DE69924975T2

DE69924975T2 - Verfahren und kit, um biologische substanzen in plasmamembran und/oder zytosol einzuführen

Info

Publication number: DE69924975T2
Application number: DE69924975T
Authority: DE
Inventors: Iraj Laffafian; Maurice Bartlett Hallett
Original assignee: University College Cardiff Consultants Ltd; Cardiff University
Current assignee: University College Cardiff Consultants Ltd; Cardiff University
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2019-02-17
Also published as: WO1999041401A1; AU2536299A; EP1054992B1; EP1054992A1; DE69924975D1; US6479288B1; ATE294240T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Einführen eines Mittels in das Zytosol oder die Plasmamembran einer Zelle unter Einsatz einer lipidüberzogenen Spitze einer Pipette oder eines Stabes oder ähnlichem, um die Zelle zu kontaktieren, jedoch nicht zu durchdringen. Zusätzlich bezieht sich die Erfindung auf eine Pipette oder einen Stab mit einer lipidüberzogenen Spitze zum Einführen von Mitteln in das Zytosol oder die Plasmamebran einer Zelle und auch auf ein Verfahren zum Überziehen einer Spitze einer Pipette oder eines Stabes mit dem Lipid.
Die Mikroinjektion von Mitteln, wie etwa Proteinen und Nukleinsäure (mRNA und DNA), in das Zytosol von lebenden Zellen ist eine kraftvolle Technik, die zu vielen neuen Entdeckungen geführt hat. Darüber hinaus unterliegt sie einigen neuen Näherungen im Hinblick auf molekulare und genetische Technik und wird geeignet für die in-vitro-Befruchtung. Die Mikroinjektion durch Einführung einer Glasmikropipette in die Zelle ist jedoch möglicherweise ein schädliches Ereignis und gegenwärtig begrenzt auf Zellen, die sowohl groß als auch robust sind. Die Mikroinjektion von kleinen Säugetierzellen (sphärischer Durchmesser 2–15 μm) oder sehr flacher Zellen (1 bis 2 μm Dicke) war stets schwierig zu erzielen ohne Beschädigung der Zelle und führte zu schlechten Zeltüberlebenschancen. Die Penetration kleiner Zellen, insbesondere sphärischer Zellen, erfordert einen raschen Eintritts- und Austritts-"Stoß", da ein langsames Herausziehen der Mikropipette oft zu einem Bruch der Zelle führt. Dementsprechend lag die "Stoß"-Injektion, bei welcher sich der Mikroinjektor innerhalb der Zelle befindet, bei etwa 100 ms, wobei ein Hochdruck (100–200 mbar) eingesetzt werden muss, um ausreichend Material während dieser Zeit in die Zelle einzuführen. Dies muss sorgfältig gesteuert werden, da ein unzureichender Druck dazu führt, dass zuwenig Material injiziert wird, und ein exzessiver Druck zu einer Zellbeschädigung oder einem Reißen führt. Die Zelle muss auch fest an einem Substrat für den "Stoß" angebracht werden, um wirkungsvoll die Zellmembran zu durchdringen. Abgesehen von diesen Problemen ist das Verfahren im wesentlichen blind und infolge der geringen Größe der Zelle und des großen Volumens des Zellzytoplasmas, welches bei Organellen anzutreffen ist, wie etwa dem Kern, Lysosomen und ER, verursacht das Eindringen des Mikroinjektors bei hohen Geschwindigkeiten leicht zu intrazellularer Schädigung. Beispielsweise ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass die Mikropipette, die in die Zelle eindringt mit einer Geschwindigkeit von etwa 700 μm/s, den Kern verschiebt, schädigt oder in diesen eindringt (wobei bei kleinen Zellen, wie etwa Neutrofilen und Basofilen bis zu 50 % des Zellvolumens ausmachen) anstatt direkt in das Zytosol einzudringen, auch wenn die Plasmamembran überlebt.
Traditionelle Injektion wurde erfolgreich bei einer Anzahl von Zelltypen eingesetzt einschließlich Hepatocyten (Cobbold) und Jurkat-Zellen. Die Erfolgsrate ist jedoch begrenzt, wobei viele Zellen die Stoßinjektion nicht überleben. Es gab verschiedene Versuche, die Probleme der Zellschädigung zu minimieren einschließlich des Einsatzes von pharmakologischen Ca²⁺-Kanalblockern. Auch andere Techniken sind zum Einsatz gekommen zur Einführung von Mitteln, wie etwa Peptidinhibitoren, Antikörper usw. in Zellen durch Membranpermeabilisation unter Verwendung von chemischen oder biologischen Molekülen oder Techniken, wie etwa durch Elektroporation. Obwohl diese Näherung nützlich sein kann, ist die Zellschädigung groß und Mechanismen, mit welchen die Zelle die Schädigung repariert, sind schwer verständlich, aber sie können Ca²⁺ und aktives Signalisieren durch die Zelle involvieren. Somit können möglicherweise erholte Zellen diese nicht in dem Status repräsentieren, der ursprünglich für das Studium beabsichtigt war. Ein weiteres Verfahren, welches eingesetzt wurde, ist interne Perfusion. Bei dieser Technik tritt die Mikropipette nicht in die Zelle ein, aber die Membran wird in die Mundöffnung der Mikropipette gesaugt und verursacht einen lokalen Riss der Zellmembran an diesem Punkt. Dies minimiert die Schädigung der intrazellularen Strukturen, aber der Vorgang des "Brechens in" die Zelle führt zu einer nicht umkehrbaren Abdichtung und die Zelle muss an der Pipette für ihr Überleben angeheftet bleiben. Dies schließt Studien der Zellformänderung usw., aus und der negative Druck, der erforderlich ist, um einen Bruch auszuführen, zieht auch Zytosol ab, wenn dies nicht sorgfältig gesteuert wird. In jedem Fall tritt während der Zeitdauer, in welcher die Mikropipette angeheftet ist, die Fusion von Material sowohl von der Mikropipette in die Zelle als auch von dem Zytosol in die Mikropipette ein. Die Fusion aus der Zelle von wichtigen kleinen Molekülen, wie etwa GTP, ATP usw. beschränkt wirkungsvoll die Eignung dieser Technik für die Verfahren, bei welchen sie nicht in volviert sind oder reguliert werden durch die Inhalte der Mikropipette. All diese Verfahren unterliegen, obwohl sie geeignet sind, somit Einschränkungen.
Andere Näherungen, die keine Glasmikroinjektion involvieren, sind ebenfalls eingesetzt worden. Eine frühe Näherung war der Einsatz von Lipidfusion entweder durch den Einsatz von Liposomen oder einer Erythrocyt-Geistfunktion. Während die Lipidfusion erfolgreich sein kann bei der Einführung von cDNA usw. in Zellen, wie bei der Lipofektion, ist die Menge an injiziertem Material sehr gering und wahrscheinlich reicht nur eine Kopie der cDNA aus für das Experiment. Um beispielsweise eine kleine Zelle (d = 10 μm) mit 1 % ihres Volumens durch Fusion von Liposomen (d = 50 nm) zu injizieren, erfordert dies tausende von Fusionseventen. Diese Anzahl von Fusionseventen ist unwahrscheinlich und der Einsatz von Liposomen für die Zellphysiologie war nicht in großem Umfang erfolgreich. Die Fusion von größeren Bläschen, wie etwa Rotzellengeistern, wurde ebenfalls eingesetzt, wobei ein Fusionsevent große Mengen von Material einführen kann. Die große Menge einer Fremdmembran wird jedoch ebenfalls eingeführt und die Zellen sind im wesentlichen Hybride anstatt ursprüngliche Zellen.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Einführen eines Mittels in das Zytosol und/oder die Plasmamembran der Zelle bereitgestellt, folgende Schritte umfassend:

(a) Überziehen mindestens eines Teils einer Spitze einer Übertragungsvorrichtung mit einem Lipid;
(b) Inkontaktbringen der lipidüberzogenen Spitze der Übertragunseinrichtung mit der Zelle und
(c) Übertragen mindestens eines Teils des Inhaltes der Übertragungseinrichtung in das Zytosol und/oder die Plasmamembran der Zelle, ohne in das Zytoplasma einzudringen.

Die Übertragungsvorrichtung ist vorzugsweise eine Pipette oder ein Stab. Die Pipette ist normalerweise eine Mikropipette (normalerweise aus Glas hergestellt) und der Stab ist normalerweise ein Mikrostab. Der Mikrostab ist eine Einrichtung (normalerweise aus Glas hergestellt), die fest ist und keine innere Bohrung aufweist. Eine Mikropipette kann zum Einsatz gebracht werden für Lipid-assistierte Mikroinjektion von Substanzen in das Zytosol oder in die Plasmamembran, während ein Mikrostab eingesetzt werden kann zum Einführen von Substanzen exklusiv in die Plasmamembran. Der Mikrostab besitzt den Vorteil, dass Lipide und die Lipid-löslichen Moleküle, wie etwa Proteine, von dem Mikrostab in die Zelle übertragen werden können und umgekehrt, ohne wässrigen Übergang in das Zytosol. Im Fall eines Stabes kann der "Inhalt" der Übertragungsvorrichtung in dem Lipid an der Spitze vorhanden sein.
Es hat sich gezeigt, dass die Technik eine Fusion bereitstellt zwischen dem Lipid an der Spitze und der Zellmembran, was zu einem Kanal in das Zellzytosol führt ohne die Möglichkeit einer intrazellularen Organellschädigung und der niedrige Druck der Übertragungsvorrichtung stellt sicher, dass die Menge an injiziertem Material gesteuert wird und die Zelle nicht zu stark schädigt. Darüber hinaus muss, da nur ein Kontakt statt einer Penetration für die Mitteleinführung dieser Nährung erforderlich ist, die Zelle nicht festgehalten werden. Die Anmelder haben den Einsatz einer einfachen Lipid-assistierten Mikroinjektion ("SLAM") an menschlichen Neutrofilen ausgeführt, lose anhaftend als sphärische individuelle Zellen oder verteilt auf Deckgläsern mit einer Zellstärke von lediglich 1 – 3 μm. Bei diesen Zellen war es sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, eine erfolgreiche Mikroinjektion durch herkömmliche Maßnahmen auszuführen.
Vorzugsweise wird mindestens ein Teil der Inhalte der Übertragungsvorrichtung unter Druck übertragen, wobei der Druck klein genug ist, um eine Schädigung der Zellinhalte zu verhindern. Dieser Druck kann typischerweise im Bereich zwischen 5 und 40 mbar liegen.
Das Verfahren ist besonders geeignet, wenn die Zelle eine lebende Zelle ist, die leben bleibt nach der Übertragung der Inhalte von der Übertragungsvorrichtung in das Zytosol und/oder die Plasmamembran der Zelle. Beispielsweise kann es sich bei der Zelle um eine kleine Säugetierzelle handeln. Somit ist das Verfahren gemäß der Erfindung besonders geeignet, beim Einführen von Mitteln in eine Zelle mit einem sphärischen Durchmesser zwischen 2 und 15 μm oder einer Zelle mit einer im wesentlichen flachen Form mit einer Dicke von nur 1 bis 3 μm. Somit kann es sich bei der Zelle typischerweise um eine menschliche Neutrofil-Zelle handeln mit einer Dicke von 1 bis 3 μm.
Typischerweise findet der Transfer des Lipids und der Lipid-löslichen Moleküle zwischen der Übertragungsvorrichtung und dem Zytosol und/oder der Plasmamembran der Zelle statt, wenn die Inhalte der Übertragungsvorrichtung auf die Zelle übertragen werden. Die Inhalte der Übertragungsvorrichtung liegen vorzugsweise in der Form einer wässrigen Lösung vor, die eine Farbe einschließen kann, wie z.B. Luzifergelb, und die helfen kann bei der Überprüfung des Übergangs der wässrigen Inhalte in die Zelle.
Das Verfahren kann darüber hinaus den Schritt umfassen, das Lipid aufzuquellen zur Bildung eines Lipidüberzuges oder einer bimolekularen Schicht (Bischicht) vor dem Inkontaktbringen der Spitze mit der Zelle.
Im gegenwärtigen Kontext ist ein Lipid jegliche Substanz einer fettartigen Natur. Somit schließt der Ausdruck Fettsäuren oder Derivate ein, die löslich in organischen Lösungsmitteln sind und unlöslich in Wasser, wie z.B. die einfachen Fette und Wachse und die Phospholipide und Cerebroside. Der Ausdruck schließt auch Verbindungen ein, wie Sterole und Squalen. Als Beispiele können gemäß der vorliegenden Erfindung sowohl natürliche als auch synthetische Lipide und Phospholipide zum Einsatz kommen. Das Lipid umfasst vorzugsweise Phosphatidylcholinoleyl-plamitoyl (PCOP). Das PCOP kann in irgendeinem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst werden, z.B. Chloroform, vor dem Aufbringen des Lipids auf die Übertragungsvorrichtung vor dem Trocknen des Lipids.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Übertragungsvorrichtung bereitgestellt zum Einführen eines Mittels in das Cytosol und/oder die Plasmamembran einer Zelle umfassend eine lipidüberzogene Spitze, die in der Lage ist, zumindest ein Teil der Inhalte der Übertragungsvorrichtung auf die Zelle zu übertragen, ohne in das Cytoplasma einzudringen.
Wie oben diskutiert wurde, kann die Übertragungsvorrichtung eine Pipette oder ein Stab sein.
Bei der Spitze kann es sich um einen Wegwerfgegenstand handeln. Somit kann eine lipidüberzogene Spitze für den Einsatz in der Übertragungsvorrichtung vorgesehen sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kitt zur Verfügung gestellt zum Einführen eines Mittels in eine Zelle, wobei das Kitt ein Mittel und eine Übertragungsvorrichtung umfasst zum Einführen des Mittels in das Zytosol und/oder die Plasmamembran der Zelle, wobei die Vorrichtung eine lipidüberzogene Spitze umfasst, die in der Lage ist, zumindest einen Teil der Inhalte der Vorrichtung in das Zytosol und/oder die Plasmamembran der Zelle zu übertragen, ohne in das Zytoplasma einzudringen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Beeinflussung einer Zelle umfassend das Einführen eines Beeinflussungsmittels in die Zelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Überziehen mindestens eines Teils einer Spitze einer Übertragungsvorrichtung mit einem Lipid;
(b) Inkontaktbringen der lipidüberzogenen Spitze der Übertragungsvorrichtung mit der Zelle und
(c) Übertragung mindestens eines Teils der Inhalte der Übertragungsvorrichtung auf die Zelle. Es wird außerdem eine Zelle oder ein Produkt einer Zelle bereitgestellt, die behandelt ist gemäß dem Verfahren der Erfindung.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Überziehen einer Spitze einer Übertragungsvorrichtung mit einem Lipid umfassend das Aufbringen einer Lipidlösung auf die Spitze der Übertragungsvorrichtung und Verdampfen des Lösungsmittels aus der Lipidlösung.
Das Verfahren ist besonders geeignet für die Massenproduktion von lipidüberzogenen Pipetten oder Stäben. Das Lösungsmittel ist vorzugsweise flüchtig. Der Kontakt der Übertragungsvorrichtung mit der Lipidlösung kann erzielt werden auf jede geeignete Weise, wobei Beispiele das Eintauchen in Lösungen des Lipids oder das Durchführen der Übertragungsvorrichtung durch ein Aerosolspray der Lipidlösung sind.
Die Lipidlösung kann gemäß einer Ausführungsform bereitgestellt werden in einem luftdichten und einem lichtdichten Behälter.
Das Verfahren des Überziehens der Spitze kann darüber hinaus den Schritt umfassen der Beladung der Übertragungsvorrichtung mit einer wässrigen Lösung vor dem Aufbringen der Lipidlösung. Das Verfahren kann darüber hinaus den Schritt umfassen, die Übertragungsvorrichtung in eine wässrige Lösung zu platzieren, derart, dass das getrocknete Lipid aufquillt zur Bildung eines Lipidüberzuges oder einer bimolekularen Schicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verpackung für eine Übertragungseinrichtung mit einer lipidüberzogenen Spitze bereitgestellt, wobei die Verpackung ein luftdichtes und lichtdichtes Ummantelungselement umfasst zur Aufnahme der Übertragungsvorrichtung, wobei, wenn die Verpackung zum Einsatz kommt, das Ummantelungselement zumindest die lipidüberzogene Spitze derart umgibt, dass die Bewahrung des Lipids in seiner molekularen Form maximiert wird.
Die Verpackung umfasst darüber hinaus vorzugsweise ein äußeres Verpackungselement. Die Verpackung kann zusätzlich darüber hinaus ein wasserabsorbierendes Mittel innerhalb des äußeren Verpackungselementes umfassen, z.B. Silikagel. Vorzugsweise wird das äußere Verpackungselement mit einem Inertgas gespült, beispielsweise Stickstoff, bevor es abgedichtet wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer lipidüberzogenen Spitze der Übertragungsvorrichtung bereitgestellt, umfassend:

(a) Positionieren einer Spitze einer Übertragungsvorrichtung in eine Ummantelung, die eine Öffnung hierin besitzt;
(b) Eintauchen der Spitze in ein Lipid in einem Lösungsmittel unter Gestattung des Hindurchtretens des Lösungsmittels durch die Öffnung und
(c) Verdampfen des Lösungsmittels.

Die Öffnung kann in einer Basis und einer Seitenwandung der Ummantelung positioniert sein, welche vorzugsweise entfernbar ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung einer Übertragungsvorrichtung mit einer lipidüberzogenen Spitze für den Einsatz der Einführung eines Mittels in das Zytosol und/oder die Plasmamembran einer Zelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst, nämlich:

(a) Platzieren der einzuführenden Substanz in die Übertragungsvorrichtung,
(b) Eintauchen der Spitze der Übertragungsvorrichtung in eine wässrige Flüssigkeit, die die Zelle umgibt, und
(c) Anlegen eines Drucks auf die Inhalte der Übertragungsvorrichtung.

Vorzugsweise wird die einzuführende Substanz von hinten in die Übertragungsvorrichtung platziert (d.h. das nicht-lipidüberzogene Ende). Eine bimolekulare Lipidschicht kann sich auf der Übertragungsvorrichtung ausbilden, während sie in die wässrige Flüssigkeit eingetaucht wird. Beim Schritt c) wird vorzugsweise ein Hochdruck angelegt, der zwischen 1000 und 3000 mbar liegen kann. Der Druck wird vorzugsweise vorübergehend angelegt (d.h. 0,1 bis 2 s). Wenn das Anlegen des Drucks eingehalten wird, bildet sich das Lipid an der Spitze neu und die Über tragungsvorrichtung ist bereit für den Einsatz in Lipid-assistierten Mikroinjektionstechniken, wie beschrieben.
Während die Erfindung oben erläutert wurde, erstreckt sie sich auf jegliche erfinderische Kombination der Merkmale, wie sie zuvor dargelegt sind, oder in der nachfolgenden Beschreibung.
Die Erfindung soll nun beispielhaft erläutert werden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen und das Beispiel, wobei:
1(a)(i) bis (iii) sind Bilder unter Wiedergabe des Lipidübergangs und (b)(i) bis (iii) von einer Mikropipette auf eine Zellmembran;
2(i) bis (v) sind Bilder der wässrigen Inhalte auf das Zytosol zeigend;
3(i) bis (iii) sind Bilder, die die Zellschädigung zeigen in Verbindung mit dem Injektionsdruck;
4 ist eine graphische Darstellung unter Wiedergabe des Zeitverlaufes der Übertragung des Materials auf das Zytosol;
5 zeigt Bilder zur Erläuterung des Eintritts des Materials in das Zytosol durch die Fusion;
6(i) zeigt eine Verpackung für die Vorrichtung gemäß der Erfindung,
6(ii) zeigt eine Draufsicht und eine Seitenansicht einer alternativen Verpackung und
7 zeigt ein Verfahren zum Lipidüberziehen innerhalb einer Schutzummantelung.
BEISPIEL
Materialien
Mikropipetten wurden vorgefertigt und die Mikromanipulation erzielt durch den Einsatz eines Eppendorf-Manipulators (Modell 9525). Phosphatdidylcholin-oleylpalmitoyl, PCOP, (Sigma) wurde in Chloroform (20 mg/ml) gelöst und gelagert unterhalb von 0°C. Aliquote dieser Lösung wurden verdünnt 1/30 mit Chloroform vor dem Einsatz (endliche PCOP-Konzentration in etwa 1 mM). DilC₁₈(3), (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat) wurde erhalten von Molekularproben, Oregon. Luzifergelb CH wurde in Wasser aufgelöst bis auf eine Konzentration von 10–50 mg/ml für den Einsatz.
Neutrofil-Isolation
Neutrofile wurden isoliert von heparinisiertem Blut von gesunden Freiwilligen, wie dies im Stand der Technik bekannt ist. Im Anschluss an eine Dextransedimentation, einem Zentrifugieren durch Ficoll-Paque (Pharmacia) und einer hypotonischen Lyse von roten Zellen wurden Neutrofile gewaschen und resuspendiert in Krebs-Puffer (120 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgSO₄, 1,3 mM CaCl₂, 25 mM HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N-[2-ethansulfonsäure] und 0,1 % Bovinserumalbumin, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,4 mit NaOH).
Lipidüberziehen der Mikropipette
Die Mikropipette wurde beladen mit einem ausreichenden wässrigen Volumen von einer Luzifergelb-Lösung, derart, dass sie einen Druck ausübte, der gerade den Kapillardruck versetzte, wenn die Mikropipette in der Nähe der Zelle platziert war. Die Mikropipette wurde dann an einer Steuerdruckeinrichtung angeschlossen (Ependorf, Mikroinjektor) mit einem auf 0 eingestellten Druck und ein Tropfen (in etwa 10 μl) der Lipidlösung (PCOP gelöst in Chloroform (1 mM)), welche auf Eis gehalten wurde, wurde auf die Spitze der Mikropipette aufgebracht. Ein Verdampfen des Chloroform führte zu einem Überzug von Lipid auf dem Glas. Die Mikropi pette wurde dann in das wässrige Medium mit Aufnahme der Zellen platziert und das getrocknete Lipid an der Spitze der Mikropipette quoll auf zur Bildung einer Doppelschicht. Der Druck in der Mikropipette wurde erhöht auf 10 mbar und das Fehlen von Ejektion oder Diffusion der Farbe von der Mikropipette, beobachtet durch Epi-Fluoreszenz, wurde als Evidenz genommen, dass eine wirksame Lipidabdichtung sich an der Spitze der Mikropipette gebildet hatte.
Das "SLAM"-Verfahren
Neutrofilen gestattete man es zu sedimentieren auf Deckgläsern, die angeordnet waren zur Betrachtung mit einem Öl-Immersionsobjektiv (100X). Die beladene lipidüberzogene Mikropipette wurde in das Gesichtsfeld eingebracht unter Einsatz eines motorisierten Mikroprozessors, gesteuert durch einen Mikromanipulator und in sanften Kontakt gebracht mit der Oberfläche eines Neutrofilen. Dies führte zum Übergang auf die Zelle sowohl des Lipids als auch der wässrigen Inhalte der Mikropipette auf die Zelle. Der Druck innerhalb der Mikropipette wurde geregelt und niedrig gehalten (5–10 mbar), da dies die Zellschädigung reduziert.
Bildsammlung und Analyse
Bilder wurden erhalten unter Einsatz entweder einer gering empfindlichen CCD-Kamera oder für die Fluoreszenzerfassung bei niedrigem Niveau einer intensivierten CCD-Kamera (ISIS, Photonics, UK) angekoppelt an ein invertiertes Zeiss-IM35-Mikroskop. Die Bilder wurden anschließend aufgezeichnet von einem Band unter Einsatz eines Videodruckers (Mitsubishi). Die Intensität der Signale von den individuellen Zellen wurde quantifiziert durch das Einstellen einer Exklusionsmaske über die Zelle von Interesse für die photometrische Aufzeichnung unter Einsatz einer Fotomultiplikatorrohrgruppe, eingestellt auf 100 ms Integrationszeit für die Aufnahme unter Einsatz von Spex DM3000CM-Software.
Die Ergebnisse der Verfahren wurde erhalten wie folgt:
(i) Lipidtransfer
Um das Überziehen der Spitze der Mikropipette mit Lipid zu demonstrieren, wie dies in dem Verfahren beschrieben wurde, kam das Fluorochrom DilC₁₈(3)(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3'.3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat) zum Einsatz. Diese Probe ist schwach fluoreszierend in Wasser, aber fluoresziert stark in Lipiddoppelschichten und wurde dementsprechend verwendet, um den Lipidüberzug an der Mikropipettenspitze zu visualisieren (1). Dies demonstrierte, dass das zuvor beschriebene Verfahren zu einem Lipidüberzug auf der Spitze der Mikropipette führte (1a). Beim Berühren eines lose anhaftenden Neutrofils (Durchmesser = 10 μm) mit der lipidüberzogenen Mikropipette wurde das DilC₁₈(3) auf die Zelle übertragen (1b). Eingangs war die DilC₁₈(3)-Fluoreszenz am Kontaktpunkt am stärksten, während später die Fluoreszenz gleichmäßiger wurde mit einer signifikanten Fluoreszenz an dem entgegengesetzten Pol der Zelle. Dies stimmte überein mit dem Transfer des DilC₁₈(3)-Transfers von der lipidüberzogenen Mikropipette auf die Zellmembran durch direkten Kontakt und das Ergebnis der Bildung einer Lipid-"Brücke" zwischen der Mikropipette und der Plasmamembran der Zelle.
Somit zeigen in 1(a) die Reihen der Bilder (i) die Phasenkontrastansicht eines einzigen Neutrofils mit der lipidüberzogenen Mikropipette vor dem Kontakt, (ii) das Fluoreszenzbild der Dil-Farbmarkierung der Stelle des Lipids an der Mikropipet tenspitze und (iii) die Überlagerung der Fluoreszenz- und Phasenkontrastbilder. In 1(b) zeigen die Reihen der Bilder (i) den Kontakt zwischen der Mikropipette und dem Neutrofil unter Phasenkontrast, (ii) das Fluoreszenzbild des Dil-Transfers auf die Neutrofilmembran unmittelbar nach dem Kontakt, bei welchem die Fluoreszenz am hellsten an dem Mikropipettenkontaktpunkt ist und (iii) 2 min später, wenn die Fluoreszenz gleichförmiger verteilt ist, um die Zellmembran.
(ii) Wässriger Transfer
Um zu bestimmen, ob sich eine wassergefüllte Lipidbrücke an dem Kontakt gebil det hat zwischen der lipidüberzogenen Pipette und der Zelle, wurde die Mikropipette mit Luzifergelb beladen und als Markierung eingesetzt für den wässrigen Phasentransfer zwischen den Inhalten der Mikropipette und dem Zellzytosol. Obwohl eine "Stich"-Injektion mit einer unbehandelten Pipette das Luzifergelb auf die Zelle übertragen könnte, versagte lediglich ein Berühren der Zelle mit der Mikropi pette dabei, ein erfassbares Luzifergelb auf das Zellzytosol zu übertragen (2). Der Überzug der Mikropipettenspitze mit Lipid erzeugte jedoch einen signifikanten Transfer von Luzifergelb auf die Zelle (2). Dies war dementsprechend konsistent mit der Bildung einer wassergefüllten Lipidbrücke von der Mikropipettenspitze auf das Zellzytosol. Dies bildete die Basis für die Einführung von Material in das Neutrofilzytosol ohne die Durchdringung der Zelle und diese Technik war dementsprechend charakterisiert für die Bestimmung, ob dieses eintraf ohne eine exzessive Zellbeschädigung.
Somit zeigt in 2 die Reihe der Bilder (i) die nichtüberzogene Mikropipette, die ein Neutrofil berührt, und die konsequente Abwesenheit des Transfers von fluoreszierendem Luzifergelb, zu sehen in (ii) dem Fluoreszenzbild. Im Bild (iii) wurde der Vorgang wiederholt nach dem Überziehen der Mikropipettenspitze mit Lipid unter Wiedergabe (iv) des Transfers der Farbe auf das Neutrofil und (v) unter dem Fluoreszenzmikroskop zum Vergleich mit dem Bild (ii).
(iii) Zell-"Schädigung"
Es war wichtig zu bestimmen, ob der "SLAM"-Vorgang signifikant weniger schädlich für die Zellen war als die Stichinjektion. Dies konnte verifiziert werden durch den Einsatz von Trypanblau. Durch die Beigabe von Trypanblau zum Inkubationsmedium war die Gesamtschädigung der Zelle erfassbar als Farbakkumulation innerhalb der Zelle. Mit der "Stichinjektion" überleben wenige (weniger als 5%) Neutrofile den "Stich", ohne dass sie Trypanblau-positiv werden, und wurden somit als nicht überlebensfähig ausgezählt. Im Gegensatz dazu erzeugte unter optimalen Bedingungen das "SLAM"-Verfahren sehr gute Überlebensraten, wobei der Trypanblau-Ausschluß nach "SLAM" dicht bei 100% lag. Ein kritischer Faktor bei der Bestimmung des Überlebens des Neutrofils nach "SLAM" war der Druck, der durch die Mikropipette erzeugt wurde innerhalb der Zelle. Dies konnte überwacht werden durch das Ausmaß an Material, welches pro Zeiteinheit injiziert wurde. Die 3 zeigt ein Demonstrationsexperiment, bei welchem drei Neutrofile SLAMinjiziert worden waren mit unterschiedlichen Drucken, und zwar zur Erläuterung des Problems des Einsatzes der Beibehaltung von Luzifergelb allein als Kriterium für eine erfolgreiche Mikroinjektion. Die mittlere Zelle wurde SLAM- injiziert bei einem Druck, der ausreicht, um die Zelle vollständig zu zerreißen, wie dies aus beiden endlichen fluoreszierenden und hellen Feldbildern ersichtlich ist. Die obere Zelle wurde SLAM-injiziert bei einem Druck von (10 mbar), wodurch eine geeignete Menge in die Zelle injiziert wurde (etwa 1 % ihres Volumens), wodurch kein Anstieg der Permeabilität von Trypanblau verursacht wurde, welches von der Zelle ausgeschlossen wurde. Die untere Zelle wurde jedoch SLAM-injiziert mit einem mittleren Druck, der die Zelle nicht zerriss und die Beibehaltung von mikroinjiziertem Luzifergelb gestattete. Es ist jedoch deutlich von dem Einschluss von Trypanblau, dass eine Zellschädigung eingetreten war und dass dieser Druck zu hoch war.
Dementsprechend zeigt in 3 die Reihe der Bilder (i) die letzten der ersten Neutrofile, mikroinjiziert durch das SLAM-Verfahren bei verschiedenen Injektionsdrucken etwa wie folgt: Obere Zelle 10 mbar, untere Zelle 50 mbar und mittlere Zelle 100 mbar. Die Bilder (ii) und (iii) zeigen die entsprechende Beladung von Luzifergelb und Trypanblau jeweils, nachdem alle drei mikroinjiziert waren. Wie das Bild (ii) zeigt, war die mittlere Zelle lysiert durch einen exzessiven Druck und enthielt kein Luzifergelb, während die untere Zelle Luzifergelb beibehielt, jedoch ebenfalls versagte Trypanblau auszuschließen. Die obere Zelle repräsentiert eine optimale Mikroinjektion, bei welcher Luzifergelb beibehalten wurde, jedoch Trypanblau ausgeschlossen war.
(iv) Charakterisierung der Lipid-assistierten Mikroinjektion
Obwohl die Anmelderin hieran nicht gebunden sein soll, ist das Nachfolgende ein Vorschlag für eine Charakterisierung der Lipid-assistierten Mikroinjektion.
Unter dem entsprechenden niedrigen Druck für die Mikroinjektion (10 mbar) ergab sich ein ersichtlicher Anstieg des Zellvolumens, bestimmt durch den Zelldurchmesser oder die Änderung der Zellformen. Um eine Sicht in den Mechanismus hinein zu erzielen, durch welchen das wässrige Material in die Zelle eintritt, wurde der Zeitverlauf des Anstieges der Zellfluoreszenz bestimmt. Es ergaben sich zwei Charakteristika des Eintrittes des wässrigen Materials. Das erste war, dass Mikroinjektion nicht eintrat unmittelbar beim Kontakt zwischen der Mikropipette und der Zelle (4). Dies war oft weniger als 1 s, jedoch in manchen Fällen mehrere Sekunden. Dies kann übereinstimmen mit der Bildung einer Lipidbrücke, die sich aus der Fusion des Lipids an der Mikropipettenspitze und der Zellmembran ergab. Das zweite war, dass ein quasi Gleichgewicht gebildet wurde innerhalb von etwa 20 s des Kontakts, wobei die Rate des Anstiegs der Fluoreszenz innerhalb der Zelle in etwa konstant war zwischen unterschiedlichen Zellen, wobei ein t_1/2 etwa 10 s betrug. Eine Möglichkeit für das quasi-Gleichgewicht war, dass weiteres Material nicht mit der ursprünglichen Rate injiziert wurde, da der Druck innerhalb der Mikropipette und der innere Druck innerhalb der Zelle in etwa gleich war. Von dem Rahmen durch Rahmendarstellung der ersten Sekunde des "SLAM"-Verfahrens wurde eine klare Welle von fluoreszierendem Material, welches in die Zelle eintritt beobachtet (5). Es war schwierig zu unterscheiden, ob diese Welle sich aus der Diffusion von Material aus der Mikropipette oder aus der Niedrigdruckinjektion ergab, aber die Kinetik könnte beschrieben werden durch Diffusion. Die abgeschätzte Diffusionskonstante für Luzifergelb mit dem Neutrofil war somit D = 100 μm²/s (einfaches Wandern von etwa 10 μm in etwa 1 s). Da dieser Wert ähnlich demjenigen ist, der erwartet wird für ein kleines Molekül in Zytosol (D_const für IP₃ = 283 μm/s), legte dieses nahe, dass der Eintritt des Materials in der ersten Sekunde durch Diffusion erfolgt sein kann.
Dementsprechend zeigt die 4 die graphische Darstellung die Fluoreszenzintensität von Luzifergelb innerhalb des Neutrofils (gezeigt in dem Einschub), während des SLAM-Verfahrens. Der Kontakt zwischen der lipidüberzogenen Mikropipette, welche das Luzifergelb enthielt und der Zelle ist an der Spur durch einen Pfeil markiert. Die Reihe der Bilder unterhalb der gleichen Zelle zeigen die ersten 25 s nach dem Kontakt mit einer Mikropipette. Die Position der Mikropipettenspitze wurde sichtbar gemacht mit Dil. In 5 zeigt die untere Reihe der Bilder die Fluoreszenzverteilung von Luzifergelb innerhalb des Neutrofils, dargestellt in dem oberen Band, nach dem Kontakt mit der Mikropipette. Die Bilder sind für die erste Sekunde gezeigt.
Unter Einsatz der obigen Nährung hat die Anmelderin die erfolgreiche Mikroinjektion von Neutrofilen gezeigt sowohl lose anhaftend (etwa 10 μm Durchmesser) als auch dünn verteilt (etwa 1 μm Dicke), die lebend und chemotaktisch verbleiben.
Weitere Information hinsichtlich der Produktion von lipidüberzogenen Mikropipetten
Die Herstellung der Mikropipetten, die vorüberzogen sind mit Lipid, kann als Massenproduktion erfolgen, indem man die Spitze der Mikropipette in Kontakt mit Lipid bringt, welches in einem flüchtigen Lösungsmittel aufgelöst ist. Dies kann erzielt werden durch ein einfaches Eintauchen der Mikropipetten in Lösungen des Lipids oder durch die Passage von Mikropipetten durch einen Aerosolspray der Lipidlösung. Ein Verdampfen des Lösungsmittels lässt die Spitze der Mikropipette entsprechend überzogen mit Lipid. Es ist wichtig, die Bedingungen zu beachten, unter welchen die lipidüberzogenen Mikropipetten verpackt werden zur Maximierung der Konservierung des Lipids in seiner ursprünglichen molekularen Form. Dementsprechend sollten Wasser und Wasserdampf ausgeschlossen werden durch die Verpackung der lipidüberzogenen Mikropipette in einer äußeren luftdichten Umhüllung und Verpackung. Dies kann verstärkt werden durch den Einschluss von Silikagel oder einem ähnlich wirkenden Mittel, welches Wasserdampf innerhalb der Verpackung absorbiert. Die äußere Verpackung sollte ebenfalls mit einem inerten Gas gespült werden, wie etwa mit Stickstoff, bevor eine Abdichtung erfolgt, um eine Oxidation des Lipids zu minimieren. Die Verpackung und die Schutzumhüllung würden einfach entfernt durch den Benutzer vor dem Einsatz. Die Verpackung ist in 6(i) und (ii) dargestellt. Die Mikropipette oder der Stab 1 in 6(i) ist innerhalb einer Kunststoffumhüllung 2 positioniert und dann innerhalb eines Beutels 3 verpackt, welcher abgedichtet ist. Der Beutel 3 ist ausgelegt, um Luft, Feuchtigkeit und Licht auszuschließen und ist mit einem inerten Gas gefüllt oder vakuumabgedichtet. Alternativ wird in 6(ii) die Pipette oder der Stab 1 auf Abstützungen 4 innerhalb einer festen Schachtel 5 gehalten mit einer Lasche 6. Die Umhüllung 2 kann, muss aber nicht vorgesehen sein, je nachdem wie dies erforderlich ist. Die Schachtel 5 schließt Luft, Feuchtigkeit und Licht aus und ist mit einem inerten Gas gefüllt oder vakuumabgedichtet. Für den Einsatz würde die Substanz, die zu mikroinjizieren ist, in die Mikropipette von hinten eingeführt (nicht am lipidüberzogenen Ende). Die bimolekulare Lipidschicht würde gebildet an der Mikropipette, während sie in eine wässrige Flüssigkeit eingetaucht ist, wie die Zelle, die zu mikroinjizieren ist. Hoher Druck (in etwa 1000-3000 mbar) würde dann ü bergangsweise (0,1–2 s) an die Mikropipette angelegt, um die Lipiddichtung aufzubrechen und die Inhalte auf die Spitze der Mikropipette zu drücken. Nach Beendigung des Hochdruckimpulses bildet sich das Lipid an der Spitze neu und die Mikropipette ist bereit für den Einsatz für Lipid-assistierte Mikroinjektionstechniken.
Eine Alternative zum Lipidvorüberziehen, welche das Problem der Lipidoxidation und Zerstörung eliminiert, liegt darin, das Lipid als Lösung in einem flüchtigen Lösungsmittel vorzusehen innerhalb eines luftdichten Behälters. Der Behälter würde so ausgelegt sein, dass er es gestattet, dass die Mikropipette in das Lösungsmittel eingetaucht werden kann und dementsprechend überzogen mit Lipid, wie dies zuvor beschrieben wurde. Um die Möglichkeit der Beschädigung der empfindlichen Spitze der Mikropipette zu elminieren, sollte die Mikropipette eingeschlossen sein in einer äußeren Umhüllung, die eine Öffnung an der Basis und am Rand besitzt. Dies macht den Eintritt von Lösungsmittel möglich in die Umhüllung hinein und überzieht die Mikropipette mit Lipid ohne die Möglichkeit der Schädigung der inneren Glasmikropipettenspitze. Die Umhüllung würde dann entfernt werden vor dem Einsatz, um die lipidüberzogene Mikropipette freizusetzen. Dies ermöglicht das Präparieren der Mikropipette in situ für anschließend folgende Mikroinjektionstechniken.
Dies ist in den 7(i) bis (v) dargestellt. Eine Glaspipette oder ein Stab 1 ist in einer Kunststoffumhüllung 7 positioniert, welche eine Öffnung 8 besitzt. Die Pipette wird gefüllt über eine Fülleinrichtung 9 mit der erforderlichen wässrigen Lösung. Die Spitze der Umhüllung 7 wird in die Lipidlösung 10 eingetaucht. Die Öffnungen 8 gestatten es der Lipidlösung 10, in das Glas einzutreten und dies zu kontaktieren. Die Umhüllung 7 wird entfernt und lässt die Pipette oder den Stab 1 zurück überzogen mit Lipid bereit für den Einsatz.

Claims

Verfahren zum Einführen eines Mittels in das Zytosol und/oder die Plasmamembran einer Zelle, folgende Schritte umfassend: (a) Überziehen mindestens eines Teils einer Spitze einer Übertragungsvorrichtung mit einem Lipid; (b) Inkontaktbringen der lipidüberzogenen Spitze der Übertragungseinrichtung mit der Zelle und (c) Übertragen mindestens eines Teils des Inhaltes der Übertragungseinrichtung in das Zytosol und/oder die Plasmamembran der Zelle, ohne in das Zytoplasma einzudringen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Übertragungseinrichtung eine Pipette oder ein Stab ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Inhalte der Übertragungseinrichtung unter Druck übertragen werden, wobei der Druck klein genug ist, um eine Beschädigung der Zelle zu vermeiden.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Druck zwischen 5 und 40 mbar liegt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine lebende Zelle ist, die am Leben bleibt nach der Übertragung mindestens ei nes Teils der Inhalte der Übertragungseinrichtung in das Zytol und/oder die Plasmamembran der Zelle.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine kleine Säugetierzelle ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der sphärische Durchmesser der Zelle zwischen 2 und 15 μm liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zelle eine flache Form besitzt mit einer Dicke von 1 bis 3 μm.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine menschliche Neutrophilzelle ist mit einer Dicke von 1 bis 3 μm.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Übertragung der Lipid- und lipidlöslichen Moleküle stattfindet zwischen der Übertragungseinrichtung und dem Zytol und/oder der Plasmamembran der Zelle.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Inhalte der Übertragungseinrichtung in der Form einer wässrigen Lösung vorliegen.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch den Schritt des Quellens des Lipids zur Bildung eines Lipidüberzuges oder einer bimolekularen Schicht vor dem Inkontaktbringen der Spitze mit der Zelle.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Lipid Phosphatidylcholkin-Oleyl-Palmitoyl (PCOP) umfaßt.
Übertragungseinrichtung zum Einführen eines Mittels in das Zytosol und/oder die Plasmamembran einer Zelle umfassend eine lipidüberzogene Spitze, die in der Lage ist, zumindest einen Teil der Inhalte der Übertragungsvorrichtung auf die Zelle zu übertragen, ohne in das Zytoplasma einzutreten.
Lipidüberzogene Spitze für den Einsatz in der Übertragungseinrichtung gemäß Anspruch 14.
Kitt zum Einführen eines Mittels in eine Zelle, wobei das Kitt ein Mittel umfaßt sowie eine Übertragungseinrichtung zur Einführung des Mittels in das Zytosol und/oder die Plasmamembran einer Zelle, wobei die Einrichtung eine lipidüberzogene Spitze umfaßt, die in der Lage ist, zumindest einen Teil der Inhalte der Einrichtung in das Zytosol und/oder die Plasmamembran der Zelle zu übertragen, ohne in das Zytoplasma einzudringen.
Verfahren zur Beeinflussung (transfect) einer Zelle, umfassend das Einführen eines Beeinflussungsmittels (transfection agent), gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) Überziehen mindestens eines Teils einer Spitze einer Übertragungseinrichtung mit einem Lipid; (b) Inkontaktbringen der lipidüberzogenen Spitze der Übertragungseinrichtung mit der Zelle und (c) Übertragung mindestens eines Teils der Inhalte der Übertragungseinrichtung auf die Zelle.
Verfahren zum Überziehen einer Spitze der Übertragungseinrichtung mit einem Lipid, umfassend das Aufbringen einer Lipidlösung auf die Spitze der Übertragungseinrichtung und Verdampfen des Lösungsmittels aus der Lipidlösung.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Lipidlösung in einem luftdichten und lichtdichten Behälter bereitgestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, darüber hinaus umfassend den Schritt der Beladung der Übertragungseinrichtung mit einer wässrigen Lösung vor dem Aufbringen der Lipidlösung.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18–20, darüber hinaus umfassend den Schritt der Platzierung der Übertragungseinrichtung in eine wässrige Lösung derart, daß das getrocknete Lipid quillt zur Bildung eines Lipidüberzuges oder einer bimolekularen Schicht.
Verpackung für eine Übertragungsvorrichtung mit einer lipidüberzogenen Spitze, wobei die Verpackung ein luftdichtes und lichtdichtes Ummantelungselement umfaßt zur Aufnahme der Übertragungseinrichtung, wobei, wenn die Verpackung zum Einsatz kommt, das Ummantelungselement zumindest die lipidüberzogene Spitze derart umgibt, daß die Bewahrung des Lipid in seiner molekularen Form maximiert wird.
Verpackung gemäß Anspruch 22, darüber hinaus umfassend ein äußeres Verpackungselement.
Verpackung gemäß Anspruch 23, darüber hinaus umfassend ein Wasserabsorptionsmittel innerhalb des äußeren Verpackungselementes.
Verpackung gemäß Anspruch 23 oder 24, wobei das äußere Verpackungselement gespült ist mit einem Inertgas vor dessen Abdichtung.
Verfahren zur Herstellung einer lipidüberzogenen Spitze einer Übertragungseinrichtung, umfassend: (a) Positionieren einer Spitze einer Übertragungseinrichtung in eine Ummantelung, die eine Öffnung hierin besitzt; (b) Eintauchen der Spitze in ein Lipid in einem Lösungsmittel unter Gestattung des Hindurchtretens des Lösungsmittels durch die Öffnung und (c) Verdampfen des Lösungsmittels.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei eine Öffnung in einer Basis und einer Seitenwandung der Ummantelung positioniert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 26 oder 27, darüber hinaus umfassend den Schritt der Entfernung der Ummantelung.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 26 bis 28, darüber hinaus umfassend den Schritt der Füllung der Übertragungseinrichtung vor dem Eintauchen in das Lösungsmittel.
Verfahren zur Herstellung einer Übertragungseinrichtung mit einer lipidüberzogenen Spitze für den Einsatz des Einführens eines Mittels in das Zytosol und/oder die Plasmamembran einer Zelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Platzieren der einzuführenden Substanz in die Übertragungseinrichtung; (b) Eintauchen der Spitze der Übertragungseinrichtung in eine wässrige Flüssigkeit, die die Zelle umgibt, und (c) Anlegen eines Drucks auf die Inhalte der Übertragungseinrichtung.
Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei die einzuführende Substanz in die Übertragungseinrichtung von dem nicht lipidüberzogenen Ende aus platziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 30 oder 31, wobei der Druck zwischen 1000 und 3000 mbar liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30–32, wobei der Druck vorübergehend angelegt wird.