DE202010017793U1

DE202010017793U1 - Analytische Methode und Sensor

Info

Publication number: DE202010017793U1
Application number: DE202010017793U
Authority: DE
Original assignee: Attana AB
Current assignee: Attana AB
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2012-08-31
Anticipated expiration: 2020-03-20
Also published as: US8802410B2; WO2010106331A2; JP5706393B2; EP2409153A2; JP2012521000A; CN102356315A; US20120198920A1; WO2010106331A8; WO2010106331A3; EP2409153B1

Abstract

Massensensitiver chemischer Sensor, wobei der chemische Sensor inaktivierte Zellen aufweist, die an en sind, und wobei der chemische Sensor zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Analytliganden und den gebundenen, inaktiven Zellen mittels Änderung der Masse an der Sensoroberfläche aufgrund der Bindung des Analytliganden an die Zellen geeignet ist, wobei der Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet ist oder einen Teil einer Durchflusszelle bildet, und wobei die normale Biochemie der Zellen aufgrund der Inaktivierung der Zellen im Wesentlichen arretiert ist, so dass die Zellen im Wesentlichen nicht mehr wachsen können.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine analytische Methode und einen Sensor, der zur Durchführung der Methode geeignet ist. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Methode zur Herstellung eines massensensitiven chemischen Sensors, der die Bindung einer Analytenspezies an eine Oberfläche, die Zellen umfasst, nachweisen kann.
Ein massensensitiver chemischer Sensor kann als Vorrichtung definiert werden, die die Messung einer Eigenschaft ermöglicht, die proportional zur Masse ist, die mit einer Messoberfläche der Vorrichtung assoziiert oder an diese gebunden ist. Es können verschiedene derartige Sensortechniken zum Einsatz kommen, wie zum Beispiel Sensoren auf Basis von evaneszenten Wellen, z. B. Oberflächenplasmonenresonanz (SPR, welche Massenänderungen anhand der damit assoziierten Änderung des Brechungsindex an der Oberfläche anzeigen kann), optische Wellenleiter (auch von Änderungen des Brechungsindex abhängig, der mit dem Auftreten von Massenbindung assoziiert ist), optische Beugung, optische Interferenz, Ellipsometrie und akustische Wellenvorrichtungen (z. B. Quarzkristallmikrowaagen (QCMs)). Diese Ansätze für Sensoren haben sich im Fachbereich etabliert (siehe zum Beispiel Biomolecular Sensors, Gizeli und Lowe. Taylor und Francis, London; 2002), und diese Instrumententypen können für Studien von chemischen Reaktionen in situ und zum Nachweis bestimmter Moleküle in einer Probe verwendet werden.
Ein QCM-System nutzt den piezoelektrischen Effekt von Quarzkristall aus. In einem solchen System beginnt ein Quarzkristall, der zwischen zwei Elektroden positioniert ist, die an eine AC-Spannung angeschlossen sind, zu schwingen, wenn sich die Frequenz der AC-Spannung nahe des Schwingungsmodus de Resonanzfrequenz des Quarzkristalls befindet. Die Resonanzfrequenz des Quarzkristalls stellt eine Funktion vieler Parameter dar, wie zum Beispiel Temperatur, Druck, Schnittwinkel des Kristalls, mechanische Belastung und Dicke des Kristalls. Die Resonanzfrequenz ist zur Kristalldicke umgekehrt proportional.
Typische Resonanzfrequenzen, die in flüssigen Anwendungen eingesetzt werden, liegen im Bereich von 1 MHz bis 50 MHz. Der Kristall hat üblicherweise einen AT-Schnitt mit einer runden oder eckigen Gestalt mit einem Durchmesser von etwa 5–10 mm. Die Elektroden (Steuer- und Gegenelektroden) sind üblicherweise auf beiden Seiten aus Gold, andere Metalle sind jedoch nicht unüblich. Die Elektroden sind im Vergleich zur Quarzkristallplatte sehr dünn und können daher als Teil der Kristallplatte angesehen werden. Wird Material zu einer der Elektroden hinzugefügt oder von einer der Elektroden entfernt, wird sie dicker oder dünner, d. h. das damit verbundene Gewicht der Elektrode ändert sich. Als Folge der Massenänderung der Elektrode nimmt die Resonanzfrequenz der Kristallplatte entweder ab oder zu, und folglich kann die Änderung der Resonanzfrequenz zum Nachweis der Massenänderung der Elektrode gemessen werden kann. Die Massenauflösung eines QCM-Systems kann so niedrig wie 1 pg/cm², entsprechend weniger als 1% einer Monoschicht Wasserstoff, betragen.
Ein typisches piezoelektrisches QCM-Sensorinstrument umfasst ein Sensorelement, eine Probeneinführeinheit, Ausrüstung zur Bestimmung der piezoelektrischen Eigenschaften (einschließlich der Schwingungsfrequenzen) eines Quarzkristalls, sowie Ausrüstung zur Signaldarstellung und Puffer und Abfallbehälter (im Unterschied zum Sensorelement können diese Gegenstände als „zugehöriger Apparat” des Sensorinstruments bezeichnet werden). Eine Probe, die jede zu untersuchende chemische Substanz sein kann, wird über die Probeneinführeinheit in das Sensorelement eingebracht. Das Sensorelement enthält einen piezoelektrischen Resonator (der QCM-Sensor), eine Probenkammer, Fließkanäle zur Kammer hin sowie von der Kammer weg, und einen Schwingkreis. Die Probe löst eine Wechselwirkung mit der Oberfläche des piezoelektrischen Sensors aus, welche wiederum durch Kontrolle der Schwingungseigenschaften der Kristallplatte, z. B. durch Messung der Änderungen der Frequenz des piezoelektrischen Resonators, beobachtet werden kann. Die Kristallplatte ist an ihrer Oberfläche mit elektrischen Kontaktbereichen für die Steuer- und Gegenelektroden ausgestattet, wobei diese Kontaktbereiche an eine Signalquelle (z. B. eine Wechselspannungsquelle) sowie an eine Messvorrichtung angeschlossen werden können. Zur Messung wird die piezoelektrische Kristallplatte auf einer Seite mit der zu untersuchenden Fluid-(z. B. Flüssigkeits-)Probe in Kontakt gebracht. Der Kristall reagiert auf die Anreicherung der Masse der nachzuweisenden Substanz oder auf eine Veränderung der physikalischen Eigenschaften der Probe, in dem sich seine Resonanzfrequenz bzw. Schwingungsamplitude verändert.
Piezoelektrische Sensoren können zur Analyse der Viskosität einer Flüssigkeitsprobe verwendet werden, und sind insbesondere zur Untersuchung chemischer und biochemischer Wechselwirkungen geeignet. Wenn ein piezoelektrischer Sensor für den letzteren Zweck verwendet werden soll, wird die Elektrode, die mit der Probe in Kontakt gebracht werden soll, mit einer spezifischen Oberflächenbeschichtung ausgestattet, die mit der Probe in Wechselwirkung tritt. Eine Übersicht der Arten von Wechselwirkungen, welche mit QCM-Sensoren untersucht werden können, wird von Cooper und Singleton (J. Mol. Recognit., 2007, 20, 154) bereitgestellt. Ungeachtet des chemischen Sensors umfassen übliche Ansätze für Oberflächenbeschichtungen selbstorganisierende Monoschichten (z. B. Alkanthiole, die auf Gold adsorbiert sind). bzw. Polymer-Matrizes, welche jeweils funktionelle Gruppen tragen können, die zur Immobilisierung einer ersten zu untersuchenden chemischen Spezies verwendet werden können. Üblicherweise ist die erste chemische Spezies eine niedermolekulare organische Verbindung oder ein Antikörper. Der Sensor, der die erste chemische Spezies trägt, wird anschließend mit einer Dispersion einer zweiten chemischen Spezies oder einer Zelle in Kontakt gebracht, und die Bindung der zweiten chemischen Spezies oder Zelle an die erste chemische Spezies wird mittels der resultierenden Änderung der Masse an der Messoberfläche kontrolliert. Fung und Wong (Anal. Chem. 2001, 73, 5302) beschreiben die Verwendung eines solchen Ansatzes zum Nachweis von Salmonella-Zellen in einer flüssigen Dispersion, und andere ähnliche Studien sind von Cooper und Singleton beschrieben (siehe oben).
Ein weitaus herausfordernder Ansatz ist die Verwendung von Zellen als immobilisierte, erste Spezies in dem chemischen Sensor. Einige wenige Studien haben dies erreicht, allerdings verwenden die beschriebenen Methoden lebende Zellen und analysieren nicht die Bindungswechselwirkung an sich; vielmehr verwenden diese Methoden Biosensortechniken zur Kontrolle von morphologischen oder anderen Veränderungen in den Zellen nach der Bindung (siehe Marx et al., Anal. Biochem., 2007, 361, 77). Solche Methoden sind zur präzisen Kontrolle der Bindungswechselwirkung aufgrund der Störung des nachgewiesenen Signals durch die zellulären Veränderungen, die sich an den Vorgang der Bindung anschließen, von geringem oder keinem Nutzen.
Der Stand der Technik beschreibt keine Methode zur Herstellung eines massensensitiven chemischen Sensors mit immobilisierten Zellen, die zum präzisen Nachweis und zur präzisen Kontrolle einer Bindungswechselwirkung zwischen den Zellen und einem Analytliganden geeignet ist, noch legt der Stand der Technik eine solche Methode nahe.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein massensensitiver chemischer Sensor bereitgestellt, wobei der chemische Sensor inaktivierte Zellen aufweist, die an einer Messoberfläche des massensensitiven chemischen Sensors gebunden sind und wobei der chemische Sensor zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Analytliganden und den gebundenen, inaktivierten Zellen mittels Änderung der Masse an der Sensoroberfläche aufgrund der Bindung des Analytliganden an die Zellen geeignet ist, wobei der Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet ist oder einen Teil einer Durchflusszelle bildet.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen fixiert.
In bestimmten Ausführungsformen des ersten Aspektes wird der massensensitive chemische Sensor durch eine Methode hergestellt, die folgende Schritte umfasst: Inkontaktbringen einer zellhaltigen Suspension mit der Messoberfläche eines Sensorelements; Ermöglichen des Bindens und des potenziellen Wachsens der Zellen auf der Messoberfläche; und nach einem geeigneten Zeitraum Behandeln der gebundenen Zellen, um diese zu inaktivieren.
Der massensensitive chemische Sensor der vorliegenden Erfindung kann den Ablauf der Bindung an sich zwischen Analytliganden und Strukturen auf den Oberflächen der Zellen präzise nachweisen und kontrollieren, möglicherweise in Echtzeit. Im Unterschied zu Sensoren, die durch Methoden des Standes der Technik hergestellt werden, bezieht sich das Signal, das durch den Sensor der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, in direkter Weise auf die Masse des an der Messoberfläche gebundenen Materials, wobei eine Störung aufgrund von Zellwachstum bzw. morphologischen Veränderungen minimal gehalten wird. Darüber hinaus sind die Zellen durch Verwendung fixierter Zellen (wobei die Fixierung durch chemische oder physikalische Mittel erreicht werden kann, wie ausführlicher im Folgenden beschrieben wird), resistenter gegenüber Scherkräften, welche während der Verwendung in der Durchflusszelle auftreten und welche ansonsten das Risiko einer Beschädigung oder Ablösung der Zellen von der Sensoroberfläche darstellen würden. Die Bezeichnung ”inaktiv”, wie hierin in Bezug auf die Zellen verwendet, soll bedeuten, dass die normale Biochemie der Zellen im Wesentlichen arretiert ist, so dass die Zellen im Wesentlichen nicht mehr zum Wachstum, zur Teilung, zur Bewegung bzw. zu morphologischen Änderungen in der Lage sind.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch eine Methode zur Herstellung eines massensensitiven chemischen Sensors bereit, der eine Wechselwirkung zwischen einem Analytliganden und immobilisierten Zellen nachweisen kann, wobei die Methode die Schritte umfasst: Inkontaktbringen einer zellhaltigen Suspension mit der Messoberfläche eines Sensorelements; Ermöglichen des Bindens und des potenziellen Wachsens der Zellen auf der Messoberfläche; und nach einem geeigneten Zeitraum Behandeln der gebundenen Zellen, um diese zu inaktivieren.
Die Methode des zweiten Aspektes kann einen massensensitiven chemischen Sensor erzeugen, der den Ablauf der Bindung an sich zwischen den Analytliganden und Strukturen auf den Oberflächen der Zellen präzise nachweisen und kontrollieren kann, möglicherweise in Echtzeit, wie es bei dem Sensor des ersten Aspektes der Fall ist. Wie oben erläutert, bezieht sich im Unterschied zu den Methoden des Standes der Technik das von dem durch die vorliegende Methode hergestellten Sensor erzeugte Signal in direkter Weise auf die Masse des an der Messoberfläche gebundenen Materials.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Methode den zusätzlichen Schritt des Integrierens des Sensors in eine Durchflusszelle, so dass der Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet ist oder einen Teil einer Durchflusszelle bildet. Die Integration des Sensors in eine Durchflusszelle kann in einer beliebigen Stufe der Methode stattfinden, d. h. bevor der Sensor mit den Zellen in Kontakt gebracht wird; vor, während oder nachdem die Zellen an die Messoberfläche gebunden sind und potenziell auf der Messoberfläche wachsen; oder vor, während oder nach der Behandlung der Zellen, um diese zu inaktivieren.
Die zu verwendende oder zu bildende Durchflusszelle gemäß der vorliegenden Erfindung sollte eine Durchflusszelle sein, die bevorzugt zur Bestimmung der kinetischen Geschwindigkeitsparameter der untersuchten Wechselwirkungen angepasst ist. Die Durchflusszelle sollte aus biologisch verträglichem Material hergestellt sein, und bevorzugt aus Polyoxymethylen, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid und spritzgießbaren Thermoplasten, wie z. B. Polystyrol oder Acrylnitril-Butadien-Styrol ausgewählt sein, ist jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Das Ausmaß der Durchflusszelle sollte zur Bestimmung der kinetischen Geschwindigkeitsparameter für molekulare Wechselwirkungen geeignet sein, d. h. die Fließeigenschaften sollten die Aufrechterhaltung der Konzentration der Massenlösung des Analytliganden an oder sehr nahe der Oberfläche mit den immobilisierten Zellen ohne wesentliche Einschränkungen der Diffusion des Analytliganden zu dem Zielmolekül auf der Zelloberfläche ermöglichen. Die bevorzugte Höhe der Durchflusszelle sollte 50 μm oder weniger betragen (gemessen von der Sensoroberfläche bis zur Decke der Durchflusszelle). Geeignete Durchflusszellen sind zum Beispiel in PCT/GB2008/001515 ( WO 2008/132487 ) beschrieben.
Die zellhaltige Suspension enthält bevorzugt ein Zellwachstumsmedium. Geeignete Zellwachstumsmedien sind dem Fachmann für eine Vielzahl von Zellen bekannt, und der Stand der Technik enthält reichlich Informationen betreffend bevorzugte und wesentliche Bestandteile für Medien zur Kultivierung der Mehrheit prokariotischer und eukaryotischer Zellen. Bevorzugte Medien enthalten Serumproteine. Es wird angenommen, dass die Serumproteine, die in solchen Wachstumsmedien vorliegen, vor (oder weniger wahrscheinlich gleichzeitig mit) den Zellen an der Messoberfläche adsorbieren; die adsorbierten Proteine anschließend eine Oberfläche mit Motiven bereitstellen, die von den Zelloberflächenkomponenten der Zellen erkannt werden können, wodurch die Bindung der Zellen an oder in der Nähe der Messoberfläche verstärkt wird. Die Erfinder möchten jedoch nicht an eine solche Annahme gebunden sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Methode enthält die Zellsuspension auch extrazelluläre Matrixproteine, die für die betreffenden Zellen von Bedeutung sind. Solche Matrixproteine, die in Abhängigkeit von der betreffenden Zellart zu einem gewissen Grad variieren, welche jedoch wiederum in Bezug auf standardisierte Laborlehrbücher bestimmt werden können, unterstützen die Zellanbindung durch Bereitstellung zusätzlicher Motive zur Erkennung und Bindung durch die Zelloberflächenkomponenten. In einigen Ausführungsformen kann eine mit Proteinen bedeckte Sensoroberfläche verwendet werden, oder die Sensoroberfläche kann durch Inkontaktbringen mit einer Lösung von Serumproteinen bzw. extrazellulären Matrixproteinen so präkonditioniert werden, dass sie die Adsorption der Lösung von Serumproteinen bzw. extrazellulären Matrixproteinen an die Oberfläche ermöglicht; in solchen Fällen können einfach serumfreie Zellsuspensionen verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen der ersten und zweiten Aspekte sind die Zellen eukaryotisch. Insbesondere können die Zellen Tierzellen sein, wie beispielsweise Säugerzellen, insbesondere humane Zellen.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Messoberfläche vor dem Inkontaktbringen mit der zellhaltigen Suspension modifiziert, so dass die Oberflächenenergie erhöht und dadurch die Bindung von Serumproteinen bzw. Zellen an die Messoberfläche verstärkt wird.
Die Messoberfläche des Sensorelements des ersten Aspekts oder die Messoberfläche des Sensorelements des zweiten Aspektes, mit der die Zellsuspension in Kontakt gebracht wird, kann durch eine Vielzahl von Materialien gebildet sein. In einigen Fällen kann eine unbehandelte Metallsensoroberfläche verwendet werden, z. B. eine Goldelektrode einer QCM oder die Edelmetalloberfläche eines SPR-Biosensors oder eine Glasoberfläche, wie sie in optischen Vorrichtungen auf Basis von Wellenleitern vorkommen. In vielen Ausführungsformen kann es jedoch wünschenswert sein, die Oberfläche entweder durch chemische oder physikalische Behandlung zu modifizieren, um die Rate bzw. das Ausmaß der Adsorption von Serumprotein bzw. Zellen an die Oberfläche zu erhöhen. Chemische Behandlungen umfassen die Adsorption polarer, hydrophiler bzw. geladener Spezies an der Oberfläche (z. B. Polyaminosäuren, wie z. B. Polylysin; oder Serumproteine bzw. extrazelluläre Matrixproteine, wie oben erwähnt, bei welchen, zusätzlich zu jeglichen Effekten auf die Oberflächenpolarität etc., bestimmte erkennbare biochemische Motive eine Rolle bei der Zellbindung spielen können). Physikalische Behandlungen umfassen die Verwendung von Plasma-Bombardement oder elektromagnetischer Strahlung einer geeigneten Art, um eine Modifizierung der Oberflächenchemie der Messoberfläche zu erzeugen.
Eine solche Entwicklung kann insbesondere für den Fall anderweitig hydrophober Oberflächen, wie beispielsweise bestimmte polymerbeschichtete Oberflächen, geeignet sein. Auf jeden Fall kann die Eignung der Oberfläche zur Bindung der Zellen und die Wirkungen jeder Modifizierung davon leicht bestimmt werden, indem der Sensor an den zugehörigen Apparat eines Sensorinstruments gekoppelt wird und anschließend mittels Änderung des Signals des Sensors bestimmt wird, ob und in welchem Ausmaß Serumproteine bzw. Zellen, die mit der Messoberfläche in Kontakt gebracht wurden, binden. Alternativ oder zusätzlich kann Mikroskopie zur Kontrolle der Bindung der Zellen an die Messoberfläche eingesetzt werden. Eine Messoberfläche kann auf diese Art und Weise optimiert und anschließend mit noch größerer Wirkung in der Methode der Erfindung verwendet werden.
In vielen Fällen hat die Messoberfläche vor der Zellimmobilisierung einen Kontaktwinkel von 10 bis 90 Grad, bevorzugt 20 bis 80 Grad und stärker bevorzugt 30 bis 70 Grad. Ein Kontaktwinkel von etwa 60 Grad kann besonders bevorzugt sein. Ein Kontaktwinkel, wie hierin verwendet, kann durch Standardmethoden des Fachbereichs bestimmt werden und bezieht sich auf einen Kontaktwinkel mit hochreinem Wasser.
In bestimmten Ausführungsformen der ersten und zweiten Aspekte ist die Messoberfläche mit einer Polymerbeschichtung ausgestattet, mit welcher die zellhaltige Suspension in Kontakt gebracht wird. Eine solche Polymerbeschichtung kann ein Polystyrol umfassen. Eine Polymerbeschichtung von massensensitiven chemischen Sensoren ist ein üblicher Ansatz und ermöglicht Flexibilität in Bezug auf was anschließend an die Messoberfläche gekoppelt werden kann. Polystyrol ist eine übliche Oberfläche, die zur Kultivierung von Zellen verwendet wird, und ist daher für die vorliegende Methode besonders geeignet. Aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaft ist die Polystyrolbeschichtung jedoch bevorzugt mittels Behandlung durch Plasma-Bombardement oder elektromagnetischer Strahlung modifiziert. UV-Behandlung ist besonders bevorzugt. Die Polymerbeschichtung (z. B. Polystyrol) kann durch Rotationsbeschichtung des Sensorelements mit einer Polymerlösung hergestellt werden. Die Polymerbeschichtung kann mit einer Dispersion von Serumproteinen bzw. extrazellulären Matrixproteinen in Kontakt gebracht werden, um die Adsorption von Serumproteinen bzw. extrazellulären Matrixproteinen vor dem Inkontaktbringen des Sensors mit der Zellsuspension zu ermöglichen.
Vor der Inaktivierung der gebundenen Zellen kann es nützlich sein, die Zellen für einen Zeitraum auf der Messoberfläche wachsen zu lassen. Jegliche Beschädigung oder Beeinträchtigung der Zellen, die während der Suspensionskultur aufgetreten ist, kann dann abgeschwächt werden. Der oben erwähnte „geeignete Zeitraum” kann nach den Anforderungen und Zielvorgaben des Versuchs sowie der eingesetzten Zellart bestimmt werden, und dieser Zeitraum kann leicht durch systematisches Ausprobieren bestimmt werden. Insbesondere können viele Zellen in der Suspension eine kugelförmige Morphologie annehmen, während die Bindung an die Oberfläche ein gewisses Ausmaß an Verstreuung und Flachdrücken der Zellen mit sich bringt. Die Wachstumsphase, in welcher die Zellen zum Aussäen auf der Oberfläche des Sensors geerntet werden sollen, sollte idealerweise die exponentielle Wachstumsphase sein – die Zellen exprimieren während dieser Phase die Rezeptoren in größerem Umfang.
Die Behandlung der Zellen zu deren Inaktivierung kann durch physikalische Mittel erreicht werden (z. B. Halten der Zellen bei verminderter Temperatur (z. B. 2–8 GradC), schnelles Gefrieren oder Wärmebehandlung unter vermindertem Druck; siehe www.denator.com) oder stärker bevorzugt durch chemische Mittel (z. B. Behandlung mit einem Gift oder chemischer Vernetzung). In bevorzugten Ausführungsformen wird die Inaktivität der gebundenen Zellen durch Fixierung der Zellen entweder durch physikalische Mittel oder stärker bevorzugt durch chemische Mittel erreicht. Chemische Mittel umfassen sowohl Methoden auf Basis organischer Lösungsmittel oder, stärker bevorzugt, Vernetzungsmethoden. Methoden basierend auf organischen Lösungsmitteln funktionieren üblicherweise durch Entfernen von Lipiden und Wasser aus den Zellen und durch Ausfällen von Zellproteinen, während Vernetzungsreagenzien intermolekulare Brücken zwischen den Oberflächenkomponenten der Zellen bilden. Methoden auf Basis von Lösungsmitteln umfassen die Verwendung von Aceton, Methanol bzw. Ethanol, üblicherweise bei etwa –20 GradC. Ansätze für Vernetzungen können zum Beispiel, Formalin, Formaldehyd oder Paraformaldehyd, gegebenenfalls in Verbindung mit einem Tensid bzw. Methanol verwenden. Eine Vielzahl alternativer Bindungsprotokolle ist von Brock et al. (Cytometrie, 1999, 35, 353) beschrieben.
Die Fixierung der Zellen auf der Sensoroberfläche verhindert weiteres Wachstum, weitere Migration bzw. weitere morphologische Veränderungen der Zellen, bewahrt jedoch die Oberflächenkomponenten der Zellen in einem Zustand, in welchem mindestens ein Teil davon noch zur Bindung an die Analytliganden verfügbar ist. Die Fixierung der Zellen, führt auch dazu, dass gebundene Zellen mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit während anschließender Analysen von der Messoberfläche dissoziieren können. Wie in Bezug auf den ersten Aspekt erwähnt, stellt dies einen besonderen Vorteil für Ausführungsformen dar, bei welchen der Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet ist oder einen Teil einer Durchflusszelle bildet. Die Fixierung der Zellen erhöhte auch die Stabilität der Zellschicht, die die Sensitivität des chemischen Sensors verbessern kann, wie ausführlich im Folgenden erörtert.
Bevor die Zellen inaktiviert werden, kann als optionaler Schritt Mikroskopie eingesetzt werden, um die Anordnung und Dichte der Zellen auf der Sensoroberfläche zu überprüfen. Es können verschiedene mikroskopische Ansätze zur Anwendung kommen, allerdings ist auch Fluoreszenzmikroskopie erwähnenswert, wobei eine Inkubation der gebundenen bzw. fixierten Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. einem Kernfarbstoff) vor der Mikroskopie erfolgt. Wenn keine geeignete Zellzahl bzw. -dichte erreicht worden ist, kann man die Zellen anschließend vor der Inaktivierung weiter wachsen lassen. Eine mikroskopische Kontrolle der Messoberfläche zur Bestimmung der Entwicklung der Bildung der Zellschicht kann in jeder Stufe der Methode erfolgen. Mikroskopie kann auch nach dem Inaktivierungsschritt sowie nach dem optionalen Schritt der Fixierung der Zellen eingesetzt werden.
Im Anschluss an die Bindung und Inaktivierung der Zellen wird die Messoberfläche bevorzugt mit einer sauren Lösung behandelt, um ungebundenes zelluläres und nichtzelluläres Material zu entfernen. Diese saure Lösung, die einen pH-Wert von weniger als 5, bevorzugt von weniger als 3, und in einigen Fällen etwa 1 aufweisen kann, kann auch ein Salz mit niedrigem Molekulargewicht enthalten. Sie kann auch einen geeigneten Puffer, wie z. B. Glycin enthalten.
In bestimmten Ausführungsformen des Sensors und der Methode der Erfindung ist der Sensor eine akustische Wellenvorrichtung. Eine solche Vorrichtung kann in bestimmten Ausführungsformen ein piezoelektrischer Sensor oder eine Quarzkristallmikrowaage sein.
Wenn der Sensor eine QCM ist, kann der Sensor in einem Sensorelement mit einer entfernbaren Abdeckung untergebracht sein, welche Zugang zur Sensoroberfläche ermöglicht, ohne dass der Sensor/QCM-Kristall von dem Gehäuse entfernt werden muss. Eine solche Sensorelementanordnung ist in WO 2008/132487 beschrieben.
Gemäß einem ähnlichen dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Methode zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Analytliganden und einer Zelle bereit, wobei die Methode die Schritte umfasst: Bereitstellen eines massensensitiven chemischen Sensors gemäß des ersten Aspektes oder Erhalten eines massensensitiven chemischen Sensors nach der Methode des zweiten Aspektes, wobei an einer Messoberfläche oder in der Nähe einer Messoberfläche des massensensitiven chemischen Sensors inaktive Zellen binden; Einbringen des Analytliganden in die Nähe der Sensoroberfläche, so dass eine Wechselwirkung zwischen dem Analytliganden und den Zellen möglich ist; und bei Auftreten einer Wechselwirkung Nachweisen der Wechselwirkung anhand der Änderung der Masse an der Messoberfläche aufgrund der Bindung des Analytliganden an die Zellen.
In Ausführungsformen des dritten Aspektes der Erfindung wird die Sensoroberfläche vor der Einführung des Analyten zum Nachweis der Wechselwirkung durch Inkontaktbringen mit dem vorgesehen Laufpuffer stabilisiert. Diese Stabilisierung kann mehrere Stunden lang stattfinden. In bestimmten Ausführungsformen wird der Analytligand mit einer Laufpufferlösung verdünnt, die zuvor zur Stabilisierung des Sensors verwendet wurde. In Ausführungsformen, in welchen der Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet ist oder einen Teil einer Durchflusszelle bildet, kann der Laufpuffer vom Ausgang der Durchflusszelle entnommen und verwendet werden, um eine Analytenprobe vor der Einführung der Probe in die Durchflusszelle zu verdünnen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Laufpuffer vom Ausgang entnommen und zur Verdünnung des Analyten im Wesentlichen unmittelbar vor der Injektion des Analyten in den Einlass der Durchflusszelle verwendet. Es wird angenommen, dass der Laufpuffer zur Verwendung gemäß diesem Schritt nur während eines Zeitraums erhalten werden kann, in dem sich kein Analyt in der Durchflusszelle befindet.
Durch Verwendung des Laufpuffers, der zuvor zur Stabilisierung der Sensoroberfläche verwendet wurde, kann eine verbesserte Anpassung zwischen dem Puffer des Analyten und dem Laufpuffer erreicht werden. Dies unterstützt die Verminderung von Signalartefakten auf Grund von Änderungen der Puffereigenschaften durch Einführung des Analyten. In bevorzugten Ausführungsformen werden Kontrollanalysen durchgeführt, in welchen der Laufpuffer aus dem Stabilisierungsschritt zum Sensor zurückgeführt wird, jedoch ohne den Analyten einzubringen.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Bindungswechselwirkung zwischen dem Analytliganden und den Zellen bei einer Vielzahl unterschiedlicher Konzentrationen des Analytliganden nachgewiesen. Ein solcher Ansatz ermöglicht die Bestimmung kinetischer Parameter für die Bindungswechselwirkung zwischen dem Analyten und der Zelle. Die Bestimmung der kinetischen Parameter aus den bei verschiedenen Konzentrationen des Analyten gesammelten Daten kann zum Beispiel mittels der von Myszka (J. Molec. Recognit., 1999, 12, 279) oder von Morton und Myszka (Methods Enzymol., 1998, 295, 268–294) beschriebenen Ansätze erreicht werden.
In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen massensensitiven chemischen Sensor bereit, der durch die Methode des zweiten Aspektes erhältlich ist, wobei der chemische Sensor zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Analytliganden und den gebundenen inaktiven Zellen mittels Änderung der Masse an der Sensoroberfläche auf Grund der Bindung des Analytliganden an die Zellen geeignet ist. Der Sensor des vierten Aspektes ist bevorzugt mit einer Durchflusszelle ausgestattet oder bildet einen Teil einer Durchflusszelle.
Es wird angenommen, dass der Sensor des vierten Aspektes in einer Methode des dritten Aspektes verwendet werden kann. Im Vergleich zu Sensoren des Standes der Technik mit Zellen, die an oder in der Nähe ihrer Messoberflächen binden, weist der Sensor des vierten Aspektes den Vorteil auf, dass die Zellen inaktiv sind und der Sensor daher in der Lage ist, ein präzises Signal bereitzustellen, das für die Bindungswechselwirkung an sich maßgeblich ist.
In einem fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines massensensitiven chemischen Sensors zur Analyse der Bindungswechselwirkung zwischen einem Analytliganden und einer Zelle bereit, die auf oder in der Nähe einer Sensoroberfläche des chemischen Sensors immobilisiert ist.
Im Unterschied zu den Ansätzen des Standes der Technik betrifft der fünfte Aspekt die Analyse der Bindungswechselwirkung zwischen dem Analyten und der Zelle an sich. Im Stand der Technik verwenden diejenigen Studien, die immobilisierte Zellen einsetzen, Sensoren zur Analyse der morphologischen und anderen Veränderungen, die nach der Bindung in den Zellen auftreten.
In bevorzugten Ausführungsformen des fünften Aspektes sind die Zellen inaktiv. In bestimmten Ausführungsformen sind die Zellen fixiert. Ansätze zur Fixierung sind in Bezug auf den ersten Aspekt der Erfindung beschrieben. In bestimmten Ausführungsformen wird die Bindungswechselwirkung quantitativ bestimmt; insbesondere kann die Bindungswechselwirkung zwischen dem Analytliganden und den Zellen bei einer bestimmten Konzentration des Analytliganden oder bevorzugt bei einer Vielzahl unterschiedlicher Konzentrationen des Analytliganden nachgewiesen werden. Solche Ansätze ermöglichen die Bestimmung kinetischer Parameter für die Bindungswechselwirkung zwischen dem Analyten und der Zelle, wie oben beschrieben.
In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung eine Methode zur Verbesserung der Sensitivität bzw. des Messbereichs eines massensensitiven chemischen Sensors bereit, umfassend eine akustische Wellenvorrichtung, wie zum Beispiel eine Quarzkristallmikrowaage, an deren Sensoroberfläche oder in deren Nähe Zellen immobilisiert sind, wobei die Methode den Schritt der Fixierung der Zellen oder des Einbettens der Zellen innerhalb einer vernetzten Polymermatrix umfasst.
In bestimmten Ausführungsformen sind die Zellen inaktiv (z. B. fixiert). Darüber hinaus oder alternativ kann der Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet sein oder einen Teil einer Durchflusszelle bilden.
Akustische Sensoren haben eine begrenzte Abklinglänge, welche den Messabstand von der Messoberfläche bestimmt. Eukaryotische Zellen mit Größen im Bereich von 10 μm können nicht vollständig von dem piezoelektrischen Sensor gemessen werden. Die Erfinder haben jedoch herausgefunden, dass der Messbereich von der Oberfläche erweitert werden kann, wenn die Zellschicht ausreichend stabil ist. In der vorliegenden Erfindung verleiht die Fixierung der Zellen (z. B. mit einem Vernetzungsmittel, wie oben beschrieben), oder das Einbetten der Zellen innerhalb einer vernetzten Polymermatrix, der Zellschicht auf der Messoberfläche Stabilität. Dies erweitert vermutlich den Messbereich des akustischen Sensors in der Zellschicht und erhöht folglich die Sensitivität des Sensors.
Wird eine vernetzte Polymermatrix für den sechsten Aspekt verwendet, kann diese aus einer Reihe von Matrices, die im Biosensorbereich bekannt sind, ausgewählt werden, zum Beispiel Matrices auf Basis von Polysacchariden. Das geeignete Verhältnis von Zellen: Polymermatrixbestandteilen kann leicht durch Routineversuche bestimmt werden. Es wird angenommen, dass ein bestimmtes Minimum an Zelldichte für den Analytliganden an der Oberfläche der Matrix distal der Messoberfläche zugänglich sein muss, um eine verlässliche Messreaktion bereitzustellen.
In einem siebten Aspekt stellt die Erfindung eine Methode zur Verbesserung der Sensitivität bzw. des Messbereichs eines massensensitiven chemischen Sensors basierend auf einer akustischen Wellenvorrichtung, wie zum Beispiel einer Quarzkristallmikrowaage, bereit, wobei die Methode das Immobilisieren von Polymerpartikeln auf oder in der Nähe einer Sensoroberfläche des massensensitiven chemischen Sensors umfasst.
Die Polymerpartikel (bestehend aus vernetztem Polymer und vorliegend in Form von z. B. Kügelchen, wie Polysaccharidkügelchen, wie Agarose) des siebten Aspekts können analog zu den fixierten oder eingebetteten Zellen des sechsten Aspekts verwendet werden. Die Partikel können mittels herkömmlicher Methoden an die Messoberfläche angebracht werden (z. B. unter Verwendung organischer Kopplungschemie, die auf dem Gebiet von Biosensoren Standard ist, wie zum Beispiel EDC/NHS-Kopplung). Die zu untersuchenden Moleküle (Rezeptoren, Liganden, Enzyme, Lektine etc.) für chemische Messstudien können an die Kügelchen entweder vor oder stärker bevorzugt nach dem Anbringen der Kügelchen an die Messoberfläche (wiederum unter Verwendung herkömmlicher organischer Kopplungstechniken) angebracht werden, so dass die Messoberfläche eine stabile Schicht für solche Moleküle darstellt. Wie in dem sechsten Aspekt ist der Messbereich von der Oberfläche eines Sensors, der gemäß dem siebten Aspekt hergestellt wurde, erweitert, und die Sensitivität der Oberfläche des Sensors ist verstärkt.
Wenn eine Zellschicht nach der Methode des sechsten Aspektes fixiert oder eingebettet ist, kann ein zusätzlicher Schritt des Anbringens einer Schicht weiterer zu untersuchender chemischer Spezies an die Zellschicht unternommen werden. Die so gebildete Schicht aus weiteren chemischen Spezies (z. B. Rezeptoren, Rezeptorliganden, Lektine, Zucker etc.) kann anschließend mit dem zusätzlichen Nutzen des vorteilhaften Effekts der stabilen Zellschicht in chemischen Messstudien eingesetzt werden.
In einem achten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch einen massensensitiven chemischen Sensor bereit, der gemäß der Methode des siebten Aspektes erhältlich ist.
In einem neunten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Verstärkung des Signal-Rausch-Verhältnisses in einem massensensitiven chemischen Sensor bereit, wobei die Methode den Schritt der Verwendung von Laufpufferlösung umfasst, die zuvor zur Stabilisierung des Sensors zur Verdünnung einer Analytenprobe vor der Einführung der Analytenprobe an die Messoberfläche verwendet worden ist.
Der Vorteil des neunten Aspektes wird oben in Verbindung mit dem dritten Aspekt beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der massensensitive chemische Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet oder stellt einen Teil dieser Durchflusszelle dar, und die Methode umfasst den Schritt der Verwendung von Laufpuffer vom Ausgang der Durchflusszelle, um eine Analytenprobe vor der Injektion der Analytenprobe in die Durchflusszelle zu verdünnen.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlicher und lediglich beispielhaft unter Bezugnahme auf die angehängten Zeichnungen beschrieben, wobei:
1 ein Fluoreszenzmikrobild eines QCM-Sensors mit darauf fixierten humanen Brustkrebszellen darstellt;
2 Daten aus einer Serie von Concanavalin A (ConA)-Bindungsversuchen zeigt, die unter Verwendung eines QCM-Sensors gemäß 1 durchgeführt wurden. ConA wurde zu 12,5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml injiziert, wobei die entsprechenden Reaktionen in ansteigender Reihenfolge gezeigt sind. Die Affinität wurde bei 15 nM bestimmt;
3 Daten aus einer Serie von Weizenkeimagglutinin(WGA)-Bindungsexperimenten zeigt, die unter Verwendung eines QCM-Sensors gemäß 1 durchgeführt wurden. WGA wurde zu 6,5 μg/ml, 12,5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml injiziert, wobei die entsprechenden Reaktionen in ansteigender Reihenfolge gezeigt sind. Die Affinität wurde bei 93 nM bestimmt;
4 ein Fluoreszenzmikrobild eines QCM-Sensors mit darauf fixierten humanen Plattenepithelkarzinom(A-431)-Zellen ist;
5 aus einer Serie von Bindungsexperimenten erhaltene Daten zeigt, die unter Verwendung des QCM-Sensors von 4 und eines anti-EGFR-Antikörpers erhalten wurden. Der Antikörper wurde zu 6, 12,5 und 25 μg/ml injiziert, wobei die entsprechenden Reaktionen in ansteigender Reihenfolge gezeigt sind. Die Affinität wurde bei 1,2 nM bestimmt;
6 aus dem Screening einer Serie von Lektinen erhaltene Daten zur Bindung an einen QCM-Sensor, auf dem A-431-Zellen fixiert sind (a), und äquivalente Experimente, bei denen keine Zellen vorlagen (b) veranschaulicht;
7a und 7b einen Vergleich zwischen der Bindung von ConA und WGA an einen QCM-Sensor mit und ohne fixierte A-431-Zellen zeigen;
8 die Ergebnisse eines Versuchs zeigt, bei dem die Bindung von ConA an A-431-Zellen untersucht wurde, die entweder an Gold- oder Polystyrol(PS)-Oberflächen immobilisiert sind. Für jede der Oberflächen wurden zwei Fixierungsmethoden, Formaldehyd (F) oder Formaldehyd + Methanol (FM), verwendet Das Diagramm stellt die maximalen Frequenzen, die von dem Attana Cell 200-Instrument aufgenommen wurden, als Ergebnis der Bindung von ConA bei 12,5 μg/ml und 6,25 μg/ml an A-431-Zellen für die vier Bedingungen PSFM, PSF, GoldFM und GoldF zusammen;
9 die zeitabhängigen Frequenzänderungen aufgrund der Bindung und Freisetzung von ConA an die A-431-Zellen zeigt. Die Wechselwirkung wurde bei den vier Bedingungen bestimmt, die in dem in 8 beschriebenen Experiment verwendet wurden, d. h. PSFM, PSF, GoldFM und GoldF;
10 die von den Wechselwirkungen zwischen einem GalNAc-Bindungslektin und zwei unterschiedlichen Zelllinien erhaltenen Daten zeigt, wobei die Zelllinien verschiedene Glykotope auf ihren entsprechenden Zelloberflächen präsentieren.
Beispiel 1 – Allgemeines Protokoll
Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode bereit, die letztendlich darauf abzielt, die Bestimmung von kinetischen und Affinitätsdaten zwischen Zellen und Proteinen oder anderen biologisch relevanten Molekülen, wie zum Beispiel Arzneimitteln, Antikörpern oder Rezeptoren, zu ermöglichen. Während Wechselwirkungsaffinitäten und -raten zuvor für Zelloberflächenrezeptoren und deren Rezeptoren/Bindungspartnern als isolierte Proteine bestimmt worden sind, ist dies nicht für die eigentlichen Zellen durchgeführt worden. Beim Bestreben nach biologisch relevanten Assays für z. B. pharmazeutische Entwicklungen sollten Echtzeit-Wechselwirkung-Assays mit ganzen eukaryotischen Zellen einen wesentlichen Fortschritt darstellen. Vorliegend wurde eine Methode für Echtzeit-Wechselwirkungsstudien eukaryotischer Zellen und deren Wechselwirkungspartner entwickelt. Ein beispielhaftes Protokoll umfasst die Schritte:

1. Rotationsbeschichtung einer Polystyroloberfläche auf einen Sensor
2. UV-Behandlung der Polystyroloberfläche
3. Wachsen der Zellen auf einer Sensoroberfläche
4. Fixierung der Zellen auf einer Sensoroberfläche
5. Optionale Vorbehandlung einer Sensoroberfläche mit Glycin
6. Stabilisierung der Sensoroberfläche in dem Biosensorinstrument
7. Injektion von Liganden/Analyt zur Bestimmung der Kinetik und Affinität der Bindung

Die Biosensoranalyse immobilisierter ganzer Zellen stellt verschiedene Schwierigkeiten dar, die zu überwinden sind. Zunächst setzt die wesentlich komplexere Oberfläche, die eine Oberfläche mit immobiliserten eukaryotischen Zellen darstellt, stabile Verfahren zur Stabilisierung der Zelloberfläche in dem Sensorsystem voraus, da das erwartete Signalniveau niedrig sein wird und ein signifikanter Signaldrift die Bestimmung der Wechselwirkungskonstanten erschweren würde. Schritt 4 dieser beispielhaften Methode ermöglicht eine stabile Oberfläche der Zellen, die fest an der Sensoroberfläche angebracht sind und nicht dissoziieren. Schritte 5 und 6 stellen die erforderliche Stabilisierung der Sensoroberfläche in dem System dar, um einen signifikant geringeren Drift zur Ausführung des Assays zu erreichen.
Zweitens weist der akustische Sensor eine begrenzte Abklinglänge auf, welche die Messdistanz von der Messoberfläche aus in der Flüssigkeit bestimmt. Eukaryotische Zellen mit Größen im Bereich von 10 μm werden wahrscheinlich nicht vollständig von dem piezoelektrischen Sensor gemessen. Versuche haben jedoch gezeigt, dass der Messbereich von der Oberfläche erweitert werden kann, wenn die hinzugefügte Schicht ausreichend stabil ist. In der vorliegenden Erfindung stellt die Fixierung der Zellen mit einem Vernetzungsmittel gemäß Schritt 4 eine Stabilisierung der Zellen auf der Messoberfläche dar, die wahrscheinlich den Messbereich des akustischen Sensors in der Zellschicht erweitert und folglich die Sensitivität erhöht.
Drittens ist bei einem niedrigen erwarteten Signalniveau für die Wechselwirkungsstudien der Zelloberfläche aufgrund der begrenzten Messdistanz und aufgrund der relativ niedrigen Konzentration an Oberflächenrezeptoren, die üblicherweise auf eukaryotischen Zellen vorhanden sind, die Entfernung unerwünschter experimenteller Nebenwirkungen, wie z. B. der Beitrag des Signals aus der Puffermatrix (Puffereffekte), notwendig. Dies wird zum Beispiel durch präzise Anpassung des Probenpuffers, wie in Schritt 7 dieser beispielhaften Methode beschrieben, erreicht.
Ausführliche Beschreibung der Methodenschritte
1. Rotationsbeschichtung einer Polystyroloberfläche auf einen Sensor
Vor dem Rotationsbeschichten werden bezüglich ihrer Leitfähigkeit überprüfte (Smart Tweezers, Siborg Systems Inc.) ungeschliffene QCM-Kristalle einer Sauerstoffplasmabehandlung (Electronic Diener, Femto) unterzogen, und anschließend mittels Utraschall in Ethanol behandelt, um eine angemessene Reinigung der Kristalloberfläche sicherzustellen. Die Polystyrolbeschichtung des Kristalls erfolgte mit Rotationsbeschichtung. Kurz gesagt wurde 10 μl Polystyrollösung, die zuvor auf eine Konzentration von 5 mg/ml in Toluol eingestellt wurde, in das Zentrum des Kristalls eingebracht und dieser wurde rotationsbeschichtet (Spin Coater^®, Modell P6700-Serie, Specialty Coating Systems, Inc.). Durchschnittlich wurde 56 Å +/– 21 Å Polystyrol auf jeden Kristall beschichtet. Die polystyrolbeschichteten Kristalle wurden anschließend vor der UV-Behandlung bei +4 GradC gelagert.
2. UV-Behandlung der Polystyroloberfläche
Zur Sicherstellung einer optimalen Anbringung der Zellen und eines optimalen Wachstums stellt die Oxidation der Polystyroloberfläche mittels UV-Bestrahlung einen bevorzugten Schritt dar. Die UV-Behandlung wurde zur Sicherstellung einer besseren Benetzbarkeit der Oberfläche, die anhand des Kontaktwinkels eines Wassertröpfchens mit der Polystyroloberfläche gemessen wurde, durchgeführt (das Taschen-Goniometer, PG-3, FIBRRO-Systems AB). Die Zeitdauer der Behandlung mit UV wurde zuvor in Überstimmung mit herkömmlichen Gewebekulturoberflächen bestimmt, um einen Kontaktwinkel von 60–65 Grad zu erhalten.
3. Wachstum der Zellen auf der Sensoroberfläche
Die Zellen wurden in geeigneten Medien (in Abhängigkeit von der Zelllinie) bei 37 GradC in einem Inkubator mit 5% CO₂ mit Trypsin behandelt (gemäß Standardverfahren zur Zelltrypsinierung), um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Auszählung der Zellen wurde mittels meiner Zählkammer durchgeführt, und die Zellen wurden mit einer geeigneten Dichte/Konzentration auf Polystyroloberflächen ausgesät, um etwa 70–80% Bedeckung der Sensoroberfläche nach 24 Std. Inkubation zu erreichen, wie nach der Fixierung durch Kernfärbung bestimmt wurde (im nächsten Absatz beschrieben).
4. Fixierung der Zellen auf der Zelloberfläche
Nach 24 Std. Inkubation wurden die zuvor auf den Kristallen ausgesäten Zellen mittels Formaldehyd (Sigma) fixiert. Die Zellmedien wurden entfernt, und die Zellen wurden in eiskaltem PBS gewaschen. Die Fixierung der Zellen wurde anschließend mittels Inkubation der Zellen für 10 Minuten bei +4 GradC mit 0,5 ml einer 3,7%igen Formaldeydlösung, die in eiskaltem PBS frisch zubereitet wurde, durchgeführt. Drei Waschschritte von 5 Minuten wurden zur Entfernung des restlichen Formaldehyds durchgeführt. Anschließend wurde eine Kernfärbung zur Bestimmung der Bedeckung des Kristalls mit Zellen durchgeführt. In Kürze wurden die Zellen für 3 Minuten mit dem Kernfarbstoff DAPI (Invitrogen, λEx/Em: 358–461 nm), der auf eine Endkonzentration von 2,8 μm eingestellt wurde, inkubiert. Nach einem Waschschritt in PBS wurden die Zellkristalle unter einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse 80i) visualisiert. Die Zellkristalle wurden anschließend in PBS bei +4 GradC gehalten.
5. Vorbehandlung der Sensoroberfläche mit Glycin
Bevor die Zellen in einem Chiphalter befestigt und in einem Attana Cell 200-Instrument (www.attana.com) untersucht werden, werden sie einer optionalen Vorbehandlung mit einer Regenerationslösung (Glycin 10 mM, NaCl 500 mM, pH 1) unterzogen. Diese Behandlung reinigt die Oberfläche weiter auf und ermöglicht eine schnellere Stabilisierung des Zell-Kristalls sowie eine stabilere Basislinie in dem Attana Cell 200-Instrument.
6. Stabilisierung der Sensoroberfläche im Biosensor-Instrument
Vorbehandelte Zell-Kristalle wurden in dem Chiphalter des Attana Cell 200-Instruments befestigt und zur Stabilisierung für mehrere Stunden oder über Nacht bei 25–50 μl/min in PBS, das mit 0,025% Tween supplementiert wurde (PBST), in das Instrument eingebracht. Der Arbeitsgang, die Bestimmung der Bindung der Lektine bzw. Antikörper, wurde bei 25 μl/min bei 20 GradC durchgeführt.
7. Injektion von Liganden/Analyt zur Bestimmung der Kinetik und der Affinität der Bindung
Der Assay wurde zur Charakterisierung der Mechanismen der molekularen Wechselwirkung des Analytliganden, z. B. Antikörper oder Lektine, die gegen die Zellrezeptoren oder andere spezifische Komponenten, z. B. Kohlenhydratstrukturen, gerichtet sind, an der Zelloberfläche durch Bestimmung der Affinitätskonstanten entworfen. Ziel ist die Bereitstellung einer biophysikalischen Interpretation der Wechselwirkungen, die an der Oberfläche von fixierten Zellen, zum Beispiel gebundenen humanen Krebszellen, vorkommen. Die Qualität der Bestimmung der Bindungskonstante in einer biomolekularen Bindungsreaktion hängt von den Bedingungen ab, zu denen die Assays durchgeführt werden. Die Affinitäts- und Geschwindingkeitskonstanten können durch Kontrolle der Bindungswechselwirkung bei einer bestimmten Konzentration des Analyten, oder bei einer Vielzahl unterschiedlicher Konzentrationen des Analyten, optional mit dazwischen liegender Regeneration der Zelloberfläche zwischen den Injektionen des Analyten, bestimmt werden (dies kann mittels 10 mM Glycin bei einem pH-Wert von 1, supplementiert mit 0,5 mM NaCl, erreicht werden).
In dem hierin beschriebenen Beispiel wurden Zellkristalle, die zu 70–80% mit Zellen bedeckt sind, eine Fließgeschwindigkeit (25 μl/min), ein Laufpuffer (PBST) und eine Kontaktdauer zwischen 80–170 Sekunden verwendet, um die Reaktion zu maximieren sowie unspezifische Wechselwirkungen und Effekte durch den Transport von geringerer Masse und Dispersion zu minimieren. Um eine stabile und präzise Bestimmung der Kinetik- und Affinitätskonstanten zu erreichen, kann eine Konzentrationsreihe verwendet werden, und in einer typischen Ausführungsform beinhaltet die Reihe zwischen 3 und 5 unterschiedliche Konzentrationen, die mindestens zwei Mal wiederholt werden. Der Konzentrationsbereich sollte mindestens das 10-Fache betragen, und bei der höchsten Konzentration sollte der Analyt an mindestens die Hälfte der vorhandenen Oberflächenrezeptoren gebunden sein. Geeignete Konzentrationen an Analytmolekülen hängen von der Affinität des Analyten für den Rezeptor ab. Für einen Antikörper der Affinität von 1 nM wurde ein Bereich von 3–50 μg/ml als geeignet angesehen und für 15 nM Affinitätslektine war ein Konzentrationsbereich von bis zu 100 μg/ml erforderlich, um die maximale Reaktion zu erreichen (üblicherweise 5–10 Hz für Antikörper an Zelloberflächenrezeptoren und 250 Hz für die Bindung von Lektinen an Zelloberflächenkohlenhydrate).
Bei kleinen erwarteten Signalreaktionen und mit äußerst komplexen Sensoroberflächen ist das Anpassen des Laufpuffers an den Probenpuffer stark bevorzugt. In einem optionalen Ansatz zur Bereitstellung einer optimalen Anpassung zwischen dem Probenpuffer und dem Laufpuffer, der über die Sensoroberfläche fließt, wurde der Puffer, der über die Sensoroberfläche geflossen ist, vom Ausgang gesammelt und zur Probenverdünnung wieder verwendet. Bevorzugt wird der Puffer kurz vor der Probeninjektion gesammelt, um die beste Anpassung zwischen den Puffern bereitzustellen. Gegebenenfalls werden Kontrollinjektionen auf dieselbe Art und Weise durchgeführt, allerdings ohne Zugabe eines Analyten. Pufferkontrollen können anschließend zur Beseitigung von Artefakten verwendet werden und stellen eine zuverlässige, qualitativ hochwertige Biosensoranalyse dar.
Eine kinetische Analyse wurde ähnlich wie ein herkömmlicher Wechselwirkungsassay mit der Bestimmung der On/Off-Geschwindigkeits- und Affinitätskonstante (Kd) durchgeführt (siehe Myszka-Referenzen oben).
Beispiel 2a: Zell-Lektin-Wechselwirkung auf einem Attana Cell 200-Instrument
Wie in 1 gezeigt, wurden MDAMB468-Zellen (humane Brustkarzinom-Zelllinie) auf einem UV-behandelten PS-Kristall ausgesät, nach 24 Std. in 3,7% Formaldehyd fixiert und die Zellkerne angefärbt.
Das Experiment wurde bei 20 GradC und einer Fließgeschwindigkeit von 25 μl/min durchgeführt. PBS, das mit 0,025% Tween supplementiert wurde, wurde als Laufpuffer verwendet. Verschiedene Lektinkonzentrationen (ConA und WGA) wurden über die Zellen mit einer Kontaktzeit von 85 Sekunden injiziert, und die Dissoziation wurde für mindestens 300 Sekunden kontrolliert. Die Daten sind in 2 und 3 gezeigt. Die Bestimmung der Kinetik erfolgte unter Verwendung der Software Clamp (TIBS, 1998, 23, 149).
Die zwei Lektine, ConA und WGA, weisen unterschiedliche Strukturen und Zuckerspezifität auf. Das hier vorgestellte Experiment zeigt, dass beide Lektine mit den Kohlenhydraten an der Oberfläche der Zelle mit unterschiedlicher Intensität und Affinität in Wechselwirkung stehen, und stellten daher wertvolle Informationen im Hinblick auf die Glykan-Zusammensetzung der Glykokonjugate der MDAMB468-Zelloberfläche bereit. Die Affinitätskonstanten für die Wechselwirkung zwischen den Zelloberflächenkohlenhydraten und den zwei Lektinen betrugen jeweils 15 nM und 93 nM für ConA und WGA.
Beispiel 2b: Spezifität der Wechselwirkung zwischen Lektin-Zelloberfläche
Zur weiteren Verifizierung der Spezifität der Wechselwirkung zwischen Lektin und Zelloberflächenkohlenhydrat ließ man ein GalNAc-Bindungslektin bei unterschiedlichen Konzentrationen mit zwei unterschiedlichen Zelllinien, SW480 und HT29, die unterschiedliche Glykotope auf ihren entsprechenden Oberflächen aufweisen, in Wechselwirkung treten. Das Lektin wurde in einem Laufpuffer bei Konzentrationen im Bereich von 6,25 μg/ml bis 200 μg/ml hergestellt und anschließend über SW480- und HT29-Zellen auf die entsprechenden Sensoroberflächen injiziert. Das Lektin wurde für 85 Sek. injiziert und anschließend für 200 Sek. zur Dissoziation stehen gelassen. Wie in 10 gezeigt wurde nur eine geringe Bindung auf den SW480-Zellen nachgewiesen, während die Bindung von HT29-Zellen konzentrationsabhängig und signifikant höher war.
Beispiel 3: Zell-Antikörper-Wechselwirkung auf einem Attana Cell 200-Instrument
Eine A-431-Zelllinie ist eine gebundene humane Epithelzelllinie (Plattenepithelkarzinom), die EGFR-Rezeptoren überexprimiert.
In 4 sind fixierte und DAPI-gefärbte A-431-Zellen auf UV-behandeltem Polystyrol-QCM-Kristall gezeigt.
Der Kristall wurde in 10 mM Glycin, 500 mM NaCl bei einem pH-Wert von 1 bei Raumtemperatur für 20 Min. vorbehandelt und in PBS-T gewaschen, bevor er in dem Chiphalter befestigt wurde. Der Kristall wurde bei 20 GradC und einer Fließgeschwindigkeit von 40 μl/min, PBS-T (0,025% Tween) über Nacht stabilisiert. Die Fließgeschwindigkeit wurde während der Antikörper-Injektionen auf 25 μl/min reduziert.
Antikörper: anti-EGFR sc 101 in PBS 2 mg/ml (Santa Cruz). 3 verschiedene Antikörper-Konzentrationen, 25, 12,5 und 6 μg/m1 wurden getestet.
Die analytischen Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Die kinetischen Geschwindigkeits- und Affinitätskonstanten (Kd = 1,2 nM) für die Wechselwirkung zwischen den anti-EGFR- und den Zelloberflächen-EGFR-Rezeptoren wurden bestimmt.
Beispiel 4: Zell-Lektin-Wechselwirkung auf einem Attana Cell 200-Instrument – Verbesserung der Sensitivität mittels Zellfixierung
A-431-Zellen (humane Plattenepithelkarzinom-Zelllinie) wurden auf UV-behandeltem PS-Kristall ausgesät und nach 24 Std. in 3,7% Formaldehyd fixiert. Das Experiment wurde bei 20 GradC mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 μl/min in PBS, das mit 0,025% Tween supplementiert wurde, durchgeführt. Die Lektine WGA und ConA wurden mit einer Konzentration von 50 μg/ml für eine Kontaktdauer von 85 Sek. injiziert, und die Dissoziation wurde für 215 Sek. kontrolliert. Ein Kontrollkristall, der aus UV-behandeltem PS-Kristall besteht und frei von Zellen ist, ansonsten jedoch identisch behandelt und zubereitet wurde, wurde in das Experiment einbezogen, um den Beitrag der Wechselwirkungen zwischen Nicht-Lektin und den Zellen zu beurteilen. Screening-Versuche wurden unter denselben Bedingungen mit einer Vielzahl anderer Lektine durchgeführt, um die Spezifität der ConA- und WGA-Wechselwirkungen zu zeigen (6a mit A-431-Zellen, und 6b ohne Zellen).
Die starke Bindungsreaktion von WGA (> 800 Hz) an die A-431-Zelloberfläche (7a) zeigt im Vergleich zu der erwarteten Reaktion einer zweidimensionalen Oberfläche, die dieselbe oder höhere Oberflächendichte an relevanten Kohlenhydraten enthält, einen signifikanten Reaktionsanstieg. Die erwartete maximale Reaktion, die auf einer zweidimensionalen Oberfläche erreicht werden kann, sollte im Bereich von 100 Hz bei einem Molekulargewicht für WGA von 35000 Da liegen, da es auf der Oberfläche keine praktische Grenze für die molekulare Packungsdichte gibt. Der etwa 8fache Anstieg an Sensitivität ist anhand der Verstärkung der Oberfläche erklärbar, die die fixierten Zellen, die auf der Oberfläche immobilisiert sind, bereitstellen. Obwohl die Zellen eine Dicke im Bereich von 10 μm aufweisen und der QCM-Sensor üblicherweise eine Ausklinglänge im Bereich von wenigen Hundert nm hat, sollte die Verbesserung der Sensitivität auf Grund der Oberflächenverstärkung begrenzt sein, wenn nicht die Stabilisierung der Zellen durch die Fixierung bereitgestellt würde. Folglich zeigen die bereitgestellten Daten, dass der Sensitivitäts- und Dynamikbereich durch Hinzufügen und Fixieren der Zellen an die Oberfläche verbessert werden kann. 7b vergleicht die A-431-Kontrollkristallfrequenzverschiebungen für die ConA- und WGA-Fixierung.
Bespiel 5: Oberflächen und Fixierungsmethoden
A-431-Zellen wurden auf Gold- oder Polystyrol-(PS)-Oberflächen mobilisiert. Immobilisierte Zellen wurden anschließend gemäß zwei unterschiedlichen Ansätzen fixiert. Die Fixierungsstrategien wurden im Allgemeinen in eine additive Fixierung, basierend auf der Bildung kovalenter Bindungen zwischen Proteinen, und denaturierender Fixierung, die aus einer Dehydration der verschiedenen Zellbestandteile besteht, unterteilt. In diesem Versuch wurden Fixierungsmethoden, die auf beiden dieser Prinzipien basieren, untersucht. Eine mikroskopische Auswertung der Zellen mit angefärbtem Zellkern wurde zur Bewertung des Ausmaßes der Immobilisierung durchgeführt.
Die vier untersuchten Bedingungen waren wie folgt:

– A-431 auf Polystyrol immobilisert und mit Formaldehyd + Methanol (PSFM) fixiert
– A-431 auf Polystyrol immobilisert und mit Formaldehyd (PSF) fixiert
– A-431 auf Gold immobilisert und mit Formaldehyd + Methanol (GoldFM) fixiert
– A-431 auf Gold immobilisiert und mit Formaldehyd (GoldF) fixiert

Die Bindung des Lektins Con A bis A-431 wurde zur Bewertung der Goldoberfläche als zusätzliche Alternative zur zuvor beschriebenen Polystyroloberfläche verwendet, um die Säugetierzellen zu bewirten. Außerdem wurde eine Denaturierungsfixierungsmethode unter Verwendung von Formaldehyd und Methanol mit der additiven Fixierungsstrategie basierend auf Formaldehyd, wie zuvor beschrieben, verglichen.
Wie 8 und 9 zu entnehmen, ist PS ein besseres Substrat zur Bindung von Zellen, wobei das höchste Signal mit der Denaturierungsfixierung erhalten wurde; allerdings kann eine Goldoberfläche als Alternative verwendet werden. Obwohl auf ähnliche Art und Weise beide Fixierungsansätze verwendet werden können, erscheint die Denaturierungsfixierung in diesem bestimmten Beispiel vorteilhaft.
Die optimale Wahl der Fixierungsmethode sowie der Oberflächenart sind von dem zu untersuchendem System abhängig. Diese Beispiele zeigen, dass nicht nur sowohl die additive als auch die denaturierende Fixierungsmethode, sondern auch die Gold- oder Polystyroloberflächen in ihrer Beschaffenheit mit der qualitativ hochwertigen Messung unter Verwendung des Attana-Cell-200-Instruments kompatibel sind.
Die obigen Beispiele sollen zur Veranschaulichung verschiedener Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dienen und sie sollen nicht den Schutzbereich der Erfindung, der durch die angehängten Ansprüche definiert ist, einschränken. Alle hierin zitierten Dokumente sind unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit einbezogen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

GB 2008/001515 [0016]
WO 2008/132487 [0016, 0030]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Biomolecular Sensors, Gizeli und Lowe. Taylor und Francis, London; 2002 [0002]
Cooper und Singleton (J. Mol. Recognit., 2007, 20, 154) [0006]
Fung und Wong (Anal. Chem. 2001, 73, 5302) [0006]
Marx et al., Anal. Biochem., 2007, 361, 77 [0007]
www.denator.com [0025]
Brock et al. (Cytometrie, 1999, 35, 353) [0025]
Myszka (J. Molec. Recognit., 1999, 12, 279) [0034]
Morton und Myszka (Methods Enzymol., 1998, 295, 268–294) [0034]
www.attana.com [0069]
TIBS, 1998, 23, 149 [0076]

Claims

Massensensitiver chemischer Sensor, wobei der chemische Sensor inaktivierte Zellen aufweist, die an einer Messoberfläche des chemischen Sensors gebunden sind, und wobei der chemische Sensor zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Analytliganden und den gebundenen, inaktiven Zellen mittels Änderung der Masse an der Sensoroberfläche aufgrund der Bindung des Analytliganden an die Zellen geeignet ist, wobei der Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet ist oder einen Teil einer Durchflusszelle bildet, und wobei die normale Biochemie der Zellen aufgrund der Inaktivierung der Zellen im Wesentlichen arretiert ist, so dass die Zellen im Wesentlichen nicht mehr wachsen können.
Massensensitiver chemischer Sensor nach Anspruch 1, wobei die Zellen fixiert sind, und/oder wobei die Zellen eukaryotisch sind.
Sensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Messoberfläche vor der Zellimmobilisierung einen Kontaktwinkel von 10 bis 90 Grad, bevorzugt 20 bis 80 Grad und stärker bevorzugt 30 bis 70 Grad aufweist, der mittels hochreinem Wasser gemessen wurde.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Messoberfläche mit einer Polymerbeschichtung ausgestattet ist, an der die Zellen gebunden sind, wobei die Polymerbeschichtung optional ein Polystyrol umfasst, welches bevorzugt durch Behandlung mit Plasma-Bombardement oder elektromagnetischer Strahlung modifiziert ist.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Sensor eine akustische Wellenvorrichtung ist, wie z. B. eine Quarzkristallmikrowaage.
Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Messoberfläche Polyaminosäuren, Serumproteine und/oder extrazelluläre Matrixproteine aufweist, die an der Messoberfläche adsorbiert sind, wodurch die Adhäsion der Zellen verstärkt sein kann.
Massensensitiver chemischer Sensor, der eine Wechselwirkung zwischen einem Analytliganden und immobilisierten Zellen nachweisen kann, wobei der massensensitive chemische Sensor nach einer Methode erhältlich ist, die die Schritte umfasst: Inkontaktbringen einer Suspension, die Zellen wie beispielsweise eukaryotische Zellen enthält, mit der Messoberfläche eines Sensorelements; Ermöglichen des Bindens der Zellen an der Messoberfläche und des potenziellen Wachsens der Zellen auf der Messoberfläche; Behandeln der gebundenen Zellen nach einem geeigneten Zeitraum, um die Zellen zu inaktivieren, so dass die normale Biochemie der Zellen im Wesentlichen arretiert ist, so dass die Zellen im Wesentlichen nicht mehr wachsen können; und Integrieren des Sensors in eine Durchflusszelle, so dass der Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet ist oder einen Teil einer Durchflusszelle bildet.
Massensensitiver chemischer Sensor umfassend eine akustische Wellenvorrichtung, wie zum Beispiel eine Quarzkristall-Mikrowaage, mit inaktivierten Zellen, die auf oder in der Nähe einer Sensoroberfläche des massensensitiven chemischen Sensors immobilisiert sind, wobei die Zellen innerhalb einer vernetzten Polymermatrix eingebettet sind, wobei der Sensor mit einer Durchflusszelle ausgestattet ist oder einen Teil einer Durchflusszelle bildet, und wobei die normale Biochemie der Zellen aufgrund der Inaktivierung der Zellen im Wesentlichen arretiert ist, so dass die Zellen im Wesentlichen nicht mehr wachsen können.