JP5253148B2 - 脂質二重層への分子の送達 - Google Patents

Description

本発明は、平面脂質二重層内への挿入のための、膜タンパク質の平面脂質二重層への送達に関する。

中に膜タンパク質が挿入された脂質二重層は、特に細胞膜として、生体系のいくつかのタイプにおける膜を構成する。そのような生体膜にインスパイアされ、平面脂質二重層に挿入された膜タンパク質に関連した多数の技術が開発されている。これらの技術においては、膜タンパク質または別の分子を平面脂質二重層へ送達することが必要である。

そのような技術の１つが確率的センシング（stochastic sensing）であって、その中において、分子または肉体の刺激への膜タンパク質の反応が、その分子または刺激のセンシングの実施に使用される。そうした反応の性質は、膜タンパク質の性質に依存するが、膜タンパク質は、天然のタンパク質であっても、あるいは、多くの有用な適用において人工的に作り出したタンパク質であってもよい。センシングの１つのタイプにおいて、膜タンパク質は、タンパク質ポアまたはタンパク質チャネルであって、それは、脂質二重層全体に電気信号を作用させること、例えば、脂質二重層に流れるイオン電流を変えることによって、検体に反応する。この場合、検体のセンシングは、脂質二重層全体において電気信号を検出することによって行ってもよい。確率的センシングは、例えば、イオン、有機分子、またはペプチドなどのセンシング、ＤＮＡの特徴づけ、リガンドとレセプターの相互作用の検査、および多段階の反応経路の検査などの広範囲の生体分子および生体系のセンシングを可能にする。

確率的センシングなどの技術の多用途性にもかかわらず、実用的な方法は面倒で費用がかかり、熟練の科学者によって行われる必要がある。大きな困難は、センシング実施のために平面脂質二重層内に膜タンパク質を挿入するために使用される技術にある。最も一般的な技術は、精製された形態の膜タンパク質を溶液に懸濁し、続いて膜タンパク質が平面脂質二重層に拡散し、平面脂質二重層に結合することによって挿入され、機能状態に組み入れられる間、待つというものである。しかし、実施において、単一の膜タンパク質を脂質二重層内に挿入するのは、非常に速度が遅く、信頼できない場合があり得る。確率的センシングの場合、単一のポアを有するのが好ましい。なぜならば、複数のポアの場合、動態解析を妨げるか、あるいは少なくとも複雑にするからである。複数のポアにおける挿入を防ぐために、膜タンパク質の濃度が低い溶液が使用される。膜タンパク質が平面脂質二重層内に挿入されるのにかかる時間は、一般的には数十分である。速度が遅いことと科学者にとってストレスのたまるものであることを別にしても、こうしたことは、上述の技術をどのように商業的に適用するに当たっても不利益である。

関連した問題が、新しく人工的に作り出したタンパク質においても起こる。この場合において、活性の不足がある場合、人工的に作り出した膜タンパク質が平面脂質二重層内に挿入されるための機能が働かないためであるのか、それとも、不十分な濃度、異なる吸着特性、または単に十分に時間が経過していないなどの別の要因によるものであるのかが、不明である。

更に、単一のポアが一旦挿入されてモニタリングが開始されても、続いて別の膜タンパク質が溶液から平面脂質二重層へと挿入されてしまうことによって、実験が台無しになり得る。この問題の一つの可能な解決法は、単一のポアが挿入された後に装置をかん流させて、溶液から余分なタンパク質を除去することである。しかし、これは難儀で信頼できない工程であり、しばしば平面脂質二重層が破裂する結果となる。

実施上の問題として、膜タンパク質の挿入に要する時間を最小限にとどめるためには、比較的広い面積の平面脂質二重層を使用する必要がある。しかし、電気的雑音を低くし、安定性を高めるためには、平面脂質二重層の面積を減らすことが望ましいであろう。

上記のような実践上の問題点はまた、いくつかの適用において望まれているであろう、アレイフォーマットにおける膜タンパク質の適用の可能性を狭めてしまう。

これらの問題のうちの少なくともいくつかを軽減する技術の開発が望まれるであろう。

本発明によれば、［請求項１］が提供される。

膜タンパク質を平面脂質二重層に送達するこの方法は、単に膜タンパク質を溶液に入れて待つという上記の既知の技術を超える多数の利点を生み出す。主要な利点は、この方法が迅速で容易に実施できることである。膜タンパク質をプローブ上に置き、プローブを移動させて、平面脂質二重層に対して固定する工程は、実験的に実施が非常に単純で、多大なスキルや専門知識を必要としない。プローブは巨視的な要素であり、手動で、またはマイクロマニピュレータなどの機械システムによって操作されることが可能である。これらの工程はまた、非常に迅速に実施され得る。

プローブを移動させて、平面脂質二重層に対してキャリア表面を固定する工程によって、膜タンパク質が平面脂質二重層に挿入される。実際には、平面脂質二重層に対してキャリア表面を固定させた後、挿入は非常に迅速に起こる。一般的に、挿入は固定から２、３秒以内に起こる。このスピードは実際面において非常に重要である。なぜならば、膜タンパク質を溶液に加えて二重層内に挿入されるのを待つことによって得られ得るよりも何倍も高い率で、実験の実施を反復できるからである。この既知の技術に比べ、本発明は、非常にハイスループットな実験の可能性を提供する。更に、ユーザ側のスキルのレベルがずっと低くとも、スピードが得られ得る。例えば、前記方法は、異なる膜タンパク質および／または検体のハイスループットなスクリーニングを提供するために適用されてもよい。本発明の高速さが特に有用であろう例としては、とりわけ以下のものが含まれる：（１）チャネル、ポア、またはその他の膜タンパク質の機能研究；および（２）検体の存在下での膜タンパク質の機能または活性の測定であって、膜タンパク質および検体のうちのいずれか、または両方の識別を提供し得るもの。

本発明の方法の更なる利点は以下の通りである。

本方法の実施の容易さおよびスピードは、例えばハイスループットなスクリーニングのためのセンサーアレイとして作用するための、膜タンパク質のアレイの生成を促進する可能性を提供する。これは、別々の脂質二重層内にタンパク質をそれぞれ挿入することによって、または単一の平面脂質二重層内に複数のタンパク質を順次的に挿入することによって達成され得るであろう。タンパク質は、同じタイプでも異なるタイプでもよい。特に、本方法は、このようなアレイを調製する際に使用するために、容易に自動化され得る。このような膜タンパク質、特に異なる構造を有する人工的に作り出したタンパク質のアレイは、今までは実施するのが困難であったが、例えば、目的の特別な検体の認識、あるいは検体の複合混合物の認識を可能にするツールとして非常に有用であるものと期待されている。例えば、様々な化合物がセンサーアレイに添加されて、機能の変化がモニターし得るであろう。

本方法の直接的な性質は、これまで人工平面脂質二重層内での再構成が困難であった膜タンパク質の調査を可能にし得る。

本方法が高速であることは、比較的小さい面積の脂質二重層への適用が可能であること、言い換えれば、電気的雑音の減少および平面脂質二重層の安定性の改善を可能にすることを意味する。

多くの利点は、プローブの使用自体に由来する。利点の１つは、送達されるべき膜タンパク質の調製を簡素化することである。例えば、膜タンパク質は、水溶液以外の媒体から得られ得る。１つの選択肢は、プローブを試料にこすりつけるというものである。試料は、例えば、細胞培養物、細菌コロニー、または菌類系であってよい。これらの場合、試料は未溶解であってよい。また、試料は非細胞の、例えば「合成」リボソーム系であってよい。

このことは、研究の際に、ＩＶＶＴなどのタンパク質の複雑な抽出および精製技術やプラスミドの精製、またはＤＮＡ増幅やタンパク質のアセンブリおよび精製の必要なしに、タンパク質が容易に脂質二重層へ移送されることを可能にする。更に、細菌コロニーは、タンパク質用の理想的なストレージシステムである。細菌内でのタンパク質の発現と二重層への送達との間に追加する工程がないので、よりデリケートなタンパク質の、潜在的に変性させる条件への露出が最小限に抑えられる。あるいは、別の利点の可能性としては、キャリア表面上への膜タンパク質の堆積の後で、例えば低温および適切な湿度などの適切な条件下で、プローブを貯蔵し得ることである。

平面脂質二重層へ膜タンパク質を送達する先行技術では、巨視的な物体への固定を回避する傾向にある。これは、脂質二重層が、固定の際の機械的衝撃に耐えることができないであろうと予期したためと推定される。しかし、実際には、破裂や損傷を引き起こさずに、平面脂質二重層をプローブに固定することが可能であることが、本発明者らによって理解されている。以下により詳細に述べられる実験において、本方法が実際に非常に強固なものであることが実証されている。平面脂質二重層は、適用された力を制御するための特別な測定を何も必要とせずに、プローブを手動で移動させることによる固定が可能であった（このような制御または自動化でさえも実現可能であり、本発明の範囲内であるが）。

平面脂質二重層に損傷を与えるプローブとは違って、平面脂質二重層の面積よりも大きな面積を有するキャリア表面を有するプローブの場合は、固定されている間、プローブが実際に脂質二重層の機械的安定性を高めることがわかっている。一般的に、平面脂質二重層を流体静力学的に破裂させるのに必要な圧力は非常に少ない。脂質二重層に静水圧を加える実験のタイプがいくつかある。例えば、圧力に駆動される薬物の送達がもっとも重要であるマイクロ流体の適用において、あるいは、平面脂質二重層を通過する流体の流れがあるその他の実験においてなどである。こうしたタイプの実験において、プローブは、平面脂質二重層を支持するため、および破裂の危険を減らすために使用されてよい。

本方法は、平面脂質二重層内に膜タンパク質を挿入することを提供する。本方法は、確率的センシング技術に適用してもよく、その中において、例えば、膜タンパク質はポアまたはチャネルであり、装置は更に、脂質二重層を流れる電気信号の測定が可能な電気回路を含む。

本方法は、いかなるタイプの膜タンパク質にも適用可能である。このことは、内在性膜タンパク質については実証されているが、表在性膜タンパク質についても同様であると期待される。本方法は、β−バレル型またはα−ヘリックス型という２つの主なクラスを含む任意の膜タンパク質に適用される。重要な適用は、ポアまたはチャネルである膜タンパク質である。ポアまたはチャネルであるタンパク質に加え、可能な膜タンパク質としては、レセプター、トランスポーター、あるいは、細胞認識または細胞から細胞への相互作用を達成するタンパク質が更に含まれるが、これらに限定されない。既に述べたように、本発明の方法に従って膜タンパク質が中に挿入された平面脂質二重層は、確率的センシング技術において使用されてよい。脂質二重層はまた、その中に挿入される膜タンパク質の特性の研究のためにも使用されてよい。例えば、膜タンパク質の特性の電圧依存が測定され得る。脂質二重層内の膜タンパク質を研究するための技術は、当該技術分野において周知である。チャネルまたはポアの機能は、確率的センシング技術と同様の方法により、例えば、平面脂質二重層全体を流れるイオン電流を測定することによって決定され得る。トランスポーターの機能は、例えば、質量分析計またはＥＬＩＺＡによって、あるいは、蛍光的または放射能的に標識された基質を使用することによって、脂質二重層内を移動した分子の量を測定することによって決定され得る。

平面脂質二重層は、任意の膜脂質の二重層であってよく、リン脂質、糖脂質、またはコレステロール、および混合物を含む。例えば、チャンバを定義するチャンバ本体と、中に脂質二重層が形成される開口を有するチャンバの壁とを含み、前記チャンバが水溶液を含有する装置内などによって、平面脂質二重層が形成されるてもよい。

キャリア表面は、膜タンパク質を保持することが可能である。膜タンパク質が表面上に保持されているために、脂質二重層内に挿入されることが可能となる。一般的に、キャリア表面は、平面脂質二重層への送達のために問題の膜タンパク質の保持を可能とする任意のタイプの表面であってよい。いくつかの例を以下に挙げる。

好ましくは、プローブは、膜タンパク質をキャリア表面上に吸着することによって膜タンパク質を保持することが可能である。吸着が起こるのを可能とする１つの選択肢は、プローブが、ヒドロゲルなどのゲルの滴を有する本体を含み、ゲルが本体から突き出しており、ゲルは突出した表面上に膜タンパク質を保持することが可能で、その突出した表面がキャリア表面を構成するものである。しかし、ゲルの使用は必須ではない。例えば代わりに、キャリア表面が、膜タンパク質を吸着する流体または固体の表面であってもよい。適切な固体には、ポリマーまたはガラスが含まれ、そのいずれもが、膜タンパク質の吸着を助けるような適切な特性を有するように選択されてよい。

更に、膜タンパク質は、他のタイプの物理的または化学的結合によって保持されてよい。例えば、キャリア表面は、問題の膜タンパク質に特異的に結合するように選択されてよい。

キャリア表面はまた、適切な表面特性が得られるように、例えばコーティングや化学修飾によって処理されてよい。キャリア表面に化学作用を適用できる点は、固体でできたキャリア表面の特別な利点である。適用が可能なコーティングの１つのタイプには、ポリエチレンイミン、あるいは、膜タンパク質への親和性を増加または減少させる任意の高分子電解質がある。適用が可能な化学修飾の１つのタイプには、シラン修飾がある。

１つのタイプの方法において、キャリア表面は平面脂質二重層よりも強くない力で膜タンパク質を保持でき、前記方法は更に、プローブを移動させて、平面脂質二重層に対してプローブのキャリア表面を固定する工程の後に、プローブを移動させて、脂質二重層からプローブのキャリア表面を離脱させ、それによって、挿入された膜タンパク質を平面脂質二重層内に残す工程を含む。このタイプの方法によって、膜タンパク質は、プローブのキャリア表面から放出される。この場合、手順を妨げることなくプローブを除去することが可能となるので、いくつかの実践的な状況において望ましいかも知れない。

しかし、こうしたプローブの除去は必須ではない。代わりに、実験技術の実施の間、プローブを平面脂質二重層に固定させたままにしておいてよい。プローブが実験を妨げることがなければ、このやり方は受け入れられる。例えば、確率的センシングの場合は、キャリア表面が、ヒドロゲルなどの水溶液が通過して拡散できる材料の表面であるプローブを使用することによって、これを達成できる。これにより、膜タンパク質がプローブ上に保持されたままである間でも、膜タンパク質にイオン電流を流すことが可能となる。

１つの実施形態において、キャリア表面は、平面脂質二重層よりも広い面積を有し、少なくとも１桁異なると有利である。この場合、プローブは、好ましくは、キャリア表面としてゲルの滴の表面を使用する。この場合、適用された力がキャリア表面の面積全体に広がるので、平面脂質二重層への圧力を減少させるという利点がある。この場合、脂質二重層を保持する要素によって動きが阻止されるまで、プローブは平面脂質二重層に対して容易に移動させることができるので、プローブの平面脂質二重層への容易な固定を提供する。圧力の減少は、プローブが平面脂質二重層を損傷することを防ぐ一助ともなる。加えて、比較的大きなプローブの使用は、プローブを移動させる間、平面脂質二重層へ向けて照準を定めることや、上述のように、平面脂質二重層の機械的安定性を高めることができるための一助となる。

別の実施形態において、キャリア表面は平面脂質二重層よりも小さい。この場合、キャリア表面は一般的に固体の表面である。上記のようにプローブが膜タンパク質を保持できるのであれば、固体の性質は重大ではない。可能な固体の１つはガラスであるが、サボテンの針を使用しても実験は成功している。このタイプのプローブは、以下のような多数の利点を提供する。キャリア表面が平面脂質二重層より小さい結果、平面脂質二重層との接触が保障され得る。ただし、これに対応して、広い面積のキャリア表面を有するプローブと比べて不利な点があり、平面脂質二重層に固定させるために正しい位置にプローブをもっていくために、プローブの移動を注意深く制御する必要がある。小さなプローブはまた、より少ない量の問題の膜タンパク質を平面脂質二重層に送達せしめる。これは例えば、より少ない量の膜タンパク質を必要とする場合など、多くの場合において利点を有する。

より良く理解できるように、添付の図面を参照しつつ、例として本発明の１つの実施形態を以下に述べるが、これに限定されることはない。

本方法の実施に使用され得る第１装置３０が、図１に示される。第１装置３０は、従来型の電気生理学セル１と、平面脂質二重層内に挿入される膜タンパク質を使用した確率的センシング（stochastic sensing）を実施するための構造と、を含む。

電気生理学セル１は、互いが鏡像となっている構造を有する２つのチャンバ本体部２を含む。チャンバ本体部２は、デルリン（Ｄｅｌｒｉｎ、登録商標）から作られてよい。チャンバ本体部２は、各々が、そのそれぞれの上面４に開口部を有するチャンバ部３を定義する。チャンバ部３は、各々が、例えば１．５ｍｌなど、数ｍｌの容積を有する。チャンバ部３は、チャンバ本体部２それぞれの側面５には壁を有さない。チャンバ本体を形成するために、２つのチャンバ本体部２は、チャンバ部３それぞれが一列に並んで共にチャンバを形成するように、互いに向かい合う側面５のところで組み合わされる。チャンバ本体部２は、任意の適切な手段で接着されてよく、その典型的な手段としては、クランプまたは接着剤がある。

電気生理学セル１は更に、ポリカーボネートまたは任意のその他の適切なポリマーで作成された隔壁６を含む。隔壁６の各面は、例えばペンタン内における１０％（Ｖ／Ｖ）ヘキサデカンでなど、従来の方法でコーティングされている。隔壁６は、例えば両方のチャンバ本体部２を隔壁６に接着するなどして、２つのチャンバ本体部２の向かい合う側面５の間に配置される。従って、隔壁６は、２つのチャンバ部３によって形成されたチャンバを分割する壁を形成する。

隔壁６は開口７を有し、これは、電気生理学セル１が組み立てられると、チャンバ部３と一列にならぶ。使用の際、図３に示されるように、平面脂質二重層である脂質二重層９が、開口７全体にわたって形成される。隔壁６は、例えば２５μｍなど、脂質二重層９の形成を容易にするのに十分な薄さである。開口７は、一般的に、脂質二重層９を支持することが可能である任意の形状およびサイズであってよいが、好ましくは約１００μｍの直径を有する円形である。

電気生理学セル１は更に、チャンバ本体部２各々のチャンバ部３各々に提供される電極８を含む。電極８は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極であってよい。電極８は、脂質二重層９を流れる電気信号を測定することが可能な電気回路２０の一部を形成する。電気回路２０は、図２に図式的に示され、脂質二重層９を流れる電流を検出することによって確率的センシングを実施する従来型のものである。

電極８は、パッチクランプ増幅器（例えばアキソンインスツリューメント(Axon Instruments)社が供給するＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ）などの増幅器２１に接続される。増幅器２１は、電極８から出力される電流信号を増幅する。

増幅器２１によって出力された電流信号は、ベッセルフィルター（例えばコーナー周波数２ｋＨｚで８０デシベル（ｄＢ）／桁（decade）といった特性で）などの低域通過フィルター２２を通じて供給される。

低域通過フィルター２２によって出力された電流信号は、例えばアキソンインスツリューメント社が供給するＤｉｇｉｔａｔａ １３２０ Ａ／Ｄ変換器などのＡ／Ｄ変換器２３に供給される。Ａ／Ｄ変換器２３は、一般的にサンプリング周波数５ｋＨｚで作動する。Ａ／Ｄ変換器２３は電流信号をデジタル信号に変換し、次に、このデジタル信号は分析のためにコンピュータ２４に供給される。コンピュータ２４は、適切なプログラムを実行して電流信号を記憶しそれをディスプレイ機器に表示する従来型のパーソナルコンピュータであってよい。

電気生理学セル１は、従来の方法で脂質二重層９を形成するために使用される。脂質二重層９を形成するための典型的な実験的手法は以下の通りである。

電気生理学セル１の組み立て後、２つのチャンバ部３は、脂質二重層９内に挿入されている膜タンパク質を考慮して選択される適切な緩衝液で満たされる。

その後、所望の膜脂質の溶液が、各チャンバ部３内の緩衝液に添加される。一般的に、リン脂質、糖脂質、またはコレステロールを含む任意の膜脂質も使用してよい。以下に報告する実験において使用されるものの典型的な例としては、ジフィタノイルホスホコリンがあり、これはペンタンに溶解でき、典型的な量は、溶液８μｌにおいて、１０ｍｇ／ｍｌの濃度であろう。続いて、例えばペンタンなどの溶媒を蒸発させて、緩衝液の表面上に膜脂質の単一層を形成する。

脂質二重層９を形成するために、各チャンバ部３における液面は開口７よりも低くしておき、その後開口７より高い位置に上げる。このような脂質二重層９の形成は、新しい実験を実施することを繰り返すことができる。

脂質二重層９中に膜タンパク質を挿入後（以下に詳細に述べる手法を使用して）、脂質二重層９全体に展開した電気信号が、従来の方法で電気回路２０によってモニターされる。

次に、本方法の実施を可能にする、従来型の電気生理学セル１の変更について述べる。

図１の第１装置３０は更に、電気生理学セル１上に取り付けてよく、巨視的な要素であるプローブ１０を含む。これにより、プローブ１０を手動で操作することが可能となる。

プローブ１０は、図３の断面図に示されるキャリア本体１１を有する。キャリア本体１１は、その遠心端に凹部１３を形成するカップ状部１２を有する。ゲル１４の滴が、凹部１３内に堆積される。ゲルは、例えばアガロースゲル、あるいはポリアクリルアミドなどの合成ゲル等のヒドロゲルである。例えば、以下に報告する実験において、ゲル１４は低融点の５％アガロースゲルであった。ゲル１４は、キャリア本体１１から突出し、ゲル１４の突出面１５が緩やかなカーブを描くようになっている。この実施形態においては、カップ状部１２は円形であるが、一般的に任意の形状を有してよい。

ゲル１４の突出面１５の面積は、カップ状部１２内の凹部１３の開口部の面積によって原則的に制御されるが、好ましくは少なくとも１ｍｍ²であり、より好ましくは少なくとも１０ｍｍ²である。例えば、カップ状部１２は、一般的に約３ｍｍの直径を有する。このように、ゲル１４の突出面１５の面積は、開口７の面積よりも大きく、少なくとも１桁、より好ましくは少なくとも２桁大きい。

キャリア本体１１は、チャンバ本体部２の一方のチャンバ部３において支持され、ゲル１４の突出面１５が、その全体に脂質二重層９が形成される開口７に面する。このような支持を提供するために、プローブ１０はブーム１６を含む。スタブ車軸１７がブーム１６から突き出している。スタブ車軸１７は、チャンバ本体部２の一方の上面４に形成された穴１８に嵌入される。スタブ車軸１７と穴１８は、ブーム１６がチャンバ本体部２の上面４上を回転することが可能なように枢着されて機能する。キャリア本体１１は、ブーム１６から支持され、ゲル１４の突出面１５がアーム１９によって開口７と一列に並び、アーム１９は、キャリア本体１１から、上面４の開口部を貫通するチャンバ部３の外のブーム１６へと伸張する。従って、スタブ車軸１７と穴１８によって形成されたピボットの周りで、ブーム１６を手動で操作することにより、キャリア本体１１を、開口７および脂質二重層９に近づけたり遠ざけたりする動きがもたらされる。

以下、第１装置３０を使用する方法について述べる。

ゲル１４の突出面１５が、分子を運んで脂質二重層９に送達するためのキャリア表面として使用される。はじめに、分子が、脂質二重層９に送達されて中に挿入される膜タンパク質である場合について述べる。

予備的段階として、ゲル１４の突出面１５は、窒素気流下で短い時間保持することにより、表面乾燥および一部脱水させる。次に膜タンパク質を、ゲル１４の突出面１５上に堆積させる。これは、ピペットを使用して、膜タンパク質の溶液を単に垂らすことによって達成される。溶液は、インビトロ転写／翻訳の混合物であってよい。同様に、堆積は任意のほかの方法によって実施されてよく、例えば、細胞培養物や細菌コロニーなどの試料にゲル１４をこすりつける。このような場合、精製の工程を完全に省くことにより、実行可能な膜タンパク質を抽出する工程が有意に短縮および簡素化される。

膜タンパク質が溶液内で堆積されると、溶媒はゲル１４内に吸収される。膜タンパク質を堆積させることによって、膜タンパク質は、ゲル１４の突出面１５上に吸着される。このように、膜タンパク質は、膜タンパク質用のキャリア表面として作用する突出面１５上に保持される。

膜タンパク質の堆積後、プローブ１０が、電気生理学セル１上に取り付けられる。次に、脂質二重層９が、上述の従来技術を使用して開口７全体に形成される。

次に、プローブ１０を移動させ、図３の矢印に示されるように開口７全体に伸張する脂質二重層９に対して、ゲル１４の突出面１５を固定する。このプローブ１０の動きは、ブーム１６を手動で操作することによって容易に実行される。

開口７内の脂質二重層９に対してゲル１４の突出面１５を固定させることにより、突出面１５上に支持された膜タンパク質が、脂質二重層９内に挿入される。このような挿入は、一般的に２〜３秒で起こる。挿入は、電気回路２０によって測定される電気信号を観察することによりモニターしてよく、例えば、コンピュータ２４のディスプレイ上に示される電流信号のモニターによって観察される。膜タンパク質がタンパク質チャネルである場合、検出される電流における特徴的な増加が観察される。

例えば、図６Ａ〜６Ｄは、脂質二重層９内にポアである膜タンパク質を挿入する間の典型的な電流信号の出力のグラフである。図６Ａ〜６Ｄの各グラフにおいて、第１矢印は、脂質二重層９に対するゲル１４の突出面１５の固定が起こった時点を示す。各場合において、この後２〜３秒以内に、電流の急増が起こり、マイナス５０ｍＶの電圧の適用下、電流の大きさは０ｐＡから５０ｐＡへと増加している。これらのグラフは、環境雑音を減じるために、電気生理学セル１を金属の箱（図示せず）に入れて作成された。しかし、プローブ１０を移動させる間、箱が開けられるので、最初の電流信号には非常に雑音が混じる。脂質二重層９内に膜タンパク質が挿入された後、箱が閉じられ、雑音の大きなパルスが引き起こされる。しかしその後は、図６Ａ〜６Ｄのそれぞれのグラフにおける第２矢印に示されるように、雑音は典型的な量まで急減する。

脂質二重層９内に膜タンパク質が挿入された後、プローブ１０は、脂質二重層９に固定されたゲル１４の突出面１５と共に適正な位置に維持される。これは、プローブ１０が実施されるべき実験を妨げることがなければ、十分に受け入れられる。この場合、プローブ１０のキャリア表面を提供するためのゲル１４の使用は特に利点を有する。なぜならば、ゲル１４は多孔性であるので、チャンバ部３内の水溶液がゲル１４を通過して拡散することを可能にするからである。これは、イオン電流が、ゲル１４を通過して膜タンパク質に流れることを可能にする。プローブ１０を脂質二重層９に固定させたままにしておくことで、一般的に膜タンパク質が繰り返し挿入されるようになり、過渡的に開くＫｃｓＡカリウムチャネルなどのチャネル等のゲーティングにとって利点がある。

あるいは、プローブ１０を移動させて開口７から遠ざけ、ゲル１４の突出面１５を脂質二重層９から離脱させてもよい。この場合、膜タンパク質は脂質二重層９内に挿入されたままになっているので、プローブ１０のキャリア表面は、脂質二重層９よりも強くない力で、膜タンパク質を保持しなければならない。この要件は、プローブ１０のキャリア表面を提供するためにゲル１４を使用することによって満たされる。

脂質二重層９内に膜タンパク質が挿入された後、問題の膜タンパク質にとって適切な実験工程が、従来の方法で実施されてよい。例えば、確率的センシングを実施するために、電気回路２０によって検出される電気信号がモニターされる。

ゲル１４の突出面１５は脂質二重層９に固定されるが、突出面１５と脂質二重層９との間の相互作用の明確な性質については、現在知られていない。ゲル１４の突出面１５が脂質二重層９に非常に近い位置にあることは明確であるが、それらの間に実際の物理的接触があるのかどうか、あるいは、例えば、それらの間に水溶液の薄膜が残っているのかどうかは、明確ではない。とは言え、固定される間、ゲル１４が隔壁６に接触することは明白である。従って、ゲル１４が柔軟性を有しているので、開口７に適合してその中にわずかに突き出し、脂質二重層９を若干変形させるのではないかと考えられる。

機械的プロービングの物理的性質が完全には理解されていないという事実はあるものの、脂質二重層９内への膜タンパク質の挿入という観点から見て、この方法は高度に再生産可能であり、信頼性がある。これについては実験的に実証されている。上述の方法全体は、非常に迅速に実施される。この方法は、例えば脂質二重層９を壊して再形成することによって繰り返し実施されてよい。プローブ１０上に新しい量の膜タンパク質を堆積させる必要なしに、新しい膜タンパク質が繰り返し挿入され得る。更に注目すべきは、チャンバ部３内の溶液にプローブ１０をただ浸したままにしておいて、たとえプローブ１０が数時間放置されていたとしても、それによって脂質二重層９内にポアが挿入されてしまうことがないことである。このように、プローブ１０を移動して、脂質二重層９に対してキャリア表面を固定させた時のみ、膜タンパク質の挿入が起こる。

この方法はまた、実施が非常に容易である。プローブ１０の単純な手動操作によって、プローブ１０が移動され得る。プローブ１０の動きを制御するのに、特別な測定の必要はない。実際、この技術的方法は非常に強固であり、脂質二重層９の破裂はめったに起こらない。特に、動作に自動化の必要はないが、もちろんそのような自動化は可能であろう。

本方法の実施に使用され得る第２装置４０が、図４に図示されている。第２装置４０は、第１装置３０との根本的な相違点を有しており、図５に示されるように、異なる形状のプローブ４１が使用される。

第２装置４０は、第１装置３０において使用される電気生理学セル１と実質的に同一の電気生理学セル１を含み、簡潔にするために、その記述は繰り返さない。

加えて、第２装置４０はプローブ４１を含み、プローブ４１は、固体材料からなるロッドの形状を有し、緩やかに丸く、プローブ４１の側面４７と接する端面４２を有する。端面４２と、側面４７の一部は、おそらく分子が脂質二重層９に送達されるようにキャリア表面として作用する。端面４２におけるプローブ４１の断面は、脂質二重層９よりも小さい。この断面は、好ましくは脂質二重層９の面積の７０％を超えず、より好ましくは５０％を超えない。なぜならば、隔壁６に隣接する脂質二重層９の外側部は、一般的には、完全に形成されていないからである。従って、プローブ４１の端面４２が小さいサイズであることにより、膜タンパク質の挿入にとって最良の特性を有する脂質二重層９の中央部と、プローブが一列に配置されることが可能となる。一般的に、プローブ４１の端面４２の直径は、５μｍから５０μｍの範囲である。

プローブ４１は、固体のロッドまたは毛細管であってよいロッド４３の先端として形成される。これは、例えば（株）成茂科学器械研究所から容易に入手できる市販の毛細管プーラーを使用して、プローブ４１を引っ張ることにより、製造が容易になる。このプーラーの工程を使用するとき、プーラーの設定の制御を通して、プローブ４１の形状および鋭さを制御することができる。ロッド４３の先端を引っ張ってプローブ４１を形成した後、端面４２が加熱されて、端面４２の粗さが平らにならされる。ロッド４３を通過する導管は、引っ張る工程によって閉じられ、本方法においてプローブ４１を使用する際に影響はない。

この製造工程は便利ではあるが、この製造工程およびこれにより得られるプローブ４１の性質は必須ではない。一般的に、プローブ４１は、脂質二重層９よりも小さい端面を有する任意の形態のプローブと取り替えることが可能である。プローブ４１を、たまたま妥当なサイズであることがわかったサボテンの針と取り替えることによって成功した実験の結果も得られている。

プローブ４１の端面４２は、脂質二重層９に送達される膜タンパク質またはその他の分子に対するプローブ４１の材料の親和性を高めるために処理され得る。

一つの選択肢は、端面４２をコーティングすることによる処理である。一つの可能なコーティングは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の吸着層である。例えばこれは、端面４２上にＰＥＩ溶液（例えば濃度５０％ｗ／ｗ）を適用し、続いて綿棒を使用して、余分なＰＥＩを除去することによって達成され得る。ＰＥＩは、αＨＬなどの負に帯電した膜タンパク質に対する親和性を有利に増加させる。その他の高分子電解質およびその他の材料も同様に適している。

別の可能な処理としては、端面４２の化学修飾がある。適切な修飾の例としては、アルキルシラン修飾などのシラン修飾が挙げられる。このようなシラン修飾の例は、以下に開示されている：“Silane-modified surfaces for biomaterial immobilization（生体材料の固定化のためのシランで修飾された表面）”、Shriver-Lake、Lisa C.、Naval Research Laboratory、Center for Bio/Molecular Science and Engineering、米国ワシントンＤＣ、Cass，TonlyおよびLigler，Frances Ｓ．編、Immobilized Biomolecules in Analysis（１９９８）、１−１４．、Oxford University Press。

従って、プローブ４１は、機械システムによって操作されることが可能な巨視的な要素である。特に、プローブ４１は、以下に述べるようにマイクロマニピュレータ５０によって操作される。ロッド４３が、ブロック４５からぶら下げられたカラム４４上に取り付けられ、ブロック４５自体がマイクロマニピュレータ５０のリンクアーム４６に取り付けられる。電気生理学セル１のチャンバ部３内でプローブ４１が見えるように、ブロック４５は透明である。マイクロマニピュレータ５０は、例えば（株）成茂科学器械研究所が供給するもののような、従来型のものである。マイクロマニピュレータ５０は、プローブ４１の三次元的に制御された動きを提供する。

以下、第２装置４０を使用する方法について述べる。

留意すべきは、第２装置４０のプローブ４１のサイズが小さいので、第１装置３０のプローブ１０に必要とされるよりも、プローブ４１の動きに対してより優れた制御が必要とされることである。マイクロマニピュレータ５０は、このような制御を提供する。実際、２つのタイプの制御が必要である。

第１のタイプの制御は、プローブ４１を脂質二重層９に平行に動かすことによって、プローブ４１を脂質二重層９と一列に整列させるものである。この整列は、例えば電気生理学セル１を明るい光で照らしながらステレオ顕微鏡を使用して、プローブ４１が脂質二重層９に向かって動くように見えることで達成することができる。この整列が一度実行された後、この整列を維持するように、マイクロマニピュレータ５０の位置の設定が固定される。

第２のタイプの制御は、プローブ４１が脂質二重層１９へ向かう動きの制御である。小さいサイズのプローブ４１は、脂質二重層９を有意な量だけ引き伸ばすこと、そしておそらくは、破裂を引き起こすことなく脂質二重層９を貫通することさえも可能にする（ただしこれは現時点では不明である）。

端面４２が脂質二重層９に固定された際に、動きを止める必要がある。このプローブ４１の動きの制御は、初期キャリブレーション工程の実施によって行われ、この工程の間、脂質二重層９の電気容量がモニターされる。電気容量をモニターするために、電極８全域に、従って脂質二重層９全域に、一定の規模の勾配を有するがサインが交互になる振動ランプの形状の電圧波形が適用される。次に出力電流がモニターされる。出力電流の大きさは、電圧信号のランプの勾配（一定である）に比例し、脂質二重層９の電気容量にも比例する。電流は、ランプ電圧のサインが変わるにつれて正電流と負電流の間で変化する。結果として、出力電流信号は、脂質二重層９の電気容量に比例する振幅を有する方形波となる。このようにして、脂質二重層９の電気容量をモニターするために、出力電流信号がモニターされる。

キャリブレーション工程の間、プローブ４１は、脂質二重層９に向かってゆっくりした速度で動かされる。プローブ４１が脂質二重層９に固定されるに至ったとき、これにより、モニターされる電気容量が変化する。これが出力電流信号から検出されると、プローブ４１の動きが停止される。この固定の時点において、端面４２の少なくとも一部が脂質二重層９に固定される。端面４２のより広い面積および側面４７の一部までもが脂質二重層９に固定されるように、プローブ４１は脂質二重層９を局所的に変形させてよい。

プローブ４１の位置が留意される。続いて、再び電気容量をモニターする必要なしに、このキャリブレーション工程の間に決定された位置と同じ位置にプローブ４１を戻すために、マイクロマニピュレータ５０が使用され得る。

マイクロマニピュレータ５０は、必要な程度の制御を提供するのに有効ではあるが、このような制御は、その他の方法によって達成してもよい。その他の方法としては、例えば機械的停止装置を使用して、あるいは適切なプログラムを実行するマイクロプロセッサによって制御されたロボットを使用してプローブ４１の動きを駆動することなどがある。

プローブ４１を脂質二重層９と一列に整列させ、キャリブレーション工程を実施した後、プローブ４１は、膜タンパク質（またはその他のタイプの分子）を脂質二重層９に送達するために、以下のように使用される。

はじめに、膜タンパク質がプローブ４１の端面４２上に堆積される。これは、単純にプローブ４１の端面４２を膜タンパク質の溶液の滴に押し付けることによって達成され得る。これによって、膜タンパク質は端面４２上に吸着され、必要なのは少量の溶液のみであるという利点がある。あるいは、例えば第１装置３０に関連して上に述べたように、堆積は、任意のその他の方法によって実施され得る。

膜タンパク質の堆積後、プローブ４１は、第２装置４０内の適切な位置に取り付けられる。次に、上述の従来技術を使用して、脂質二重層９が開口７全体にわたって形成される。

次に、プローブ４２が動かされて脂質二重層９に対してプローブ４１の端面４２を固定する。このとき、正しい整列を得るために、また、キャリブレーション工程で決定された、0あるいはステレオ顕微鏡で見た正しい位置にプローブ４１を移動させるために、マイクロマニピュレータ５０を使用する。

脂質二重層９に対して端面４２を固定させることによって、端面４２上に支持された膜タンパク質の脂質二重層９内への挿入が引き起こされる。一般的に、このような挿入は数秒で起こり、第１装置３０に関連して上に述べたようにモニターされる。

脂質二重層９内に膜タンパク質が挿入された後、プローブ４１は、適正な位置に維持されても、第１装置３０に関連して上に述べたように脂質二重層９から離脱させてもよい。続いて、問題の膜タンパク質にとって適切な実験工程が、従来の方法で実施されてよい。

例として、脂質二重層９内に多数の異なる膜タンパク質を挿入するために、上述の方法が実施されている。以下、図７〜１０を参照しつつ、これらの実験の結果を述べる。図７〜１０は、それぞれが脂質二重層９内に挿入された異なる膜タンパク質についての電流信号出力のグラフである。

以下の方法を、図１の第１装置３０を使用して実施した。

溶液からプローブ１０上に堆積されたＷＴ（野生型）αＨＬタンパク質ポアを挿入するために、前記方法を実施した。検出された電流信号が図７に示されている。マイナス５０ｍＶの電流が適用されている。このとき、チャンバ部３において使用された緩衝液は、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳでｐＨは７．００であった。検出された電流信号の形状および信号に係る電流と電圧との関係は、単純に溶液内にタンパク質ポアを配置して挿入を待つという従来技術によって挿入されたものと同じタンパク質ポアを使用して得られたものと区別ができなかった。このタイプのタンパク質ポアは、γ−シクロデキストリンを結合する。結合キネティクスおよびγ−シクロデキストリンの結合における電流の減衰（１５μＭ）については、本方法を使用して挿入されたタンパク質ポアについてものと、従来の方法で挿入されたポアについてのものが同じであった。これらの結果に基づくと、プローブ１０の使用により、脂質二重層９または膜タンパク質自体の特性を変えることなしに、膜タンパク質の適切な挿入が達成されることがわかる。

また、本方法を野生型αＨＬタンパク質ポアを挿入するために実施し、野生型αＨＬタンパク質ポアは、第１にｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＤＮＡ、緩衝液、アミノ酸、リボソームおよび脂質を含有するインビトロ転写／翻訳の混合物内から得られた野生型αＨＬタンパク質ポアからであり、第２にプローブ１０を細菌コロニーにこすりつけることによってプローブ１０上に堆積される。後者の場合、界面活性剤および細胞膜を壊すためのその他の成分を含む０．５μＬの溶解緩衝液を適用することによって、寒天プレート上に大腸菌の細菌コロニーを溶解させた。どちらの場合においても、図７に示されるものと同様の結果が得られ、それによって、インビトロ転写／翻訳の混合物や細菌コロニーにおけるその他の成分やよりも、野生型αＨＬタンパク質ポアが挿入されたことの方がより明らかに実証される。

また、本方法を野生型ＫｃｓＡチャネル（ストレプトミセス リビダンス由来のＫ⁺チャネル）を挿入するために実施した。このとき、チャンバ部３内の溶液は、１００ｍＭのフタル酸カリウムで緩衝化された１５０ｍＭ ＫＣｌで、ｐＨは４．０であった。図８は、マイナス１５０ｍＶの電位の適用下でのチャネルゲーティングについての、検出された電流信号を示す。これらチャネルのオープニングのイベントはめったにないので、脂質二重層９内に挿入されるチャネルの数が最大になるように、電気的記録を行う間ずっとプローブ１０をそのままにして、ゲル１４の突出面１５を脂質二重層９に固定させておいた。図８を見ればわかるように、検出された電流信号は、チャネルのオープニングの特性である事象を示す。

続いて、プローブ１０を移動させて、ゲル１４の突出面１５を脂質二重層９から離脱させた。このとき、検出された電流信号において、同じ事象が観察された。このことに基づくと、ゲル１４の突出面１５を脂質二重層９に固定させても、実験工程を妨げなかったことがわかる。

また、本方法を、ｐＨが７．００の緩衝液１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳを使用してロイコシジンのポアを挿入するために実施した。プローブ１０を離脱させた後に検出された電流信号が図９に示されている。適用された電位はマイナス４０ｍＶであった。検出された電流信号のレベルは、ポアが開いていることを示している。

以下の方法は、図４の第２装置４０を使用して実施され、ハイスループットなスクリーニングに適用された際の前記方法の有効性を実証する。

前記方法を、寒天プレート上に堆積されたαＨＬを発現する細菌コロニー由来のαＨＬタンパク質ポアを挿入するために実施した。毎回、プレートには１００個のコロニーを配置し、そのうちの約９５〜９９個のコロニーが野生型αＨＬを発現し、残りのものがαＨＬの変異体、Ｍ１１３Ｆ／Ｋ １４７Ｎを発現した。異なるタイプのコロニーの数および位置は、プレートスクリーナーでは明らかにされなかった。前記方法は、各コロニーについて実施した。αＨＬタンパク質ポアを、プローブをコロニーにこすりつけることによってプローブ上に堆積した。

タンパク質は細菌の細胞質内で発現されたが、コロニーを溶解または化学的に処理する必要はなかった。自然に溶解したコロニー内の細菌の画分によって、十分なタンパク質が供給されたようであった。プローブの先端は、コロニーをスクリーニングした後で、新しい寒天内を引っ張って通過させることによりクリーニングすることが可能であった。また、クリーニングされた先端は、ポアを産生しなかった。

タンパク質ポアを脂質二重層９内に挿入し、検出された電流信号をモニターした。ポアからの記録後、次の試料に移る前にセル１をクリーニングする必要はなかった。その代わりに、脂質二重層９を壊して再形成することによってシステムをリセットした。これらの操作は、スクリーニングのスピードを改善した。

プローブ４１は、マイクロマニピュレータ５０に固定し、セル１のシス（ｃｉｓ）側チャンバ部３内に沈め、脂質二重層９に固定した。プローブ４１は、記録する間、脂質二重層９に固定させることが可能であった。単一のポア、または複数のポアを挿入するために必要な時間は変化した。異なるコロニーからのタンパク質の入手可能度は一貫していなかった。概して、αＨＬコロニー（野生型または変異体）は強力であった。つまり、プローブ４１の脂質二重層９への固定がたとえ短い時間であっても（〜０．５秒）、複数のポアの挿入が引き起こされた。これらのコロニー由来の単一のポアを記録するために、脂質二重層９を電気パルスで壊し、再形成し、プローブ４１を再度固定した。プローブ４１上のポア形成タンパク質の量が、単一のポアの挿入が可能になるのに十分な程度減少するまで、この工程を繰り返した。プローブ４１の固定／離脱および脂質二重層９の再形成は、１分当たり少なくとも５回繰り返すことができた。しかし、一般的に、単一の機能的なポアを得るために必要な繰り返し回数は、２〜４回のみである。

検出された電流信号によって、２つのタイプのαＨＬタンパク質ポアの区別が可能となった。両方のタイプのαＨＬが、類似のイオン伝導度を有するポアを形成する。しかし、変異体αＨＬのみが、シス（ｃｉｓ）側由来の分子アダプターβＣＤを結合する。プレートはプローブ法によってスクリーニングされた。シス（ｃｉｓ）側およびトランス（ｔｒａｎｓ）側のチャンバ部３の両方が、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１Ｍ ＫＣｌを含有し、ｐＨは７．０であった。脂質二重層９は−５０ｍＶで保持された。記録は、シス（ｃｉｓ）側のチャンバ部３内において、９０μＭのβＣＤで行われた。βＣＤは変異体のポアに結合したが、野生型のポアには結合しなかった。

野生型のαＨＬは、二重層内に挿入された各ポアについて、電流の段階的な増加を示した。４つのポアの場合の例が図１０Ａに示される。しかし、Ｍ１１３Ｆ／Ｋ１４７Ｎ変異体がβＣＤを結合し、電流の特性の減衰を与えている。２つのポアの場合の例が図１０Ｂに示される。１００個のコロニー全てをスクリーニングした後、プレートの作製者がその後明らかにした位置に厳密に対応する位置において、変異体を発現するコロニーが発見された。

この実験は、野生型ポアのバックグラウンドにおける新しい機能のまれな場合の迅速なスクリーニングを実証している。

次に、活性なタンパク質ポア、特に、２つの異なるモノマーから構成され、４つのＬｕｋ Ｆサブユニットおよび４つのＬｕｋ Ｓサブユニットが中心軸の周囲に交互に配置されて八量体のポアを与えるロイコシジンを産生するために組み合わされる２つのタンパク質のサブユニットを堆積するために、前記方法を実施した。

野生型Ｌｕｋ Ｆおよび野生型Ｌｕｋ Ｓを発現する別々の大腸菌コロニーを寒天プレートからこすり取り、新鮮な寒天の表面上に共に配置し、外科用メスの刀で完全に混合したが、溶解はしなかった。注目すべきことに、プローブ４１を細菌の混合物の中に浸して脂質二重層９に固定し、野生型ロイコシジンのポアを産生することが可能であることが発見された。このように、精製することなく、別々の成分由来の完全に機能的な２成分の膜のポアを組み立てることが可能であった。単一のロイコシジンのポアの挿入には、通常、αＨＬコロニーの場合よりもより長い時間のプローブの固定を必要とした。ロイコシジンは、溶血アッセイにおいてαＨＬよりも活性がはるかに低いので、このことは予期されるであろう。一般的に、新たに混合されたコロニーを使用すると、プローブ４１は、単一のポアが挿入される前に数秒間、脂質二重層９に固定しておいた。しかし、混合されたコロニーは、時間の経過によりしばしばより強力になり、１秒当たりにαＨＬコロニーと同等の量のポアを産生するものもあった。ロイコシジンのコロニーの混合物は、寒天プレート上で少なくとも１ヶ月間、４℃で保存でき、依然としてプローブ法によってタンパク質ポアを生産することができた。

これまでに、αＨＬのβ−バレル型におけるあるアミノ酸が、βＣＤの結合を強化するために変異可能なことが示されている（αＨＬとβＣＤの両方が７回折り畳み軸対称を有する）。

例えば、αＨＬのＭ１１３残基がフェニルアラニンに変異された場合、βＣＤの結合の持続時間は、野生型のαＨＬと比較すると最大で３×１０⁴倍長い。βＣＤの過メチル化形態であるＴＲＩＭＥＢは、βＣＤよりも最大で４倍長い時間、Ｍ１１３Ｆ αＨＬに結合する。これらの知見に基づくと、変異タンパク質が過メチル化されたγＣＤであるＴＲＩＭＥＧと結合するように（ロイコシジンとＴＲＩＭＥＧの両方が８倍の軸対称を有する）、ロイコシジンのβ−バレル型において同様の変異を行い得ると仮定した。

配列相同性、αＨＬ７量体の結晶構造、そしてＬｕｋ Ｆ（ＨｌｇＢ）、Ｌｕｋ Ｆ（ＰＶ）およびＬｕｋ Ｓ（ＰＶ）モノマーそれぞれの結晶構造に基づいて、バレルのβ鎖内のアミノ酸の配列を、３つのモノマーすべてについてモデル化した。変異を行い、Ｌｕｋ ＦおよびＬｕｋ Ｓのβ鎖に沿った多様な位置における天然のアミノ酸を、フェニルアラニンで置換した。β−バレル型の内部では、変異された残基が整列して、８個のフェニルアラニンの環が１つ、または４個のフェニルアラニンの環が別々に２つ、形成することができた。αＨＬ Ｍ１１３Ｆから類推して、整列したフェニルアラニン残基が、ＴＲＩＭＥＧを結合するロイコシジンの形態を作り出すと仮定された。

以前は、ＩＶＴＴによって、Ｌｕｋ ＦおよびＬｕｋ Ｓの個々のモノマーを発現させることにより、変異ロイコシジンを作製した。モノマーがウサギの赤血球膜上で組み立てて８量体を得た。続いて８量体をゲル精製にかけた。

一方、本発明の方法においては、変異サブユニットから機能的なロイコシジンのポアを得るために、はるかに迅速なプローブの手順を使用した。２つのサブユニットの３５通りの新しい組合せそれぞれについて、３つの個々のポアが試験され、動的データが平均化された。Ｌｕｋ Ｆ Ｑ１１２Ｆ／Ｌｕｋ Ｓ Ｓ１０８ Ｆの組合せが、他の組合せよりも少なくとも２桁分長い時間、ＴＲＩＭＥＧと結合した一方で、野生型のロイコシジンがＴＲＩＭＥＧと結合した時間は最も短かった。これらのデータは、Ｍ１１３、Ｑ１１２およびＳ１０８におけるアミノ酸が、αＨＬ、Ｌｕｋ ＦおよびＬｕｋ Ｓ内それぞれにおいて、同じ位置および配向を共有することを示唆する。

この実験は、コロニー由来のβＰＦＴが単量体であるという考えを支持する。この場合、水溶性モノマーは、混合後に組み立てなければならない。これらの実験において使用される細菌株は、内因性膜のチャネルおよびポアを有していなければならない。しかし、これらによる妨げは、電気的記録においては観察されなかった。過剰発現したタンパク質の細菌コロニーから平面二十層への移送は非効率的であり、当然、内因性タンパク質の挿入が起きる頻度が低いであろうと予測される。非効率的な移送は、バルクアッセイにおいては望ましくないであろうが、その一方で、単一のチャネルの記録によるスクリーニングには理想的に適合する。

大量のデータ収集は、別のアプローチでは多くの時間と労力を要したであろうが、複数のＬｕｋコロニーを混合してガラス製プローブに適用したことにより、効率的なスクリーニングが可能となった。このことは、本発明の有効性がハイスループットなスクリーニングを可能にすることをはっきりと実証している。

上述の報告された実験結果は、膜タンパク質の主要な２つのクラスの例に関する挿入を実証する。すなわちβ−バレル型（例えばαＨＬのポアおよびロイコシジンのポア）およびα−ヘリックス型（例えばＫ⁺チャネル）は、本発明の方法を使用して挿入することができる。このことに基づいて、任意の膜タンパク質が、平面脂質二重層９内に同様に挿入できることがわかる。前記方法により、不溶性の膜タンパク質を含有する、細胞溶解物または画分を含む任意の材料を、天然環境から脂質二重層９へと直接送達することができると予想される。

確率的センシングを実施するための第１装置の分解立体図である。 図１の第１装置の電気回路の構成図である。 図１の第１装置のプローブのキャリア部の断面図である。 確率的センシングを実施するための第２装置の斜視図である。 図４の第２装置のプローブの拡大図である。 脂質二重層内にタンパク質ポアを挿入する間における、典型的な電流信号出力のグラフである。 脂質二重層内にタンパク質ポアを挿入する間における、典型的な電流信号出力のグラフである。 脂質二重層内にタンパク質ポアを挿入する間における、典型的な電流信号出力のグラフである。 脂質二重層内にタンパク質ポアを挿入する間における、典型的な電流信号出力のグラフである。 脂質二重層内に挿入された野生型αＨＬタンパク質ポアについての電流信号出力のグラフである。 脂質二重層内に挿入された野生型ＫｃｓＡタンパク質チャネルについての電流信号出力のグラフである。 脂質二重層内に挿入された野生型ロイコシジンのポアについての電流信号出力のグラフである。 脂質二重層内に挿入された、野生型αＨＬタンパク質ポア、およびαＨＬ変異体 Ｍ１１３Ｆ／Ｋ１４７Ｎタンパク質ポア、それぞれについての電流信号出力のグラフである。 脂質二重層内に挿入された、野生型αＨＬタンパク質ポア、およびαＨＬ変異体 Ｍ１１３Ｆ／Ｋ１４７Ｎタンパク質ポア、それぞれについての電流信号出力のグラフである。

Claims (29)

1. 平面脂質二重層における電気信号の測定が可能な電気回路を有する装置を用い、平面脂質二重層に膜タンパク質を挿入する方法であって、
   手動または機械システムによって移動可能に配置された巨視的な要素であり、かつ前記膜タンパク質の保持が可能なキャリア表面を有する、プローブを提供する工程と、
   膜タンパク質がキャリア表面上に保持されるように前記プローブのキャリア表面上に前記膜タンパク質を堆積させる工程と、
   手動または機械システムによって前記プローブを移動させ前記平面脂質二重層に対して前記キャリア表面を固定し、前記膜タンパク質を前記脂質二重層へ挿入させ前記電気回路によって測定される電気信号に基づき前記挿入が検出される工程と、
   を含む方法。
2. 前記キャリア表面は、前記平面脂質二重層が前記膜タンパク質を保持する力よりも強くない力で前記膜タンパク質を保持することができ、
   前記方法は更に、前記プローブを移動させ、平面脂質二重層に対してプローブのキャリア表面を固定する工程の後に、前記プローブを移動させて、平面脂質二重層からプローブのキャリア表面を離脱させ、それによって、挿入された膜タンパク質を平面脂質二重層内に残す工程を含む請求項１記載の方法。
3. 前記プローブは、キャリア表面上に前記膜タンパク質を吸着することによってこの膜タンパク質を保持することが可能である請求項１または２に記載の方法。
4. 前記プローブは、ゲルの滴を有する本体を含み、前記ゲルは前記本体から突き出ており、ゲルは、その突出した表面上に膜タンパク質を保持することが可能であり、突出した表面が前記キャリア表面を構成する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記ゲルがヒドロゲルである請求項４に記載の方法。
6. 前記ゲルがアガロースゲルまたは合成ゲルである請求項５に記載の方法。
7. 前記ゲルがポリアクリルアミドである請求項６に記載の方法。
8. 前記本体が凹部を有し、前記ゲルの滴が前記凹部内にある請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記キャリア表面が、水溶液が通過して拡散できる材料の表面である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記キャリア表面が固体の表面である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
11. 前記キャリア表面が、膜タンパク質に対する親和性が増加するように処理される請求項１０に記載の方法。
12. 前記キャリア表面が、シラン修飾によって処理される請求項１１に記載の方法。
13. 前記固体がガラスである請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記キャリア表面が、前記平面脂質二重層の面積よりも大きな面積を有する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
15. 前記キャリア表面が、少なくとも１桁、平面脂質二重層の面積よりも大きな面積を有する請求項１４に記載の方法。
16. 前記キャリア表面が、少なくとも１ｍｍ^２の面積を有する請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記キャリア表面が前記平面脂質二重層よりも小さい請求項１〜３または９〜１２のいずれかに記載の方法。
18. 前記キャリア表面が、前記平面脂質二重層の面積の最大で７０％の面積を有する請求項１７に記載の方法。
19. 前記プローブの前記キャリア表面上に前記膜タンパク質を堆積させる前記工程が前記プローブの前記キャリア表面上に前記膜タンパク質を含有する溶液を堆積させる工程を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記プローブの前記キャリア表面上に前記膜タンパク質を堆積させる前記工程が、前記膜タンパク質を含有する試料に前記プローブの前記キャリア表面をこすりつける工程を含む請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
21. 前記膜タンパク質が、ポアまたはチャネルである請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
22. 前記膜タンパク質がβ−バレル型またはα−ヘリックス型である請求項２１に記載の方法。
23. 平面脂質二重層への膜タンパク質の挿入が、平面脂質二重層を流れる電流の特徴的な増加に基づき前記電気回路で検出される請求項２１または２２に記載の方法。
24. 前記平面脂質二重層が、チャンバを定義するチャンバ本体と、中に前記平面脂質二重層が形成される開口を有する前記チャンバの壁と、を含む装置内に形成され、前記チャンバが水溶液を含有する請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
25. 分子が、ポアまたはチャネルである膜タンパク質である請求項２４に記載の方法。
26. 前記プローブが、前記平面脂質二重層に対して前記キャリア表面を固定するために前記プローブを動かすことができるように前記チャンバ本体上に取り付けられる請求項２４または２５に記載の方法。
27. 前記チャンバが、前記チャンバの上面に開口部を有し、前記壁は前記チャンバの側面に形成される開口を有し、
    前記プローブが、
    前記キャリア表面を有する本体と、
    前記チャンバ内の本体を支持し、前記開口部を通して前記チャンバの外に伸張し前記プローブの操作を可能にするアームとを含む請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
28. 前記プローブが更に、前記チャンバ本体上に取り付けられて前記アームを支持するブームを含む請求項２７に記載の方法。
29. 前記プローブが、前記チャンバ本体上に枢動可能に取り付けられる請求項２６または２７に記載の方法。

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