JP4504082B2

JP4504082B2 - 液体注入装置

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Publication number: JP4504082B2
Application number: JP2004133791A
Authority: JP
Inventors: 護俊安藤
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 2004-04-28
Filing date: 2004-04-28
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2024-04-28
Also published as: JP2005312359A; EP1591519B1; US7479388B2; US20050244948A1; EP1591519A3; DE602004023481D1; EP1591519A2

Description

この発明は、液体注入装置に関し、例えば、細胞に遺伝子溶液や薬剤溶液を注入するための液体注入装置に関するものである。

近年、ライフサイエンス分野、特に、再生医療やゲノム創薬等の分野において、細胞に遺伝子や薬剤を注入し、細胞の性質を改変することが行われている。このような技術を用いることにより、遺伝子の役目を解明することができると共に、個人の遺伝的特性に応じた治療等を行うテーラーメード医療が可能になる。

そして、このような細胞を生産するため、多くの液体注入技術が提案されている。具体的には、ウイルスベクター法等の生物的方法、リポフェクション法等の化学的方法、エレクトロポレーション法等の電気的方法、パーティクルガン法等の物理的手法、レーザインジェクション法等の光学的方法、及び、マイクロインジェクション法等の機械的方法が知られている。

このうち、ウイルスベクター法は、ウイルスＤＮＡに導入遺伝子を組み込むことによって遺伝子組換えウイルスを作成し、この遺伝子組換えウイルスの感染機構を利用して、細胞に遺伝子導入を行う方法である。また、リポフェクション法は、荷電しているリポソームとＤＮＡとを混合し、これを細胞の表面に吸着させて、細胞内部にＤＮＡを入れる方法である。しかしながら、このような物的方法や化学的方法は、細胞と導入物質の組合せに制約が大きいという欠点がある。特に、ウイルスベクター法は、感染力の大きい細胞を用いるために感染症の危険性が比較的大きいという欠点がある。

また、エレクトロポレーション法は、電気パルスで細胞膜を破壊し、その穴から遺伝子や薬液を注入する方法である。また、パーティクルガン法は、遺伝子を付着させた微細粒子を細胞に打ちつけて細胞膜を破壊することで、遺伝子を細胞に導入する方法である。これら電気的方法や物理的方法は、細胞と導入物質の組合せを選ばないという利点を有する一方、装置制御が難しく、細胞膜をうまく破壊できなかったり、逆に、細胞膜を大きく破壊し過ぎて細胞が死滅してしまうという欠点があり、導入成功率は数％のオーダにとどまっているという問題があった。

これに対して、レーザインジェクション法等の光学的方法やマイクロインジェクション法等の機械的方法は、成功率や安全性が高い方法として注目されてきている。
このレーザインジェクション法では、細胞の培養液中に薬液を溶かし、この細胞の細胞膜にレーザを照射して開口部を形成する。そして、この開口部を介して、薬液をブラウン運動で細胞内に侵入させる（例えば、特許文献１参照）。この方法では、レーザで細胞膜を破壊するので、細胞の微細な構造に応じた液体注入を行うことができるという利点を有する。

また、マイクロインジェクション法は、１μｍ以下の径の細い針に薬液を満たし、この針を細胞に突き刺して薬液を注入する方法である（例えば、特許文献２参照）。この方法では、細胞の導入を顕微鏡下で行うことにより、また、熟練した作業者または分解能の高い制御装置を用いることにより、細胞へのダメージを最低限に抑えるための針先制御が可能になる。したがって、ほぼ１００％に近い成功率を得ることができる。さらに、この方法は、細胞と導入物質の組合せを選ばないという利点もある。

特開２００３−７０４６８号公報特開平８−２９０３７７号公報

しかしながら、レーザインジェクション法では、薬液を細胞内に侵入させる原動力としてブラウン運動を利用しているため、薬液の濃度や種類が限定されるという問題があった。また、原動力としてブラウン運動を利用しているため、薬剤分子の運動方向が一定せず薬液の導入効率が悪いという問題があった。したがって、高価な薬液を多量に使用する必要があり、注入コストが高いという欠点があった。

また、マイクロインジェクション法では、同一の針を繰返し使用すると、この針に細胞膜の一部が付着し、針先が太くなって使用できなくなるという問題があった。また、針で細胞膜を突き破るためには、針にある程度の勢いを持たせて細胞に突き刺す必要があるため、細胞の微細な構造に応じたインジェクションができないという問題があった。例えば、浮遊細胞の細胞質は厚みがわずか１〜２μｍしかないため、この部分に針先を合わせることが困難であり、この部分にインジェクションを行うことが難しかった。

この発明は、上述した従来技術による問題点を解消するためになされたものであり、細胞や導入物質の種類及び使用回数に左右されることなく、細胞の微細な構造に対応した液体注入を低コストで効率よく行うことができる、液体注入装置を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するため、請求項１に記載の液体注入装置は、液体を細胞へ注入するための液体注入装置であって、前記液体を前記細胞に向けて噴射する液体噴射手段と、前記細胞にレーザを照射することにより、前記液体噴射手段にて噴射された前記液体を前記細胞の内部に流入させるための開口部を、前記細胞に形成するレーザ照射手段とを備え、前記レーザ照射手段は、前記細胞の細胞膜上における前記レーザの照射位置から前記細胞の核に至る方向に対して略直交する方向に、前記レーザを照射することを特徴とする。

この請求項１に記載の発明によれば、核を避けてレーザ照射を行って形成した開口部を介して、液体が自己の推進力で細胞内部に注入される。

また、請求項２に記載の液体注入装置は、請求項１に記載の液体注入装置において、前記液体噴射手段は、前記細胞の核に向かう方向に前記液体を噴射し、前記レーザ照射手段は、前記細胞の細胞膜における、前記液体噴射手段にて噴射された前記液体の進行方向上に位置する部分に、前記開口部を形成し、前記液体噴射手段は、前記細胞の細胞膜上における前記レーザの照射位置から前記細胞の核に至る方向であって、前記レーザの照射方向に略直交する方向に、前記液体を噴射することを特徴とする。

この請求項２に記載の発明によれば、噴射された液体の進行方向上に核にレーザを当てることなく開口部が形成され、液体がそのまま細胞の内部に注入される。

また、請求項３に記載の液体注入装置は、液体を細胞へ注入するための液体注入装置であって、前記液体を前記細胞に向けて噴射する液体噴射手段と、前記細胞にレーザを照射することにより、前記液体噴射手段にて噴射された前記液体を前記細胞の内部に流入させるための開口部を、前記細胞に形成するレーザ照射手段と、噴射された前記液体が前記細胞に到達した時点、または、当該時点よりも所定時間前の時点に、前記開口部を形成するよう、前記レーザ照射手段による照射タイミングを制御するタイミング制御手段を備えることを特徴とする。

この請求項３に記載の発明によれば、液体が細胞に到達する前であって、かつ、細胞に形成された開口部が自己修復等する前に液体を注入できる。

また、請求項４に記載の液体注入装置は、請求項３に記載の液体注入装置において、前記細胞と前記液体噴射手段との相対距離を計測する相対距離計測手段を備え、前記タイミング制御手段は、前記相対距離計測手段にて計測された前記相対距離に基づいて、前記照射タイミングを制御することを特徴とする。

この請求項４に記載の発明によれば、細胞と液体噴射手段との相対距離が計測され、この相対距離に基づいてレーザの照射タイミングが決定される。

また、請求項５に記載の液体注入装置は、請求項３に記載の液体注入装置において、前記細胞の位置と前記液体噴射手段にて噴射された前記液体の位置とを検知する液体位置検知手段を備え、前記タイミング制御手段は、前記液体位置検知手段にて計測された前記細胞の位置及び前記液体の位置に基づいて、前記照射タイミングを制御することを特徴とする。

この請求項５に記載の発明によれば、細胞の位置及び液体の位置が検知され、これら両位置に基づいてレーザの照射タイミングが決定される。

請求項１に記載の発明によれば、レーザで形成した開口部を介して、液体が自己の推進力で細胞内部に注入されるので、多くの細胞に注入を行った場合でも針先に細胞が付着する等の問題がなく、細胞や導入物質の種類及び使用回数に左右されることなく液体注入を行うことができる。さらに、開口部の形状や位置をレーザ制御で調整できるので、細胞の微細な構造に応じた液体注入が可能になる。また、液体に推進力を与えて細胞の内部に侵入させることができるので、液体の注入効率がよく、注入コストを低減できるという効果を奏する。

また、請求項２の発明によれば、噴射された液体がそのまま進行方向上の開口部を介して細胞に注入されるので、液体をスムーズに効率よく注入できるという効果を奏する。

また、液体の噴射形態に関し、液体を点状に噴射した場合、液体使用量の最少化を図ることができる。
また、細胞の細胞膜上における前記レーザの照射位置から前記細胞の核に至る方向に対して略直交する方向に、前記レーザを照射した場合、レーザによって核を傷付ける可能性を低減でき、液体注入の生産性を向上させることができる。
また、前記細胞の細胞膜上における前記レーザの照射位置から前記細胞の核に至る方向であって、前記レーザの照射方向に略直交する方向に、前記液体を噴射した場合、液体を開口部の正面側から核に向けて噴射でき、液体を一層スムーズに注入することができる。

また、請求項３の発明によれば、液体が細胞に到達する前であって、かつ、細胞に形成された開口部が自己修復等する前に液体を注入できるので、液体をスムーズに効率よく注入できるという効果を奏する。

また、請求項４の発明によれば、細胞と液体噴射手段との相対距離に応じた適切なタイミングでレーザを照射でき、開口部を適切なタイミングで形成できて、液体をスムーズに効率よく注入できるという効果を奏する。

また、請求項５の発明によれば、細胞の位置及び液体の位置に応じた適切なタイミングでレーザを照射でき、開口部を適切なタイミングで形成できる。特に、液体の進行速度を事前に求めておく必要がないため、液体注入が一層容易になる。また、細胞培養液の粘度やポンプの押圧の変動によって液体の進行速度が変化しても、その影響を受けることなくレーザ照射タイミングを決定できるので、注入処理を一層正確に行うことができる。さらに、液体が細胞に到達する時間を算出する必要がないので、注入処理を一層迅速に行うことができる。

また、前記細胞が通過する溝状の流路を備え、前記液体噴射手段を、前記流路の内部に略水平に配置した場合、細胞の側方から液体を噴射でき、細胞の核に至る一層効果的な角度で液体を噴射できる。

以下に添付図面を参照して、この発明に係る液体注入装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。

まず、本発明に係る液体注入装置による液体注入の概要について説明する。図１は、本発明に係る液体注入装置による液体注入の概念を説明するための説明図である。この図に示すように、細胞１は細胞膜２と核３を備えて構成されている。ここで、液体注入の目的は、液体４を細胞膜２の内部、すなわち、細胞膜２と核３との間、あるいは、望ましくは核３の内部に注入することにある。このため、まず、液体噴射ノズル５から、細胞１に向けて、液体４を噴射する。そして、この液体４が細胞膜２に到達する前に、細胞膜２にレーザ６を照射して、細胞膜２に開口部７を形成する。このことにより、噴射された液体４が開口部７を介して細胞膜２の内部に注入される。

ここで、レーザ６の照射方向について説明する。レーザ照射方向は、基本的には、レーザ照射にて細胞膜２に形成された開口部７を介して、液体４を細胞１に注入可能である限りにおいて、任意に決定することができる。ただし、より好ましくは、細胞１の細胞膜２における、液体噴射ノズル５にて噴射された液体４の進行方向上に位置する部分に、開口部７を形成するようにレーザ照射を行う。このことにより、噴射された液体４が、細胞膜２によって遮られることなく、開口部７を介して細胞１の内部に注入される。

また、細胞１にレーザ６を照射する場合、細胞膜２から核３に至る方向にレーザ６を照射したのでは、レーザ６によって細胞膜２のみでなく核３までも傷付けしまい、細胞１を死滅させる危険性がある。このため、細胞膜２におけるレーザ６の照射位置から細胞１の核３に至る方向に対して略直交する方向（図１に示すレーザ照射方向）に、レーザ６を照射することが好ましい。このことにより、レーザ６を細胞膜２のみに照射でき、核３を傷付ける危険性を低減できる。なお、具体的な開口部７の径は、液体４のスムーズな注入を許容する一方で、細胞１へのダメージを最低限に留めることが好ましく、例えば、噴射された液体４と略同等か若干大きな径とすることができる。

さらに、液体噴射の方向について説明する。この方向は、基本的には、レーザ照射にて細胞膜２に形成された開口部７を介して、液体４を細胞１に注入可能である限りにおいて、任意に決定することができる。ただし、より好ましくは、細胞膜２におけるレーザ６の照射位置から細胞１の核３に至る方向であって、レーザ６の照射方向に略直交する方向に、液体４を噴射する。この場合には、細胞１に形成した開口部７の正面から液体４を噴射でき、液体４を一層効率よく注入することができる。

次に、レーザ照射のタイミングについて説明する。概略的には、噴射された液体４が細胞膜２に到達すると同時に、細胞膜２にレーザ６を照射して開口部７を形成する。ただし、より厳密には、到達時間の到来と同時にレーザ６を照射したのでは、レーザ６によって開口部７が完全に形成される前に、液体４が細胞膜２に到達してしまう可能性がある。このため、レーザ６の動作時間や開口部７の形成時間を考慮して、液体４が細胞膜２に到達する所定時間前にレーザ照射を行ってもよい。その一方、開口部７の形成が早すぎる場合、液体４が到達する前に開口部７が自己修復等によって狭められてしまい、細胞１の内部への液体４の進行が妨げられる可能性がある。これらのことから、液体４が細胞膜２に到達する前であって、開口部７が狭められる前、例えば、液体４が細胞膜２に到達する数ｍＳ程度前に、レーザ照射を行うことが好ましい。

次に、実施例１に係る液体注入装置について説明する。図２は、実施例１に係る液体注入装置１０の構成を示す説明図である。図２において液体注入装置１０は、移動テーブル１１、テーブル制御部１２、液体噴射ノズル１３、液体ポンプ１４、ノズル移動テーブル１５、ノズル制御部１６、ポンプ制御部１７、レーザ照射装置１８、レーザ制御部１９、観察装置２０、画像処理部２１、及び、中央制御部２２を備えて構成されている。なお、以下の説明では、図２に示すように、移動テーブル１１に平行な面内において相互に直交する２方向をＸ方向及びＹ方向、これらＸ方向及びＹ方向に直交する方向をＺ方向と定義する。

このうち、移動テーブル１１は、Ｘ方向及びＹ方向に移動可能な細胞移動手段である。この移動テーブル１１の具体的構成は任意であるが、例えば、後述する観察装置２０による下方からの細胞観察が可能なように、透明なガラス又はポリカーボネートから形成された平板として構成することができる。この移動テーブル１１の上面に載置されたシャーレ２３の内部には、細胞培養液が入っており、このシャーレ２３の上面には細胞１（図２において図示省略）が固定されている。この細胞１の固定方法としては公知の方法を用いることができ、例えば、細胞接着剤による接着や、吸引装置を用いた吸着を採用することができる。また、テーブル制御部１２は、中央制御部２２からの制御に基づいて、移動テーブル１１の移動を制御するテーブル制御手段である。

また、液体噴射ノズル１３及び液体ポンプ１４は、液体４（図２において図示省略）を細胞１に向けて噴射する液体噴射手段である。これら液体噴射ノズル１３及び液体ポンプ１４の具体的構成は任意であり、所定量の液体４を所定方向に噴射するためのあらゆる構成を採用することができる。例えば、液体ポンプ１４は、数ｍｍ程度の直径のピストンを備えて構成され、ほぼ定量の液体４を圧送するように構成することができる。また、液体噴射ノズル１３は、数μｍ程度の内径を有する中空針を有し、液体ポンプ１４にて圧送された定量の液体４を、その長手方向に沿って点状に噴射するように構成される。

なお、本実施例１においては、レーザ６を鉛直上方から照射した場合、シャーレ２３の側縁が障害になって液体噴射ノズル１３を完全に水平に配置することができないため、レーザ照射方向に対して直交状に液体噴射を行うことができない。このように直交状の噴射を行う例は後述する実施例３で示す。このように噴射される液体４は任意であるが、例えば、遺伝子を含んだ遺伝子溶液や、薬剤を含んだ薬剤溶液を噴射することができる。また、ノズル移動テーブル１５は、ノズルをＸ方向及びＹ方向に移動可能なノズル移動手段である。またノズル制御部１６は、ノズル移動テーブル１５を制御するノズル移動制御手段である。また、ポンプ制御部１７は、ポンプを制御するポンプ制御手段である。

また、レーザ照射装置１８は、細胞１にレーザ６を照射することにより、液体噴射ノズル１３にて噴射された液体４を細胞１の内部に流入させるための開口部７（図２において図示省略）を、細胞１に形成するレーザ照射手段である。このレーザ照射装置１８の具体的構成は任意であるが、例えば、近赤外線パルスレーザ（Ｎｄ；ＹＡＧレーザ、Ｔｉ：サファイアレーザ）を用いることができる。このようにパルスレーザを用いた場合には、液体噴射毎にレーザをパルス照射することができる。また、レーザ制御部１９は、中央制御部２２からの制御に基づいて、レーザ照射装置１８によるレーザ照射を制御するレーザ制御手段である。

また、観察装置２０は、顕微鏡やＣＣＤカメラの如き画像取得手段を備えて構成された撮像手段である。また、画像処理部２１は、観察装置２０にて取得された画像の解析及び処理を行う画像処理手段である。特に、本実施例１において、観察装置２０及び画像処理部２１は、細胞１と液体噴射ノズル１３との相対距離を計測する相対距離計測手段を構成する。

また、中央制御部２２は、図示のように、テーブル制御部１２、ポンプ制御部１７、ノズル制御部１６、レーザ制御部１９、及び、画像処理部２１に電気的に接続されており、これら各部を制御する中央制御手段である。特に、本実施例１において、中央制御部２２は、観察装置２０及び画像処理部２１にて計測された細胞１と液体噴射ノズル１３との相対距離に基づいて、レーザ６の照射タイミングを制御するタイミング制御手段を構成する。

次に、液体注入装置１０による液体注入の具体的方法について説明する。図３〜９は、実施例１の液体注入の過程を順次示す説明図である。また、図１０は、実施例１の液体注入処理のフローチャートである。まず、作業者は、細胞培養液を入れたシャーレ２３を移動テーブル１１に載置する。この際、シャーレ２３の上面に細胞を固定する。また、ノズル移動テーブル１５で液体噴射ノズル１３を移動させ、液体噴射ノズル１３の先端を細胞１の近傍に位置させる。

そして、観察装置２０にて細胞１及びその周辺の画像を取得する。すると図３のように、細胞１及び液体噴射ノズル１３の先端が自動的に観察される。例えば、細胞１の中心位置（核３の位置）は、当該細胞１の周辺が特定できれば容易に決定できる。なお、図３〜９において、細胞１に対するレーザ６の照射位置を符号Ｐ１として示す。

次いで、観察装置２０にて得た画像を画像処理部２１で画像処理することで、細胞１の位置及び液体噴射ノズル１３の先端の位置を特定する（図１０のステップＳ１）。また、撮像画像内におけるレーザ６の照射位置Ｐ１は、あらかじめ座標等によって設定しておくか、あるいは、観察装置２０に対するレーザ６の位置から求めることができる。そして、中央制御部２２は、図４に示すように、細胞１の細胞膜２の位置と、レーザ６の照射位置Ｐ１とが合致するように、テーブル制御部１２を介した制御によって、移動テーブル１１をＸ方向及びＹ方向に移動させる（図１０のステップＳ２、Ｓ３）。ここでは、観察装置２０とレーザ６の照射位置Ｐ１との相対的位置は一定であるため、移動テーブル１１を移動させることで、細胞１のみを移動させることができる。

次に、中央制御部２２は、図５に示すように、液体噴射ノズル１３の先端が適切な噴射位置に配置されるように、ノズル制御部１６を介して、液体噴射ノズル１３をＸ方向及びＹ方向に移動させる（図１０のステップＳ４、Ｓ５）。ここで、適切な噴射位置とは、上述のように、噴射方向が細胞１の核３に向かう方向であり、液体噴射ノズル１３の先端、レーザ照射位置Ｐ１、及び、核３がほぼ同一直線上に並ぶ位置である。なお、本実施例１においては、このように液体噴射ノズル１３をＸ方向及びＹ方向に移動させているが、液体噴射ノズル１３を、その基部を中心として回動させてもよい。

そして、中央制御部２２は、液体４が細胞膜２に到達するまでの時間を算出する（図１０のステップＳ６）。具体的には、観察装置２０にて取得された画像を画像処理部２１で画像処理することで、液体噴射ノズル１３の先端と細胞１の細胞膜２との距離（図５に示すＬ１）を求める。また、これに先立って、液体噴射ノズル１３から噴射された液体４の進行速度を求めておく。この進行速度は、細胞培養液や液体４自体の濃度、あるいは、ポンプの押圧力等に基づいて定まる。そして、中央制御部２２は、到達時間を、（距離Ｌ１／進行速度）として算出できる。

このように到達時間を算出した後、中央制御部２２は、図６に示すように、ポンプ制御部１７を介してポンプを駆動させ、液体噴射ノズル１３から液体４を噴射させる（図１０のステップＳ７）。ここでは、液体４の使用量を最少化するため、１つの細胞１に必要な量の液体４のみを点状に噴射することが好ましい。

液体噴射の完了と同時に、中央制御部２２は、先に算出した到達時間の到来の監視を開始する（図１０のステップＳ８）。この間、図７に示すように、噴射された液体４はその噴射方向に進行し、徐々に細胞１に近づく。そして、中央制御部２２は、到達時間が到来した時、レーザ制御部１９を介して、レーザ照射装置１８によるレーザ照射を行う（図１０のステップＳ９）。これにより、図８に示すように、細胞膜２に開口部７が形成される。なお、この到達時間の算出や監視の際には、上述のように液体４が細胞膜２に到達する所定時間前に開口部７が形成されるよう、数ｍＳ程度のタイミング調整を行うことが好ましい。そして、図９に示すように、開口部７を介して液体４が細胞１の内部に進行し、液体注入が完了する。

このように、本実施例１では、従来のマイクロインジェクション法のような針を用いないため、多くの細胞１に注入を行った場合でも針先に細胞１が付着する等の問題がなく、細胞１や導入物質の種類及び使用回数に左右されることなく液体注入を行うことができる。さらに、開口部７の形状や位置をレーザ制御で調整できるので、細胞１の微細な構造に応じた液体注入が可能になる。また、液体４に推進力を与えて細胞１の内部に侵入させることができるので、従来のレーザインジェクション法のようなブラウン運動による注入に比べて、液体４の注入効率がよく、注入コストを低減できる。

次に、実施例２に係る液体注入装置３０について説明する。図１１は、実施例２に係る液体注入装置３０の構成を示す説明図である。なお、特に説明なき構造及び方法については、上述した実施例１と同様であり、同一の構成及び処理ステップを同一の符号を付して説明する。液体注入装置３０は、実施例１の観察装置２０、画像処理部２１、及び、中央制御部２２に代えて、観察装置３１、画像処理部３２、及び、中央制御部３３を備えて構成されている。

また、観察装置３１は、細胞１、液体噴射ノズル１３の先端、及び、噴射された液体４の位置を特定するため、これらの撮像を行う撮像手段であり、例えば、微分干渉顕微鏡や位相差顕微鏡として構成される。すなわち、遺伝子や薬剤を含んだ液体４は、シャーレ２３の上面の細胞培養液に比べて屈折率が異なるため、この屈折率変化に基づく光学的位相変化を解析することで、その位置を特定することができる。また、画像処理部３２は、観察装置３１にて取得された画像の解析及び処理を行うことにより、細胞１、液体噴射ノズル１３の先端、及び、噴射された液体４の位置を特定する画像処理手段である。特に、本実施例２において、観察装置３１及び画像処理部３２は、細胞１の位置と液体噴射ノズル１３にて噴射された液体４の位置とを検知する液体位置検知手段を構成する。

また、中央制御部３３は、図示のように、テーブル制御部１２、ノズル制御部１６、ポンプ制御部１７、レーザ制御部１９、及び、画像処理部３２に電気的に接続されており、これら各部を制御する中央制御手段である。特に、本実施例２において、中央制御手段は、観察装置３１及び画像処理部３２にて計測された細胞１の位置及び液体４の位置に基づいて、レーザ６の照射タイミングを制御するタイミング制御手段を構成する。

次に、液体注入装置３０による液体注入の具体的方法について説明する。図１２は、実施例２の液体注入の過程を示す説明図である。また、図１３は、実施例３の液体注入処理のフローチャートである。

まず、実施例１における図１０のステップＳ１〜Ｓ５と同様に、細胞１と液体噴射ノズル１３の位置決めが行われる（図１３のステップＳ１〜Ｓ５）。その後、中央制御部３３は、図１２に示すように、ポンプ制御部１７を介してポンプを駆動させ、液体噴射ノズル１３から液体４を噴射させる（図１３のステップＳ６）。そして、この噴射完了と同時に、中央制御部３３は、観察装置３１にて取得された画像に基づいて、画像処理部３２にて特定された、液体４の位置を監視する。すなわち、点状に噴射された液体４は、細胞培養液中を細胞１に向かって進行する。この時、細胞培養液と液体４との界面では屈折力がわずかに異なるため、光学的位相変化が生じる。そこで、この位相変化を観測することによって液体４の細胞培養液中における進行状況（液体４の各時点の位置）をリアルタイムで特定することができる。

そして、中央制御部３３は、液体４が、図１２の液体４ａや液体４ｂの如き位置まで進行し、さらに、細胞１の細胞膜２に到達した時点で、あるいは、到達する所定時間前の時点で（図１３のステップＳ７）、レーザ制御部１９を介して、レーザ照射装置１８によるレーザ照射を行う（図１３のステップＳ８）。これにより、細胞膜２に開口部７が形成され、開口部７を介して液体４が細胞１の内部に進行し、液体注入が完了する。

上述してきたように、本実施例２では、実施例１の効果に加えて、液体４の進行状況をリアルタイムで把握してレーザ照射を行うので、液体４の進行速度を事前に求めておく必要がないため、液体注入が一層容易になる。また、細胞培養液の粘度やポンプの押圧の変動によって液体４の進行速度が変化しても、その影響を受けることなくレーザ照射タイミングを決定できるので、注入処理を一層正確に行うことができる。さらに、液体４が細胞１に到達する時間を算出する必要がないので、注入処理を一層迅速に行うことができる。

次に、実施例３に係る液体注入装置４０について説明する。図１４は、実施例３に係る液体注入装置４０の構成を示す説明図である。なお、特に説明なき構造及び方法については、上述した実施例２と同様であり、同一の構成及び処理ステップを同一の符号を付して説明する。液体注入装置４０は、実施例２の中央制御部３３に代えて、中央制御部４１を備えて構成されている。また、液体注入装置４０は、さらに、流路４２、細胞入力部４３、入力制御部４４、細胞出力部４５、及び、出力制御部４６を備えて構成されている。

このうち、流路４２は、細胞培養液の流動経路であり、例えば図示のように直方状の溝部として形成される。また、細胞入力部４３は、細胞培養液を流路４２に入力するための細胞入力手段であり、例えば、注射器の如き構造を備える。また、入力制御部４４は、細胞入力部４３による細胞入力動作を制御する細胞入力制御手段である。また、細胞出力部４５は、細胞培養液を流路４２から取得するための細胞出力手段であり、例えば、注射器の如き構造を備える。また、出力制御部４６は、細胞出力部４５による細胞出力動作を制御する細胞出力制御手段である。

次に、液体噴射ノズル１３の配置について説明する。図１５は、実施例３における液体噴射ノズル１３の配置を説明するための斜視図であり、図１６は、実施例３における液体噴射ノズル１３の配置を説明するための縦断面図である。これら図１５、１６に示すように、液体噴射ノズル１３の先端は、移動テーブル１１の内部に略水平に配置されている。具体的には、移動テーブル１１に略水平の貫通口１１ａが形成されており、液体噴射ノズル１３の先端は、この貫通口１１ａを介して、移動テーブル１１の側方から流路４２に至るように配置されている。したがって、レーザ６を鉛直方向から照射した場合、レーザ６の照射方向に略直交する水平方向から液体噴射を行うことができる。

ここで、流路４２における、液体噴射ノズル１３の先端に対応する位置には、図示しない細胞捕捉手段が設けられており、この細胞捕捉手段によって流路４２を流れる細胞１を一時的に捕捉することができる。この捕捉手段の具体的構成は任意であるが、例えば、流路４２に細胞１より小さい径の開口部（図示せず）を設け、この開口部から細胞１を吸引装置にて吸引するようにしてもよい。また、レーザ照射装置１８のレーザ照射位置Ｐ１は、図１６に示すように、細胞捕捉手段にて捕捉された細胞１の細胞膜２の位置に合致するように決定されている。

次に、液体注入装置４０による液体注入の具体的方法について説明する。図１７は、実施例３における液体注入処理のフローチャートである。まず、中央制御部４１は、入力制御部４４を介して細胞入力部４３を駆動し、細胞培養液を流路４２に入力させる（図１７のステップＳ１０）。そして、中央制御部４１は、観察装置にて撮像し、画像処理部にて画像処理された画像に基づいて、細胞捕捉手段による細胞１の捕捉有無を監視する（図１７のステップＳ１１）。すなわち、入力された細胞１が、流路４２の内部を流動し、細胞捕捉部によって捕捉されると、その周囲の細胞培養液との屈折率の相違に基づいて、細胞１が捕捉されたことを検知できる。

そして、中央制御部４１は、細胞１が捕捉された場合、ポンプ制御部１７を介してポンプを駆動させ、液体噴射ノズル１３から液体４を噴射させる（図１７のステップＳ１２）。そして、この噴射完了と同時に、中央制御部４１は、観察装置にて撮像し、画像処理部にて画像処理された画像に基づいて、噴射された液体４の進行状況をリアルタイムに監視する。

そして、中央制御部４１は、液体４が、細胞１の細胞膜２に到達した時点、あるいは、到達する所定時間前の時点が到来したら（図１７のステップＳ１３）、レーザ制御部１９を介して、レーザ照射装置１８によるレーザ照射を行う（図１７のステップＳ１４）。これにより、細胞膜２に開口部７が形成され、開口部７を介して液体４が細胞１の内部に進行し、液体注入が完了する。最後に、中央制御部４１は、必要に応じて細胞捕捉手段から細胞１を解放した後、出力制御部４６を介して細胞出力部４５を駆動し、細胞培養液を流路４２から出力させる（図１７のステップＳ１５）。

上述してきたように、本実施例３では、実施例２の効果に加えて、液体噴射ノズル１３を流路４２の内部に略水平に配置したので、細胞１の側方から液体４を噴射でき、細胞１の核３に至る一層効果的な角度で液体４を噴射できる。

以上、本発明の実施例１〜３について説明したが、本発明の具体的な構成及び方法は、特許請求の範囲に記載した各発明の技術的思想の範囲内において、任意に改変および改良することができる。また、発明が解決しようとする課題や発明の効果は、上記した内容に限定されるものではなく、本発明によって、上記に記載されていない課題を解決したり、上記に記載されていない効果を奏することもでき、また、記載されている課題の一部のみを解決したり、記載されている効果の一部のみを奏することがある。

細胞には、細胞様の微細粒子を含むものとする。また、上記各実施例で自動的に行われるものとして説明した制御の全部又は任意の一部は、手動で行っても良い。また、レーザ６の照射タイミングや液体４の噴射タイミングは、液体注入を行う毎に決定する必要はなく、平均的なタイミングを一律に適用してもよい。

（付記１）液体を細胞へ注入するための液体注入装置であって、
前記液体を前記細胞に向けて噴射する液体噴射手段と、
前記細胞にレーザを照射することにより、前記液体噴射手段にて噴射された前記液体を前記細胞の内部に流入させるための開口部を、前記細胞に形成するレーザ照射手段と、
を備えたことを特徴とする液体注入装置。

（付記２）前記液体噴射手段は、前記細胞の核に向かう方向に前記液体を噴射し、
前記レーザ照射手段は、前記細胞の細胞膜における、前記液体噴射手段にて噴射された前記液体の進行方向上に位置する部分に、前記開口部を形成すること、
を特徴とする付記１に記載の液体注入装置。

（付記３）前記液体噴射手段は、前記液体を点状に噴射すること、
を特徴とする付記１又は２に記載の液体注入装置。

（付記４）前記レーザ照射手段は、近赤外パルスレーザであること、
を特徴とする付記１〜３のいずれか一つに記載の液体注入装置。

（付記５）前記レーザ照射手段は、前記細胞の細胞膜上における前記レーザの照射位置から前記細胞の核に至る方向に対して略直交する方向に、前記レーザを照射すること、
を特徴とする付記１〜４のいずれか一つに記載の液体注入装置。

（付記６）前記液体噴射手段は、前記細胞の細胞膜上における前記レーザの照射位置から前記細胞の核に至る方向であって、前記レーザの照射方向に略直交する方向に、前記液体を噴射すること、
を特徴とする付記１〜５のいずれか一つに記載の液体注入装置。

（付記７）前記液体噴射手段にて噴射された前記液体が前記細胞に到達した時点、または、当該時点よりも所定時間前の時点に、前記開口部を形成するよう、前記レーザ照射手段による照射タイミングを制御するタイミング制御手段、
を備えたことを特徴とする付記１〜６のいずれか一つに記載の液体注入装置。

（付記８）前記細胞と前記液体噴射手段との相対距離を計測する相対距離計測手段を備え、
前記タイミング制御手段は、前記相対距離計測手段にて計測された前記相対距離に基づいて、前記照射タイミングを制御すること、
を特徴とする付記７に記載の液体注入装置。

（付記９）前記細胞の位置と前記液体噴射手段にて噴射された前記液体の位置とを検知する液体位置検知手段を備え、
前記タイミング制御手段は、前記液体位置検知手段にて計測された前記細胞の位置及び前記液体の位置に基づいて、前記照射タイミングを制御すること、
を特徴とする付記７に記載の液体注入装置。

（付記１０）前記細胞が通過する溝状の流路を備え、
前記液体噴射手段を、前記流路の内部に略水平に配置したこと、
を特徴とする付記１〜９のいずれか一つに記載の液体注入装置。

以上のように、本発明に係る液体注入装置は、遺伝子溶液や薬液等の液体を細胞に注入する装置として有用であり、特に、多数の細胞に注入すること、細胞の微細な構造に応じた注入を行うこと、あるいは、液体の導入コストを低減することに適している。

本発明に係る液体注入装置による液体注入の概念を説明するための説明図である。実施例１に係る液体注入装置の構成を示す説明図である。実施例１の液体注入の過程を順次示す説明図である。実施例１の液体注入の過程を順次示す説明図である。実施例１の液体注入の過程を順次示す説明図である。実施例１の液体注入の過程を順次示す説明図である。実施例１の液体注入の過程を順次示す説明図である。実施例１の液体注入の過程を順次示す説明図である。実施例１の液体注入の過程を順次示す説明図である。実施例１の液体注入処理のフローチャートである。実施例２に係る液体注入装置の構成を示す説明図である。実施例２の液体注入の過程を示す説明図である。実施例２の液体注入処理のフローチャートである。実施例３に係る液体注入装置の構成を示す説明図である。実施例３における液体噴射ノズルの配置を説明するための斜視図である。実施例３における液体噴射ノズルの配置を説明するための縦断面図である。実施例３における液体注入処理のフローチャートである。

符号の説明

１細胞
２細胞膜
３核
４液体
５液体噴射ノズル
６レーザ
７開口部
１０、３０、４０液体注入装置
１１移動テーブル
１２テーブル制御部
１３液体噴射ノズル
１４液体ポンプ
１５ノズル移動テーブル
１６ノズル制御部
１７ポンプ制御部
１８レーザ照射装置
１９レーザ制御部
２０、３１観察装置
２１、３２画像処理部
２２、３３、４１中央制御部
２３シャーレ
４２流路
４３細胞入力部
４４入力制御部
４５細胞出力部
４６出力制御部

Claims

液体を細胞へ注入するための液体注入装置であって、
前記液体を前記細胞に向けて噴射する液体噴射手段と、
前記細胞にレーザを照射することにより、前記液体噴射手段にて噴射された前記液体を前記細胞の内部に流入させるための開口部を、前記細胞に形成するレーザ照射手段と、
を備え、
前記レーザ照射手段は、前記細胞の細胞膜上における前記レーザの照射位置から前記細胞の核に至る方向に対して略直交する方向に、前記レーザを照射すること、
を特徴とする液体注入装置。
前記液体噴射手段は、前記細胞の核に向かう方向に前記液体を噴射し、
前記レーザ照射手段は、前記細胞の細胞膜における、前記液体噴射手段にて噴射された前記液体の進行方向上に位置する部分に、前記開口部を形成し、
前記液体噴射手段は、前記細胞の細胞膜上における前記レーザの照射位置から前記細胞の核に至る方向であって、前記レーザの照射方向に略直交する方向に、前記液体を噴射すること
を特徴とする請求項１に記載の液体注入装置。
液体を細胞へ注入するための液体注入装置であって、
前記液体を前記細胞に向けて噴射する液体噴射手段と、
前記細胞にレーザを照射することにより、前記液体噴射手段にて噴射された前記液体を前記細胞の内部に流入させるための開口部を、前記細胞に形成するレーザ照射手段と、
前記液体噴射手段にて噴射された前記液体が前記細胞に到達した時点、又は、当該時点よりも所定時間前の時点に、前記開口部を形成するよう、前記レーザ照射手段による照射タイミングを制御するタイミング制御手段、
を備えたことを特徴とする液体注入装置。
前記細胞と前記液体噴射手段との相対距離を計測する相対距離計測手段を備え、
前記タイミング制御手段は、前記相対距離計測手段にて計測された前記相対距離に基づいて、前記照射タイミングを制御すること、
を特徴とする請求項３に記載の液体注入装置。
前記細胞の位置と前記液体噴射手段にて噴射された前記液体の位置とを検知する液体位置検知手段を備え、
前記タイミング制御手段は、前記液体位置検知手段にて計測された前記細胞の位置及び前記液体の位置に基づいて、前記照射タイミングを制御すること、
を特徴とする請求項３に記載の液体注入装置。