WO1999028742A1 - Verfahren und vorrichtung zum aufschluss biologischer zellen zur extraktion und analyse der zellinhalte - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum aufschluss biologischer zellen zur extraktion und analyse der zellinhalte Download PDF

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WO1999028742A1
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cell
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biological cells
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Achim GÜTH
Uwe Vohrer
Jürgen Bernhagen
Bentsian Elkine
Günter Tovar
Rüdiger KÖLBLIN
Andreas SCHÜLE
Frank Vitzthum
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/44—Sample treatment involving radiation, e.g. heat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for disrupting biological cells for extracting and analyzing their cell contents, in particular the nucleic acids.
  • the cell walls and membranes For the investigation of biological cells and in particular the analysis of the cell contents, in particular proteins and nucleic acids (DNA and RNA), for example for the purposes of medical diagnosis, the cell walls and membranes must be disrupted in order to be able to extract the cell interior from the cells in a suitable form.
  • DNA and RNA proteins and nucleic acids
  • Ultrasonic digestion methods are also known, in which the cell walls and membranes are literally torn open by cavitation effects, so that the cell interior can reach the outside.
  • ultrasound digestion however, a considerable sound power is dissipated in the sample to be examined, as a result of which the sample is heated unnecessarily. Cooling precautions are therefore necessary. Due to the occurring temperature fluctuations, however, a somewhat precise process control is difficult.
  • the known apparatuses for using high-performance ultrasound are difficult to clean, which means that the risk of cross-contamination cannot be ruled out.
  • the digestion of biological cells by chemical means only requires chemicals that are individually adapted to the cells, which means that when examining unknown cell types, as is the case, for example, when diagnosing unknown pathogens, there is a difficulty in choosing the right chemical in each case.
  • An example of a cell disruption method using purely chemical digestion reactions is described in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 1.25-1.31.
  • the reaction times required for the disruption of cells with the exclusive use of chemicals are several hours despite the high concentrations of them used chemicals, which can also have disruptive effects in subsequent analysis steps, such as PCR reactions.
  • the digestion rate is also insufficient for some microorganisms; For example, it is extremely difficult to achieve a rate higher than 20% by chemical means in Micrococcus luteus.
  • biological cells such as bacteria or fungi, suspended in liquid media are exposed to a strong electric field.
  • biological cells are killed by means of pasteurization and sterilization by means of electrical fields, as is described, for example, in US Pat. No. 5,235,905.
  • pulsed electric fields are applied to the sample, each with pulse durations of a few microseconds. Since a biological cell is electrically viewed from an electrolytic and therefore electrically conductive content, which is enclosed by an electrically insulating membrane, the electrical charge carriers move inside when an electric field is applied from the outside.
  • the asymmetrical or directional transport of various substances through the cell wall is one of the most important functions of the cell membrane.
  • the cell membrane has an asymmetrical structure, on the other hand, the cell content differs significantly from the external environment of the cell.
  • the size of the transported molecules is often comparable to the cell size itself, which is one of the reasons why the different transport mechanisms on which the inward and outward transfer are based cannot be described by simple diffusion models - even though simple diffusion is not a purely symmetrical process.
  • the transport mechanisms are complicated, involve several steps and are very specific for the respective transport direction.
  • the invention is based on the object of developing a method for disrupting biological cells for extracting and analyzing the cell contents in such a way that the method can run fully automatically and without great expenditure on apparatus and technology.
  • the extracted portion of the cell contents to be analyzed should be high regardless of the cell type, the process time for extraction and isolation of the cell contents being significantly reduced.
  • a device can be specified with which an inexpensive, quick and safe implementation of the method is possible.
  • the method for disrupting biological cells for extracting and analyzing the cell contents is characterized in that the cells are exposed to an electric field and in that the cells are brought into contact with a substance which supports cell disruption before or after the application of the electric field .
  • the biological cells which are usually suspended in a liquid medium, are exposed to a pulsed electrical field with typical field strengths between 5 and 100 kV / cm and a pulse length of approximately 0.5 to 50 microseconds.
  • the cells can also be present in cell assemblies, such as pieces of tissue, or can be immobilized on a carrier, for example on a filter.
  • chemicals which act on the cell content and in particular on the molecules to be analyzed in such a way that they are lighter and to be released quickly. These chemicals diffuse into the interior of the cell through the pores created by electrical treatment, and break down proteins, for example, and specifically cut DNA molecules into smaller fragments, which are, however, suitable for subsequent DNA analysis. The resulting DNA fragments can then diffuse freely through the pores.
  • a surface-active substance such as sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • Another variant takes advantage of the fact that the pores created by electrical treatment represent weak points which considerably facilitate and accelerate the attack of the chemicals on the membrane.
  • Chemicals that can be used to completely degrade the cell walls include chaotropic reagents such as urea, guanidinium hydrochloride or thiocyanate and others. Dimethyl sulfoxide can also be used.
  • the addition of the additional chemical substance does not require an excessively high concentration, as a result of which negative effects due to the presence of the chemical substance can be ruled out in subsequent analysis steps.
  • the cells brought into contact with the chemicals are brought to a temperature level between 35 and 100 ° C.
  • a device In order to carry out the method, a device according to the invention is designed in such a way that a sample volume that holds the cells or cell clusters suspended in a medium is provided with two flat electrodes that lie opposite one another and that is formed by a cover element whose side facing the sample volume is convex the top of the sample volume is lockable.
  • the convex lid element can advantageously avoid the fact that when the liquid medium is enclosed within the sample volume, no air bubbles are trapped, which lead to the uneven distribution of the electric field and therefore possibly lead to undesired electrical breakdowns in the treatment device.
  • Fig. 3 alternative embodiment with metallic separating film within the sample volume
  • Fig. 4 alternative embodiment with friction elements for tissue reduction.
  • FIG. 1 an advantageous device for performing the method for disrupting biological cells is shown, which shows a treatment cell, which has a plastic housing 2, in which a lower electrode 3 is cast and provides an upper electrode 4, which also represents the cover element.
  • the biological cells to be disrupted suspended in a solution are located in the sample volume 1 between the electrodes.
  • the cells can be immobilized on a carrier, for example a filter, the remaining volume of the device being filled with an electrolyte solution.
  • the convexly curved surface of the cover element 4 ensures that no air bubbles are trapped in the sample volume 1 when the cover element is placed on it.
  • the excess of the suspension 5 which is displaced by the cover element 1 when the cover element is placed on the sample volume 1 collects in a recess 6 provided circularly around the cover element 4 of the plastic housing 2.
  • the lower electrode 3 opposite the cover element 4, however, is concave, so that the distance between the two electrodes is chosen to be constant.
  • the design of the electrode shape facilitates the filling of a liquid into the sample volume 1 without air bubbles and a largely complete sampling after the cell disruption process has been carried out.
  • the lower electrode 3 has a plug 7 and the upper electrode 4 has a recess 8.
  • the electrode distance preferably set in the exemplary embodiment is 2 to 5 mm, the electrode diameter is approximately 1 cm. With these dimensions and a relatively easy-to-handle voltage of approx. 20 kV, the strength of the electric field is between 40 and 100 kV / cm, a field strength that is quite suitable for cell disruption.
  • the electrode surfaces can preferably be made of aluminum, since this material is biologically inert and chemically sufficiently stable. In addition, it is easy to process and cheap, and is therefore particularly suitable for single-use items.
  • the chemical treatment in the same volume can be continued by adding the chemicals, or alternatively the cell suspension can be pipetted into another vessel.
  • the embodiment shown in FIG. 1 may be cumbersome due to the constructive design of the cover element for taking a sample, since the cover element has to be removed before emptying the sample volume 1, on which a substantial part of the solution can get caught as drops. This, in turn, could lead to contamination of the environment and thus to cross-contamination of further samples, which must be avoided, however, particularly when such samples are handled automatically.
  • the device according to the exemplary embodiment in FIG. 2 provides a two-part design of the cover element 4.
  • the cover element 4 has a central bore 9 and is covered with an electrically conductive film 10, which preferably covers the cover element 4 and is made of aluminum.
  • a pipette is inserted through the channel 9 and pierces the film 10 so that the suspension contained in the sample volume 1 can be sucked off.
  • the film must be replaced every time, but this appears advantageous, especially since the entire treatment cell can be designed as a disposable article in order to avoid cross-contamination.
  • FIG. 3 shows a further exemplary embodiment which has a cover element 4 comparable to the embodiment according to FIG. 1.
  • this embodiment provides a metal foil 11 which separates the sample volume 1 and which also represents the lower electrode.
  • the treatment cell is filled with a suspension of biological cells and high-voltage treatment with chemical additives for cell disruption is carried out.
  • the cavity 12 is evacuated through the channel 7.
  • the film 11 tears open, so that the treated suspension can be sucked off through the channel 7 for further analysis.
  • This variant is particularly suitable for a fully automated process implementation in which the risk of cross-contamination can be completely excluded.
  • the chemicals can be the solution be added before the electrical field application; however, since in many cases they are electrolytes or act optimally in electrolytic buffers, they should only be added to the cell suspension after the electrical field application has been completed.
  • a mixture of 15 different restriction endonucleases (3 U / ml each) is added to the cell suspension and incubated at 37 ° C. for about 10 to 30 minutes.
  • the reagents diffuse into the interior of the cell through the membrane pores created during the electrical field application and deliberately cut the DNA strands into pieces with a few thousand base pairs, which can later be used for the PCR reaction.
  • proteinase K is added to the suspension in a concentration of 1 ⁇ g / ml, and the temperature level is adjusted to 60 ° C. Proteinase K also diffuses through the pores and causes the lysis of both cell proteins and the enzymes added in the previous step, so that disruptive influences on the subsequent PCR reactions are excluded.
  • guanidinium hydrochloride or thiocyanate (GdnHCI or GdnSCN) is added to the cell suspension after completion of the electrical field application, so that a 0.3 to 3 M concentration is set.
  • the suspension is brought to a temperature of 60 to 100 ° C. and incubated for 10 to 30 minutes. This destroys the cell walls and membranes, releasing the DNA.
  • This method is simpler than the one described above, but has the disadvantage that guanidinium compounds, which are used in a lower concentration than otherwise for purely chemical cell disruption, can inhibit the subsequent PCR reaction and therefore have to be removed from the solution.
  • surface roughnesses are provided on the upper sides of the electrodes 13 and 3, by means of which tissue pieces 16 introduced into the sample volume 1 can be comminuted.
  • the upper electrode 13 and the housing 2 are designed according to the embodiment of Figure 4 such that the electrode 13 is axially and rotationally guided.
  • the remaining volume of the sample volume 1 is filled with a liquid 17 and the tissue sample 16 is pressed between the electrodes by pressure on the upper electrode 13.
  • the liquid is only necessary to rule out electrical discharges between the electrodes, since the sample itself contacts the electrodes directly.
  • the liquid introduced between the electrodes is therefore not necessarily electrically conductive, so that pure water or oil can be used.
  • the tissue sample 16 is crushed by applying a strong pressure to the upper electrode 13, possibly combined with rotational movements.
  • the upper electrode 13 and the housing 2 with the lower electrode 3 thus play the role of a stamp and a die.
  • the electrode surfaces preferably have a rough profile 17 in order to make the disintegration of the tissue more efficient.
  • Treatment room filled with the biological material to be treated in the appropriate medium (electrolyte solution)
  • Housing / capsule Lower electrode cover Medium excess Well / groove for it Plug Hole for electrode connection Channel in the cover
  • Metal foil on the cover Lower electrode made of metal foil Cavity

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Aufschluss biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte, insbesondere Nukleinsäuren. Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass die Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt werden und dass vor oder nach dem Anlegen des elektrischen Feldes die Zellen mit Substanzen in Kontakt gebracht werden, die den Zellaufschluss unterstützen.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und
Analyse der Zellinhalte
B es c h re i b u n g
Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Aufschluß von biologischen Zellen zur Extraktion und Analyse ihrer Zeilinhalte, insbesondere der Nukleinsäuren.
Für die Untersuchung biologischer Zellen und insbesondere der Analyse der Zellinhalte, insbesondere Proteine und Nukleinsäuren (DNA und RNA), beispielweise zu Zwecken medizinischer Diagnostik, müssen die Zellwände und Membranen aufgeschlossen werden, um das Zellinnere in einer geeigneten Form aus den Zellen extrahieren zu können.
Stand der Technik
Hierzu sind eine Reihe bekannter Verfahren geeignet, die in dem Beitrag von Carl A. Schnaitman, "Cell Fractionation" in Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Mikrobiology, Washington, DC 20006, 1981 , Chapter 5, Seite 52-61 , in einer Übersichtsdarstellung beschrieben sind. Die in diesem Beitrag beschriebenen Methoden lassen sich in unterschiedliche Gruppen einteilen, die sich nach ihrer Art der Zellwandzerstörung bzw. -auflösung unterscheiden:
Mechanische Verfahren beruhen auf der Erzeugung lokaler Druckschwankungen am Ort der aufzuschließenden Zellen, wodurch Zellwände und Membranen regelrecht aufgebrochen werden. Aufgrund der für die Zellwandzerstörung notwendigen starken Druckschwankungen bedarf es jedoch entsprechend stabil ausgebildeter Vorrichtungen, wie sie beispielsweise in dem Artikel von J.R. Raper und E.A. Hyatt, "Modified Press For Disruption Of Microorganisms", J. of Bacteriology, V. 85, S. 712- 713, beschrieben sind. Weitere Vorrichtungen zur Erzeugung derartig großer Druckoder Scherkräfte sind sogenannte Kugelmühlen oder die sogenannte French press, die in "Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology", American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1986 in Kapitel 9.3.6. auf Seiten 103-104 dargestellt sind.
Die vorstehend genannten Vorrichtungen bedürfen neben einen sehr großen technischen und mechanischen Aufwand, der betrieben werden muß, um derartig große Druckkräfte zu erzeugen und sicher zu beherrschen, viel Platz und lassen sich überdies schwer automatisieren. Ein weiterer Nachteil der bekannten Druckbehandlung biologischer Zellen besteht überdies auch darin, daß die Zellinhalte, hierbei sind insbesondere die langkettigen DNA-Moleküle gemeint, stark fragmentiert werden, so daß eine vollständige DNA-Analyse erschwert ist.
Auch sind Ultraschall-Aufschlußmethoden bekannt, bei denen die Zellwände und Membranen durch Kavitationseffekte regelrecht aufgerissen wird, so daß das Zellinnere nach außen gelangen kann. Beim Ultraschallaufschluß wird jedoch eine erhebliche Schall-Leistung in der zu untersuchenden Probe dissipiert, wodurch die Probe unnötigerweise erwärmt wird. Kühlvorkehrungen sind daher nötig. Durch die auftretenden Temperaturschwankungen ist jedoch eine einigermaßen genaue Prozeßführung erschwert. Überdies sind die bekannten Apparaturen zur Anwendung des Hochleistungsultraschalls schwierig zu reinigen, wodurch die Gefahr der Querkontamination nicht ausgeschlossen werden kann.
Der Aufschluß von biologischen Zellen auf ausschließlich chemischem Wege bedarf individuell auf die Zellen angepaßten Chemikalien, wodurch bei der Untersuchung unbekannter Zelltypen, wie es beispielsweise bei der Diagnose unbekannter Krankheitserreger der Fall ist, die Schwierigkeit der Wahl der jeweils richtigen Chemikalie besteht. Ein Beispiel für ein Zellaufschlußverfahren unter ausschließlicher Verwendung rein chemisch ablaufender Aufschlußreaktionen ist in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 1.25-1.31 beschrieben. Die für den Aufschluß von Zellen erforderlichen Reaktionszeiten bei ausschließlicher Verwendung von Chemikalien betragen mehrere Stunden trotz hohen Konzentrationen der dabei verwendeten Chemikalien, die zudem bei anschließenden Analyseschritten, wie beispielsweise PCR-Reaktionen, störende Einflüsse haben können. Auch ist die Aufschlußrate bei einigen Mikroorganismen nicht ausreichend; es ist beispielweise extrem schwierig bei Micrococcus luteus auf dem chemischen Wege eine Rate höher als 20% zu erreichen.
Schließlich sind Verfahren bekannt, bei denen in flüssigen Medien suspendierte biologische Zellen, wie beispielsweise Bakterien oder Pilze, einem starken elektrischen Feld ausgesetzt werden. So werden mittels elektrischer Felder biologische Zellen im Wege der Pasteurisierung und Sterilisation abgetötet, wie es beispielsweise in der Druckschrift US 5 235 905 beschrieben ist. Hierbei wird, um einen zu großen Energieeintrag in die Probe und dessen Überhitzung zu vermeiden, die Probe mit gepulsten elektrischen Feldern beaufschlagt mit jeweils Impulsdauern von einigen Mikrosekunden. Da eine biologische Zelle elektrisch betrachtet aus einem elektrolytischen und deshalb elektrisch leitenden Inhalt besteht, der von einer elektrisch isolierenden Membran umschlossen ist, verschieben sich die elektrischen Ladungsträger im Inneren beim Anlegen eines elektrischen Feldes von außen. Auf diese Weise entstehen lokale Potentiaidifferenzen zwischen dem Zellinneren und Zelläußeren, die dazu führen, daß die Zellmembran einen elektrischen Durchbruch erfährt, wodurch sie ihre semipermeablen Eigenschaften verliert und an elektrischer Leitfähigkeit zunimmt. Bei geringen äußeren Feldstärken sowie kurzen Impulsdauern ist die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit der Zellmembran reversibel, eine Erscheinung, die bei der Elektroporation (siehe hierzu E. Neumann, A.E. Sowers, CA. Jordan, "Electroporation and Electrofusion in Cell Biology", Plenum Press, New York, 1989) eine zentrale Rolle spielt. Die wird beispielweise benutzt, um genetisches Material in die Zellen zu bringen. Nachteilig bei dieser Anwendung der Elektroporation ist, daß typischeweise die Effizienz im Bereich von 0,01% liegt, d.h. nur in eine Zelle aus 10000 das Material auch tatsächlich hineingebracht wird.
Bei stärkeren Feldern und ausreichender Impulsdauer, insbesondere bei einer wiederholten Behandlung der biologischen Zellen, sind diese Änderungen permanent und führen letztendlich zum Zelltod. Diese Vorgehensweise wird standardmäßig zur Abtötung von Mikroorganismen in Lebensmitteln eingesetzt. In der DE 35 37 261 A1 ist ein Verfahren zum feldinduzierten Einschleusen von Makromolekülen in lebenden Zellen beschrieben, das einen zum gezielten Ausschleusen von Zellinhalte reziproken Vorgang darstellt und somit anderen Prozeßbedingen unterworfen ist. So können das Ein- und Ausschleusen von Teilchen in Zellen nicht als äquivalente Vorgänge angesehen werden, zumal die Natur des Transportes asymetrisch ist.
Der asymmetrische bzw. gerichtete Transport von verschiedenen Stoffen durch die Zellwand gehört vielmehr zu den wichtigsten Funktionen der Zellmembran. So weist zum einen die Zellmembran einen asymmetrischen Aufbau auf, zum anderen unterscheidet sich der Zellinhalt wesentlich von der äußeren Umgebung der Zelle. Die Größe der transportierten Molekülen ist oftmals mit der Zellgröße selbst vergleichbar, wodurch nicht zuletzt auch dadurch die unterschiedlichen Transportmechanismen, die dem Ein- und Ausschleusen zugrunde liegen, nicht durch einfache Diffusionsmodelle beschrieben werden können - wobei auch die einfache Diffusion kein rein symmetrischer Prozeß ist. Die Transportmechanismen sind kompliziert, beinhalten mehrere Schritte und sind für die jeweilige Transportrichtung sehr spezifisch.
Gleiches gilt auch für das aus der JP 04173093 A hervorgehende Transformationsverfahren von Bacillus stearothermophilus mit einem Plasmid.
Allen bekannten Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen haftet neben dem zum Teil sehr großen apparativen und technischen Aufwand der Nachteil an, daß die Verfahren nicht vollautomatisch durchzuführen sind. Zudem kommt, daß die Zellaufschlußrate nicht immer ausreichend groß ist.
Darstellung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte derart weiterzubilden, daß das Verfahren vollautomatisch und ohne großen apparativen und technischen Aufwand ablaufen kann. Insbesondere soll der extrahierte Anteil der zu analysierenden Zellinhalte unabhängig vom Zelltyp hoch sein, wobei die Verfahrenszeitdauer zur Extraktion und Isolation der Zellinhalte deutlich reduziert werden soll. Überdies soll eine Vorrichtung angegeben werden, mit der eine kostengünstige, schnelle und sichere Durchführung des Verfahrens möglich ist.
Erfindungsgemäß ist erkannt worden, daß die Nachteile, die bei den bekannten Verfahren des ausschließlichen chemischen Aufschlußes von biologischen Zellen auftreten, durch eine gezielte Abfolge bzw. Überlagerung von elektrischer und chemischer Behandlung von biologischen Zellen vermieden werden können.
Erfindungsgemäß zeichnet sich das Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte dadurch aus, daß die Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt werden und daß die Zellen vor oder nach dem Anlegen des elektrischen Feldes mit einer Substanz in Kontakt gebracht werden, die den Zellaufschluß unterstützt.
Die für gewöhnlich in einem flüssigen Medium suspendierten biologischen Zellen werden einem gepulst betriebenen elektrischen Feld mit typischen Feldstärken zwischen 5 und 100 kV/cm und einer Pulslänge von ca. 0,5 bis 50 Mikrosekunden ausgesetzt. Ebenso können die Zellen auch in Zellverbänden, wie etwa Gewebestücken vorliegen oder auf einem Träger immobilisiert aufgebracht sein, bspw. auf einem Filter.
Durch die Einwirkung des elektrischen Feldes und den elektrischen Durchbruch entstehen in den Lypidschichten, aus den die Zeilmembran besteht, Poren. Da sie aber sehr klein sind, und da bei bestimmten Zelltypen neben der Zellmembran auch die Zellwand die Diffusion von großen Molekülen wie beispielweise Nukleinsäure hindern kann, reicht die Behandlung der Zellen mit elektrischem Feld alleine für die Freisetzung der Zellinhalte in vielen Fällen nicht aus.
Es wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, das Entstehen der Poren in der Zellmembran auszunutzen, um die Wirkung von Chemikalien zum Zellaufschluß zu unterstützen und zu beschleunigen.
In einer Variante werden Chemikalien verwendet, die auf den Zellinhalt und insbesondere auf die zu analysierende Moleküle so einwirken, daß sie leichter und schnelle freigesetzt werden. Diese Chemikalien diffundieren durch die durch elektrische Behandlung entstandene Poren in das Zellinnere, und bauen beispielweise Proteine ab und schneiden gezielt DNA-Moleküle in kleinere Fragmente, die aber für nachfolgende DNA-Analyse geeignet sind. Die entstandene DNA-Fragmente können dann ungehindert durch die Poren nach außen diffundieren. Diese Prozesse werden durch Zugabe einer oberflächenaktiven Substanz (Detergenz), wie beispielweise Natriumdodecylsulfat (SDS), unterstützt.
In einer anderen Variante wird die Tatsache ausgenutzt, daß die durch elektrische Behandlung entstandene Poren schwache Stellen darstellen, die den Angriff der Chemikalien auf die Membran wesentlich erleichtern und beschleunigen. Chemikalien, die zum vollständigen Abbau der Zellwände eingesetzt werden können, sind beispielweise chaotrope Reagenzien wie Harnstoff, Guanidiniumhydrochlorid oder -thiocyanat und andere. Es kann auch Dimethylsulfoxid eingesetzt werden.
Da die in einem Medium suspendierten biologischen Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt sind, bedarf es bei der Beimengung der zusätzlich chemischen Substanz keiner allzu hohen Konzentration, wodurch negative Auswirkungen, bedingt durch die Gegenwart der chemischen Substanz, bei nachfolgenden Analyseschritten ausgeschlossen werden können.
Um die angestrebte chemische Wirkung zu optimieren und zu beschleunigen, werden die in Kontakt mit den Chemikalien gebrachte Zellen, beispielweise in Form einer Zellsuspension, auf ein Temperaturniveau zwischen 35 und 100°C gebracht.
Zur Durchführung des Verfahrens ist erfindungsgemäß eine Vorrichtung dadurch ausgebildet, daß ein, die in einem Medium suspendierten Zellen oder Zellverbände aufnehmendes Probenvolumen mit zwei flächig ausgebildeten, sich gegenüberliegenden Elektroden vorgesehen ist, das durch ein Deckelelement, dessen dem Probenvolumen zugewandte Seite konvex ausgebildet ist, an der Oberseite des Probenvolumens abschließbar ist. Durch das konvex ausgebildete Deckelelement kann vorteilhafterweise vermieden werden, daß bei einem Einschluß des flüssigen Mediums innerhalb des Probenvolumens keine Luftblasen eingeschlossen werden, die zur ungleichmäßigen Verteilung des elektrischen Feldes und daher möglicherweise zu unerwünschten elektrischen Durchbrüchen in der Behandlungsvorrichtung führen würden..
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen exemplarisch beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1 Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Aufschluß biologischer Zellen,
Fig. 2 alternative Vorrichtung mit metallischer Folie am Deckelelement,
Fig. 3 alternatives Ausführungsbeispiel mit metallischer Trennfolie innerhalb des Probenvolumens, sowie
Fig. 4 alternatives Ausführungsbeispiel mit Reibelementen zur Gewebezerkleinerung.
Kurze Beschreibung eines Ausführungsbeispiels
In Fig. 1 ist eine vorteilhafte Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Aufschluß biologischer Zellen dargestellt, die eine Behandlungszelle zeigt, die ein Kunststoffgehäuse 2 aufweist, in das eine untere Elektrode 3 eingegossen ist und eine obere Elektrode 4 vorsieht, die zugleich das Deckelelement darstellt. Zwischen den Elektroden befindet sich im Probenvolumen 1 die in einer Lösung suspendierten aufzuschließenden biologischen Zellen. Alternativ können sich die Zellen immobilisiert auf einem Träger, beispielweise einem Filter, befinden, wobei das Restvolumen der Vorrichtung mit einer Elektrolytlösung aufgefüllt wird. Durch die konvex gewölbte Oberfläche des Deckelelementes 4 wird gewährleistet, daß beim Aufsetzen des Deckelelementes keine Luftblasen im Probenvolumen 1 eingeschlossen werden. Der beim Aufsetzen des Deckelelementes auf das Probenvolumen 1 durch das Deckelelement 1 verdrängte Überschuß der Suspension 5 sammelt sich in einer zirkulär um das Deckelelement 4 vorgesehenen Vertiefung 6 des Kunststoffgehäuses 2. Die dem Deckelelement 4 gegenüberliegende untere Elektrode 3 ist hingegen konkav ausgebildet, so daß der Abstand zwischen beiden Elektroden konstant gewählt ist. Zudem erleichtert die Ausgestaltung der Elektrodenform das Einfüllen einer Flüssigkeit in das Probenvolumen 1 ohne Luftblasen sowie eine weitgehend restlose Probenentnahme, nach Durchführung des Zellaufschlußverfahrens.
Um die Elektroden 4 und 3 zu kontaktieren sowie die Behandlungszellenteile insbesondere in einer automatisierten Vorrichtung zu transportieren und zu fixieren, weist die untere Elektrode 3 einen Stecker 7 sowie die obere Elektrode 4 eine Vertiefung 8 auf.
Der in dem Ausführungsbeispiel vorzugsweise eingestellte Elektrodenabstand beträgt 2 bis 5 mm, der Elektrodendurchmesser ca. 1 cm. Bei diesen Abmessungen und bei einer noch relativ leicht handhabbaren Spannung von ca. 20 kV beträgt die Stärke des elektrischen Feldes zwischen 40 und 100 kV/cm, eine Feldstärke, die für einen Zellaufschluß durchaus geeignet ist.
Die Elektrodenoberflächen können vorzugsweise aus Aluminium gefertigt sein, da dieses Material biologisch inert und chemisch ausreichend beständig ist. Außerdem is es leicht zu verarbeiten und billig, und daher insbesondere für Einwegartikel geiegnet.
Nach der Behandlung mit elektrischem Feld kann die chemische Behandlung im gleichen Volumen durch hinzugäbe der Chemikalien fortgesetzt werden, oder alternativ kann die Zellsuspension in ein anderes Gefäß umpipettiert werden.
Die in Fig. 1 dargestellte Ausführungsform mag durch die konstruktive Auslegung des Deckelelementes für eine Probenentnahme umständlich sein, da das Deckelelement vor dem Entleeren des Probenvoiumens 1 zu entfernen ist, an dem ein wesentlicher Teil der Lösung als Tropfen hängenbleiben kann. Dies wiederum könnte zu der Kontamination des Umfeldes und somit zur Querkontamination weiterer Proben führen, die es jedoch gilt, insbesondere bei der automatischen Handhabung derartiger Proben, zu vermeiden. Um die Probenentnahme insbesondere in einer automatisierten Vorrichtung zu erleichtern und sicher gegenüber Querkontamination zu machen, sieht die Vorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel der Figur 2 eine zweiteilige Ausgestaltung des Deckelelementes 4 vor. Das Deckelelement 4 verfügt über eine mittige Bohrung 9 und ist mit einer das Deckelelement 4 umhüllenden elektrisch leitenden, vorzugsweise aus Aluminium gefertigten Folie 10 umhüllt. Nach der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch den Kanal 9 eine Pipette eingeführt, die die Folie 10 durchstößt, so daß die im Probenvolumen 1 enthaltene Suspension abgesaugt werden kann. Zwar muß in diesem Ausführungsbeispiel die Folie jedes Mal ausgetauscht werden, doch erscheint dies vorteilhaft, zumal zur Vermeidung von Querkontaminationen die gesamte Behandlungszelle als Einwegartikel ausgebildet werden kann.
In Fig. 3 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel dargestellt, das ein Deckelelement 4 vergleichbar zur Ausführungsform gemäß Fig. 1 aufweist. Jedoch sieht diese Ausgestaltung eine das Probenvolumen 1 abtrennende Metallfolie 11 vor, die zugleich die untere Elektrode darstellt. Unter der Elektrode 11 befindet sich ein Hohlraum 12, der mit einem Kanal 7 verbunden ist. Wie im Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 wird die Behandlungszelle mit einer Suspension von biologischen Zellen aufgefüllt und eine Hochspannungsbehandlung mit chemischen Additiven zum Zellaufschluß durchgeführt.
Nach Abschluß der elektrischen Feldapplikation wird durch den Kanal 7 der Hohlraum 12 evakuiert. Infolge der Druckdifferenz reißt die Folie 11 auf, so daß die behandelte Suspension zur weiteren Analyse durch den Kanal 7 abgesaugt werden kann.
Diese Ausführungsvariante eignet sich insbesondere für eine vollautomatische Verfahrensdurchführung, bei der die Gefahr der Querkontaminationen vollständig ausgeschlossen werden können.
In allen beschriebenen Fällen ist eine chemische Nachbehandlung notwendig, um effizient die Zellinhalte nach außen zu bringen. Die Chemikalien können der Lösung vor der elektrischen Feldapplikation zugesetzt werden; da sie aber in vielen Fällen Elektrolyten sind bzw. in elektrolytischen Puffern optimal wirken, sollen sie dann erst nach Abschluß der elektrischen Feldapplikation der Zellsuspension hinzugefügt werden.
In einer Variante der chemischen Behandlung wird der Zellsuspension eine Mischung aus 15 verschiedenen Restriktionsendonukleasen (je 3 U/ml) hinzugefügt, und bei 37°C ca. 10 bis 30 Minuten inkubiert. Die Reagenzien diffundieren durch die bei der elektrischen Feldapplikation entstandenen Membranporen in das Zellinnere und zerschneiden gezielt die DNA-Stränge auf Stücke mit einigen Tausend Basenpaaren, die später für PCR-Reaktion verwendet werden können. Nach der Behandlung wird der Suspension Proteinase K in einer Konzentration von 1 μg/ml hinzugefügt, und das Temperaturniveau wird auf 60°C eingestellt. Proteinase K diffundiert gleichfalls durch die Poren und bewirkt die Lyse sowohl von Zellproteinen als auch der im vorherigen Schritt hinzugefügten Enzymen, so daß störende Einflüsse auf die nachfolgenden PCR-Reaktionen ausgeschlossen werden. Nach Inkubation von 10 bis 30 Min. bei 60°C wird die Temperatur auf 95°C gebracht. Dabei denaturiert die Proteinase K, und die DNA diffundiert durch die Poren in der Membran nach außen. Durch derartige Behandlung werden die PCR-Inhibitoren, sowohl hinzugefügte als auch zelleigene, weitgehend abgebaut.
In einer anderen Variante der chemischen Behandlung wird nach Abschluß der elektrischen Feldapplikation der Zellsuspension Guanidiniumhydrochlorid bzw. - thiocyanat (GdnHCI bzw. GdnSCN) hinzugefügt, so daß eine 0,3 bis 3 M Konzentration eingestellt wird. Die Suspension wird auf eine Temperatur von 60 bis 100°C gebracht und 10 bis 30 Min inkubiert. Dadurch werden die Zellwände und Membranen zerstört, wodurch die DNA freigesetzt wird. Diese Methode ist einfacher als die oben beschriebene, hat aber den Nachteil, daß Guanidiniumverbindungen, die zwar in einer geringeren Konzentration als sonst für rein chemischen Zellaufschluß verwendet werden, die nachfolgende PCR-Reaktion inhibieren können und deswegen aus der Lösung entfernt werden müssen. In der Ausführungsform gemäß Fig. 4 sind an den Oberseiten der Elektroden 13 und 3 Oberflächenrauhigkeiten vorgesehen, durch die in das Probenvolumen 1 eingebrachte Gewebestücke 16 zerkleinert werden können.
Die obere Elektrode 13 und das Gehäuse 2 sind gemäß Ausführungsbeispiel der Figur 4 derart ausgeführt, daß die Elektrode 13 axial und rotationsbeweglich geführt ist. Das Restvolumen des Probenvolumens 1 wird mit einer Flüssigkeit 17 aufgefüllt und die Gewebeprobe 16 durch einen Druck auf die obere Elektrode 13 zwischen den Elektroden zusammengepreßt. In diesem Fall ist die Flüssigkeit nur notwendig, um elektrische Entladungen zwischen den Elektroden auszuschließen, da die Probe selbst die Elektroden direkt kontaktiert. Die zwischen die Elektrode eingebrachte Flüssigkeit ist daher nicht unbedingt elektrisch leitend, so daß reines Wasser oder auch Öl verwendet werden kann.
Nach der Hochspannungsbehandlung und der Zugabe entsprechender chemischer Additive wird die Gewebeprobe 16 durch Anlegen eines starken Druckes an die obere Elektrode 13, eventuell kombiniert mit Rotationsbewegungen zerquetscht. Die obere Elektrode 13 und das Gehäuse 2 mit der unteren Elektrode 3 spielen also die Rolle eines Stempels und einer Matrize. Vorzugsweise weisen die Elektrodenoberflächen ein rauhes Profil 17 auf, um die Desintegration des Gewebes effizienter zu machen.
Die dabei freigesetzte Flüssigkeit bzw. der sich bildende Brei, der die Nukleinsäuren enthält, steigt in den Spalt 14 zwischen der oberen Elektrode 13 und dem Gehäuse 2 auf und kann durch den Kanal 15 zur weiteren Analyse abgesaugt werden.
BEZUGSZEICHENLISTE
Behandlungsraum (wird mit dem zu behandelnden biologischen Material im entsprechenden Medium (Elektrolytlösung) befüllt) Gehäuse / Kapsel Untere Elektrode Deckel Mediumüberschuß Vertiefung / Rinne dafür Stecker Bohrung für Elektrodenanschluß Kanal im Deckel Metallfolie auf dem Deckel Untere Elektrode aus Metallfolie Hohlraum Obere Elektrode Spalt Kanal im Gehäuse Gewebeprobe Flüssigkeit

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt werden und daß vor oder nach dem Anlegen des elektrischen Feldes die Zellen mit Substanzen in Kontakt gebracht werden, die den Zellaufschluß unterstützen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet daß das elektrische Feld ein gepulstes Feld mit einer Feldstärke über 5 kV/cm, bevorzugt über 20 kV/cm und mit einer Pulsdauer etwa 0,5 bis 50 Mikrosekunde ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß etwa 1 bis 100 Feldpulse an die Zellen angelegt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen im Gewebeverband oder auf einem Träger, bevorzugt einem Filter, vorliegen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß die Zellen in einem elektrisch leitenden Medium suspendiert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß das Medium, in dem die Zellen suspendiert sind einen spezifischen elektrischen Widerstand von 20 bis 200 Ohm m aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet daß die Substanz ein Detergenz, eine Nuklease oder eine Protease ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat) ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease Proteinase K ist
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet daß die Substanz Dimethylsulfoxid (DMSO) ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet daß die Substanz Guanidiumthiocyanat oder -hydrochlorid (GdnSCN oder GdnHCI) ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet daß die Guanidinium-Verbindung eine Konzentration von über 0,2 M aufweist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium einer Temperatur zwischen 35 und 100°C ausgesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet daß die aufzuschließenden Zellinhalte Nukleinsäuren sind.
15 Vorrichtung zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein, die in einem Medium suspendierten Zellen, Zellverbände in Form eines Gewebeverbandes oder auf einem Träger aufgebrachte Zellen aufnehmendes Probenvolumen mit zwei flächig ausgebildeten, sich gegenüberliegenden Elektroden vorgesehen ist, das durch ein Deckelelement, dessen dem Probenvolumen zugewandte Seite konvex ausgebildet ist, an der Oberseite des Probenvolumens abschließbar ist.
16 Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Deckelelement als Elektrode ausgebildet ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet daß die dem Deckelelement gegenüberliegende Elektrode eine dem Probenvolumen zugewandte konkav ausgebildete Seite aufweist.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet daß das Deckelement eine Durchgangsöffnung zum Probenvolumen aufweist und an der dem Probenvolumen zugewandten Seite mit einer elektrisch leitenden Folie überzogen ist.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Deckelelement gegenüberliegende untere Elektrode als Folie ausgebildet ist, die das Probenvolumen von einem unter der Folie befindlichen Abflußkanal trennt.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Deckelelement als Stempel ausgebildet ist, der axial und rotatorisch beweglich innerhalb des Probenvolumens führbar ist.
21. Vorrichtung nach einem der Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Probenvolumen zugewandten Flächen der Elektroden aufgerauht sind.
22 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden etwa 1 bis 5 mm voneinander beabstandet sind.
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