DE3525411C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft den im Anspruch 1 angegebenen Mikroorganismus der Gattung Torulopsis sowie dessen Verwendung nach Anspruch 2.

Sophorose stellt eine brauchbare Substanz mit der Fähigkeit dar, die Bildung von Cellulase durch Bakterien zu fördern. Die Substanz ist ferner als Rohmaterial für Kosmetika brauchbar. Sophorose wurde erstmals als die Zuckerkomponente des Camphelolglykosids festgestellt, das in den Schalen der Früchte von Sophora japonica L. enthalten ist. Sophorose wird jedoch in der Natur selten in Form eines freien Disaccharids erhalten. Es ist lediglich bekannt, daß Sophorose als ein freies Disaccharid in Gel´e royale enthalten ist.

Andererseits ist bisher nicht bekannt, daß Sophorose durch Bakterien gebildet wird. Lediglich im Verlauf ihrer Untersuchungen der Bildung von Oligo-Sacchariden durch Mikroorganismen, die zur Bakteriengattung Acetobacter gehören, haben Khan et al., die Bildung geringer Mengen Sophorose beobachtet [A. W. Khan et al., Nature, 183, 682 (1959); T. K. Walker et al., Arch. Biochem. Biophys., 83, 161 (1959)].

Es besteht daher ein dringender Wunsch, einen Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Sophorose-Bildung aufzufinden.

Von den Erfindern wurden umfangreiche Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, einen Mikroorganismus zu finden, der die Fähigkeit zur Sophorose-Bildung hat. Dabei wurde festgestellt, daß unter den Mikroorganismen, die zur Gattung der Hefe Torulopsis gehören, ein Mikroorganismus mit einer derartigen Fähigkeit vorhanden ist. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Untersuchungsergebnissen.

Erfindungsgemäß wird ein neuer Mikroorganismus Torulopsis bombicola KSM-36 (FRI-Hinterlegung FERM BP-799) zur Verfügung gestellt, welcher zur Gattung Torulopsis gehört und die Fähigkeit zur Sophorose-Bildung aufweist.

Die einzige Figur stellt eine Elutionskurve dar, in der die Ergebnisse der Säulenchromatographie des Bezugsbeispiels 1 dargestellt sind.

Der erfindungsgemäße Mikroorganismus Torulopsis bombicola KSM-36 hat folgende mycologische Eigenschaften.

(a) Wachstumszustand auf verschiedenen Kulturmedien

Wächst zu elliptischen bis länglich elliptischen Hefen mit einer Größe von (0,75 bis 3,0)×(1,5 bis 5,5) µm auf Malzkulturmedium, Malzagar, Kartoffeldextroseagar und Maismehlagar und man beobachtet keine Bildung von Euhyphen oder Pseudohyphen beim multipolaren Sprossungs-Typ.

(b) Bildung von Ascosporen

Unter Verwendung von Malzextraktagar wird untersucht, ob sich Ascosporen bilden oder nicht. Es wird keine Bildung von Ascosporen beobachtet.

(c) Bildung von Ballistosporen

Bei Kultivierung auf Malzagar beobachtet man keine Bildung von Ballistosporen.

(d) Verschiedene physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumsbedingungen
pH	3 bis 8 (optimaler pH=5 bis 6)
Temperatur	7 bis 38°C (optimale Temperatur=25 bis 34°C
(2) Assimilation von Salzen der Salpetersäure	(-)
(3) Zersetzung von Fett	(+)
(4) Zersetzung von Harnstoff	(-)
(5) Verflüssigung von Gelatine	(-)
(6) Resistenz gegenüber Natriumchlorid	6 bis 8% (Gew./Vol.)
(7) Bildung von Carotenoid	(-)
(8) Bildung organischer Säuren in Casters Kulturmedium	(+)
(9) Bildung von stärkeartigen Substanzen	(-)
(10) Vitaminbedarf	(+)

(e) Assimilierkapazität (AK) und Fermentierkapazität (FK)

(f) Ort der Probennahme

Isoliert aus Kohlblättern in einem Kohlfeld in der Nähe von Musashino-shi, Tokyo.

Aufgrund der obigen mycologischen Eigenschaften wird der KSM-36 Stamm als zur Gattung Torulopsis gehörig bestimmt. Der obige Stamm hat folgende zusätzliche Merkmale. Man beobachtet keine Hautbildung, wenn der obige Stamm in Malzkulturmedium, YM-Kulturmedium bzw. Glucose-Hefeextrakt-Pepton-Kulturmedium kultiviert wird. Der Stamm zeigte ein gutes Wachstum auf YM-Agar-Kulturmedium und die resultierende Kolonie ist derart geformt, daß sie entlang ihrer gesamten peripheren Kante ansteigt und semilinsenförmig aussieht. Seine Oberfläche ist glatt, hat einen schimmernden Glanz, zeigt butterartige Eigenschaften und ist im Farbton cremefarben. Bei der Kultivierung zur Bildung einer Makrokolonie ist die Form der resultierenden Kolonie kreisförmig, ihr Aussehen und die Form sind jedoch ähnlich derjenigen einer auf YM-Agar-Kulturmedium kultivierten Kolonie.

Im Hinblick auf Mikroorganismen mit derartigen mycologischen Eigenschaften wurde eine Recherche durchgeführt auf der Basis von J. Lodder, "The Yeasts", North-Holland Publishing Co., Amsterdam-London, 1971; Kazuo Komagata "Biseibutsu No Kagakubunrui Jikkenho", Gakkai Center, 1982; und Hiroshi Iizuka und Shoji Goto, "Kobo No Bunrui Doteiho", 2. Aufl., Tokyo Daigaku Shuppan Kai, 1977. Dabei wurde Torulopsis bombicola ATCC 22 214 (GBS6009) als ein Stamm ermittelt, der dem Stamm der vorliegenden Erfindung ähnlich ist. Torulopsis bombicola KSM-36 der vorliegenden Erfindung ist jedoch ein Stamm, der aus Kohlblättern isoliert wurde, und zwar mittels eines Isolierungskulturmediums, das n-Alkane als alleiniges Kohlenstoffquellen-Substrat enthält, wohingegen der bekannte Torulopsis bombicola-Hefestamm aus dem Blumenhonig von Wildblumen isoliert wurde (z. B. wilder Mohn in der Provinz Alberta, Kanada), und zwar mittels eines Isolierungskulturmediums, das Glucose in hoher Konzentration als alleiniges Kohlenstoffquellen-Substrat enthält. Torulopsis bombicola KSM-36 der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich auch dadurch von dem bekannten Torulopsis bombicola-Hefestamm, daß letzterer Harnstoff assimiliert, daß mit anderen Worten seine Urease-Aktivität "+" ist, während die Urease-Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Stamm "-" ist. Als deutlichster Unterschied sei ferner erwähnt, daß Torulopsis bombicola KSM-36 eine viel größere Sophorose-Bildungskapazität aufweist als der bekannte Torulopsis bombicola-Hefestamm.

Die Erfinder haben somit den KSM-36-Stamm als eine neue Hefe der Gattung Torulopsis erkannt und ihn als Torulopsis bombicola KSM-36 bezeichnet. Wie bereits oben erwähnt, wurde der neue Stamm bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt.

Um diesen KSM-36-Stamm aus Kohlblättern zu isolieren, wo er seinen Ursprung hat, ist es lediglich erforderlich, nach Routineverfahrensweisen vorzugehen unter Verwendung eines Kulturmediums, das, wie obenerwähnt, ein n-Paraffin als alleinige Kohlenstoffquelle enthält.

Um unter Verwendung des KSM-36-Stamms der vorliegenden Erfindung Sophorose herzustellen, ist es erforderlich, den KSM-36-Stamm in einem Kulturmedium zu kultivieren, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle oder eine organische Nährstoffquelle, anorganische Salze und dergl. enthält, die erforderlich sind, um ein gutes Wachstum des KSM-36-Stamms und eine glatte Bildung von Sophorose zu gewährleisten.

Als Kohlenstoffquellen können beliebige Kohlenstoffquellen eingesetzt werden, wenn sie nur assimiliert werden können. Geeignete Quellen umfassen Kohlenhydrate (z. B. Glucose, Fructose, Saccharose, Sorbit, etc.), organische Säuren (z. B. Citronensäure, Bernsteinsäure, etc.), Kohlenwasserstoffe (z. B. n-Dodecan, n-Hexadecan, etc.), Öle und Fette und deren Derivate (z. B. tierische und pflanzliche Öle, tierische und pflanzliche Fette, Diglyceride, Monoglyceride, Fettsäuren, Fettsäureester, aliphatische Alkohole und deren Ester, etc.), Alkyl (oder Alkenyl)-halogenide und dergl. Als Stickstoffquellen oder organische Nährstoffquellen seien beispielsweise erwähnt; anorganische Stickstoffquellen-Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumnitrat; Aminosäuren, wie Glutaminsäure; organische Stickstoffquellen-Substanzen, wie Hefeextrakte, Fleischextrakte und Pepton, und dergl. Andererseits können verschiedene Phosphorsäuresalze, Magnesiumsulfat und dergl. als anorganische Salze eingesetzt werden. Daneben werden Schwermetallsalze ebenfalls in Spurenmengen verwendet. Ihr Zusatz ist jedoch bei Kulturmedien mit einem Gehalt an natürlichen Substanzen nicht erforderlich. Thiamin und Biotin werden als Vitamine benötigt. Ähnlich wie die Schwermetallsalze ist ihr Zusatz nicht erforderlich bei Kulturmedien, die natürliche Substanzen enthalten. Im Falle von Varianten, die die Verwendung bestimmter Nährstoffe erfordern, müssen den Kulturmedien Substanzen zugesetzt werden, die derartigen Nährstoffanforderungen genügen.

Die Kultivierung des Mikroorganismus kann durchgeführt werden, indem man ein Kulturmedium sterilisiert, und zwar beispielsweise durch Erhitzen oder andere bekannte Maßnahmen. Das Kulturmedium wird beimpft und anschließend geschüttelt oder unter Belüftung gerührt bei 20 bis 35°C während 3 bis 5 Tagen. Hinsichtlich des pH können gute Ergebnisse erzielt werden, falls der anfängliche pH auf 5 bis 6,5 eingestellt ist und anschließend die pH-Einstellung der Kultur überlassen bleibt. Falls man eine Kohlenstoffquelle einsetzt, die kaum in Wasser löslich ist, oder eine ähnliche Kohlenstoffquelle kann es sich als wirksam erweisen, den Kulturmedien ein oder mehrere verschiedene Surfaktantien, wie Polyoxyethylensorbitan, zuzusetzen.

Die auf diese Weise kultivierte Mischung kann so, wie sie ist, als Hefequelle eingesetzt werden. Es ist jedoch auch möglich, den Mikroorganismus aus der kultivierten Mischung abzutrennen unter Verwendung üblicher Fest-Flüssigkeits-Trennverfahren und den resultierenden, lebenden Mikroorganismus oder dessen weiterbehandeltes oder verarbeitetes Produkt (gefriergetrocknete Mikroorganismen oder dergl.) als Hefequelle zur Verfügung zu halten.

Die Isolierung von Sophorose aus der kultivierten Mischung kann, wie weiter unten anhand des Bezugsbeispiels erläutert, durchgeführt werden unter Anwendung von Sammlungs- und Reinigungsverfahren, wie sie für organische Verbindungen im allgemeinen angewendet werden, wobei bestimmte physikalische und chemische Eigenschaften der Sophorose für das Trennverfahren genutzt werden.

Die kultivierte Mischung kann beispielsweise einer Zentrifugation, Filtration, Phasentrennung oder dergl. unterworfen werden, um eine Kulturflüssigkeit zu gewinnen. Nach Entfernung der Verunreinigungen aus der Kulturflüssigkeit, z. B. durch Extraktionstechniken oder durch Ionenaustausch, wird Sophorose durch Säulenchromatographie isoliert und gereinigt, wobei man eine Aktivkohlesäule oder dergl. verwendet oder indem man eine ähnliche, an sich bekannte Technik anwendet.

Torulopsis bombicola KSM-36 gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt Sophorose. Das wird weiter unten anhand von Bezugsbeispielen erläutert.

Wie bereits oben erwähnt, gibt es bisher nur einen einzigen Bericht über die Sophorose-Bildungskapazität von Mikroorganismen. Dieser Bericht beschreibt darüber hinaus lediglich die Bildung von Sophorose in sehr geringen Mengen. Demgegenüber hat der erfindungsgemäße Stamm Torulopsis bombicola KSM-36 eine äußerst große Fähigkeit zur Sophorose-Bildung.

Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels erläutert sowie des Bezugsbeispiels.

Beispiel 1

(i) 10 g Kohlblätter, die aus einem Kohlfeld in der Nähe von Musashino-shi, Tokyo, stammen, werden in einen Becher placiert, der 30 ml sterilisiertes Wasser enthält. Die Kohlblätter werden 10 min mit einem Magnetrührer dispergiert und suspendiert. Anschließend läßt man die resultierende Mischung stehen. 10 ml der überstehenden Flüssigkeit werden gesammelt und zur Beimpfung von 100 ml eines Isolierungs-Kulturmediums verwendet, das die unten angegebene Zusammensetzung aufweist und in einer 500 ml Flasche (Sakaguchi flask) enthalten ist. Der Inhalt wird geschüttelt und 7 Tage bei 30°C und 120 Schüttelbewegungen/min kultiviert. Dieses Verfahren wird wiederholt, um vier Anreicherungskulturoperationen durchzuführen.

Zusammensetzung des Trennflüssigkeit-Kulturmediums
n-Hexadecan|100 ml
Ammoniumnitrat	25 g
Kaliumdihydrogenphosphat	10 g
Magnesiumsulfat-heptahydrat	5,0 g
Kaliumchlorid	5,0 g
Hefeextrakt	1,0 g
Leitungswasser	1000 ml (pH 4,5)

(ii) Anschließend werden 0,5 ml der kultivierten Flüssigkeitsmischung aus dem flüssigen Anreicherungs-Kulturmedium in jeder Stufe entnommen. Unter Verwendung eines Conradi-Stabes wird die Probe auf die Oberfläche eines Trenn-Agarkulturmediums einförmig aufgebracht, das auf die unten angegebene Weise hergestellt wurde. Dann wird das Kulturmedium mit einem Filterpapier, das mit n-Hexadecan imprägniert ist, bedeckt, mit einem Cellophanklebeband verschlossen und bei 30°C kultiviert.

Herstellung des Trenn-Agarkulturmediums

Zu dem oben beschriebenen, flüssigen Kulturmedium für die Trennung, bei dem das n-Hexadecan weggelassen wurde, gibt man Agar in einer Menge von 2,5 Gew.-%, bezogen auf das flüssige Kulturmedium. Anschließend wird das resultierende Gemisch mit Dampf sterilisiert. Das sterilisierte Gemisch wird in gleichen Portionen in sterilisierte Petrischalen unter Erhitzen eingefüllt, und man erhält auf diese Weise Platten-Agar-Kulturmedien.

(iii) Anschließend wird ein Pt-Spatel einer in der obigen Kultur gewachsenen Kolonie auf das 100fache mit sterilisiertem Wasser verdünnt. Daraufhin wird 0,1 ml der verdünnten Lösung wiederum auf ein Agar-Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie das oben erwähnte Trenn-Kulturmedium aufgebracht. Das Agar-Kulturmedium wird ebenfalls mit einem n-Hexan-imprägnierten Filterpapier abgedeckt und das Kulturmedium 3 Tage bei 30°C unter Zuführung von n-Hexadecan kultiviert. Durch visuelle und mikroskopische Beobachtung wird festgestellt, daß die resultierende Vielzahl der Kolonien untereinander keine Unterschiede aufweist. Zehn der oben beschriebenen Kolonien werden anschließend auf ein geneigtes Agar-Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie das Trenn-Agar-Kulturmedium okuliert. Unter Zuführung von n-Hexadecan aus einem n-Hexadecan-imprägnierten Filterpapier wird das Kulturmedium 3 Tage bei 30°C kultiviert. Wiederum wird durch visuelle und mikroskopische Beobachtung festgestellt, daß die Mikroorganismen auf den 10 geneigten Kulturmedien alle von der gleichen Art sind. Es wurde auch festgestellt, daß die mycologischen Eigenschaften und die physiologischen Eigenschaften dieser zehn Mikroorganismen auf ihren jeweiligen Kulturmedien identisch sind. Die mycologischen Eigenschaften und die physiologischen Eigenschaften der Mikroorganismen auf dem jeweiligen Kulturmedium sind die gleichen wie oben erwähnt.

Durch diese oben beschriebenen Tests wird im Ergebnis festgestellt, daß die auf den zehn Kulturmedien kultivierten Mikroorganismen alle dem gleichen Stamm angehören, der aus der Natur isoliert wurde.

(iv) Anschließend wird ein Pt-Spatel des Mikroorganismus, der gemäß dem obigen Verfahren auf dem geneigten Kulturmedium rein kultiviert worden war, in einer sterilisierten 10%igen wäßrigen Lösung von Glycerin (2 ml) suspendiert, die in einer Gefrier- und Lagerampulle enthalten ist. Das Ganze wird gefroren und bei -80°C gelagert. Nach 3monatiger Lagerung im gefrorenen Zustand wird rasch aufgetaut. Ein Pt-Spatel der auf diese Weise erhaltenen Suspension wird der Anabiosis auf einem gewöhnlichen Agar-Kulturmedium unterworfen. Anschließend werden die mycologischen Eigenschaften und die physiologischen Eigenschaften auf den jeweiligen Kulturmedien unter den gleichen Bedingungen untersucht, wie sie oben beschrieben wurden. Man findet als Ergebnis keine Änderungen im Vergleich zu den korrespondierenden Eigenschaften vor dem Einfrieren.

Das obige Einfrier- und Auftauverfahren wird in jedem Monat insgesamt fünfmal wiederholt. Die mycologischen Eigenschaften und physiologischen Eigenschaften der resultierenden Mikroorganismen auf ihren jeweiligen Kulturmedien wurden untersucht, ohne daß irgendwelche Änderungen festgestellt wurden.

Bezugsbeispiel 1

(i) In einen 5-l-Kultur-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 500 ml eines sterilisierten Saatkulturmediums (pH 6,2) mit einem Gehalt an 5% (Gew./Vol.) (im folgenden durch w/v % ausgedrückt) Glucose und 2 w/v % Maisquellwasser, okuliert man 50 ml einer flüssigen Kulturmischung von Torulopsis bombicola KSM-36. Die flüssige Mischung wurde erhalten durch Kultivierung des gleichen Stammes bei 30°C während 48 h in einer 500-ml-Sakaguchi-Flasche, die ein Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie das in dem Erlenmeyerkolben enthaltende enthält. Das Saatkulturmedium wird durch 48stündiges Schütteln bei 30°C kultiviert. 300 ml des erhaltenen, flüssigen Gemisches werden dann zur Beimpfung eines 30 l Flaschenfermentors verwendet, der 15 l eines Hauptkulturmediums (pH 5,6) enthält. Dieses enthält 15 w/v% Palmöl, 10 w/v% Glucose und 0,5 w/v% Hefeextrakt. Während 5 Tagen wird unter folgenden Bedingungen die Kultivierung durchgeführt:
Temperatur 30°C; Belüftung 0,5 VVM; Innendruck 0,75 kg/cm²; Rühren 350 U/min.

(ii) Etwa 15 l des so kultivierten, flüssigen Gemisches werden in ein Phasentrennrohr gefüllt, das einen Innendurchmesser von 15 cm und eine Länge von 100 cm aufweist. Das Rohr ist an seinem freien Ende konisch und mit einem Heizmantel ausgerüstet. Während das flüssige Gemisch durch Einsprudeln von Luft aus einem unteren Teil des Rohrs gerührt wird, erhitzt man das flüssige Gemisch 30 min bei etwa 70°C und stoppt dann die Belüftung. Das kultivierte, flüssige Gemisch wird dann 30 min stehengelassen, damit eine Sedimentation stattfindet. Das kultivierte, flüssige Gemisch trennt sich in vier Phasen. Die unterste Sedimentationsphase und eine Mikroorganismus-Phase, die über der untersten Phase liegt, werden durch eine untere Auslaßöffnung vorsichtig abgelassen. Anschließend wird eine Wasserschicht, bei der es sich um die nächst obere Phase handelt (d. h. die zweite Phase von oben nach der Phasentrennung) sorgfältig gesammelt.

(iii) 1 l der auf diese Weise aufgefangenen Wasserphase wird abgetrennt und nachfolgend einer Extraktion mit 500 ml einer 2 : 1 Lösungsmittelmischung aus Chloroform und Methanol unterworfen. Auf diese Weise werden Materialien, die in dem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol löslich sind, aus der Wasserphase entfernt. Nach der Extraktionsbehandlung wird die resultierende Wasserphase 30 min bei 5°C und 3500 U/min zentrifugiert, wobei man eine überstehende Flüssigkeit erhält. Unter Verwendung eines Rotationsverdampfers wird diese überstehende Flüssigkeit auf einem Ölbad bei 35°C erhitzt. Das Ethanolgemisch und ähnliche Komponenten werden abdestilliert und gleichzeitig wird unter verringertem Druck das Ganze konzentriert. Zur Entfernung ionischer Materialien aus den etwa 50 ml des auf diese Weise erhaltenen, flüssigen Konzentrats werden sowohl Kationenaustauscherharz als auch Anionenaustauscherharz zu dem flüssigen Konzentrat zugegeben. Nach 2stündigem Rühren der Mischung werden die Ionenaustauscherharze gewaschen und entfernt.

(iv) Anschließend gibt man 320 ml der auf diese Weise entsalzten Wasserschicht vollständig auf eine Aktivkohlesäule. Als Aktivkohlesäule wird eine solche verwendet, die durch Packen von 180 ml Aktivkohle in eine Glassäule mit einem Innendurchmesser von 2,5 cm und einer Länge von 60 cm erhalten wurde. Man läßt 1000 ml einer wäßrigen 4N HCl-Lösung durch die auf diese Weise gepackte Glassäule fließen. Anschließend läßt man 4000 ml destilliertes Wasser durch die Glassäule fließen. Das Isolierungsverfahren unter Verwendung der Aktivkohlesäule wird vervollständigt unter Bewirkung einer schrittweisen Eluierung. Dabei wird, genauer gesagt, zunächst 1000 ml destilliertes Wasser und anschließend 2500 ml einer 5%igen wäßrigen Lösung von Ethanol, 1000 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung von Ethanol und 1000 ml einer 20%igen wäßrigen Lösung von Ethanol in dieser Reihenfolge als Eluierungsmittel verwendet. Schließlich läßt man 1000 ml einer 50%igen wäßrigen Lösung von Ethanol durch die Säule strömen. Die Eluate werden gesondert aufgefangen, und zwar mit 100 g/Fraktion unter Verwendung eines großen Fraktionssammlers. Die gesonderten Fraktionen werden jeweils durch Dünnschichtchromatographie, Gaschromatographie, Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und dergl. analysiert. Man stellt fest, daß das in den Fraktionen Nr. 11 bis 40 abgetrennte Material Sophorose ist (vergl. die beigefügte Figur). Unter den obigen Fermentationsbedingungen erhält man Sophorose in einer Menge von etwa 30 g/l der flüssigen Fermentationsmischung. Es wird ferner festgestellt, daß die Fraktionen Nr. 1 bis 10 Mannit enthalten. Mannit wird in einer Menge von etwa 12 g/l flüssiger Fermentationsmischung erhalten.

Claims (2)

1. Torulopsis bombicola KSM-36 (FRI-Hinterlegung FERM BP-799) mit folgenden mycologischen Eigenschaften:

• (a) Wuchszustand auf verschiedenen Kulturmedien:
  wächst zu elliptischen bis länglich elliptischen Hefen mit einer Größe von (0,75 bis 3,0)×(1,5 bis 5,5) µm auf Malzkulturmedium, Malz-Agar, Kartoffeldextrose-Agar und Maismehl-Agar, und es wird keine Bildung von Euhyphae oder Pseudohyphae beobachtet bei dem multipolaren Sprossungstyp;
• (b) Bildung von Ascosporen:
  unter Verwendung von Malzextrakt-Agar wird keine Bildung von Ascosporen beobachtet;
• (c) Bildung von Ballistosporen:
  bei Kultivierung auf Malz-Agar wird keine Bildung von Ballistosporen beobachtet;
• (d) verschiedene physiologische Eigenschaften: (1) Wachstumsbedingungen pH 3 bis 8 (optimaler pH=5 bis 6) Temperatur 7 bis 38°C (optimale Temperatur 25 bis 34°C (2) Assimilation von Salzen der Salpetersäure (-) (3) Zersetzung von Fett (+) (4) Zersetzung von Harnstoff (-) (5) Verflüssigung von Gelatine (-) (6) Resistenz gegenüber Natriumchlorid 6 bis 8% (w/v) (7) Bildung von Carotenoid (-) (8) Bildung organischer Säuren in Casters Kulturmedium (+) (9) Bildung von stärkeartigen Substanzen (-) (10) Vitaminbedarf (+) (e) Assimilierkapazität (AK) und Fermentierkapazität (FK)

2. Verwendung des Mikroorganismus nach Anspruch 1, zur Herstellung von Sophorose unter Kultivierung des Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium.