DE2212092C3 - Verfahren zur Herstellung von 14 C-markierten Verbindungen - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ¹⁴C-markierten Verbindungen.

Die Verwendung lebender Zellen zur Umwandlung anorganischer Formen von radioaktiven oder stabilen Isotopen in brauchbarere organische Verbindungen ist nicht neu. Vollständige Pflanzen, abgetrennte Zweige oder andere Pflanzenorgane, die mikroskopisch kleine Grünalge Chlorella, Schwefelbazillen, wie Thiobacillus thioxidans, Hefe und andere Mikroorganismen wurden jo bereits für diesen Zweck verwendet.

Alle diese Organismen, die bisher für diese Markierungsverfahren verwendet wurden, weisen jedoch bestimmte Nachteile auf. Höhere Organismen, wie höhere Pflanzen und Tiere, werden durch Strahlung stark geschädigt, so daß sie — um ein spezielles Beispiel aufzugreifen — mit dem ¹⁴C-lsotop nur bei ziemlich niedriger Isotopenkonzentration eingesetzt werden können. Organismen, wie Schwefelbakterien, haben den Vorteil, daß sie Kohlendioxid unmittelbar aufnehmen, jedoch haben sie ein ziemlich langsames Wachstum, was ihre Anfälligkeit gegen Strahlenschädigung erhöht. Viele andere Mikroorganismen zeigen den Nachteil, daß man ihnen das ^MC-lsotop in organischer Form, wie z. B. als Glucose oder Acetat, zuführen muß. Das ist kostspieliger als die Zuführung von isotopem Kohlendioxid und es kann schwierig sein, das Kohlenstoffisotop in sehr hoher Konzentration einzubringen. Obgleich es möglich ist, beispielsweise einheitlich markierte Glucose als Substrat zu verwenden, kann man damit jedoch keine höhere Isotopenkonzentration als 80% erreichen.

Die mikroskopisch kleine Grünalge Chlorella war der bisher zur Herstellung markierter Verbindungen, besonders von 'kohlenstoff-Verbindungen, am häufigsten eingesetzte intakte Organismus. Die Vorteile, welche die Verwendung von Chlorella mit sich bringt, sind bekannt. Es ist möglich, Chlorella mit so hohen Isotopenkonzentrationen von ¹⁴Kohlenstoff, wie 90 bis 95%, zu züchten.

Die Verwendung von Chlorella ist aber für diesen to Zweck ungünstig, da der Gehalt an Nucleinsäuren niedrig und insbesondere an Desoxyribonucleinsäure (DNS) sehr niedrig ist. Wenn jedoch Chlorella bei einer sehr hohen Isotopenkonzentration von ^l4Kohlenstoff gezüchtet wird, werden die Zellen stark vergrößert und h> der Anteil des Kohlenstoffgehalts, der als DNS gewonnen wird, wird erheblich unter das normale Maß verringert. Chlorella ist daher eine sehr unergiebige Quelle für mit ^HKohlenstoff bei hoher lsotopenkony.cntration markierte DNS und demzufolge auch für Desoxyribonucleotide und Desoxyribonucleoside.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, welches die oben geschilderten Nachteile nicht mehr aufweist

Diese Aufgabe zur Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von ^l4C-markierten Verbindungen durch aerobes Vermehren einer Alge in einem Kulturmedium, das das ¹⁴C-IsOtOp in einer solchen Form enthält daß es von der Alge aufgenommen wird, und durch Gewinnen der ^l4C-markierten Verbindungen aus den geernteien Algen nach bekannten Verfahren, wurde dadurch gelöst, daß ein Mikroorganismus der Gattung Anacystis verwendet wird.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Mikroorganismus der Art Anacystis nidulans verwendet

Mikroorganismen der Gattung Anacystis und Anacystis nidulans sind unter der Bezeichnung »Indiana 625« von The Culture Collection of Algae, Department of Botany, Indiana University, Bloomington, Indiana/USA erhältlich.

Die bevorzugte Species Anacystis nidulans ist eine mikroskopisch kleine, blaugrüne Alge, die auch als Anacystis maxima, Phormidium mucicola oder Lauterbornia nidulans bekannt ist In die Erfindung fällt auch die Verwendung von Mutanten der Species Anacysiis nidulans, gleichgültig, ob sie natürlich vorkommen oder künstlich induziert sind.

In der Veröffentlichung von O. Kandier in »Die Naturwissenschaften«, Band 48 (1961), Seite 604, wird über Kurzzeitversuche (die Versuchsdauer betrug lediglich 5 Sekunden bis zu mehreren Minuten) mit Anacystis nidulans berichtet, bei denen die ersten Stufen der Photosynthese näher untersucht werden. Es läßt sich der Literaturstelle jedoch kein Hinweis darauf entnehmen, daß und inwiefern die Verwendung des Mikroorganismus Anacystis zur präparativen Herstellung von radioaktiv-markierten Verbindungen gegenüber dem bisher üblicherweise verwendeten Mikroorganismus Chlorella Vorteile aufweist, ja die Literaturstelle läßt nicht einmal vermuten, daß der Mikroorganismus Anacystis überhaupt zur präparativen Herstellung von radioaktiv-markierten Verbindungen mit hohem Isotopengehalt herangezogen werden kann. Die mit Chlorella gemachten Erfahrungen haben gezeigt, daß diese Mikroorganismen beim Wachsen aus einer ¹⁴C-Kohlenstoffquelle keine nennenswerten Mengen an DNS zu bilden vermögen, da hier keine Zellteilung stattfindet. Zwar war der Fachwelt bekannt, daß Mikroorganismen, die imstande sind, Kohlendioxid zu assimilieren, auch bis zu einem gewissen Grade ^l4C-markiertes Kohlendioxid zu assimilieren vermögen und daß sich dabei auch kleinere und größere Mengen an bestimmten markierten organischen Verbindungen in den Mikroorganismen bilden. Algen, zu denen sowohl die Chlorella-Mikroorganismen als auch die von Anacystis gehören, zeichnen sich durch vegetatives Wachstum (Aufquellen) und reproduktives Wachstum (Zellteilung) aus. Um ein gleichmäßiges Wachstum aller organischen Bestandteile, einschließlich Nucleinsäuren, zur Erzielung einer gleichmäßigen Markierung sicherzustellen, halte es sich als notwendig erwiesen. Algen in Anwesenheit der markierten Nahriingsquelle über mehrere Generationen hinweg wachsen zu lassen. Die zitierte Arbeit von C). Kandier enthält jedoch keinen Hinweis darauf. etwas derartiges unter Verwendung von Anacystis zu

um. Dazu halte es auch Kenntnisse über eine Reihe von Faktoren bedurft, die noch nicht zur Verfügung standen. So fehlten Kenntnisse über die Generationszeil von Anaeystis und insbesondere Erfahrungen darüber, ob diese für die Mikroorganismen kurz genug ist, um sie für den vorgesehenen Zweck einsetzen zu können. Erfahrungen, die mit anderen lebenden Zellen immer wieder gemacht wurden, haben gezeigt, daß Vorhersagen hierüber nicht möglich sind. Man wußte auch nichts über die Empfindlichkeil von Anacysiis gegenüber Strahlen und nichts darüber, wie hoch der Nucleinsäuregehalt der Zellen von Anacysiis-Mikroorganismen ist. Weiter war unbekannt, ob die Verwendung von ^M C-markiertem Kohlendioxid als Kohlenstoffquelle zu einer Veränderung der Wachstumseigenschaften der Mikroorganismen führt. Völlig ungeklärt war auch, welche Teile der Zelle markiert werden und ob die Markierung gleichsiäßig vor sieh geht und reproduzierbar ist. Diese Fragen wurden erst im Rahmen von langwierigen Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten, geklärt.

Anaeystis nidulans ist ein photosynthetischer Mikroorganismus und benötigt für sein Wachstum nur Wasser, anorganische Salze. Licht und ein Kohlendioxid/Bicarbonat-System als alleinige Kohlenstoffquelle. Als Isotopenquelle wird in der vorliegenden Erfindung ^I4CO2 verwendet. Der Mikroorganismus nimmt unter stabilen Bedingungen das ¹⁴COi ziemlich rasch auf und der "Kohlenstoff wird allmählich auf die verschiedenen Moleküle des Organismus verteilt.

Die "C-markierten Verbindungen sind besonders Nucleoside, Nucleotide und Aminosäuren. Man züchtet einen Mikroorganismus der Art Anacysiis nidulans in einem Kohlendioxid/Bicarbonat-Sysiem, in dem als vorzugsweise alleinige Kohlenstoffquelle ¹⁴C vorzugsweise mit einer Isotopenkonzentration von etwa 100% vorhanden ist.

Die Bedingungen, unter denen Anacysiis nidulans gezüchtet werden kann, sind bekannt und ähnlich denjenigen für die Züchtung von Chlorella, so daß Einzelheiten nicht beschrieben zu werden brauchen. Es ist möglich und wird im allgemeinen vorgezogen, im wesentlichen 100%iges ¹⁴COj einzusetzen, obwohl gewünschtenfalls auch geringere Isoiopenkonzentrationen an "Kohlenstoff in dem CO2 vorhanden sein können. Nachdem die Züchtung beendet oder so weit wie gewünscht abgelaufen ist, werden die Algen geerntet und können nach bekannten Verfahren zur Gewinnung der gewünschten markierten Verbindung bzw. Verbindungen behandelt werden.

Anaeystis nidulans kann zur Herstellung von markierten Verbindungen, wie Proteinen, Aminosäuren, Nucleosiden, Nucleotiden, Nucleinsäuren, Desoxynucleosiden, Desoxynucleotiden, Desoxynucleinsäuren, Fettsäuren, Steroiden und anderen Lipoiden, sowie für Wuchsfaktoren, die mit stabilen oder radioaktiven Isotopen markiert sind, eingesetzt werden. Durch die Verwendung von Anaeystis nidulans anstelle von Chlorella werden überraschenderweise die folgenden Vorteile erreicht:

A. Wachstumsgeschwindigkeit

Anaeystis nidulans kann zur Züchtung mil einer kürzeren Generalionszeil (Zeit zur Verdoppelung der Zellenzahl) als Chlorella verwendet werden und wächst daher viel schneller. Bei nicht radioaktivem COi und unter optimalen Bedingungen kann Anaeystis nidulans mit einer Generationszeit von etwa 2 Stunden gezüchtet werden, wohingegen die optimale Zeit für Chlorella S bis 6 Stunden beträgt. Es ist auch nicht notwendig, Anaeystis nidulans unter absolut optimalen Bedingungen zu züchten, sondern es wurden standardisierte Bedingungen angewandt die eine Generationszeit von 5 bis 6 Stunden ermöglichen. Dadurch haben geringe Änderungen des pH-Wertes der Umgebung, der Belichtung, der Temperatur usw. keinen merklichen Einfluß auf die Wachstumsgeschwindigkeit, so daß das Arbeitsverfahren zuverlässiger ist. Chlorella hingegen muß unter optimalen Bedingungen bei hoher spezifischer "Kohlenstoff-Aktivität gezüchtet werden, wenn man ein gutes Wachstum erzielen will, und demzufolge haben geringe Änderungen der Umgebungsbedingungen eine deutlich nachteilige Wirkung auf das Wachstum.

B. Resistenz gegen Strahlung

Anaeystis nidulans ist resistenter gegen Strahlung als Chlorella und hat die folgenden Vorteile:

1. Bei der Züchtung bzw. dem Wachstum bei hoher spezifischer "Kohlenstoff-Aktivität bleibt die Generationszeit von Anaeystis nidulans konstant und das Wachstum ist iu ca. 24 Stunden beendet. Chlorella wird jedoch durch Strahlung geschädigt und jede folgende Generationszeit ist langer (was nahezu zu einem exponentialen Anstieg der Generationszeit führt). Während also bei den gewählten Wachstumsbedingungen nur ein geringer Unterschied zwischen den

so Anfangsgenerationszeiten der beiden Organismen vorliegt, erfordert die Züchtung von Chlorella bis zur Beendigung 48 bis 72 Stunden (d. h. zwei- bis dreimal so lange wie bei Anaeystis nidulans).

2. Wenn Zellen mit CO2 bei hoher spezifischer Aktivität gezüchtet werden, wird Chlorella durch Strahlenschäden veranlaßt, Zellen zu bilden, die viel größer und brüchiger sind als solche mit nicht radioaktivem CO2. Diese größeren Zellen unterliegen leicht der Lysis, und der potentiell wertvolle Zellinhalt geht in die überstehende Schicht verloren, aus der er nur schwer wieder zurückgewonnen werden kann. Demgegenüber ist kein sichtbarer Unterschied zwischen Anacystis-nidulans-Zellen zu erkennen, die mit "CO2 von hoher spezifischer Aktivität, gegenüber solchen, die mit nicht radioaktivem Kohlendioxid gezüchtet wurden. Verluste durch Zell-Lysis sind geringer als bei Chlorella, und es werden etwa 85% des Anfangs-"CO? in die Zellen aufgenommen, im Vergleich zu 75 bis 80% bei Chlorella.

3. Weil die Zellen von Chlorella ihre Größe bei hoher spezifischer "Kohlenstoff-Aktivität möglicherweise erhöhen, nimmt der DNS-Gehalt pro Zelle in dem Maße ab, wie die spezifische Aktivität zunimmt; dies trifft nicht für Anaeystis nidulans zu.

4. Es wurde ein Inoculum von etwa 5% bei der photosynthetischen Arbeit verwendet, um sowohl einen Abfall der spezifischen Aktivität als auch die Gefahr von uneinheitlicher Markierung der Produkte zu vermeiden. Dies macht für eine Züchtung 4 bis 5 Generationen notwendig, um den gewünschten Abschluß (d. h. die vollständige ¹⁴CO2-Aufnahme) zu erreichen. Wenn das Chlorella-Wachstum schlecht anläuft (d.h. mit einer längeren als der üblichen Anfangsgenerationszeit), z. B. infolge von Veränderungen der Umgebung und Vorliegen nichtoptimaler Bedingungen, treten erhebliche Strahlenschädcn ein, und das Wachstum kann unvollständig erfolgen, oder es erreicht den vollständigen Zustand später, so daß während der letzten

Wachstunisstufen übermäßige Zell-Lysis und demzufolge ein Verlust an wen vollem Material eintreten kann.

C Nucleinsäuregehalt

Bei einer hohen spezifischen '''Kohlenstoff-Aktivität (etwa 95°/oige Isotopenkonzentration) liegen folgende Nucleinsäuregehalte bei Anacystis nidulans und Chlorella vor:

Gesamt-Nuclein-
säuren

DNS

RNb
(Differenz)

Anacystis nidulans 6,5% 1,7% 4,8%

Chlorella 3,7% 0,2% 3,5%

Das heißt, Anacystis nidulans enthält etwa 2mal so viel Nudeinsäure als Chlorella (8,5mal so viel DNS und 1,3mal so viel RNS).

D. Proteingehalt

Anacystis nidulans liefert etwa 10% mehr Protein als Chlorella.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden näher erläutert:

Züchtung von Anacystis nidulans mit >⁴CO2
bei etwa 100%iger Isotopenkonzentratkin

Der Organismus kann in irgendeiner Vorrichtung gezüchtet werden, wie sie bereits für die Züchtung von Chlorella-'⁴C beschrieben worden ist. Beispiele verschiedener Vorrichtungen sind von J. R. Catch (»Radioisotope Conference 1954«, Band 1, Seite 337, Butterworth, London, 1954); R. W. Du t ton und C. E. Dalgliesh (J. Chem. Soc, 1956, 3792); P. H. A b e 1 s ο η et al. (»Studies in Biosynthesis of E. coli«, Kapitel 4, Carnegie Institute, Washington, 1955); Z. Nejedly,]. Filip, D. Grünberger (»Methods of Preparing and Storing Labelled Compounds«, Seiten 527 bis 537, Euratom, Brüssel, 1968); J. Liebster, ]. Kopoldova, J. Kozel, M. Dobiasova (Coil. Czech. Chem. Commun. 1961,26, 1582); P. D. Ell ner, (Plant Phys. 1959, 34, 638-40), beschrieben worden. Es kann ein System verwendet werden, das ein flüssiges Volumen von etwa 5 Liter und ein Gasvolumen von etwa 20 Liter hat, wobei Rühr- und/oder Gaszirkulationsvorrichtungen vorgesehen sind, um die Aufnahme von Kohlendioxid aus der Gasphase in die Flüssigkeit zu erleichtern. Ein solches System ermöglicht das Einbringen von lOOmg-Mol ^l4Kohlenstoffdioxid entsprechend 6,2 Curie bei 100%iger Isotopenkonzentration. Die Flüssigkeit wird künstlich mit vier Lampenaggregaten belichtet, wobei jedes vier 0,6-m-»Warmlicht«- oder -»Gro-lux«-Leuchtröhren aufweist. Die Temperatur wird über einen Thermostat durch einen Kühlwassermantel auf 37°C gehalten.

Das verwendete Nährmedium ist eine Modifikation eines anorganischen Standardmediums, dem Spuren von Metallionen zugegeben sind und das routinemäßig zur Züchtung von Chlorella und anderen photosynthetischen Mikroorganismen verwendet wird (vgl. »Growth of Phototropic Bacteria and Blue-Green Algae« von N. G. Carr in Methods in Microbiology, herausgegeben von ). R. N ο it is und D. W. Ribbons, Academic Press, London und New York, Band 3B, Seiten 53 bis 57. 1970). Diese Modifikation besteht in einer höheren als üblichen Konzentration an Phosphat zur Erhöhung der Pufferkapazität und zur Verringerung von pH-Wcrt-Änderungcn, die während der Züchtung besonders in einem geschlossenen System auftreten können.

Das Inoculum, entsprechend 5% des Endgewichis an Anacystis nidulans. wird einer Kultur von nicht radioaktivem Anacystis nidulans in der Exponcmial-Wachstumsphasc entnommen. Diese Kultur wird dadurch erhalten, daß man von einer Agar-Schrägkuliur Anacystis nidulans in 50 ml Kulturmedium in einen 500-inl-Erlenmeyer-Kolben impft und diesen (in einer

ίο Atmosphäre von 5% Kohlendioxid in Luft) in einem Schüttler mit Kreisbewegung inkubiert und mit zwei 40-Watt-»Tageslicht«-Leuchtröhren im Abstand von 28 cm beleuchtet, wodurch man ein Inoculum für 500 ml Medium in einem zylindrischen Kulturgefäß (1 Liter.

40 χ 7 cm) erhält, das durch einen mit Thermostat versehenen Kühlwassermantel auf 37°C gehalten, mit sechs 40-Watt-»Tageslicht«-Leuchtröhren im Abstand von 20 cm beleuchtet und mit einer Geschwindigkeit von 1,0 bis 1,5 Liter/Minute mit steriler Luft, die 2 bis 5% Kohlendioxid enthält, belüftet wird. Damit erhält man in 24 bis 36 Stunden eine schnell wachsende Kultur, aus der das präparative 5-Liter-Wuchsmedium geimpft wird.

Nach Sterilisation mit Hilfe eines Autoklav werden etwa 5 Liter Kulturmedium aseptisch in ein sterilisiertes Kulturgefäß über ein Entnahmerrohr überführt und während der Überführung geimpft. Nach beendeter Überführung und Impfung wird der Luftdruck in dem Kulturgefäß auf etwa 0,5 Atmosphären verringert und anschließend 10OmMoI ^Kohlendioxid (6.2 Curie bei 100% Isotopenkonzentration) durch Zugabe von verdünnter Perchlorsäure zu 100 mMol ^l4C-Bariumcarbonat in einem einfachen Herstellungsgefäß, wie es normalerweise für die Herstellung von 'kohlendioxid verwendet wird, hergestellt. Das 'kohlendioxid wird mit Luft in das Kulturgefäß eingespült, bis der Druck in dem Gefäß etwa 80 mm Hg-Säule unter atmosphärischem Druck beträgt, so daß bei irgendeinem Leckwerden des Gefäßes während der Züchtung eher Luft in den Kessel eintritt als ^Kohlendioxid aus dem Kessel austritt.

Eine Probe wird sofort nach der ¹⁴Kohlendioxidherstellung entnommen und deren pH-Wert gemessen, um sicherzugehen, daß dieser richtig (pH 7,4) ist. Es werden dann in gewissen Zeitabständen Proben entnommen und das Wachstum durch Messen des pH-Werts der Probe, der optischen Dichte bei 380 μιπ, der Gesamtradioaktivität (gelöstes 'kohlendioxid. Zellen und die in das Medium ausgetretenen markierten Produkte), der Radioaktivität nach Ansäuern (Zellen und die in das Medium ausgetretenen markierten Produkte) und der von einem Membranfilter (Zellen) zurückgehaltenen Radioaktivität überwacht.

Nach etwa 14 Stunden, wenn das Wachstum etwa 50%ig ist, beginnt der pH-Wert zu steigen und es wird in Intervallen Säure zugegeben, um sicherzustellen, daß der pH-Wert nicht über 8,5 ansteigt. Sobald das Wachstum sich dem Ende nähert, hört der pH-Wert zu steigen auf und die Aktivitätsbestimmungen zeigen, daß sich weniger als 5% des anfänglich vorhandenen '^Kohlendioxids noch in Lösung befindet. Die Zellen werden dann entnommen.

Die geringe Menge von nicht aufgenommenem 'kohlendioxid wird dadurch wiedergewonnen, daß man die Luft in dem Gefäß durch eine Alkalifalle, die

b5 ICJ ml 4 n-Kaliumhydroxid enthält, zirkulieren läßt. Die Zellen (die etwa 85% der Gesamtradioaklivitäi enthalten) werden dann aus der überstehenden Schicht (die etwa 10% der Gesamtradioaktivität enthält) durch

Zentrifugieren in einer (auf etwa 4°C) gekühlten Zentrifuge, die mit einem Strömungsrotor versehen ist, abgetrennt und dann schnell weiterverarbeitet, um mögliche Verluste an hochmolekularen Nucleinsäuren durch Strahlungsabbau zu verringern.

Verarbeitung markierter Anacyslis-nidulans-Zellen

Lipoide, die etwa 15% der Gesamtaktivität der Zellen enthalten, werden aus den zentrifugierten Zellen durch Lösungsmittelextraktion isoliert, zweimal mit absolutem Äthanol und dann mit Äthanol/Chloroform (9:1) gewaschen. Das Lösungsmittelgemisch wird in einem Stickstoffstrom entfernt und das zurückbleibende lipoide Material in Benzol gelöst und unter Stickstoff in Glasampullen zur nachfolgenden Verarbeitung nach Standardmethoden eingefüllt und die Ampullen verschlossen.

Der nach der Lipoidextraktion verbleibende Rückstand wird in einem kleinen Volumen (etwa 30 ml) destilliertem Wasser suspendiert, 10 Minuten der Beschallung unterworfen und dann zentrifugiert. Die überstehende Schicht wird entfernt und der Rückstand erneut mit einem geringen Wasservolumen suspendiert und das Beschallungsverfahren wiederholt. Die beiden überstehenden Schichten, die wasserlösliche Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht enthalten, werden gesammelt und der unlösliche Rückstand, der hauptsächlich Proteine und Nucleinsäuren enthält, weiterverarbeitet, um die Nucleinsäurekomponenten von dem Protein zu trennen.

Die mit Desoxynucleotid angereicherte Fraktion wird dadurch erhalten, daß man eine Suspension dieses Rückstandes mit Ribonuclease-freier Desoxyribonuclease I behandelt, die die wasserunlösliche DNS (mit hohem Molekulargewicht) zu wasserlöslichen Oligodesoxyribonucleotiden abbaut. Nach beendeter Reaktion wird die Oligodesoxynucleotidfraktion durch Zentrifugieren isoliert und in ein Gemisch der vier Desoxyribonucleosidmonophosphate (Desoxyadcnosin-5'-monophosphat, Desoxytidin-5'-monophosphat, Desoxyguanosin-5'-monophosphat und Thymidin-5'-monophosphat) durch Behandlung mit Phosphatase-freier, gereinigter Schlangengift-Phosphodiesterase umgewandelt. Die vier Desoxyribonucleosidmonophosphate werden dann in reiner Form aus diesem Gemisch nach Standard-Verfahren mit Hilfe einer, mil einem Diälhylaminoäthyl-Dextran gefüllten Kolonne sowie Papier- und Dünnschicht-Chromatographie isoliert.

Die mit RNS angereicherte Fraktion wird anschließend aus dem Rückstand, der nach der DNase-Behandlung verbleibt, durch Extrahieren mit heißer 10%iger Natriumchloridlösung isoliert. Die RNS wird aus diesem 10%igen Natriumchioridexirakt durch Äthanolausfällung isoliert und anschließend unter Bildung eines Gemisches der vier Ribonucleosidmonophosphate (Adenosin-S'-monophosphat, Cytidin-S'-monophosphat. Guanosin-5'-monophosphat und Uridin-5'-monophosphat) durch Behandlung mit einer Phosphatase-freien, gereinigten Schlangengift-Phosphodiesterase abgebaut. Die Ribonucleosidmonophosphate werden anschließend in reiner Form aus diesem Gemisch nach Standard-Verfahren unter Verwendung einer, mit einem Diäthylaminoäthyl-Dextran gefüllten Kolonne sowie von Papier- und Dünnschicht-Chromatographie isoliert.

Der nach der Natriumchloridextraktion der Nucleinsäuren verbleibende unlösliche Rückstand besteht hauptsächlich aus unlöslichem Protein und wird mit Salzsäure nach Standard-Verfahren hydrolisiert. Das so gebildete Proteinhydrolysat (dessen Radioaktivität etwa 60% der Radioaktivität der geernteten Zellen beträgt) wird nach Standard-Verfahren unter Bildung von radiochemisch reinen Aminosäuren fraktioniert. Die vorstehend beschriebene Isolierung der ^l4C-markierten Verbindungen ist nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

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Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von ^l4C-markierten Verbindungen durch aerobes Vermehren einer Alge in einem Kulturmedium, cbs das ^l4C-lsotop in einer solchen Form enthält daß es von der Alge aufgenommen wird, und durch Gewinnen der 'Omarkierten Verbindungen aus den geernteten Algen nach bekannten Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gattung Anacystis verwendet wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Art Anacystis nidulans verwendet wird.