DE4427217C2

DE4427217C2 - Zellkulturverfahren

Info

Publication number: DE4427217C2
Application number: DE19944427217
Authority: DE
Inventors: Johann Hinrich Prof Dr Peters
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-08-01
Filing date: 1994-08-01
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2014-08-02
Also published as: DE4427217A1; WO1996004367A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kultivieren von eukaryotischen Adhäsions- und Suspensions-Zellen mit Ausnahme von Sacchaiomyces und eine nach diesem Verfahren erhältliche Kultur.

Es ist bekannt, Zellen in einem Nährmedium in Gegenwart eines Trägers zu kultivieren. Hierzu werden als Träger sogenannte Mikrocarrier verwendet. Die se Mikrocarrier bestehen aus Glas oder Polymeren, z. B. Zellulose. Die Mikro carrier weisen eine große Oberfläche auf. Auf ihr können sich die Zellen fest setzen und vermehren. Eine große Zelldichte kann damit in einem Kulturver fahren erreicht werden. Die verwendeten Mikrocarrier sind allerdings sehr teuer. Auch lassen sie sich oftmals nur einmal verwenden, was ein sie bein haltendes Zellkulturverfahren zusätzlich verteuert.

EP-A2-0 595 124 beschreibt einen Träger, auf den Mikroorganismen aufgebracht sind, zur Verwendung bei der Behandlung eines Bodens. Die Mikroorganismen umfassen Bakterien (prokaryotische Zellen) z. B. der Gattung Pseudomonas. Beispielsweise wird zur Herstellung eines Mikroorganismen-enthaltenden Trägers Pseudomonas Cepacia in einem Kulturmedium in Gegenwart von Holzpulver kultiviert. In EP-A2-0 595 124 wird auch Saccharomyces (eine Hefe) erwähnt. Es wird jedoch nicht beschrieben, daß eine Hefe der Gattung Saccharomyces in Gegenwart von Holzpulver kultiviert wird.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel be reitzustellen, mit dem eukaryotische Adhäsions- und Suspensions-Zellen in großer Dichte kultiviert werden können, wobei das Mittel nicht teuer ist.

Erfindungsgemäß wird dies in einem Zellkulturverfahren mit einem Träger er reicht, der ein poröses Zellulose- und Lignin-enthaltendes Material umfaßt.

Der Ausdruck "poröses Zellulose- und Lignin-enthaltendes Material" umfaßt jegliches Material mit Zellulose und Lignin, das Poren aufweist. Ein solches Material (nachstehend mit "Träger-Material" bezeichnet) stammt z. B. von Pflanzen. Vorzugsweise ist es Holz, Kork, Rinde, Bast, Faser, Frucht, Frucht schale, Samen, Knolle oder ein Teil davon. Beispiele hiervon sind in Tabelle 1 angegeben.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Träger-Material chemisch modifiziert. Der Ausdruck "chemisch modifiziert" weist darauf hin, daß das Träger-Material, insbesondere seine Oberfläche durch eine oder mehrere che mische Verbindungen modifiziert ist. Solche Verbindungen sind dem Fach mann bekannt. Dies sind z. B. Verbindungen, welche die Adsorption der Zellen an die Oberfläche des Träger-Materials fördern oder Verbindungen, wie Proteine oder Lipide, die für das Wachstum der Zellen förderlich sind. Die chemischen Verbindungen können direkt oder über einen üblichen Linker mit der Oberfläche des Träger-Materials verbunden sein. Dem Fachmann sind die hierzu notwendigen Verfahren und Materialien bekannt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Träger-Material gewaschen und/oder sterilisiert. Das Waschen kann mit Wasser, Puffer, z. B. Phosphatpuffer, oder organischem Lösungsmittel erfolgen. Durch das Wa schen mit organischem Lösungsmittel werden insbesondere Harze entfernt, die in den Poren des Träger-Materials vorliegen können. Das Sterilisieren kann durch übliche Sterilisationsverfahren, wie Behandlung mit Ethylenoxid, Be strahlung, trocknes Erhitzen auf z. B. 180°C oder Autoklavieren, z. B. bei einer Temperatur von über 100°C und einem Druck von 1,2 Atü, durch geführt werden. Waschen und/oder Sterilisieren kann in getrennten Schritten oder gleichzeitig erfolgen. Bei letzterem kann z. B. das Träger-Material zu sammen mit einem vorstehenden Puffer autoklaviert werden. Nach dem Autoklavieren wird das Träger-Material in üblicher Weise abgetrennt, z. B. durch Sedimentation oder Filtration. Waschen und/oder Sterilisieren kann mehrmals wiederholt werden.

Das poröse Träger-Material kann in jeder beliebigen Form und Größe im er findungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Es kann z. B. in pulveriger Form, wie Sägemehl, oder in Stücken mit mehreren Millimetern bis Zentime tern Breite und/oder Länge, wie Holzspäne oder Holzwolle, eingesetzt werden. Vorzugsweise hat es eine annähernd kugelige Form mit einem Durchmesser von 10 µm bis 1 mm, besonders bevorzugt 100 bis 200 µm. Das Träger- Material kann durch übliche Zerkleinerungsverfahren hergestellt werden.

Von den eukaryotischen Adhäsions- und Suspensions-Zellen sind die Adhäsionszellen bevorzugt.

Vorstehende Zellen umfassen Tier-, Pflanzen- oder Hefezellen.

Der Ausdruck "Nährmedium" umfaßt Medien jeglicher Art, die zur Kultivierung von vorstehenden Zellen verwendet werden können. Dies können Vollmedien sein, d. h. Medien, die alle zum Zellwachstum notwendigen Stoffe enthalten. Auch können es Minimalmedien sein, denen es an Stoffen mangelt, die an vor stehendem Träger-Material gebunden sein können. Solche Stoffe sind z. B. Proteine oder Lipide. Dem Fachmann sind Medien vorstehender Arten be kannt.

Ebenso sind dem Fachmann zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver fahrens geeignete Apparaturen, wie Reaktoren, Fermenter etc., und Bedin gungen, wie Temperatur, pH, Sauerstoffpartialdruck etc., bekannt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich darin aus, daß es die Kultivie rung von vorstehenden Zellen zu großer Dichte ermöglicht. Die Gewinnung großer Mengen eines Produktes der Zellen ist damit ebenfalls ermöglicht. Auch kennzeichnet sich das Verfahren dadurch, daß es ein leicht erhältliches und handhabbares Träger-Material verwendet. Dieses kann mehrfach verwendet werden. Hierzu werden gebundene Zellen durch übliche Verfahren, wie Trypsin- oder Kalzium- Entzug, von dem Träger-Material abgelöst und dieses wird gewaschen und/ oder sterilisiert. Das Träger-Material zeichnet sich ferner dadurch aus, daß es billig ist, wodurch das gesamte Kultivierungsverfahren billig gehalten werden kann. Des weiteren ist das Träger-Material nicht-toxisch und nicht-immuno gen. Damit ist es möglich, die kultivierten Zellen zusammen mit dem Träger- Material für pharmazeutische und medizinische Maßnahmen zu verwenden. Eine solche Maßnahme ist z. B. die Verabreichung von Leberzellen zusammen mit dem Träger-Material an einen Organismus, um den weitgehenden Verlust seiner Leber zu kompensieren.

Erfindungsgemäß wird auch eine Kultur von vorstehenden Zellen bereitgestellt, die an einen Träger gebunden sind, der ein poröses Zellulose- und Lignin-enthaltendes Material umfaßt. Eine solche Kultur ist zu vorstehenden pharmazeutischen und medizinischen Maßnahmen befähigt.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von mit CHO-Zellen bewachsenen Lindenholz-Sägespänen,

Fig. 2 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Linden holz-Sägespänen ohne Zellen,

Fig. 3 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von mit CHO-Zellen bewachsenen Korkteilchen,

Fig. 4 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von mit CHO-Zellen bewachsenen Pernambuco-Holzspänen und

Fig. 5 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von mit CHO-Zellen bewachsenem Pulver der Kaffeefrucht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 Kultivierung von CHO-Zellen in Gegenwart von Linden holz-Sägespänen

Lindenholz-Sägespäne wurden in Phosphatpuffer, pH 7,4 in üblicher Weise, autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurde der Puffer entfernt. Die autokla vierten Lindenholz-Sägespäne wurden mit CHO-Zellen in einem Nährmedium aus 80% RPMI 1640, 20% Medium 199, 10% fötalem Kälberserum wäh rend 7 Tagen kultiviert (37°C, 5% CO₂). Danach wurden die mit CHO-Zellen bewachsenen Lindenholz-Sägespäne vom Nährmedium in üblicher Weise abgetrennt. Zur Anfertigung einer rasterelektronenmikroskopischen Aufnahme wurden die Zellen mit üblichem Formolpuffer fixiert. Die rasterelektronenmi kroskopische Aufnahme wurde nach einem Standardverfahren angefertigt (vgl. Fig. 1).

Zum Vergleich wurde eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Lindenholz-Sägespänen angefertigt, die jedoch nicht mit CHO-Zellen bewach sen waren (vgl. Fig. 2).

Aus dem Vergleich der Fig. 1 und 2 geht hervor, daß die Lindenholz-Säge späne, die zusammen mit CHO-Zellen inkubiert worden waren, einen dichten CHO-Zellrasen aufwiesen.

Beispiel 2 Kultivierung von CHO-Zellen in Gegenwart von Korkteil chen

Es wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren durchgeführt, wobei an Stelle von Lindenholz-Sägespänen Korkteilchen verwendet wurden und die Kultivierung während 5 Tagen durchgeführt wurde.

Aus Fig. 3 geht hervor, daß die Korkteilchen und ihre Hohlräume mit CHO- Zellen bewachsen waren.

Beispiel 3 Kultivierung von CHO-Zellen in Gegenwart von Pernambu co-Holzspänen

Pernambuco-Holzspäne wurden viermal mit einem Überschuß von PBS-Puffer autoklaviert. Danach wurden vom Holz nur noch geringe Mengen roter Farb stoff freigesetzt. Diese Pernambuco-Holzspäne wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 mit CHO-Zellen während 5 Tagen kultiviert.

Aus Fig. 4 geht hervor, daß die Pernambuco-Holzspäne mit CHO-Zellen bewachsen waren.

Beispiel 4 Kultivierung- von CHO-Zellen in Gegenwart von Kaffee- Pulver

Geröstetes Kaffee-Pulver wurde mit einem Überschuß an kochendem Wasser mehrfach extrahiert. Anschließend wurde das extrahierte Kaffee-Pulver nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise gewaschen und autoklaviert. Das autoklavierte Kaffee-Pulver wurde mit CHO-Zellen während 3 Tagen unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen kultiviert.

Aus Fig. 5 geht hervor, daß das Kaffee-Pulver mit CHO-Zellen bewachsen war. Auf Grund der Kultivierungszeit von nur 3 Tagen wies das Kaffee-Pulver keinen vollständigen Zellbewuchs auf.

Beispiele 5-37 Kultivierung von CHO-Zellen in Gegenwart unter schiedlicher poröser Zellulose- und Lignin-enthal tenden Materialien

Holz (H) und Samen (S) wurden durch Sägen oder Mahlen in eine Korngröße zwischen 10 µm und 1 mm Durchmesser gebracht. Sie wurden nach der an gegebenen Art vorbehandelt oder unvorbehandelt in die Kultur genommen. Der Ausdruck "autoklaviert, gewaschen" bildet einen Arbeitsschritt, wie er in Beispiel 1 beschrieben wurde. Das Wachstum der Zellen wurde phasenkon trastmikroskopisch ausgewertet und in vier Kategorien klassifiziert:

- = kein Zellwachstum,
+ = Adhärenz und Zellwachstum gering, aber positiv,
+ + = Adhärenz und Zellwachstum sehr gut,
+ + + = Adhärenz und Zellwachstum ausgezeichnet.

Tabelle 1

Aus Tabelle 1 geht hervor, daß mit allen untersuchten Materialien ein sehr gutes (+ +) bzw. ausgezeichnetes (+ + +) Zellwachstum erreicht werden konnte.

Claims

1. Verfahren zum Kultivieren von eukaryotischen Adhäsions- und Suspensions-Zellen mit Ausnahme von Saccharomyces in einem Nährmedium in Gegenwart eines Trägers, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein poröses Zellulose- und Lignin-enthaltendes Material umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Träger- Material Holz, Frucht, Samen, Knolle und/oder einen Teil davon um faßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Träger-Material chemisch modifiziert ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Träger-Material gewaschen und/oder sterilisiert ist.

5. Kultur von auf einem Träger sitzenden eukaryotischen Adhäsions- und Suspensions-Zellen mit Ausnahme von Saccharomyces, wobei der Träger ein poröses Zellulose- und Lignin-enthaltendes Material umfaßt.

6. Verwendung des porösen Zellulose- und Lignin-enthaltenden Materials nach einem der Ansprüche 1-4 als Träger für eukaryotische Adhäsions- und Suspensions-Zellen mit Ausnahme von Saccharomyces in einem Nährmedium.