migrationsrichtungspfeil 5).
-
2 zeigt anhand einer fluoreszenzmikroskopischen Bilderserie die Funktionalität der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Zunächst wurde eine konfluente Zellschicht auf der Funktionsschicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung kultiviert. Durch Bestrahlung mit Laserlicht geeigneter Wellenlänge, fokussiert durch das 10x-Objektiv eines Fluoreszenzmikroskops, wurden die Zellen entlang eines nahezu horizontalen Streifens im Zellrasen durch die gezielte und ortsselektive Freisetzung von 1O2 abgetötet, wodurch ein Teilbereich 6 der Funktionsschicht entsteht, der abgestorbene Zellen aufweist. Anschließend wurden die Zellen einer etablierten Lebend-Tod-Färbung unterzogen. Der Funktionstest dokumentiert durch die Lebend-Tod-Kontrastierung die Einführung einer nahezu horizontalen Wunde (siehe Teilbereich 6 der Funktionsschicht mit abgestorbenen Zellen) in einen ansonsten kontinuierlichen Zellrasen (siehe Teilbereich 7 der Funktionsschicht mit lebenden Zellen). Mit zunehmender Zeit migrieren die Zellen aus der Peripherie 7 in die neu geschaffene Wunde 6, ersetzen die noch vorhandenen toten Zellen und verschließen die Wunde. Die Aufnahme bei 0 h zeigt die Zellschicht unmittelbar nach der Bestrahlung mit einem VIS-Laser entlang eines horizontalen Streifens. Ebenfalls dargestellt ist die Zellschicht nach 3 Stunden, sechs Stunden, neun Stunden und 24 Stunden Regenerationszeit.
-
Bezugszeichenliste
-
- 1:
- flächiges Substrat;
- 2:
- Funktionsschicht;
- 3:
- biologische Zellen;
- 4:
- elektromagnetische Strahlung;
- 5:
- Zellmigrationsrichtung;
- 6:
- Teilbereich der Funktionsschicht mit abgestorbenen Zellen;
- 7:
- Teilbereich der Funktionsschicht mit lebenden Zellen.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- US 7332313 B2 [0008, 0013]
- US 6309818 B1 [0009]
- US 8227223 B2 [0014]