DE3733927A1 - Verfahren zur gewinnung von zellinhaltsstoffen - Google Patents
Verfahren zur gewinnung von zellinhaltsstoffenInfo
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- C12N1/06—Lysis of microorganisms
- C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical methods
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur
Gewinnung von Zellinhaltsstoffen aus Zellen beliebiger Herkunft
uner Aufrechterhaltung der intakten Zellstruktur.
Bereits seit den Anfängen der fermentativen Bearbeitung von Mikroorganismen
sowie von pflanzlichen und tierischen Zellen besteht ein
Interesse an der Freisetzung von Syntheseprodukten (z. B. Primär-
oder Sekundärmetaboliten) aus der produzierenden Zelle. Mit der
Entwicklung gentechnologischer Verfahren zur Manipulation von
Mikroorganismen sowie tierischer und pflanzlicher Zellen, besteht in
zunehmendem Maße ein Bedarf an verfeinerten und schonenden Isolationsmethoden.
Eine Vielzahl ökonomisch interessanter und wichtiger Zellinhaltsstoffe
ist nicht in der Lage, die Zellmembranen zu passieren und wird
normalerweise nicht an das umgebende Nährmedium abgegeben, sondern
verbleibt innerhalb der Produzentenzelle. Dies gilt in erster Linie
für makromolekulare Verbindungen, wie Polypeptide, Proteine, Polysaccaride
und Nucleinsäuren. Aber auch niedermolekulare Syntheseprodukte,
wie z. B. zahlreiche Metabolite des Sekundärstoffwechsels
von Mikroorganismen, Pilzen und Pflanzen werden zum Teil in den
produzierenden Geweben und Zellen abgelagert und sind folglich nicht
ohne weiteres verfügbar.
In der pflanzlichen Zelle dient in erster Linie die Zellvakuole als
Reservoir und Speicher für die verschiedensten Stoffwechselprodukte.
Beispielhaft seien hier die in der Zellvakuole gelösten Farbstoffe,
wie die Anthocyane und Anthoxanthine genannt. Daneben findet man
aber auch Wirksubstanzen, die in der Human- und Tiermedizin oder der
Naturheilkunde eine große Bedeutung erlangt haben oder erlangen
könnten, wie z. B. verschiedene Glykoside (Digitalisglykosid),
Alkaloide (Morphin) und viele andere mehr.
Zur Isolierung dieser Zellinhaltsstoffe mußte bisher zunächst ein
Zellaufschluß erfolgen, der meist nur unter Einsatz von großem
Zeit- und Arbeitsaufwand möglich ist und im allgemeinen zu einer
Zerstörung der Zellen führt.
Da es sich bei biologischen Produkten in einer Vielzahl der Fälle um
empfindliche Verbindungen handelt, deren strukturelle und funktionelle
Integrität nur innerhalb eng begrenzter Milieubedingungen
gewährleistet ist, kann die Aufarbeitung nur unter Anwendung
entsprechend verfeinerter Methoden durchgeführt werden.
In der Regel werden bisher zwei verschiedene Verfahrensweisen
angewendet.
Zum einen ist es möglich, die Zellen mit Hilfe mechanischer Manipulationen
aufzubrechen, z. B. durch Vermahlen in Rührwerkskugelmühlen
oder Koloid-Mühlen, durch Anwendung von Druck und nachfolgende
Enspannung (Homogenisator) sowie durch Ultraschallbehandlung.
Eine andere Möglichkeit besteht in der Anwendung von
thermischen, chemischen oder enzymischen Methoden. Hierzu gehört
beispielsweise die Trocknung und Lyophilisation der Zellen sowie
die Behandlung der Zellen mit oberflächenaktiven Verbindungen
(Detergentien) oder mit organischen Lösungsmitteln.
Diese bekannten Verfahrensweisen haben aber entscheidende Nachteile,
da sie mit zeit- und arbeitsintensiven Aufarbeitungsschritten
verbunden sind und im allgemeinen mit der Zerstörung der Zellen
enden.
Im Falle der mechanischen Zerstörung der Zellstruktur müssen
zunächst die anfallenden Zellwandtrümmer und andere zelluläre
Bestandteile aus der Kulturlösung abgetrennt werden, bevor die
weitere Aufarbeitung und Isolierung der gewünschten Zellinhaltsstoffe
erfolgen kann.
Die Ultraschallbehandlung führt oft zu einer ungewollten und
nachteiligen Erwärmung und zur unerwünschten Bildung freier Radikale,
was zu unkontrollierbaren Reaktionen führen kann. Hinzu kommen
hohe Energie- und Kostenaufwendungen.
Bei der Anwendung von Detergentien kann es andererseits zu unerwünschten
Denaturierungen von Proteinen kommen. Darüberhinaus müssen
die zugesetzten Chemikalien in der Regel zuerst wieder aus der
Fermentationsbrühe entfernt werden, bevor die weitere Aufarbeitung
erfolgen kann.
Die Verwendung von Enzymen ist im allgemeinen teuer und bleibt daher
normalerweise auf den Labormaßstab beschränkt. Auch in diesem Fall
kann es zu unerwünchten Wechselwirkungen kommen, die die weitere
Aufarbeitung erschweren.
Alle diese Nachteile können überraschenderweise durch die einfachen
Maßnahmen der vorliegenden Erfindung überwunden werden, insbesondere
dadurch, daß bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
die Zellstruktur in dem Maße erhalten bleibt, daß keine
Zelltrümmer oder sonstige, die Aufarbeitung störende Zellbestandteile
ins Kulturmedium gelangen.
In neuerer Zeit wurden Verfahren entwickelt, die es ermöglichen,
Makromoleküle in Mikroorganismenzellen sowie in tierische und
pflanzliche Zellen bzw. Protoplasten einzuschleusen, ohne deren
Zellstruktur und damit die Lebensfähigkeit der Zellen nachhaltig zu
beeinrächtigen.
Dabei ist es gelungen, die Membranpermeabilität von Protoplasten
durch Behandlung mit elektrischen Impulsen zu erhöhen und somit
einen Übertritt von Makromolekülen (z. B. DNA in Form von Plasmiden)
aus dem Kulturmedium in die Protoplasten zu ermöglichen (Shillito,
R. P. et al., (1985). Bio/Technology 3, 12, pp. 1099-1103).
Nun konnte überraschenderweise ein Verfahren entwickelt werden, das
sich in Umkehrung der oben erwähnten Prinzipien nunmehr in hervorragender
Weise für die Ausschleusung von Zellinhaltsstoffen aus
Zellen unter Aufrechterhaltung der intakten Zellstruktur, eignet.
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich somit um ein Verfahren
zur Gewinnung von Zellinhaltsstoffen aus Zellen beliebiger
Herkunft, das sich dadurch kennzeichnet, daß man besagte Zellen in
einem geeigneten Inkubationsmedium mit elektrischen Spannungs-
Impulsen hoher Intensität beaufschlagt und die in das Inkubationsmedium
entlassenen Inhaltsstoffe isoliert.
Dabei werden zweckmäßigerweise die Zellen zunächst in einem
geeigneten Nährmedium über einen angemessenen Zeitraum hinweg
kultiviert, anschließend konzentriert und im gleichen oder jedem
beliebigen anderen geeigneten Medium resuspendiert. Die Zellsuspension
wird in eine Elektroporator-Kammer zwischen zwei Elektroden
eingebracht. Durch Entladung eines Kondensators über der Zellsuspension
werden die Zellen kurzzeitig sehr hohen elektrischen Feldstärken
ausgesetzt, was zu einer Freisetzung von Inhaltsstoffen aus
dem Zellinneren in das umgebende Nährmedium führt. Die Isolierung
der Zellinhaltsstoffe aus dem Kulturmedium erfolgt mit Hilfe an sich
bekannter Methoden, wie z. B. durch Extraktion, durch Säulenchromatographie
oder ähnliche Reinigungsverfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als kontinuierliches
Verfahren angewendet werden, indem man die zellhaltige Suspension
kontinuierlich und mit konstanter Geschwindigkeit zwischen den
Kondensatorplatten hindurchbewegt, und die Zellen kurzzeitig hohen
elektrischen Feldstärken aussetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für die Gewinnung von
Syntheseprodukten aus Zellen beliebiger Herkunft, die sich in Kultur
stabil erhalten und vermehren lassen. Das Verfahren ist nicht auf
bestimmte Zellen limitiert und beispielsweise auf Zellen von
Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen und mycelbildende Pilze, sowie
Zellen oder Protoplasten menschlichen, tierischen und pflanzlichen
Ursprungs gleichermaßen anwendbar.
Besagte Zellen können auch in immobilisierter Form vorliegen.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
betrifft die Isolierung von Zellinhaltsstoffen aus Pflanzenzellen.
Die Kultivierung der Pflanzenzellen erfolgt z. B. in einem für diesen
Zweck geeigneten Nährmedium, z. B. in einem Medium nach Murashige und
Skoog (Murashige T. and Skoog F., Physiol. Pl. 15, pp. 473-497,
1962), welches je nach dem gewünschten Stoffwechselprodukt in der
entsprechenden Weise modifiziert werden kann.
Die Pflanzenzellen werden in einem der besagten Medien herangezogen
und anschließend zweckmäßigerweise über ein Edelmetall-Sieb von
großen Zellaggregaten abgetrennt. Es folgen Zentrifugation und
Resuspendierung der Zellen in einem identischen oder jedem beliebigen,
für die Kultivierung von Pflanzenzellen geeigneten Kultur-
Medium oder einem durch Zusatz eines geeigneten, die Zellen stabilisierenden
Agens, modifizierten Kultur-Medium. Die so erhaltene
Zellsuspension wird in eine zuvor z. B. mit Ethanol sterilisierte
Elektroporator-Kammer eingebracht, wo die Zellen anschließend durch
Entladung eines Kondensators über der Zellsuspension kurzzeitig mit
sehr hohen elektrischen Feldstärken beaufschlagt werden. In der
Regel erfolgt eine drei- bis zehnmalige Entladung mit einer Repetitionsfrequenz
zwischen 0,1 und 20 Sekunden, wobei die erreichten
Feldstärken zwischen etwa 0,1 kV · cm-1 und etwa 15 kV · cm-1 betragen.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Feldstärken sind
abhängig von der Zellgröße der verwendeten Zellen, wobei die Größe
der Zellen und die Feldstärke negativ korrrelliert sind. Die Impulsbreite
liegt vorteilhafterweise im Bereich von 1 Nanosekunde bis
1000 Mikrosekunden.
Diese Behandlung der Zellen mit hohen Spannungs-Impulsen führt zur
Freisetzung von Zellinhaltsstoffen, wie z. B. von in der Zellvakuole
gelösten Farb- oder Wirkstoffen, in das die Zellen umgebende
Kulturmedium ohne Zerstörung der Zellstruktur. Es hat sich gezeigt,
daß sich das erfindungsgemäße Verfahren auch auf immobilisierte
Zellen anwenden läßt, die z. B. in mit Agarose oder Alginat oder
anderen Vernetzungsmitteln verfestigten Kulturmedien vorliegen.
Aber auch anderweitig immobilisierte Zellen können in dem erfindungsgemäßen
Verfahren eingesetzt werden.
Der außerordentlich hohe Anteil an mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren freigesetzter Substanz aus der Zelle kann mit Kontrollversuchen
nachgewiesen werden, wobei als Kontrolle die Gewinnung der
Zellinhaltsstoffe nach herkömmlichen Methoden, z. B. durch Extraktion
dient.
Die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Anwendung der Elektroporation
kann z. B. anhand des Wachstums der behandelten Zellen in
frischem MS-Medium überprüft werden.
Die Freisetzung von Zellinhaltsstoffen aus den behandelten Zellen
und deren Lebensfähigkeit korrellieren im allgemeinen miteinander.
Hohe elektrische Feldstärken zwischen z. B. 8 kV · cm-1 und 15 kV · cm-1
führen zu einer quantitativen Freisetzung der Inhaltsstoffe aus der
Zelle (Abb. 1), wobei jedoch die Vitalität der behandelten Zellen
stark beeinträchtigt wird (Abb. 2). Hohe Überlebensraten der
behandelten Zellen sind dagegen in der Regel mit geringeren Ausbeuten
an Zellinhaltsstoffen verbunden. Eine Möglichkeit der
Kompensation besteht im Zusatz von stabilisierenden Agenzien ins
Inkubationsmedium, wodurch die Vitalität der Zellen auch bei relativ
hohen Spannungswerten und daraus resultierend hohen Feldstärkewerten
erhalten bleibt.
Im Gegensatz zu den Feldstärkewerten scheint der Einfluß der verwendeten
Kapazitäten auf die Freisetzung der Zellinhaltsstoffe über
einen weiten Bereich (10 nF-40 nF) gering zu sein (Abb. 3).
Ein Zusammenhang zwischen der Vitalität der behandelten Zellen und
den verwendeten Kapazitäten läßt sich nur bei niedrigen Feldstärken
(1200 V · cm-1) feststellen, während bei hohen Werten (4800 V · cm-1)
keine Korrelation zwischen beiden Parametern existiert (Abb. 4).
Wie die oben gemachten Ausführungen zeigen, ist es somit bei
Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, je nach der
vorliegenden Problemstellung, die experimentellen Parameter so zu
wählen, daß man zu einem gewünschten Ergebnis gelangt, das heißt
z. B. zu hohen Ausbeuten an synthetisierten Inhaltsstoffen bei
gleichzeitig verminderter Vitalität der behandelten Zellen oder aber
zu hohen Überlebensraten bei etwas geringerer Ausbeute an Inhaltsstoffen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden
Erfindung und haben keinen limitierenden Charakter.
In den nachfolgenden Beispielen und Abbildungen werden folgende
Abkürzungen verwendet:
1 kV1000 Volt
2.4 D (2,4-Dichlorophenoxy)essigsäure
FGFrischgewicht MS-MediumMurashige und Skoog's Medium UpmUmdrehungen pro Minute w/vGewicht/Volumen
(Volumetrisches Gewicht) w/wGewicht/Gewicht sSekunde hStunde mMinute
FGFrischgewicht MS-MediumMurashige und Skoog's Medium UpmUmdrehungen pro Minute w/vGewicht/Volumen
(Volumetrisches Gewicht) w/wGewicht/Gewicht sSekunde hStunde mMinute
Berberin ist ein charakteristischer Inhaltsstoff der Berberidaceae
und Ranunculaceae. Es handelt sich dabei um eine intensiv gelb
gefärbte Verbindung, die chemisch gesehen zu den Benzylisochinolin-
Alkaloiden gehört und in der Vakuole gelöst vorliegt.
Zellen einer Zellinie von Thalictrum rugosum werden über einen
Zeitraum von zwei Wochen hinweg in einem Medium nach Murashige und
Skoog (MS), dem zuvor 2.4 D in einer Konzentration von 2 µM zugesetzt
wurde, bei einer Temperatur von 26°C angezogen. Die Kultivierung
der Zellen erfolgt in einer Flüssig-Schüttelkultur (120 Upm)
im Dunkel. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird die Zellsuspension
durch ein Edelstahlsieb mit einer Maschenweite von 500 µm filtriert,
um eventuell vorhandene große Zellaggregate abzutrennen.
Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert und in frischem
MS-Medium resuspendiert. Um dabei eine einheitliche Zelldichte der
für die Elektroporationsexperimente vorgesehenen Zellsuspensionen zu
erreichen, werden die abzentrifugierten Zellen in einem Verhältnis
(w/v) von 1 : 10 verdünnt (1 g Frischgewicht in 9 ml Medium).
Die Elektroporationsexperimente werden in einer Elektroporator-
Kammer vom Dialog® 'Porator' (Dialog GmbH, Harffstraße 34,
4000 Düsseldorf, Deutschland-West) durchgeführt.
Es handelt sich dabei um zylindrische Kammern mit einem Volumen von
0,35 ml und 1 ml. An den Kammerenden befinden sich Edelstahl-Elektroden
mit einem Elektrodenabstand von 1 cm.
Vor dem Einbringen der Zellsuspension wird die Elektroporator-Kammer
durch Waschen mit 70%igem und 100%igem Äthanol sterilisiert und
anschließend über einem sterilen Lufftstrom aus einem Gebläse mit
laminarer Luftströmung getrocknet.
0,30 ml oder 1 ml der oben erwähnten Zellsuspension werden dann in
die Elektroporatorkammer überführt und hier 3 bis 10mal einem elektrischen
Impuls im Nano- bis Microsekundenbereich von 0,3 kV bis
15 kV, was einer elektrischen Feldstärke von 0,3 kV · cm-1 bis
15 kV · cm-1 entspricht, ausgesetzt. Der Abstand zwischen den einzelnen
Impulsen beträgt dabei 10 s. Zur Erzeugung der elektrischen
Feldimpulse werden Kondensatoren mit unterschiedlichen Kapazitäten
verwendet, was zu unterchiedlichen exponentiellen Abkling-Konstanten
der induzierten Impulse führt, die zwischen 5 bis 20 Mikrosekunden
liegen.
Die Freisetzung des Vakuolenfarbstoffs Berberin aus Zellen von
Thalictrum rugosum ins Kulturmedium wird mit Hilfe dünnschicht-
chromatographischer bzw. spektroskopischer Methoden ermittelt.
Die Menge an freigesetzter Substanz aus den Zellen wird in den
Abbildungen in relativen Größen im Vergleich zu Kontrollexperimenten
angegeben. Bei den Kontrollen handelt es sich um Zellen, die
unter gleichen Bedingungen angezogen werden, deren Farbstofffreisetzung
aber unter Anwendung herkömmlicher Verfahren erreicht wird,
wie z. B. durch Extraktion mit Methanol.
Beim Betanin handelt es sich um eine intensiv rot gefärbte Verbindung,
die beispielsweise als Zellinhaltsstoff in Roten Rüben zu
finden ist. Auch dieser Farbstoff, der chemisch gesehen als β-D-
Glucopyranosid zu betrachten ist, liegt in der Vakuole gelöst vor.
Die Kultivierung der Zellen von Chenopodium rubrum erfolgt über
einen Zeitraum von 3 Wochen in einem mit 2.4 D (2 µM) angereicherten
MS-Medium als Flüssig-Schüttelkultur (80 Upm) unter Einhaltung eines
Tag/Nacht-Rhythmus (16 h/8 h). Die Inkubationstemperatur liegt
auch in diesem Fall bei 26°C.
Die Elektroporationsexperimente werden in analoger Weise zu den oben
gemachten Angaben für Thalictrum rugosum durchgeführt.
Die Ermittlung der Menge an freigesetztem Betanin ins Kulturmedium
erfolgt nach der Abtrennung der Zellen aus der Zellsuspension durch
Zentrifugation aufgrund der Absorption der Kulturlösung bei 540 nm.
Die Zellen einer Thalictrum rugosum Zellinie werden in MS-Medium
unter Zusatz von 2.4 D über einen Zeitraum von 2 Wochen in einer
Flüssig-Schüttelkultur (120 Upm) bei einer Temperatur von 26°C im
Dunkeln kultiviert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Zellsuspension wird dann zunächst zur Abtrennung eventuell
vorhandener Zellagglomerate filtriert, anschließend werden die
Zellen abzentrifugiert und in einem w/v-Verhältnis von 1 : 10 in
frischem MS-Medium resuspendiert (1 g Zellen (FG)/9 ml MS-Medium).
Zur Herstellung von immobilisierten Zellen wird dem Kulturmedium
Agarose (z. B. Sigma Typ VII) bis zu einer Konzentration von 4%
(w/w) bei einer Temperatur von 37°C zugesetzt.
Dieser Ansatz wird dann unter ständigem Rühren mit einem Magnetrührer
mit 40 ml Soja-Öl gleicher Temperatur vermischt. Nach
Bildung von Tröpfchen mit einem Durchmesser von 0,5 mm-1 mm
erfolgt die Abkühlung der Mixtur auf 10°C. Es entstehen auf diese
Weise Agarose-Kügelchen, in denen die Zellen eingeschlossen vorliegen.
Diese Agarose-Kügelchen werden gesammelt und durch mehrmaliges
Waschen mit MS-Medium von anhängenden Ölresten befreit.
Die auf die oben beschriebene Weise immobilisierten Zellen werden
dann in analoger Weise zu den suspendierten, freien Zellen für die
Elektroporations-Experimente verwendet. In diesem Fall werden die
immobilisierten Zellen in der 1 ml-Elektroporationskammer mit
Spannungs-Impulsen mit einer exponentiellen Abklingkonstanten von
10 Mikrosekunden beaufschlagt.
Die Kultivierung der Zellen von Thalictrum rugosum wird in gleicher
Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Zur Herstellung der immobilisierten Zellen wird in diesem Fall
Alginat verwendet. Dabei werden die filtrierten und abzentrifugierten
Zellen in Alginat-haltigem MS-Medium (z. B. 2% w/w,
Portan HF) bei Zimmertemperatur in einem Verhältnis von 1 : 10
resuspendiert (1 g Zellen (FG)/9 ml MS-Medium).
Die Zellsuspension wird anschließend tröpfchenweise in MS-Medium,
das einen Anteil von 50 mM CaCl₂ enthält, zugegeben. Es bilden sich
Kügelchen, die weitere 30 Minuten gerührt werden, bevor sie mehrmals
mit frischem MS-Medium, enthaltend 5 mM CaCl₂, gewaschen und separiert
werden.
Auch in diesem Fall erfolgt die Durchführung der Elektroporationsexperimente
in gleicher Weise wie zuvor in Beispiel 4 für die Zellen
in Suspensionskultur beschrieben.
Die Ergebnisse der durchgeführten Versuche beweisen, daß bei Wahl
geeigneter Parameter eine quantitative Freisetzung von Zellinhaltsstoffen
aus den Vakuolen erreicht wird (Abb. 1 und 3), unabhängig
davon, ob die verwendeten Zellen in Suspension oder in Form
immobilisierter Zellen vorliegen (Abb. 5).
Es besteht eine eindeutige Abhängigkeit der Freisetzung der Vakuolenfarbstoffe
von der elektrischen Feldstärke. In einem Bereich
zwischen 1 kV · cm-1 und 4 kV · cm-1 ist ein starker Anstieg der Freisetzung
zu beobachten, die bei Werten von 8 kV · cm-1 bzw. 15 kV · cm-1
(Chenopodium rubrum) quantitativ erfolgt (Abb. 1).
Die Kapazität des verwendeten Kondenstors hat dagegen offenbar nur
geringe Bedeutung für die Menge an freigesetzter Substanz.
Die Schwankungen in den Freisetzungsraten über den verwendeten
Kapazitätsbereich (10 nF-40 nF) hinweg sind nur gering (Abb. 3).
Es zeigt sich, daß auch in diesem Fall hohe Feldstärken
(4800 V · cm-1) zu hohen Freisetzungsraten (bis 100%) führen, während
bei niedriger elektrischer Feldstärke (1200 V · cm-1) die Werte
entsprechend geringer ausfallen (ca. 25%).
Auch die Anzahl der abgegebenen Spannungsimpulse spielt für die
Freisetzung der Farbstoffe offenbar nur eine untergeordnete Rolle.
Wie die Abb. 6 am Beispiel der Berberin-Freisetzung zeigt,
verlaufen die Kurven für 3 bzw. 10 Impulsgaben praktisch parallel.
Im Gegensatz zur Farbstofffreisetzung aus der Vakuole nimmt die
Lebensfähigkeit der Zellen nach der Elektroporation mit zunehmender
Feldstärke ab.
Wie am Beispiel von Thalictrum rugosum gezeigt (Abb.2), ist in
einem Bereich zwischen 600 V · cm-1 und 2400 V · cm-1 eine starke
Abnahme an lebensfähigen Zellen zu beobachten.
Auch die verwendete Kapazität hat in diesem Fall einen Einfluß auf
die Lebensfähigkeit der Zellen, vornehmlich im unteren Feldstärke-
Bereich (1200 V · cm-1). Diese nimmt bei Werten zwischen 10 nF-40 nF
deutlich ab. Dagegen bleibt sie bei einer elektrischen Feldstärke
von 4800 V · cm-1 praktisch unverändert (Abb. 4).
Claims (15)
1. Verfahren zur Gewinnung von Zellinhaltsstoffen aus Zellen,
beliebiger Herkunft, dadurch gekennzeichnet, daß man besagte Zellen
in einem geeigneten Inkubationsmedium mit elektrischen Spannungs-
Impulsen hoher Intensität beaufschlagt und die in das Inkubationsmedium
entlassenen Inhaltsstoffe isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei besagten Zellen um solche handelt, die sich in Kultur stabil
erhalten oder vermehren lassen.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei besagten Zellen um Mikroorganismen-Zellen
handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei besagten Mikroorganismen um Bakterien, Hefen oder mycelbildende
Pilze handelt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei besagten Zellen um solche tierischer oder
menschlicher Herkunft handelt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei besagten Zellen um solche pflanzlicher
Herkunft handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei besagten Zellen um Zellinien von Thalictrum rugosum handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei besagten Zellen um Zellinien von Chenopodium rubrum handelt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man Zellen beliebiger Herkunft in einem geeigneten
Inkubationsmedium in einer Weise mit elektrischen Spannungsimpulsen
beaufschlagt, daß besagte Zellen elektrischen Feldstärken
zwischen 0,1 kV · cm-1 und 15 kV · cm-1 ausgesetzt sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die
Inkubation der Zellen in einem flüssigen Nährmedium erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei besagten Zellen um immobilisierte Zellen handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die
Immobilisierung der Zellen mit Agarose oder Algint erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man
besagte Zellen mit 1 bis 10 elektrischen Spannungsimpulsen mit einer
Repetitionsfrequenz zwischen 0,1 und 20 Sekunden beaufschlagt.
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die
Impulsbreite 1 Nanosekunde bis 1000 Mikrosekunden beträgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem gewonnenen Zellinhaltsstoff um
Berberin und/oder Betanin handelt.
Applications Claiming Priority (1)
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1987
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