DE60112398T2

DE60112398T2 - Verfahren zur Einbringung von Fremdmaterial in höhere Zellen unter Verwendung eines Laserstrahls

Info

Publication number: DE60112398T2
Application number: DE60112398T
Authority: DE
Inventors: Akio Toyonaka City Kobayashi; Kiichi Osaka City Fukui; Satoshi Takatsuki City Harajima; Eiichiro Suita City Fukusaki; Shinichiro Takatsuki City Kajiyama; Shinya Ibaraki City Okuda; Takeshi Osaka City Shoji
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: Osaka University NUC
Priority date: 2000-12-25
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2021-12-21
Also published as: US7132289B2; DK1225228T3; EP1225228A3; US20020115219A1; EP1225228B1; JP2002325572A; AU9729001A; EP1225228A2; AU773342B2; DE60112398D1

Description

Hintergrund der Erfindung
(1) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einführung eines Fremdstoffes in eine lebende Zelle. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Einführung eines Fremdstoffes mit einer niedrigen physikalischen Festigkeit in eine lebende Zelle unter Anwendung eines Lasers.
(2) Beschreibung des Standes der Technik
Als Methoden zur Einführung von Fremdstoffen wie beispielsweise genetischen Substanzen in lebende Zellen sind eine Methode zur direkten Einführung eines Fremdstoffes in eine lebende Zelle unter Anwendung eines feinen Glasrohrs (Mikroinjektionsmethode), eine Methode zur Anwendung einer Zellfusionstechnik (eine Liposomenfusionsmethode und eine Protoplastenfusionsmethode), eine Einführungsmethode unter Verwendung eines Infektionsverfahrens (Agrobakterie-Methode), eine Methode zur Förderung der Membranpermeabilität (Elektropolationsmethode) und dergleichen bekannt, bei Anwendung einer allgemeinen Klassifizierung.
Nach der Mikroinjektionsmethode wird eine feine Mikropipette unter Verwendung eines Glasröhrchens hergestellt, mit einem Mikromanipulator verbunden und eine Flüssigkeit eines Fremdstoffes wird in eine Zelle, eine nach der anderen, unter Betrachtung mit einem Mikroskop eingeführt. Diese Methode eignet sich sehr gut als Fremdstoff-Einführungsmethode für tierische Zellen, die keine Zellwände aufweisen.
Als Methoden, die die Zellfusionstechnik anwenden, gibt es die Liposomenmethode, die Protoplastenfusionsmethode und dergleichen. Nach der Protoplastenfusionsmethode wird eine Colibakterie (Escherichia coli) oder dergleichen mit einem Coliplasmid zu einem Protoplasten umgewandelt, das mit einer Zielzelle mit Ethylenglycol oder dergleichen fusioniert wird, wodurch ein Gen in die Zelle eingeführt wird. Nach der Liposomenfusionsmethode wird ein Fremdstoff in eine Zielzelle durch Verwendung eines Liposoms als Träger eingeführt.
Als Infektionsprozess-verwendendes Einführungsverfahren ist ein Verfahren zur Einführung eines Gens unter Anwendung einer Agrobakterie, die ein Ti-Plasmid trägt, bekannt.
Nach der Elektropolationsmethode auf der Basis der Förderung der Membranpermeabilität wird eine Zelle in einer Lösung eines Fremdstoffes suspendiert, und DC pulsiert mit hoher Spannung auf die resultierende Lösung oder Suspension, und dadurch wird der Fremdstoff in die Zelle eingeführt.
Ferner ist eine "Gene-Gun"-Methode bekannt, bei der ein kleines Metallpartikel, das mit DNA überzogen ist, in eine Zelle eines Organismus geschossen wird, wodurch ein Gen durch eine Zellwand und/oder Zellmembran in die Zelle eingeführt wird. Ferner ist seit kurzem ein Verfahren bekannt, mit welchem ein Fremdstoff in eine Zelle unter Verwendung eines Lasers eingeführt wird. Diese herkömmlichen Methoden zur Einführung von Fremdstoffen in Zellen werden im wesentlichen zur Transformation der Zielzellen durch die Einführung von fremden Genen verwendet.
Das Dokument EP-A-0 137 504 offenbart die Einführung einer Lösung von Fremdproteinen in eine Zelle, indem ein Loch in eine Zellwand und/oder Zellmembran durch Bestrahlung der Zellen mittels einem Laser gebohrt wird.
Das Dokument US-A-5 916 788 offenbart einen Laserapparat, der fähig ist, ein Loch durch die Zellwand einer höheren Pflanze zu bohren, um eine Lösung von fremdem genetischen Material in die Zelle zu injizieren.
Mit den neuesten Fortschritten in der Biotechnologie haben sich im Hinblick auf die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, das molekulare Züchten von landwirtschaftlichen Produkten, die mit verschiedenen Toleranzen versehen sind, die Produktion von nützlichen Produkten einschließlich Viehbestand usw., durch Einführen von Fremdstoffen, die von Genen verschieden sind, z. B. Organellen wie z. B. Chloroplasten, Zellkernen, Chromosomen und Mitochondrien, physiologisch aktive Materialien und Indikatoren oder funktionellen Proteinen, in lebende Zellen neue Möglichkeiten ergeben. Ferner ist die Produktion von direkt transformierten Körpern, die weder eine De-Differenzierung noch eine Re-Differenzierung durchlaufen haben, vorstellbar im Fall von Pflanzen, z. B. indem ein Fremdstoff in eine bestimmte Zelle eines lebenden Gewebes eingeführt wird.
Folglich sieht man der molekularen Züchtung von vielen nützlichen Pflanzen entgegen, in denen das De-Differenzierungssystem oder Re-Differenzierungssystem noch nicht etabliert worden ist. Desweiteren sieht man der Produktion von transformierten Produkten entgegen, in denen eine Vielzahl von Charakteristika simultan transformiert werden, indem simultan mehrere Arten von Fremdstoffen in eine Zelle oder in Zellen eingeführt werden.
Unter diesem Gesichtspunkt treten Probleme im Hinblick auf Schwierigkeiten bei der Einführung von Fremdstoffen, die von Genen verschieden sind, im Fall der Geneinführenden Methode, die Ti-Plasmide tragende Agrobakterien einsetzt, der Protoplastenfusionsmethode und der "Gene-Gun"-Methode unter den herkömmlichen Methoden zur Einführung von Fremdstoffen auf. Ferner weisen zwar die Mikroinjektionsmethode, die Liposomenmethode und die Elektropolationsmethode die Möglichkeit der Einführung von Fremdstoffen, die von Genen verschieden sind, in Zellen auf, jedoch erfordern die Liposomenmethode und die Elektropolationsmethode eine Protoplastenkonversion, wenn sie auf Pflanzenzellen angewendet werden, so dass diese Methoden das Problem aufweisen, dass Schwierigkeiten bei der Einführung eines Fremdstoffes in eine bestimmte Zelle eines spezifischen Gewebes auftreten.
Die Mikroinjektionsmethode weist die Schwierigkeit auf, dass sie extrem schwierig anzuwenden ist, da es Erfahrung erfordert, eine Pflanzenzelle mit einer Zellwand, die stärker ist als jene einer tierischen Zelle, handzuhaben. Andererseits kann eine Lasermethode einen Fremdstoff in eine gegebene Zielzelle einführen, jedoch weist die herkömmliche Lasermethode das Problem auf, dass es schwierig ist, Fremdstoffe stabil in Zellen einzuführen, die eine extrem geringe physikalische Festigkeit aufweisen, wie z. B. künstliche Chromosomen oder makrostrukturelle Körper wie z. B. Organellen.
Folglich bestand das große Bedürfnis nach einer Entwicklung einer Methode, die einfach handzuhaben ist und eine breite Anwendbarkeit aufweist, die eine bestimmte Zelle als Zielzelle transformiert, und die einen Fremdstoff mit einer extrem niedrigen physikalischen Festigkeit, ausgewählt aus künstlichen Chromosomen und Organellen, in lebende Zellen einführen kann, unabhängig von der Art der Organismen. Jedoch ist bisher eine solche Methode zur Einführung von Fremdstoff in eine lebende Zelle nicht bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist folglich eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Methode bereitzustellen, bei der eine chemische Bindung eines Biopolymers, aus dem eine Zellwand aufgebaut ist, durch Anwendung einer Hochleistungseigenschaft eines Laserstrahls ausgeschnitten wird, wodurch ein Fremdstoff in eine Zelle eingeführt wird, wie in Anspruch 1 angegeben.
Bei der Durchführung von Untersuchungen zur Lösung der vorstehend angegebenen Probleme haben die vorliegenden Erfinder festgestellt, dass robuste Zellwände, insbesondere Pflanzenzellwände, von lebenden Zellen durchbohrt werden können, indem die Hochleistungseigenschaft (high processing characteristic), die ein Laserstrahl aufweist, verwendet wird. Folglich führten die Erfinder die vorliegende Erfindung aus.
Das heißt, das Verfahren zur Einführung von Fremdstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte von Platzieren eines kleinen Partikels, der einen Fremdstoff wie in Anspruch 1 angegeben trägt, auf einer Zelloberfläche einer lebenden Zelle, Bohren eines Lochs in diesem Teil der Zellwand und/oder Zellmembran durch Bestrahlen und Behandeln dieses Teils der Zelloberfläche mit einem Laserstrahl und Einführen des Fremdstoffes in die lebende Zelle.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der lebenden Zelle um eine Zelle einer Pflanze, und mindestens ein Teil der Zellwand der Pflanzenzelle wird entfernt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung wird mindestens ein Teil der Zellwand durch Bestrahlung mit einem Laserstrahl oder durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl in Kombination mit einer Behandlung mit einem Hydrolyseenzym entfernt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Methode zur Einführung eines Fremdstoffes gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem kleinen Partikel um ein Feinpartikel mit einem Partikeldurchmesser von 0,01 μm bis 10 μm.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Partikel um ein Liposom, das den Fremdstoff enthält.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem kleinen Partikel um ein Kügelchen, das den Fremdstoff fixiert.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Fremdstoff fixiert, indem eine wässrige Lösung, die mindestens einen Fremdstoff und ein Härtungsmittel enthält, in eine Emulsion vom Wasser-in-Öl-Typ mit einem härtbaren Ausgangsmaterial in Wasser gegeben wird, und ein gehärtetes Reaktionsprodukt gebildet wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem härtbaren Ausgangsmaterial um Natriumalginat, bei dem Härtungsmittel um Calciumchlorid und bei dem gehärteten Reaktionsprodukt um Calciumalginat.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Laser um mindestens einen Laser, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem YAG-Laser, einem Eximer-Laser, einem Ar-Ion-Laser, einem Stickstoff-Laser und einem Stickstoff-angeregtem Farb-Laser (nitrogen-excited color laser).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Fremdstoff um mindestens ein Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem künstlichen Chromosom und Organellen.
Gemäß einem Aspekt der Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine lebende Zelle mit einem Laserstrahl bestrahlt, ein Teil der Zellwand der lebenden Zelle wird ausgebohrt, ein Teil der Zellmembran wird exponiert, ein Liposom, das einen Fremdstoff enthält, wird auf der exponierten Zellmembran angeordnet und die exponierte Zellmembran wird mit dem Liposom fusioniert, wodurch der Fremdstoff in die lebende Zelle eingeführt wird. Als Fremdstoff werden ein künstliches Chromosom und Organellen verwendet.
Die Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem (1) das kleine Partikel, das den Fremdstoff trägt, um ein gebohrtes Loch herum angeordnet wird, und (2) das Liposom, das den Fremdstoff enthält, um das gebohrte Loch herum platziert wird und die Zellmembran mit dem Liposom fusioniert wird. Als lebende Zellen, die die Zielzellen gemäß der vorliegenden Erfindung darstellen, können tierische Zellen, Pflanzenzellen, Mikroorganismen und dergleichen angegeben werden.
Zunächst wird die Methode (1), umfassend die Schritte des Anordnens eines kleinen Partikels, das einen Fremdstoff wie in Anspruch 1 angegeben trägt, auf einer Zelloberfläche einer lebenden Zelle, des Bohrens eines Lochs in eine Zellwand und/oder eine Zellmembran, indem dieser Teil der Zelloberfläche mit einem Laserstrahl bestrahlt und behandelt wird, und des Einführens des Fremdstoffes in die lebende Zelle, erläutert.
Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung anzuwendende Laser ist nicht sonderlich eingeschränkt. Der Laser ist sehr geeignet, da er eine hervorragende Lichtkondensationsfähigkeit aufweist, während er beinahe keinen Wärmeeinfluss auf einen anderen Teil als den Laserstrahlpunkt aufweist. Als Laser können der YAG-Laser, der Eximer-Laser, der Ar-Ion-Laser, der Stickstoff-Laser, der Stickstoff-angeregte Farb-Laser und dergleichen angegeben werden. Der Eximer-Laser ist unter dem Gesichtspunkt, dass eine Hitzeschädigung der bearbeiteten Zelle besonders gering ist, die Verarbeitungsgenauigkeit hoch ist und die Verarbeitungstiefe über die Bestrahlungsenergie und die Anzahl von Bestrahlungen einfach eingestellt werden kann, bevorzugt.
Die Bestrahlungsbedingungen des Lasers auf die lebenden Zellen können in Abhängigkeit der Arten der lebenden Zellen geeignet verändert werden.
Der Durchmesser des Laserpunktes (laser spot) ist beispielsweise in einem Bereich von 1 bis 100 μm. Vorzugsweise liegt er im Bereich von 5 bis 30 μm. Der Grund für diesen Bereich liegt darin, dass es sich dabei um eine Größe handelt, die groß genug ist, um nach der Bestrahlung Fremdstoff einzuführen, und dass eine Schädigung der Zelle gering ist.
Die Energiedichte des Lasers ist nicht sonderlich eingeschränkt, liegt jedoch in einem Bereich von 1 bis 100 mJ/cm². Vorzugsweise liegt sie in einem Bereich von 30 bis 80 mJ/cm². Der Grund für diesen Bereich liegt darin, dass wenn die Energiedichte weniger als 1 mJ/cm² beträgt, die Zellwand nicht ausreichend bearbeitet werden kann, während wenn sie größer als 100 mJ/cm² ist, der Laser die Zellmembran penetriert und die Zelle stark schädigt.
Ferner kann der Laser in einem Bereich einer höheren Energiedichte als vorstehend angegeben eingesetzt werden, insbesondere wenn die Zellwand vollständig mit einer Bestrahlung entfernt werden soll. In diesem Fall liegt ein bevorzugter Bereich der Energiedichte bei 500 bis 700 mJ/cm². Der Grund dafür, weswegen die Energiedichte in diesem Bereich liegt, wenn die Zellwand vollständig mit einer Bestrahlung entfernt werden soll, liegt darin, dass wenn sie weniger als 500 mJ/cm² beträgt, der Laser nicht sicher die Zellwand penetrieren kann, während wenn sie mehr als 700 mJ/cm² beträgt, der Laser die Zellwand penetrieren kann, jedoch die Überlebensrate der Zelle anschließend abnimmt.
Die Ausgangsleistung (output) des Lasers liegt bevorzugt in einem Bereich von 1 bis 1000 mJ/cm², und noch bevorzugter zwischen 10 und 100 mJ/cm².
Die Größe des durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl gebohrten Lochs ist nicht beschränkt, auch wenn sie von der Größe des einzuführenden Fremdstoffes abhängt. Beispielsweise liegt die Größe des gebohrten Lochs in einem Bereich von etwa 1 bis 1000 μm². Wenn ein relativ großer Stoff wie eine Organelle einzuführen ist, liegt die Größe des Lochs in einem Bereich von etwa 100 bis 1000 μm. Wenn ein relativ kleiner Stoff wie beispielsweise ein Plasmid einzuführen ist, so ist die Größe des Lochs in einem Bereich von etwa 1 bis 100 μm².
Der Laserstrahl wird unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gestrahlt, wodurch ein Loch in einem Teil der Zellmembran und/oder der Zellwand der lebenden Zelle gebohrt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das kleine Partikel, das den Fremdstoff trägt, auf einem Teil der Zellmembran angeordnet. In der tierischen Zelle ist die Zellmembran an der äußeren Peripherie der Zelle angeordnet, und kann einfach exponiert werden. Andererseits ist die Zellmembran der Pflanzenzelle innerhalb der Zellwand angeordnet, so dass die Zellwand entfernt werden muss. Die Zellwand kann unter Verwendung einer üblichen Protoplasten-Konversionsmethode entfernt werden.
Die gesamte Zellwand oder ein Teil der Zellwand kann entfernt werden, indem sie mit dem Laser bestrahlt wird, während die Bestrahlungsstärke frei eingestellt und variiert wird, so dass ein Loch insbesondere lokal in der Zellwand gebohrt werden kann. Während eine Reihe von intakten Zellen in der Nähe der bestrahlten Zelle beibehalten werden, kann folglich der Fremdstoff genau in lediglich die gewünschte Zelle eingeführt werden, die hervorragend transformieren und lediglich die spezifische Zelle, in welche der Fremdstoff eingeführt worden ist, multiplizieren kann.
Als Methode zum Platzieren des kleinen Partikels können beispielsweise eine Methode unter Verwendung eines Mikromanipulators, eines Paars von optischen Pinzetten oder dergleichen angegeben werden.
Im folgenden wird erläutert, wie das kleine Partikel, das den Fremdstoff trägt, hergestellt werden kann. Das kleine Partikel steht für ein Feinpartikel, das den Fremdstoff tragen (enthalten, absorbieren, befestigen usw.) und den Fremdstoff nach der Einführung in die Zelle freisetzen kann. Das kleine Partikel wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Liposomen, Metallteilchen wie z. B. einem Goldteilchen oder einem Wolframteilchen, Siliciumcarbid-Whiskern und Kügelchen, die aus Alginsäure, κ-Carrageenan und wasserlöslichen gelierten Polysacchariden aufgebaut sind.
Im folgenden werden beispielhaft Kügelchen als kleine Partikel erläutert, jedoch ist die Erfindung nicht darauf beschränkt.
Bei dem Material der Kügelchen handelt es sich um ein einwertiges Salz von Alginsäure, eine wässrige Lösung von κ-Carrageenan und wasserlösliche gelierte Polysaccharide wie z. B. Agar und Gellangummi.
Der Fremdstoff kann auf dem kleinen Partikel geträgert werden, indem eine wässrige Lösung, die mindestens einen Fremdstoff und ein Härtungsmittel enthält, in eine Emulsion vom Wasser-in-Öl-Typ mit einem härtbaren Ausgangsmaterial in Wasser gegeben und ein gehärtetes Reaktionsprodukt gebildet wird. Als härtbares Ausgangsmaterial kann beispielsweise Natriumalginat genannt werden. Als Härtungsmittel kann beispielsweise Calciumchlorid genannt werden. In diesem Fall handelt es sich bei dem gehärteten Reaktionsprodukt um Calciumalginat. Sofern ein Paar optischer Pinzetten verwendet wird, um den Fremdstoff mit guter Bedienbarkeit in die Zelle einzuführen, wird Calciumalginat unter dem Gesichtspunkt, dass Calciumalginat die folgenden Bedingungen (1) bis (9) erfüllt, die für die Methode mit optischen Pinzetten erforderlich sind, vorzugsweise eingesetzt.

(1) Das gehärtete Reaktionsprodukt ist ein Material, das als Lösung vorliegt, in der ein Fremdstoff wie z. B. DNA vor der Verfestigung gelöst oder suspendiert ist, während es nach der Verfestigung als ein Feststoff oder ein Gel, das in gewissem Ausmaß in der wässrigen Lösung stabil ist, vorliegt.
(2) Das gehärtete Reaktionsprodukt lässt Licht durch und besitzt einen Brechungsindex, der höher ist als jener von Wasser, so dass die Manipulierung mit den optischen Pinzetten möglich ist.
(3) Das gehärtete Reaktionsprodukt besitzt ein spezifisches Gewicht, das gleich oder leicht höher ist als jenes von Wasser.
(4) Die Bedienungsschritte sind einfach.
(5) Das gehärtete Reaktionsprodukt kann unter Verwendung von üblichen Materialien und einer üblichen Vorrichtung hergestellt werden.
(6) Das gehärtete Reaktionsprodukt unterbricht nicht das Zellwachstum der Zelle.
(7) Nach der Herstellung der Kügelchen und der Fixierung bleibt der Fremdstoff wie z. B. DNA stabil im gehärteten Reaktionsprodukt.
(8) Das gehärtete Reaktionsprodukt kann verarbeitet werden, um einen Durchmesser von nicht mehr als 10 μm für dessen Einführung in die Zelle aufzuweisen.
(9) Das gehärtete Reaktionsprodukt setzt den Fremdstoff innerhalb der Zelle frei.

Als Materialien, die die vorstehend beschriebenen Bedingungen (1) bis (9) erfüllen, können neben Calciumalginat auch Liposomen genannt werden.
Die vorstehend beschriebene Emulsion vom Wasser-in-Öl-Typ wird aus einer wässrigen Lösung eines einwertigen Salzes von Alginsäure zur Einführung eines Fremdstoffes in Kügelchen mit einem organischen Lösungsmittel, das nicht mit Wasser mischbar ist, und Suspendieren der Kügelchen mittels einer Ultraschallbehandlung erhalten. Die resultierende Emulsion vom Wasser-in-Öl-Typ wird geliert, indem eine wässrige Lösung, die zweiwertige oder höherwertige Kationen und den Fremdstoff enthält, zur Emulsion zugegeben und vermischt werden. Dadurch können Kügelchen, die den Fremdstoff im Inneren und auf der Oberfläche davon enthalten, in einem Partikeldurchmesser von 0,01 bis 10 μm gebildet werden. Die Form der Kügelchen ist nicht besonders beschränkt, ist jedoch vorzugsweise kugelförmig.
Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Kügelchen ist vorzugsweise ein Kügelchen aus Calciumalginat. Das Calciumalginat wird nicht nur aus den vorstehend beschriebenen Gründen verwendet, sondern auch weil Alginsäure mit zweiwertigen Calciumionen geliert. Das Kügelchen kann erhalten werden, indem eine Lösung von Alginsäure in einem organischen Lösungsmittel/Wasser-Emulsionssystem emulgiert wird, anschließend Calciumchlorid zugemischt und gerührt wird. Das organische Lösungsmittel, welches bei der Emulgierung eingesetzt wird, ist nicht besonders eingeschränkt, es können beispielsweise Isoamylalkohol, Butanol usw. genannt werden.
Das Kügelchen kann auch hergestellt werden, indem die Alginsäurelösung unter Verwendung eines Zellsortierers in einen feinen Flüssigkeitstropfen umgewandelt wird, und dieser in die Calciumchloridlösung getropft wird.
Wenn eine 0,5%-ige bis 3%-ige wässrige Lösung von Natriumalginat tropfenweise in eine wässrige Lösung von etwa 50 mM Calciumchlorid zugegeben wird, kann ein Gel hergestellt werden, das semi-transparent ist und ein höheres spezifisches Gewicht als jenes von Wasser aufweist. Vorzugsweise liegt die Konzentration der wässrigen Natriumalginatlösung bei 0,5% bis 3%, und jene des Calciumchlorids bei 50 mM bis 1000 mM. Der Grund für diese Bereiche liegt darin, dass wenn die Konzentration der wässrigen Natriumalginatlösung nicht mehr als 0,25% beträgt oder wenn die Konzentration von Calciumchlorid nicht mehr als 25 mM beträgt, es vorkommen kann, dass Natriumalginat nicht geliert. Ferner, wenn die Konzentration des Natriumalginats höher als 3% liegt, besteht die Neigung, dass die Größe des Flüssigkeitstropfens beim Emulgieren ansteigt. Um Kügelchen mit einer sinnvollen Größe (10 μm bis 0,1 μm) herzustellen, ist es bevorzugt, dass die Konzentration der wässrigen Natriumalginatlösung 0,5% bis 1,5% beträgt, und dass jene von Calciumchlorid 50 mM bis 200 mM beträgt.
Wenn die Emulsion in einer wässrigen Lösung von 10 mM Calciumchlorid suspendiert und die Suspension auf ein Nylonnetz mit einem Porendurchmesser von beispielsweise 5 μm gegeben wird, und einer Zentrifugalfiltration bei 500 UpM für 5 Minuten unterworfen wird, um Kügelchen mit Größen von mehr als 5 μm zu entfernen, können kleinere Kügelchen erhalten werden.
Die Kügelchen werden vorzugsweise in einer wässrigen Lösung von 10 mM Calciumchlorid gelagert. Eine Solbildung wird verhindert, da die Kügelchen in einer Lösung, die EDTA oder EGTA enthält, welche zweiwertige Kationen gelatisieren, oder einer Lösung, die einwertige Kationen in hoher Konzentration enthält, rasch in einen Solzustand übergehen.
Die Konzentration an Calcium liegt vorzugsweise bei weniger als 1 M. Wenn sie mehr als 1 M beträgt, ist es wahrscheinlich, dass die Kügelchen ausflocken, wodurch es schwierig sein kann, sie erneut zu suspendieren. Wenn die Zentrifugaltrennung bei 7000 UpM oder mehr zum Rückgewinnen durchgeführt wird, ist es ebenfalls wahrscheinlich, dass die Kügelchen ausflocken, wodurch es schwierig wird, sie erneut zu suspendieren.
Wie vorstehend angegeben kann der Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung in die lebende Zelle über das kleine Partikel eingeführt werden. Als Fremdstoff, der in die Zelle eingeführt werden kann, wird eine Organelle oder ein Chromosom eingesetzt.
Das Verfahren, nach welchem das kleine Partikel, das den Fremdstoff trägt, in die lebende Zelle eingeführt wird, ist im folgenden beschrieben.
Ein Loch kann in eine Zellmembran innerhalb eines bestimmten Zeitraums mittels Bestrahlung mit Laser gebohrt werden. Das kleine Partikel kann durch das derart gebohrte Loch in die Zelle fließen. Nachdem das kleine Partikel in die Zelle aufgenommen worden ist, wird das Loch geschlossen, so dass die Zellmembran wieder ihren ursprünglichen Zustand annimmt. Tatsächlich wird das Loch in der Membran in einem kurzen Augenblick mittels Bestrahlung mit dem Laser gebohrt, und nahezu simultan fließt das kleine Partikel in die Zelle.
Wenn das kleine Partikel, das den Fremdstoff enthält, eine geeignete Kügelchengröße aufweist, kann es in die Zelle der Pflanze mittels Endocytose aufgenommen werden.
Das derart aufgenommene kleine Teilchen setzt den Fremdstoff, der darin enthalten ist, in das Innere der Pflanzenzelle frei. Die Größe des Kügelchens für eine einfache Aufnahme liegt vorzugsweise bei 0,01 bis 1 μm im Partikeldurchmesser.
Wenn es sich bei der lebenden Zelle um eine kultivierte Zelle eines Tiers wie z. B. eines Menschen oder eines chinesischen Hamsters handelt, so wird das kleine Partikel in die Zelle mittels Phagocytose aufgenommen und setzt den Fremdstoff frei, wenn die kultivierte Zelle (der Pflanze) mit dem Kügelchen vermischt wird. Die Größe des Kügelchens für eine einfache Aufnahme ist vorzugsweise 0,1 bis 0,5 μm im Partikeldurchmesser.
Wenn es sich bei der lebenden Zelle um eine Hefe handelt, so wird das Kügelchen, das den Fremdstoff enthält, mittels Endocytose in die Hefe aufgenommen, wenn das kleine Partikel mit der Hefe, welche in Form eines Sphäroplasten umgewandelt wurde, vermischt wird. Die Größe des Kügelchens für eine einfache Aufnahme ist vorzugsweise 0,01 bis 1 μm im Partikeldurchmesser.
Als nächstes wird eine Methode erläutert, bei der ein Loch in einem Teil einer Zellmembran und/oder Zellwand einer lebenden Zelle gebohrt wird, indem die lebende Zelle mit einem Laserstrahl bestrahlt wird, ein Liposom, das einen Fremdstoff enthält, um das derart gebohrte Loch herum angeordnet wird, und der Fremdstoff in die lebende Zelle eingeführt wird, wie in Anspruch 11 beschrieben.
Die gebräuchliche Liposomenmethode weist eine geringe Wirksamkeit auf und erfordert eine komplizierte Handhabung. Nach dem Verfahren zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung können solche Defekte jedoch überwunden werden, indem das Loch mit dem Laserstrahl gebohrt wird.
Das Liposom kann auf das Loch platziert werden, indem eine Lösung, die das Liposom enthält, unter Anwendung einer Mikropipette, einer Glaskapillare, eines Mikromanipulators oder dergleichen zugetropft wird. Als das Liposom enthaltende Lösung kann eine Lösung genannt werden, die Polyethylenglycol, Mannitol, Calciumchlorid usw. enthält. Polyethylenglycol und Calciumchlorid werden verwendet, um die Fusion zwischen dem Liposom und der Zellmembran zu fördern. Die Konzentration von jedem davon wird in Abhängigkeit der tatsächlich untersuchten Zelle geeignet eingestellt. Mannitol wird verwendet, um den osmotischen Druck zwischen der exponierten Zellmembran der Zelle und der zuzutropfenden Lösung anzugleichen. Die Konzentration an Mannitol wird ebenfalls in Abhängigkeit der tatsächlich untersuchten Zelle eingestellt.
Die Kombination der Lasermethode mit der Liposomenmethode weist die folgenden Vorteile auf. Bei der gewöhnlichen Liposomenmethode ist es notwendig, dass die gesamte Gewebeprobe einer Zielpflanze mit einem Enzym behandelt wird, und eine Zelle verwendet wird, die vollständig in Form eines Protoplasten umgewandelt wurde. Daher kann eine Zelle, in welche ein Fremdstoff eingeführt werden soll, nicht genau bestimmt werden.
Andererseits können mit der Kombination des Lasers mit der Liposomenmethode gemäß der vorliegenden Erfindung (1) Zielpflanzen, auf die die erfindungsgemäße Methode angewendet werden kann, aus einem weiten Bereich ausgewählt werden, da nicht das gesamte Pflanzengewebe in einen Protoplasten umgewandelt werden muss, und (2) ein physikalisch schwacher Fremdstoff, ausgewählt aus künstlichen Chromosomen und Organellen, sicher in die Zelle eingeführt werden.
Es können die gleichen Laserbestrahlungsbedingungen wie die Art des Lasers, die Bestrahlungsbedingungen, der Punktdurchmesser und dergleichen wie in den Fällen der Verwendung der vorstehend beschriebenen kleinen Partikel in der erfindungsgemäßen Methode, bei der der Laserstrahl und die Liposomenmethode zusammen eingesetzt werden, angewendet werden.
Es können ferner die gleichen einführbaren Fremdstoffe wie im Fall der Verwendung der vorstehend beschriebenen kleinen Partikel eingesetzt werden.
Wie vorstehend angegeben, ist es in Übereinstimmung mit der Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, eine Organelle wie z. B. ein Nukleus oder ein Chromosom des gleichen oder eines anderen Organismus oder eine große DNA wie z. B. ein künstlich hergestelltes Chromosom in eine lebende Zelle einzuführen. Folglich kann ein Multigen, das bisher nur schwer eingeführt werden konnte, zusammen eingeführt werden. Beispielsweise kann eine Gruppe von Genen, die an der Biosynthese einer nützlichen physiologisch aktiven Substanz beteiligt sind, zusammen eingeführt werden, um wirksam solch eine Substanz in einem schnellwachsenden lebenden Organismus zu produzieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen, worin:
1 eine Abbildung einer Zellwand ist, von der ein Teil mittels Laserbestrahlung entfernt wurde.
2(a) eine fluoreszierende Abbildung ist, die durch Betrachten des fluoreszierenden Lichtes erhalten wurde, und 2(b) eine Hellfeld-Abbildung ist.
3(a) und 3(b) Fotografien sind, die Goldteilchen zeigen, die in eine Zelle mittels Laserbestrahlung eingeführt wurden, wobei die 3(a) eine Mikrofotografie ist, die durch Fokussieren der Oberfläche der Zelle erhalten wurde, und die 3(b) eine Mikrofotografie ist, in welcher das Innere der Zelle fokussiert wurde.
4(a) und 4(b) Hellfeld-Abbildungen der Epidermis der betrachteten Zwiebel sind. 4(a) zeigt eine Hellfeld-Abbildung der Laser-bearbeiteten Zwiebel-Epidermiszelle auf der linken Seite und jene der Zelle, die Laser-bearbeitet und anschließend mit dem Enzym behandelt wurde, auf der rechten Seite, 4(b) zeigt eine Hellfeld-Abbildung des vorstehend Beschriebenen mit einer inzidenten Lichtquelle.
5 ist eine Abbildung, die mit fluoreszierendem Licht erhalten wurde, durch Betrachtung der vorstehend beschriebenen Probe, die mit einem Zellwand-Anfärbungsreagenz Fluostain angefärbt wurde, unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie.
6 zeigt eine transiente Expression von sGFP.
7 ist eine Hellfeld-Abbildung einer Epidermiszelle einer betrachteten Zwiebel.
8 ist eine Mikrofotografie, die zeigt, dass die sGFP-Plasmidlösung in eine Zelle eingeführt und darin transient exprimiert wurde.
Referenzbeispiele
Beispiel 1
Es wurde versucht, eine Substanz in eine Zelle zum Zeitpunkt der Bestrahlung mit einem Laser einzuführen. Calcein, bei dem es sich um einen Calciumionenindikator handelt und das häufig zur Bestätigung der Einführung von Substanzen in Zellen verwendet wird, wurde als einzuführendes Material eingesetzt. Ein 0,1 bis 1 μ-Tropfen der einzuführenden Substanz (eine Lösung von Calcein) wurde auf eine Epidermiszelle einer Zwiebel getropft. Ein Loch von 10 × 10 bis 30 × 30 μm wurde in die Zwiebelepidermiszelle durch die zugetropfte Lösung mit einem Eximer-Laser bei einer Energiedichte von 30 bis 90 mJ/cm² gebohrt. Mittels einem Fluoreszenzmikroskop wurde bestätigt, dass Calcein simultan mit der Bildung des Lochs in der Zwiebelepidermiszelle mittels dem Laser in die Zelle eingeführt wurde. Ferner wurde mit einem MTT bestätigt, dass die mit dem Laser bearbeitete Zelle 24 Stunden nach der Bearbeitung lebte.
Der Zustand einer Zellwand, von der ein Teil mittels Bestrahlung mit dem Eximer-Laser entfernt wurde, wurde mit einem Farblaser 3D-Profilmikroskop dreidimensional analysiert. Die Zellwand wurde von der Zwiebelepidermiszelle erhalten und die Laser-Anwendungsbedingungen waren: eine Energiedichte von 60 mJ/cm², eine bestrahlte Fläche von 20 × 20 μm² und eine Wellenlänge von 193 nm. Die Ergebnisse sind in der 1 dargestellt. Die 1 zeigt die Form einer Pore der Zellwand der Zwiebelepidermiszelle, die mit dem Laserstrahl behandelt wurde. Aus der 1 kann deutlich bestätigt werden, dass die Pore mittels Bearbeitung mit dem Laser gebildet wurde, während die Zelle anschwoll (1(a)).
Als nächstes wurde versucht, einen Fremdstoff in eine lebende Zelle einzuführen, indem ein kleines Partikel verwendet wurde. Als Fremdstoff wurde Fluoresceinisothiocyanat-D-Extran (üblicher Name: FITC-Dextran) verwendet, das bei Sigma Co., Ltd. kommerziell erhältlich ist. In Bezug auf das Molekulargewicht des FITC-Dextrans lag keine Beschränkung vor.
Herstellung von kleinen Partikeln
In ein 1,5 Mikro-Zentrifugenröhrchen wurden getrennt voneinander 1% Natriumalginat (100 μl) und Isoamylalkohol (900 μl) eingeführt. Die Mischung wurde für 15 Sekunden einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Zu der Lösung wurde eine 100 mM Lösung von Calciumchlorid, die mit FITC markiertes Dextran enthielt, zugegeben, wobei kleine Partikel suspendiert wurden. Die kleinen Partikel wurden durch ein Nylonnetz (Porengröße 10 μm) mittels eines Zentrifugiervorgangs bei 2000 UpM für 5 Minuten geführt. Die erhaltenen Partikel wurden wiederum mittels einem Zentrifugiervorgang durch eine Netz mit einer Porengröße von 5 Mikrometer geführt, wodurch kleine Partikel erhalten wurden. Diese kleinen Partikel wurden verwendet, um in Zellen eingeführt zu werden.
Einführung eines kleinen Partikels in eine Zelle
Eine Epidermiszelle wurde aus einer Zwiebel geschnitten, die nach einer hydrophonischen Methode in zwei Tagen gezüchtet wurde, und auf eine MS-Festkultur aufgetragen. Ein Teil der Zellwand wurde durch Bestrahlung einer Einführungszielzelle mit einem ArF-Eximer-Laserstrahl (193 nm) in einer Bestrahlungsfläche von 100 μm² bei einer Energiedichte von 40 mJ/cm² entfernt. Auf diese Seite wurde mit einem Mikromanipulator etwa 0,1 μl einer wässrigen Lösung getropft, in welcher die vorstehend beschrieben hergestellten FITC-Dextran-einschließenden kleinen Partikel suspendiert waren. Anschließend wurde ein ArF-Eximer-Laserstrahl (193 nm) auf diese Stelle durch die zugetropfte Lösung in einer Bestrahlungsfläche von 100 μm² bei einer Energiedichte von 10 mJ/cm² gestrahlt, wodurch eine kleines Partikel in die Zelle eingeführt wurde.
Die Einführung des kleinen Partikels wurde wie folgt bestätigt. Die Einführung des kleinen Partikels in die Zelle wurde bestätigt, indem Fluoreszenzlicht des FITC unter einem Farbmittel-trennenden IB angeregtem (U-MNIBA)-Filter mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops betrachtet wurde, bei dem ein aufgerichtetes Mikroskop vom Typ OLYMPUS BX 50 mit einer Fluoreszenzvorrichtung BX-FLA mit inzidentem Licht verbunden war. Die 2(a) zeigt eine Fluoreszenzabbildung, die durch Betrachtung des Fluoreszenzlichts erhalten wurde, die 2(b) zeigt eine Hellfeldabbildung. Als Ergebnis waren die lebenden Zellen intakt, ohne zu beobachtende Abnormalitäten.
Beispiel 2
Als nächstes wurde versucht, einen Fremdstoff in eine Zelle einzuführen, unter Verwendung der Mikroinjektionsmethode nach Laserbestrahlung.
Ein Loch, 10 × 10–30 × 30 μm, wurde in eine Epidermiszelle einer Zwiebel mit dem Eximer-Laser bei einer Energiedichte von 30 bis 90 mJ/cm² gebohrt. Eine Calceinlösung wurde unter Verwendung einer Mikroinjektion durch das im Laservorgang gebohrte Loch in die Zelle eingeführt. Mit dem Fluoreszenzmikroskop konnte beobachtet werden, das die Calceinlösung in die Zelle eingeführt worden war.
Beispiel 3
Dreißig Tage nach Einpflanzung eines Samens einer SR-1 Tabakpflanze in ein MS-Medium wurde ein Kotyledon verwendet und mit einem Eximer-Laser laserbearbeitet. Die Energiedichte des Lasers lag bei 30 bis 90 mJ/cm² und es wurde ein Loch in einer Größe von 10 × 10–30 × 30 μm gebohrt. Ein Zellwand-verdauendes Enzym wurde auf das Loch getropft, das mittels der Laserbearbeitung gebohrt worden war. 20 Stunden später wurde eine Protoplastenzelle eines Mesophylls, in der die Zellwand nahe des Loches verdaut worden war, isoliert und betrachtet.
Beispiel 4 Einführung eines Liposoms in eine Zelle
FITC-DEXTRANFLUORESCEINISOTHIOCYANAT-DEXTRAN (üblicher Name: FITC-DEXTRAN), das von Sigma, Co., Ltd. erhältlich ist, wurde eingesetzt. In Bezug auf das Molekulargewicht des FITC-DEXTRANS lag keine Einschränkung vor.
Herstellung von Liposomen
L-α-Dioleoyl-phosphatidylethanolamin und N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium wurden jeweils in Chloroform in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst. Die resultierenden Lösungen wurden 200 μl : 200 μl vermischt und das Chloroform wurde bei einer niedrigen Temperatur unter reduziertem Druck vollständig aus der vermischten Lösung verdampft. Es bildete sich simultan mit der Verdampfung ein dünner Lipidfilm. Zu diesem dünnen Film wurde 50 μl einer Probenlösung, die FITC-Dextran erhielt, zugegeben, und für 5 Minuten auf dem Film stehen gelassen. Anschließend wurden 450 μl einer Pufferlösung 10 mM Tris-HCl, pH 5,8, zugegeben, und für 15 Minuten stehen gelassen. Der dünne Lipidfilm, die Probenlösung und die Pufferlösung wurden unter Rühren mit einem Vortex vermischt, wodurch ein Liposom hergestellt wurde, das FITC-Dextran enthielt.
Einführung des Liposoms in eine Zelle
Eine Epidermiszelle wurde aus einer Zwiebel ausgeschnitten, die für zwei Tage nach der hydrophonischen Methode gezüchtet worden war, und in ein MS-Festmedium eingebettet. Ein Eximer-Laserstrahl wurde auf die Zwiebelepidermis gestrahlt, um die Epidermis zu bearbeiten. Zu diesem Zeitpunkt betrug die bestrahlte Fläche 100 bis 400 μm², und die Energiedichte lag bei 20 bis 60 mJ/cm². Eine wässrige Suspension (enthaltend 6% Polyethylenglycol und 0,1 M Mannitol) des wie vorstehend beschrieben hergestellten Liposoms, das FITC enthält, wurde auf die bearbeitete Epidermis getropft. Ein Eximer-Laserstrahl wurd auf die aufgetropfte wässrige Suspension gestrahlt.
Betrachtung des eingeführten Liposoms
Während das Fluoreszenzlicht des FITC unter einem Farbauftrennungs-IB angeregtem (U-MNIBA)-Filter unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops betrachtet wurde, bei dem ein aufgerichtetes Mikroskop vom Typ OLYMPUS BX 50 mit einer vertikalen Fluoreszenzvorrichtung BX-FLA verbunden war, wurde eine kleiner Partikel in eine Zelle eingeführt.
Beispiel 5
Als nächstes wurde versucht, genetisches Material in eine Zelle einzuführen. Genauer gesagt wurde versucht, ein genetisches Material einzuführen, das auf einem Goldpartikel oder einem magnetischen Partikel absorbiert war.
Als erstes wurden 60 mg Goldpartikel in einem 1,5 ml kleinem Zentrifugenröhrchen abgewogen. Zu den Partikeln wurde 1 ml einer 70%-igen Lösung von Ethanol zugegeben, gefolgt von 5 Minuten Rühren. Nachdem die erhaltene Mischung für 15 Minuten stehen gelassen worden war, wurde sie einer Zentrifugenauftrennung bei 10000 UpM für etwa 3 bis 5 Sekunden unterworfen (Zentrifugenvorrichtung HITACHI himac CF15R Zentrifugenseparator, T15A23 Rotor). Nachdem überstehende Flüssigkeit entfernt worden war, wurde der Rest für eine Minute gerührt, nachdem 1 ml sterilisiertes Wasser hinzugegeben worden war. Nachdem die Mischung für eine Minute stehen gelassen worden war, wurde eine Zentrifugenauftrennung bei 10000 UpM für etwa 3 bis 5 Sekunden durchgeführt. Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde 2 mal wiederholt. Anschließend wurde flüssiger Überstand entfernt, und der Rest wurde in 1 ml einer zugegebenen 50%-igen Lösung Glycerol suspendiert. In Feinmengen-Zentrifugenröhrchen wurden separat 1,5 ml Feinmengen der Suspension eingeführt, die bis zur Anwendung bei –20°C gelagert wurden. Anschließend wurden 25 μl der Goldpartikel, eingeführt in ein Zentrifugenröhrchen und bei –20°C gelagert, in ein frisches 1,5 ml Feinmengen-Zentrifugenröhrchen eingeführt, welches gut gerührt wurde. In das Röhrchen wurden 3 μg Plasmid-DNA (Konzentration 1 mg/ml) eingeführt, gefolgt von Rühren für 2 bis 3 Minuten. Daraufhin wurden 25 μl 2,5 M CaCl₂ zu der Mischung zusätzlich zugegeben, gefolgt von Rühren für 2 bis 3 Minuten. Daraufhin wurden 10 μl 0,1 M Spermidin zusätzlich zu der Mischung zugegeben, gefolgt von Rühren für 2 bis 3 Minuten. Nachdem die Mischung für eine Minute stehen gelassen wurde, wurde sie einer Zentrifugenauftrennung bei 15000 UpM für eine Sekunde unterworfen. Nachdem überstehende Flüssigkeit entfernt worden war und 70%-iges Ethanol zu dem Rest zugegeben worden war, wurde die Mischung entlang der Wand des Röhrchens fließen gelassen. Anschließend wurde überstehende Flüssigkeit entfernt. Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde mit 100%-igem Ethanol wiederholt. Schlussendlich wurde das Produkt in 30 μl 100%-igem Ethanol suspendiert und die notwendige Menge der Suspension wurde für die Anwendung in eine Kapillare eingefüllt. Im Hinblick auf die magnetischen Partikel wurden die gleichen Verfahren durchgeführt. Es wurden Goldpartikel mit einem Partikeldurchmesser von 1 μm eingesetzt. Magnetische Partikel mit einem Durchmesser von 20 nm wurden eingesetzt. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Quantum-Prep, hergestellt von BIO-RAD Co., Ltd, gereinigt.
Die Plasmid-DNA, die mit den Goldpartikeln absorbiert war, wurde für die Einführung eingesetzt.
Eine Epidermiszelle einer Zwiebel wurde in ein 0,5% Agarmedium, das 0,5 M Mannitol enthielt, eingesetzt, das einer Plasmaauftrennung unterworfen wurde. Eine Zellwand wurde vollständig entfernt, indem eine Lücke (Abstand), die zwischen der Zellwand und einer Zellmembran durch die Plasmaauftrennung gebildet worden war, mit einem Laser in einer Quadratfläche von 10 μm × 10 μm bei einer Laserenergiedichte von 600 mJ/cm² erstellt wurde. Ein Fremdstoff wurde in die innere Lücke durch ein Laser-gebildetes Loch mittels Mikroinjektion eingeführt. Bei den verwendeten Fremdstoffen handelte es sich um Goldpartikel und magnetische Partikel mit absorbierter Plasmid-DNA, Plasmid-DNA-einschließende Alginsäurekügelchen, Liposomen usw. Nach der Einführung des Fremdstoffs wurde die Zwiebelepidermis in ein 0,5% Agarmedium, das 0,2 M Mannitol enthielt, eingepflanzt, um ein Plasma zu erhalten. Anschließend wurden nach 24 Stunden Kultur die Expression des für die Einführung verwendeten Gens beobachtet.
Genauer gesagt wurde als genetisches Informationsmaterial, das für den Fremdstoff eingesetzt wurde, ein chimäres Gen eingesetzt, in welchem ein Gen (Green Fluorescense Protein (GFP)), das für ein fluoreszierendes grünes Licht emittierendes Protein der Qualle (Aequorea victoria) kodiert, abwärts mit einem 35S-Promotor eines Blumenkohlmosaikvirus verbunden wurde. Dieses chimäre Gen wird in eine Pflanzenzelle eingeführt und exprimiert, um ein Protein zu produzieren, das eine grüne Fluoreszenz emittiert. Die Beurteilung, ob eine Expression stattgefunden hatte oder nicht, beruhte auf der Beobachtung der Lichtemission unter Verwendung einer Plasmid-DNA, die dieses chimäre Gen enthielt. Das lumineszierende Licht wurde mit dem aufgerichteten Fluoreszenzmikroskop (BX-50), hergestellt von OLYMPUS Co., Ltd. (BX-50), betrachtet. Genauer gesagt wurde eine Hellfeldaufnahme und eine Fluoreszenzaufnahme mit diesem Mikroskop betrachtet. Bei den im Rahmen dieser Fluoreszenzbetrachtung verwendeten Fluoreszenzfiltern handelte es sich um U-MWIB2, U-MWIBA2 oder U-MNIBA2.
Beispiel 6
Es wurde versucht, DNA-Plasmid, das auf Goldpartikeln oder dergleichen absorbiert war, auf die gleiche Art und Weise wie im Beispiel 5 einzuführen.
Eine Epidermiszelle einer Zwiebel wurde in ein 0,5% Agarmedium, das 0,5 M Mannitol enthielt, implantiert, welches einer Plasmaauftrennung unterworfen wurde. Eine Zellwand wurde teilweise oder vollständig entfernt, indem eine Lücke (Abstand), die zwischen der Zellwand und einer Zellmembran durch die Plasmaauftrennung geformt worden war, mit einem Laser in einer Quadratfläche von 10 μm × 10 μm bei einer Laserenergiedichte von 600 mJ/cm² erstellt wurde. Eine Lösung, die einen Fremdstoff wie z. B. Goldpartikel oder magnetischen Partikel, die Plasmid-DNA absorbieren, Plasmid-DNA-einschließende Alginsäurekügelchen oder Liposomen oder dergleichen enthielt, wurde auf die durch die Laserverarbeitung gebildete Pore mittels Mikroinjektion getropft. Anschließend wurde erneut eine Laserbestrahlung durchgeführt, sodass die Fremdstoff-enthaltende Lösung in die Lücke (Abstand) floss, die durch die Trennung des Plasmas gebildet worden war. Die Zwiebelepidermiszelle wurde in ein 0,5% Agarmedium, das 0,2 M Mannitol enthielt, eingepflanzt, um ein Plasma zu gewinnen. Anschließend wurde nach 24 Stunden Kultur die Expression des für die Einführung eingesetzten Gens mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Die Betrachtung wurde durchgeführt, indem ein Gen eingesetzt wurde, das für das Fluoreszenzgrünlichtemissionsprotein der Qualle (Aequorea victoria) kodiert, auf die gleiche Art und Weise wie im Beispiel 5.
Beispiel 7
Als nächstes wurde erneut eine Einführung während der Laserbearbeitung für eine Zelle untersucht, die zuvor mit Laser bearbeitet worden war.
Als einzuführendes Material wurde ein DNA-Plasmid, absorbiert auf Goldpartikeln, wie in Beispiel 5 verwendet.
Ein Teil der Zellwand wurde durch Laserbearbeitung einer Epidermiszelle einer Zwiebel in einer Quadratfläche von 10 μm × 10 μm bei einer Laserenergie von 60 mJ/cm² abgeschält. Eine Lösung, enthaltend Goldpartikel oder magnetische Partikel, die die Plasmid-DNA absorbieren, wurde auf die Pore, die durch Laserbearbeitung gebildet worden war, mit Hilfe der Mikroinjektion getropft. Der Fremdstoff wurde in die Zelle eingeführt, indem erneut eine Laserbestrahlung durchgeführt wurde. Nachdem der Fremdstoff eingeführt worden war, wurde die laserbehandelte Zelle für 24 Stunden gezüchtet, und die Expression des Gens wurde mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Die Betrachtung wurde durchgeführt, indem ein Gen verwendet wurde, das für das Fluoreszenzgrünlichtemissionsprotein der Qualle (Aequorea victoria) kodierte, auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 5.
Die 3(a) und 3(b) sind Fotographien, die zeigen, dass Goldpartikel in eine Zelle mittels Laserbestrahlung eingeführt wurden. Bei der 3(a) handelt es sich um eine Mikrofotographie, die erhalten wurde, indem die Oberfläche der Zelle fokussiert wurde. Diese Mikrofotographie ist eine Hellfeld-Abbildung, die erhalten wird, wenn eine Oberflächenschicht der Epidermiszelle der Zwiebel abgeschält wurde mittels der Laserbearbeitung, und die Goldpartikel auf den bearbeiteten Porenteil mittels eines Mikromanipulators aufgetragen wurden. Bei diesem Bild wurde die Oberfläche der Zelle fokussiert. Bei der 3(b) handelt es sich um eine Mikrofotographie, in welcher das Innere der Zelle fokussiert wird. Im Vergleich zur vorstehend beschriebenen Probe wurde die Fokussierung in das Innere der Zelle verschoben. Dies zeigt, das die Goldpartikel innerhalb der Zelle vorliegen.
Beispiel 8
Als nächstes wurden die vollständige Entfernung eines Teils einer Zellwand und Einführung eines Materials untersucht, mittels Durchführung einer Laserbearbeitung einer Pflanzenzelle in Kombination mit der Verwendung eines Zellwand-abbauenden Enzym.
Eine Eximer-Laser wurde auf eine Epidermiszelle eines Stamms einer Torenia-Pflanze gestrahlt. Die Laserbestrahlung wurde in einer Quadratfläche (Größe) 5 × 5–10 × 10 μm durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt lag die Energiedichte bei 60 bis 80 μJ/cm². Nach der Laserbearbeitung wurde das Zellwand-abbauende Enzym (0,1% Pectolyase Y23, 1% Cellulase Onozuka RS, 0,4 M Mannitol, pH 5,5) direkt auf die mit dem Laser bearbeitete Stelle mittels einer Mikrokapillare aufgetropft. Anschließend (etwa 15 bis 30 Minuten später) wurde die Zelle mit sterilisierten destillierten Wasser gewaschen (der Abbau der Zelle wurde beendet, indem die Enzymlösung abgewaschen wurde). Mit dem aufgerichteten Mikroskop konnte bestätigt werden, dass die Zellwand nahe der Laser-verarbeiteten Stelle abgebaut und vertieft war. Um zu bestätigen, dass die Zellwand vollständig entfernt worden war, wurde eine 0,1% wässrige Lösung von Fluostain direkt auf die Laser-verarbeitete Stelle mittels einer Mikrokapillare aufgetropft. Nach Anfärben für 5 Minuten wurde diese Stelle mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, wodurch bestätigt wurde, dass der Laser-verarbeitete Teil nicht angefärbt worden war. Andererseits, wenn eine Zelle lediglich mit einem Laser bei einer niedrigen Energiedichte bearbeitet und der gleichen Behandlung wie vorstehend unterzogen wurde, konnte beobachtet werden, dass die Laser-verarbeitete Stelle angefärbt wurde. Folglich wird davon ausgegangen, dass die Zellwand vollständig durch Abbau entfernt, wenn die Flüssigkeit, die das Zellwand-abbauende Enzym enthält, auf die mit dem Laser bearbeitete Stelle aufgetragen wurde.
Als nächstes wurde eine Mikrokapillare in die vorstehend beschriebene bearbeitete Stelle mittels Mikroinjektion eingestochen, um eine DNA-Lösung einzuführen. In der DNA-Lösung wurde eine Plasmid-DNA mit GFP verwendet. Nach der Mikroinjektion wurde die Pflanze in ein MS-Plattenmedium überführt, gefolgt von Kultivieren für 24 Stunden. Die Fluoreszenz von GFP wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Olympus BX50) betrachtet.
Die 4(a) und 4(b) sind Hellfeld-Abbildungen der untersuchten Epidermiszelle der Zwiebel. Die 4(a) zeigt eine Hellfeld-Abbildung der Laser-bearbeiteten Zwiebelepidermiszelle auf der linken Seite und jene der Laser-bearbeiteten und anschließend mit dem Enzym behandelten Zelle auf der rechten Seite. Die 4(b) zeigt Hellfeld-Abbildungen des vorstehend beschriebenen, betrachtet mit einer indizenten Lichtquelle.
Die 5 ist eine Abbildung, die mit Fluoreszenzlicht erhalten wurde, durch Betrachtung der vorstehend beschriebenen Probe, die mit einem Zellwand-anfärbenden Reagenz, Fluostain, angefärbt wurde, unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. In der rechten Abbildung ist ein Mittelteil nicht mit dem Reagenz angefärbt, wie aus dem Vergleich mit der Abbildung auf der linken Seite gesehen werden kann. Es wird folglich angenommen, dass in der rechten Abbildung eine Zellmembran exponiert ist.
Die 6 zeigt eine transiente Expression von sGFP. Das heißt, die 6 ist eine Abbildung, die erhalten wird, indem die Expression von sGFP mit dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet wird, nachdem Laser auf die Epidermiszelle eines Stamms einer Torenia-Pflanze gestrahlt, die Zelle mit dem Enzym behandelt und anschließend die sGFP-Plasmid-Lösung mittels der Mikroinjektionsmethode eingeführt wurde und die Zelle für 24 Stunden kultiviert wurde. Aus dieser Abbildung geht deutlich hervor, dass das Fluoreszenzprotein durch das eingeführte Gen exprimiert worden war.
In diesem Beispiel wurde eine Mikrokapillare bei der Enzymbehandlung eingesetzt, es ist jedoch selbstverständlich, dass dies auch ohne Verwendung einer Mikrokapillare vorgenommen werden kann. Beispielsweise wird die Laser-bearbeitete Seite in der Enzymlösung eingetaucht, und für wenige oder mehrere Minuten umgesetzt, und mit sterilisierten destillierten Wasser gewaschen, um die Enzymbehandlung durchzuführen.
Beispiel 9
Eine Plasmidlösung (enthaltend sGFP) wurde unter Verwendung der gleichen Methode wie im Fall der Einführung der Calceinlösung, die im Beispiel 2 beschrieben ist, eingeführt, und die Expression von sGFP wurde mittels dem Fluoreszenzmikroskops nach 24 Stunden Kultivierung bestätigt.
Die 7 ist eine Hellfeld-Abbildung einer untersuchten Epidermiszelle einer Zwiebel. Das heißt, die 7 zeigt die Hellfeld-Abbildung der Epidermiszelle einer Zwiebel, betrachtet nach 24-stündiger Kultivierung nach einer Laserverarbeitung und Injektion der Plasmidlösung. Die 8 ist eine Mikrofotographie, die zeigt, dass die sGFP-Plasmid-Lösung in eine Zelle eingeführt und transient in ihr exprimiert wurde. In der 8 ist die Expression von sGFP durch Beobachtung des sGFP-enthaltenden Plasmids in 7 mit dem Fluoreszenzmikroskop zu sehen.
Die Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt die vorteilhafte Wirkung, dass eine einzelne bestimmte Zelle als Zielzelle bei der Produktion einer transformierten Pflanze verwendet werden, indem der Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt wird.
Die Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt die weitere vorteilhafte Wirkung, dass die Zielpflanzenspezies, die mit dem Laser zu bestrahlen ist, nicht beschränkt ist, im Unterschied zu Fällen, bei denen Pflanzenpathogene Bakterien eingesetzt werden, und folglich wird die vorliegende Methode für allgemeine Anwendungen eingesetzt.
Die Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt den weiteren Vorteil, dass ein großer Fremdstoff wie zum Beispiel ein Zellkern oder ein Chromosom in eine Zelle eingeführt werden kann.
Die Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung weist den weiteren Vorteil auf, dass viele Arten von Fremdstoffen gleichzeitig in eine Zelle eingeführt werden können.
Die Methode zur Einführung von Fremdstoff gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt noch den weiteren Vorteil, dass ein Fremdstoff mit einer niedrigen physikalischen Festigkeit, ausgewählt aus Chromosomen und Organellen, stabil in eine Zelle eingeführt werden kann.

Claims

Verfahren zum Einführen eines Fremdstoffs, gewählt aus Chromosomen und Organellen, in eine Zelle, gekennzeichnet durch die Schritte: Anordnen eines kleinen Partikels, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Liposomen, Metallpartikeln, Siliciumcarbid-Whiskern und Kügelchen, die aus Alginsäure, κ-Carrageen und wasserlöslichen gelierten Polysacchariden, welcher einen Fremdstoff trägt, auf einem Teil einer Zelloberfläche einer lebenden Zelle, Bohren eines Lochs in diesen Teil der Zellwand und/oder Zellmembran durch Bestrahlen und Behandeln dieses Teils der Zelloberfläche mit einem Laserstrahl, und Einführen des Fremdstoffs in die lebende Zelle.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin es sich bei der lebenden Zelle um eine Zelle einer Pflanze handelt und wenigstens ein Teil der Zellwand der Pflanzenzelle entfernt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der wenigstens eine Teil der Zellwand durch Bestrahlung mit einem Laserstrahl oder durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl zusammen mit einer Behandlung mit einem Hydrolyseenzym entfernt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin es sich bei dem kleinen Partikel um ein Feinpartikel mit einem Partikeldurchmesser von 0,01 μm bis 10 μm handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin es sich bei dem kleinen Partikel um ein Liposom handelt, das den Fremdstoff enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin es sich bei dem kleinen Partikel um ein Kügelchen handelt, das den Fremdstoff fixiert.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin der Fremdstoff fixiert wird, indem eine wässrige Lösung, die mindestens den Fremdstoff und ein Härtungsmittel enthält, in eine Emulsion vom Wasser-in-Öl-Typ mit einem härtbaren Ausgangsmaterial in Wasser gegeben wird, und ein gehärtetes Reaktionsprodukt gebildet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das härtbare Ausgangsmaterial Natriumalginat ist, das Härtungsmittel Calciumchlorid ist und das gehärtete Reaktionsprodukt Calciumalginat ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin es sich bei dem Laser um mindestens einen Laser handelt, gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem YAG-Laser, einem Eximer-Laser, einem Ar-Ionen-Laser, einem Stickstoff-Laser und einem Stickstoff-angeregten Farb-Laser.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin es sich bei dem Fremdstoff um ein Chromosom handelt.
Verfahren zum Einführen eines Fremdstoffs, gewählt aus Chromosomen und Organellen, in eine lebende Zelle, gekennzeichnet durch die Schritte: Bestrahlen einer lebenden Zelle mit einem Laserstrahl, Entfernen eines Teils einer Zellwand der lebenden Zelle, Exponieren eines Teils der Zellmembran, Anordnen eines Liposoms, das einen Fremdstoff enthält, auf der exponierten Zellmembran, und Fusionieren der exponierten Zellmembran mit dem Liposom, um dadurch den Fremdstoff in die lebende Zelle einzuführen.