JP2022509555A

JP2022509555A - センサ表面に細胞を播種するための方法

Info

Publication number: JP2022509555A
Application number: JP2021550708A
Authority: JP
Inventors: スティーブンファウラー; ナホンチウ; グオジュンチェン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2022-01-20
Also published as: WO2020104348A1; US20210270828A1; CN113167793A; EP3884273A1

Abstract

本発明は、バイオセンサ表面に細胞を播種するための方法、および細胞－分子相互作用を測定するためにその表面に播種された細胞を有するバイオセンサの使用を提供する。

Description

本発明は、バイオセンサ表面に細胞を播種するための方法、および分子細胞相互作用を測定するための方法における播種された細胞の使用に関する。

生細胞をバイオセンサと会合させることは、バイオセンサ先端の小さな領域に起因して技術的に困難である。バイオセンサを上向きに配置するとき、非常に小さい先端領域は、十分な細胞培養培地を保持することができず、非常に急速に乾燥する。また、細胞を培地の底部に落下させ、細胞が付着されるはずのバイオセンサから離れる細胞沈降のために、バイオセンサを下向きに配置することも不可能である。現在のアプローチは、細胞がセンサ表面と相互作用して結合することを潜在的に可能にする時間とともに細胞が沈むのを防ぐために、培養培地の密度を変化させることを含む［論文参照］。これを達成するための試薬はまだ開発中であり、細胞培養条件の変化、試薬の細胞毒性、および細胞付着の一貫性のない結果などの品質問題のために市販されていない。

従って、生細胞を最適な細胞培養条件でバイオセンサと会合させるために、単純で堅牢な方法が必要である。

第１の態様では、本発明は、センサ（４）のバイオセンサ表面（５）に細胞を付着させる方法であって、
ａ）液体受容ユニット（１）内に細胞懸濁液を提供することであって、細胞懸濁液が液体受容ユニット（１）の外部に対して表面（７）を形成する、細胞懸濁液を提供することと、
ｂ）バイオセンサ表面（５）を液体受容ユニット（１）内の細胞懸濁液の表面（７）と接触させることと、
ｃ）細胞をセンサ表面（５）上で重力により静置させ、細胞をバイオセンサ表面（５）に接着させることと
を含む、方法を提供する。

本発明の方法の実施形態では、液体受容ユニット（１）は、接着力および表面張力によって細胞懸濁液を規定の領域／空間に保持する。

本発明の方法の実施形態では、液体受容ユニット（１）は、毛細管、微細溝、マイクロウェル、マイクロループ、マイクロワイヤスプリング、またはマイクロ突起からなる群から選択される構造を備える。

本発明の方法の実施形態では、液体受容ユニット（１）は、リザーバ（２）に接続されて液体受容ユニット（１）を形成する毛細管（３）を備える。

本発明の方法の実施形態では、毛細管（３）は、細胞懸濁液が液体受容ユニット（１）の外部に対して表面（７）を形成し且つ前記表面（７）がセンサ表面（５）と接触する端部開口部（６）を有する。

本発明の方法の実施形態では、毛細管（３）は、細胞懸濁液が流出するのを防ぐために、端部開口部（６）に疎水性区域を有する。

本発明の方法の実施形態では、毛細管（３）は、少なくとも細胞懸濁液で充填されている。

本発明の方法の実施形態では、液体受容ユニット（１）は、２つ以上の液体受容ユニット（１）を備えるアレイ形式で配置され、好ましくはアレイ形式は、９６ユニットプレート形式であり、より好ましくは９６ユニットＩＭＡＰｌａｔｅ（商標）である。

本発明の方法の実施形態では、センサ（４）は、センサ表面（５）を有する針状センサである。

本発明の方法の実施形態では、バイオセンサ表面（５）は、上向きに配置されている。

本発明の方法の実施形態では、ステップｃ）において、細胞は、約１～２４時間静置される。

本発明の方法の実施形態では、バイオセンサ表面（５）は、細胞付着および細胞増殖を支持するために生体適合性マトリックスでコーティングされている。

本発明の方法の実施形態では、バイオセンサ表面（５）は、生体適合性マトリックスでコーティングされる前に、アセトンなどの溶媒で前処理される。

本発明の方法の実施形態では、バイオセンサ表面（５）は、センサ表面（５）に固定される細胞の表面分子と特異的に相互作用する分子でコーティングされている。

第２の態様では、本発明は、試験分子と細胞との間の分子相互作用を測定するための方法であって、
ａ）本発明に係るセンサのバイオセンサ表面に細胞を付着させる方法に係るバイオセンサ表面（５）に細胞を固定化することと、
ｂ）センサ（４）を試験分子と共にインキュベートすることと、
ｃ）適切な方法によって試験分子と固定された細胞との相互作用を測定することと
を含む、方法を提供する。

本発明の方法の実施形態では、分子は、生体分子である。

本発明の方法の実施形態では、適切な方法は、バイオレイヤー干渉法である。

本発明の方法の実施形態では、試験分子は、マルチウェルプレート、好ましくは９６マルチウェルプレートの反応チャンバ内にある。

第３の態様では、本発明は、複数の液体受容ユニット（１）を備えるマルチユニットプレートを備える、センサ（４）のバイオセンサ表面（５）に細胞を付着させるためのキットであって、液体受容ユニット（１）が、リザーバ部（２）と、端部開口部（６）を有する毛細管部（３）と、バイオセンサ（４）のセットと、本発明の細胞播種方法に従ってバイオセンサ表面（５）に細胞を付着させる方法のためのプロトコルとを有する、キットを提供する。

本発明のキットの実施形態では、マルチユニットプレートは、ＩＭＡＰｌａｔｅ（商標）であり、センサは、バイオレイヤー干渉バイオセンサである。

本発明の実施形態では、キットは、バイオセンサ（４）のセットを収容するマルチユニットプレートと、２つのマルチユニットプレートを接続するスペーサとをさらに備える。

ＩＭＡＰｌａｔｅ（商標）は、ＮＣＬＮｅｗＣｏｎｃｅｐｔＬａｂＧｍｂＨの登録商標である。ＩＭＡＰｌａｔｅ（商標）は、例えば、ＮＣＬＮｅｗＣｏｎｃｅｐｔＬａｂＧｍｂＨ、ＣＨ－４３１３Ｍｏｅｈｌｉｎなどの異なる供給元から市販されている。

本明細書で使用される「試験化合物」という用語は、合成的にまたは天然源から誘導された有機または無機化合物を含む。化合物は、これらに限定されるものではないが、比較的低い分子量を特徴とする、ポリヌクレオチド、脂質、多糖またはホルモン類似体などの無機または有機化合物を含む。他の生体高分子有機試験化合物は、約２～約４０のアミノ酸を含むペプチドおよび約４０～約５００のアミノ酸を含むより大きなポリペプチド、例えば抗体または抗体コンジュゲートを含む。

本発明の細胞播種方法を実行するための例示的なアセンブリを示している。アセンブリは、複数の液体受容ユニット１を有するＩＭＡｐｌａｔｅ（商標）と、細胞が播種されるセンサ表面５を備えるバイオセンサ４を収容するバイオセンサホルダとを備える。２つのプレートは、双方のプレートの四隅に配置された４つのスペーサによって規定の距離に保持される。上部プレートの液体受容ユニット１は、下部毛細管部３と、上部リザーバ部２とを備える。下部毛細管部は、細胞懸濁液が流出するのを防ぐために疎水性区域を有する開口端部を有する。２つのプレート間の規定の距離は、センサ表面５を毛細管３の下端部６に形成された細胞懸濁面７と接触させる。本発明の方法に従って播種された細胞を有するセンサ表面５を示している。細胞は、センサ表面上に単層を形成する。図３は、本発明に係る液体受容ユニット１の異なる実施形態を示している。図３ａは、上部リザーバ部２および下部毛細管部３を備える液体受容ユニット１を示している。毛細管部３は、開口底部６を有し、毛細管３の開口区域は、播種される細胞を含む液体が流出するのを防ぐために、例えばポリスチロールなどの疎水性材料から作製される。図３ｂ～３ｅは、本発明の液体受容ユニットのさらなる実施形態を示している。図３ｂは開口壁を有する毛細管として機能する微細溝、図３ｃはマイクロループ、図３ｄはマイクロワイヤスプリング、図３ｅはマイクロ突起。本発明の実施形態に係るセンサ４－液体受容ユニット１のアセンブリを示している。液体受容ユニット１は、リザーバ部２と、端部開口部６を有する毛細管３とを備える。液体受容ユニット１は、その充填状態で示されている。すなわち、液体受容ユニット１は、細胞懸濁液で充填されている。液体受容ユニット１内の細胞懸濁液は、毛細管３の端部開口部６において、センサ表面５と接触する、外部７に対する表面、特に凸状メニスカス７を形成する。毛細管３の端部開口部６に形成された凸状液体メニスカス７と、図４に示すセンサ／液体受容ユニットアセンブリのセンサ表面５との間の界面の拡大図を示している。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）において、本発明の方法に従って細胞でコーティングされたバイオセンサを使用した抗体結合動態実験の結果を示している。

本発明の方法は、通常の細胞培養培地を使用して針状バイオセンサ表面上に効率的に細胞を播種することを可能にする。本発明の方法は、細胞播種密度の精密な制御を可能にし、細胞ストレスを防止する特別な試薬が必要とされない。

本発明の方法は、細胞または粒子がバイオセンサ表面に固定される必要がある任意の針状センサシステムと共に使用されることができる。固定された細胞または粒子は、小分子および大分子ならびに細胞または粒子とのオリゴヌクレオチド化合物相互作用の生物物理学的測定に使用されることができる。適切なバイオセンサは、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（ｗｗｗ．ｆｏｒｔｅｂｉｏ．ｃｏｍ）から市販されている。

実施例１：図３ａおよび図４に示す構成を有する９６個の液体受容ユニットを有するＩＭＡＰｌａｔｅ（商標）を使用したバイオセンサ表面への細胞播種。検出方法は、以下のステップを含む：
１．接着性細胞を継代する標準的なプロトコルを使用して細胞懸濁液を調製する。
２．細胞懸濁液を細胞培養培地で適切な細胞密度（典型的な範囲：バイオセンサ表面あたり０．５×１０^６～１×１０^６細胞／ｍＬまたは２０００～５０００細胞）に希釈する。
３．図１に示すように、細胞播種アセンブリを組み立てる。アセンブリは、細胞懸濁液で充填された９６個の液体受容ユニット１を有する上部ＩＭＡＰｌａｔｅと、センサ表面５を有する針状センサ４を収容する下部プレートとを備える。
４．細胞懸濁液を混合し、５μＬの細胞懸濁液を上部ＩＭＡＰｌａｔｅの毛細管３に充填し、次いで、液体受容ユニット１のリザーバ部２に２０～３０μＬの細胞培養培地を充填することによって毛細管３内の５μＬの細胞懸濁液を覆う。毛細管３内の細胞懸濁液は、毛細管の端部開口部において外部に対して表面を形成するが、流出しない。センサ表面５は、液体表面と接触し、細胞は、センサ表面５に播種および接着することができる。
５．細胞培養インキュベータ内で２～４時間インキュベートして、細胞を静置させ、センサ表面５に接着させる。
６．センサ４を細胞播種アセンブリから取り外す；細胞が接着したセンサ表面５（下向き）を、細胞培養培地を含む標準的な９６ウェルプレートのウェル内に配置し、細胞培養インキュベータ内で一晩インキュベートする。
７．細胞形態についてバイオセンサ表面をチェックする。その表面５上に細胞が接着したバイオセンサは、細胞－分子結合アッセイにおける使用の準備が整う。

実施例２：生体適合性マトリックス（コラーゲン）によるバイオセンサ表面のコーティング
本発明者らは、生体適合性マトリックスで直接コーティングされた市販のセンサが、細胞付着および増殖をほとんどサポートすることができないことを見出した。それは、おそらくバイオセンサ表面上の材料の毒性に起因するものであった。多くの試行後、本発明者らは、生体適合性マトリックスコーティングの前にアセトンなどの溶媒で前処理することが、細胞を正常に増殖させることを可能にすることができることを見出した。

本発明の実施形態では、バイオセンサ表面は、バイオセンサ表面への細胞接着を改善するために生体適合性マトリックスでコーティングされている。生体適合性マトリックスでバイオセンサ表面をコーティングする例示的な方法は、以下のステップを含む：
１．アセトンを含むウェルまたはチューブ内にバイオセンサを（表面を下にして）配置し、バイオセンサ表面がアセトンと接触することを確認する。
２．バイオセンサを僅かに撹拌しながらＲＴ（２０℃）で約１５分間インキュベートする。
３．アセトンを含む新たなウェルまたはチューブにバイオセンサを移送し、ステップ２と同様にインキュベートする。
４．ステップ３を繰り返す。
５．エタノールを含むウェルまたはチューブにアセトン処理されたバイオセンサを移送し、僅かに撹拌しながら約５分間インキュベートする。
６．最後に、バイオセンサを水で洗浄する。ここで、バイオセンサは、コラーゲンでコーティングされる準備が整う。
コラーゲンによるバイオセンサ表面のコーティング：
ａ）コラーゲン溶液（典型的には０．１～０．５ｍｇ／ｍＬの濃度）を含むウェルまたはチューブにバイオセンサを（表面を下にして）配置し、バイオセンサ表面が液体と接触することを確認する。
ｂ）ＲＴ（２０℃）で一晩インキュベートし、バイオセンサをＲＴ（２０℃）で一晩乾燥させる。
ｃ）バイオセンサをＰＢＳで洗浄し、続いて水によって洗浄する。ここで、バイオセンサは、本発明の方法によって細胞を播種する準備が整う。

実施例３：本発明の方法に従って細胞を播種したバイオセンサを使用するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ（結果については図６を参照）
結合ではなく他の細胞活性（インターナリゼーションなど）を排除するための、細胞でコーティングされたバイオセンサの前処理を行う。リガンドとの細胞表面分子相互作用を研究するために、以下の３つのステップが細胞ベースのＢＬＩアッセイプロトコルに追加された：
１．低温衝撃：アッセイ前に、バイオセンサを（表面を下にして）氷冷緩衝液または細胞培養培地に約５分間配置する。
２．ＮａＮ_３処理：アッセイ前に、バイオセンサを（表面を下にして）１～３ｎｇ／ｍＬのＮａＮ_３を含む緩衝液または細胞培養培地に約２０分間配置する。
３．アセトン処理（細胞固定）：アッセイ前に、バイオセンサを（表面を下にして）氷冷アセトンに約１０秒間配置する。
バイオレイヤー干渉法アッセイ：
バイオセンサおよび試薬プレートをＢＬＩ装置に配置する（ＢＬＩマニュアルに従う）。
アッセイステップを定義し、ＢＬＩを実行する。
一般プログラム：緩衝ウェルにバイオセンサを最初にディップする→ベースライン確立。
試料ウェル（試験化合物を含む）にバイオセンサを移送する→会合（結合が観察される）。
最後に、バイオセンサを緩衝ウェルに移送する→解離。

Claims

センサ（４）のバイオセンサ表面（５）に細胞を付着させるための方法であって、
ａ）液体受容ユニット（１）内に細胞懸濁液を提供することであって、前記細胞懸濁液が前記液体受容ユニット（１）の外部に対して表面（７）を形成する、細胞懸濁液を提供することと、
ｂ）前記バイオセンサ表面（５）を前記液体受容ユニット（１）内の前記細胞懸濁液の前記表面（７）と接触させることと、
ｃ）前記細胞を前記センサ表面（５）上で重力により静置させ、前記細胞を前記バイオセンサ表面（５）に接着させることと
を含む、方法。
前記液体受容ユニット（１）が、接着力および表面張力によって前記細胞懸濁液を規定の領域／空間に保持する、請求項１に記載の方法。
前記液体受容ユニット（１）が、毛細管、微細溝、マイクロウェル、マイクロループ、マイクロワイヤスプリング、またはマイクロ突起からなる群から選択される構造を備える、請求項１または２に記載の方法。
前記液体受容ユニット（１）が、
リザーバ（２）に接続されて前記液体受容ユニット（１）を形成する毛細管（３）
を備える、請求項３に記載の方法。
前記毛細管（３）が端部開口部（６）を有し、前記端部開口部（６）において、前記細胞懸濁液が前記液体受容ユニット（１）の前記外部に対して前記表面（７）を形成し、且つ前記表面（７）が前記センサ表面（５）と接触する、請求項３または４に記載の方法。
前記毛細管（３）が、前記細胞懸濁液が流出するのを防ぐために、前記端部開口部（６）に疎水性区域を有する、請求項４に記載の方法。
前記毛細管（３）が、少なくとも前記細胞懸濁液によって充填される、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
前記液体受容ユニット（１）が、２つ以上の液体受容ユニット（１）を備えるアレイ形式で配置され、好ましくはアレイ形式は、９６ユニットプレート形式であり、より好ましくは９６ユニットＩＭＡＰｌａｔｅ（商標）である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
前記センサ（４）が、センサ表面（５）を有する針状センサである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記バイオセンサ表面（５）が上向きに配置されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
ステップｃ）において、前記細胞が、約１～２４時間静置される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
前記バイオセンサ表面（５）が、細胞付着および細胞増殖を支持するために生体適合性マトリックスによってコーティングされている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
前記バイオセンサ表面（５）が、前記センサ表面（５）に固定される前記細胞の表面分子と特異的に相互作用する分子でコーティングされている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
試験分子と細胞との間の分子相互作用を測定するための方法であって、
ａ）請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法に従って細胞をバイオセンサ表面（５）に固定することと、
ｂ）前記センサ（４）を前記試験分子と共にインキュベートすることと、
ｃ）適切な方法によって前記試験分子と前記固定された細胞との相互作用を測定することと
を含む、方法。
前記分子が生体分子である、請求項１４に記載の方法。
前記適切な方法がバイオレイヤー干渉法である、請求項１４に記載の方法。
前記試験分子が、マルチウェルプレート、好ましくは９６マルチウェルプレートの反応チャンバ内にある、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
複数の液体受容ユニット（１）を備えるマルチユニットプレートを備える、センサ（４）のバイオセンサ表面（５）に細胞を付着させるためのキットであって、前記液体受容ユニット（１）が、リザーバ部（２）と、端部開口部（６）を有する毛細管部（３）と、前記バイオセンサ（４）のセットと、請求項１から１３のいずれか一項に従って前記バイオセンサ表面（５）に細胞を付着させる方法のためのプロトコルとを有する、キット。
前記マルチユニットプレートが、ＩＭＡＰｌａｔｅ（商標）であり、前記センサは、バイオレイヤー干渉バイオセンサである、請求項１８に記載のキット。
前記バイオセンサ（４）のセットを収容するマルチユニットプレートと、２つの前記マルチユニットプレートを接続するスペーサとをさらに備える、請求項１８または１９に記載のキット。
前記バイオセンサ表面（５）が、生体適合性マトリックスでコーティングされる前に、アセトンで前処理される、請求項１２に記載の方法。